（水生生物学专业论文）干扰沉积物再悬浮对浮游细菌群落结构和多样性的影响.pdf

ff 舢删胛胛删删 y 17 9 9 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学侥论文 石 如需保密，解密时间年月日 是否保密 口 独创性声明 本人声明所星交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谶的地方外，论文中不包含其他入已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农韭大学或其健教育机专句的学位或证书 而使用过的材耩，指导教师对此进行了审定与我一圃工作的网志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意 研究生签名：新彩 时同：渺年月擎日 一 张暂移名：渺 注：蟊i ： 将本表敷接装订往学位论文的扉页和目录之润 干扰一沉积物再悬浮对浮游细菌群落结构和多样性的影响 目录 摘要i a b s t r a c t i i i 缩略语表v i i 第l 章绪论1 1 1 干扰与生物多样性1 1 1 1 干扰1 1 1 2 生物多样性1 1 1 3 中度干扰假说1 1 2 沉积物再悬浮对水生生态系统影响2 1 2 1 浅水湖泊中的一种干扰沉积物再悬浮2 1 2 2 沉积物再悬浮概念2 1 2 3 沉积物再悬浮对浮游植物的影响2 1 2 4 沉积物再悬浮对浮游动物的影响2 1 3 水生生态系统中浮游细菌的研究3 1 3 1 浮游细菌在水生生态系统中的作用3 1 3 2 细菌的分类地位4 1 3 3 影响浮游细菌的主要因子5 1 4 微生物群落结构研究方法的历程6 1 4 1 微生物群落研究的主要分子生物学方法6 1 5 本论文的主要研究内容和研究意义1 8 1 5 1 研究内容18 1 5 2 研究意义1 9 第2 章沉积物再悬浮对浮游细菌群落结构影响的微宇宙实验2 l 2 1 前言2 1 2 2 材料与方法2 2 2 2 1 实验设计2 2 2 2 2 样品采集2 2 2 2 3 浮游细菌基因组d n a 提取2 3 2 2 4 浮游细菌群落t - r f l p 分析2 3 2 2 5 浮游细菌群落d g g e 分析2 5 2 2 6 统计分析2 6 2 3 结果与分析2 7 2 3 1 模拟实验过程中水化因子分析2 7 4 1 z 1 1 z ：! 果4 4 4 9 4 9 4 9 ：；( ) ! ；l 影响5 3 5 3 5 4 5 4 ! ；! ； 5 5 5 6 5 6 干扰沉积物再悬浮对浮游细菌群落结构和多样性的影响 4 2 6 统计分析5 6 4 3 结果与分析5 7 4 3 1 浮游细菌基因组d n a 提取5 7 4 3 2t - r f l p 分析浮游细菌群落组成5 8 4 3 3 浮游细菌群落多样性指数的变化一5 9 4 3 4 不同生态恢复区中浮游细菌群落组成的比较6 3 4 3 5 生态恢复区中浮游细菌分类地位6 4 4 3 6 不同围隔的理化的变化6 9 4 3 7 非生物因子与浮游细菌群落结构的相关分析7 0 4 4 讨论7 7 4 4 1 不同生态恢复区中浮游细菌群落结构存在不同的原因7 7 4 4 2 沉积物再悬浮对浮游细菌群落结构和多样性的影响7 9 4 4 3 浮游细菌群落结构和多样性与生态系统功能8 1 结论与展望8 3 研究主要结论8 3 对今后研究的展望8 4 参考文献8 5 参与课题1 1l 发表及撰写论文1 11 至炙谢113 干扰沉积物再悬浮对浮游细菌群落结构和多样性的影响 摘要 浮游细菌在水生生态系统的物质循环和能量流动中具有重要作用：一方面， 细菌分解有机物释放能量，为消费者；另一方面，它能利用真核藻类无法吸收利 用的可溶性有机物，将之转化为颗粒有机物进行二次生产，此时细菌又表现为生 产者。由于环境中的细菌存在不同程度的复苏障碍，传统的分离纯培养的方法制 约着人们对环境中细菌生态学、多样性和生态功能等的研究。分子生物学技术应 用于生态学研究以来，特别是基于免培养的方法的运用使传统微生物生态学研究 有了长足的发展，使微生物生态学理论更加接近其自然本质。 本研究通过微宇宙的原位模拟实验，采用末端限制性片段长度多态性 ( t e r m i n a lr e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，t - r f l p ) 和变性梯度凝胶电泳 ( d e n a t u r i n gg r a d i e n tg e le l e c t r o p h o r e s i s ，d g g e ) 两种分子生态学常用方法探讨沉积 物再悬浮对浮游细菌群落结构和多样性的影响，并通过多元统计分析其可能的调 控机制。最后构建浮游细菌的1 6 sr d n a 克隆文库，分析不同再悬浮处理中，浮 游细菌主要的种类。采用末端限制性片段长度多态一 生( t e r m i n a lr e s t r i c t i o nf r a g m e n t l e n g t hp o l y m o r p h i s r n , t - r f l p ) 研究了生态恢复区中浮游细菌群落结构。通过与 p a t 数据库对比，揭示生态恢复区中浮游细菌主要的种类。通过对浮游细菌群落 与环境因子动态变化的多元统计分析，揭示各个生态恢复区中影响浮游细菌群落 结构的主导环境因子，探讨沉积物再悬浮对其可能的影响。论文的主要结果如下： 1 再悬浮处理组浮游细菌的物种丰度( s p e c i e sr i c h n e s s ) 高于对照组，并且弱 再悬浮中细菌物种丰度高于强再悬浮处理；弱再悬浮中细菌多样性( s p e c i e s d i v e r s i t y ) 也高于强再悬浮处理。中等强度的干扰增加了浮游细菌的多样性。浮游 细菌与环境因子的典型对应分析( c c a ) 和冗余分析( r d a ) 结果表明，浮游动物枝 角类( c l a d o c e r a ) 乘l 颗粒态磷( p p ) 浓度与浮游细菌群落结构动态变化均表现出显著 的相关性畎0 0 5 ) 。沉积物再悬浮可能从营养盐等上行效应以及浮游动物等下行 效应影响了浮游细菌的群落结构；因此沉积物再悬浮对浅水湖泊的微食物网有重 要影响。 2 选取6 月2 5 日强再悬浮( d s r ) 、弱再悬浮( d w r ) 和对照( d c ) 3 个不同 处理的样品构建1 6 sr d n a 克隆文库，分析不同再悬浮处理中，浮游细菌主要的 华中农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 种类。在d s r 、d w r 和d c 中分别检测到2 6 个、3 3 个和3 1 个o t u s 。样品 中浮游细菌主要种类为变形菌f - ( p r o t e o b a c t e r i a ) 的仅、p - 和 r 一亚纲，放线菌门 ( a c t i n o b a c t e r i a ) ，蓝藻f - j ( c y a n o b a c t e r i a ) ，拟杆菌f - j ( b a c t e r o i d e t e s ) ，浮霉菌门 ( p l a n c t o m y c e t e s ) 5 大类群。d - s r 和d c 样品中变形茵i q ( p r o t e o b a c t e r i a )菌占优 势，分别为8 5 和8 7 。q p r o t e o b a c t e r i a 是其中主要的类群。d w r 中虽然变形 菌n ( p r o t e o b a c t e r i a ) 也占优势但其比例只有5 5 ；放线菌门( a c t i n o b a c t e r i a ) 和拟杆 菌1 - ( b a c t e r o i d e t e s ) 有占很大比例，分别为2 4 和9 。在弱再悬浮处理中发现了 我们还了解甚少的浮霉菌f q ( p l a n c t o m y c e t e s ) 这类细菌。 3 采用非公制多维尺度分析( n o n m e t r i cm u l t i d i m e n s i o n a ls c a l i n g ，n m d s ) 比 较5 个不同生态恢复区中群落结构的相似性，结果显示生态恢复区中浮游细菌群 落季节上的差异大于空间上的差异。即不同采样时间样品的差异大于不同处理围 隔的差异。通过与数据库对比显示生态恢复区中浮游细菌主要是变形菌门 ( p r o t e o b a c t e r i a ) 的7 - p r o t e o b a c t e r i a ，0 【p r o t e o b a c t e r i a 亚纲；放线菌门( a c t i n o b a c t e r i a ) 的a c t i n o b a c t e r i d a e 亚纲；拟杆菌i - ( b a c t e r o i d e t e s ) 的黄杆菌纲( f l a v o b a c t e r i a ) 。 4 在t - r f l p 分析浮游细菌群落结构变化的基础上，采用多元统计分析浮游 细菌群落结构与环境因子的相关性，结果显示t p 、c h la 和t n 与浮游细菌群落 结构变化具有极显著的相关性( p 喜喜 | 演 图1 - 3 d g g e 技术原理概要图 f i g u r e1 - 3 t h ep r o c e d u r eo f d e n a t u r i n gg r a d i e mg e le l e c t r o p h o r e s i st e c h n o l o g y 1 4 1 1 2 末端限制性片段长度多态性( t e r m i n a lr e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t h p o l y m o r p h i s m ) 末端限制性片段长度多态性，t e r m i n a lr e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t h p o l y m o r p h i s m ( t - r f l p ) 。l i u ( 1 9 9 7 ) 首先介绍了该技术，更早的时候c a n c i l l a ( 1 9 9 2 ) 、 a v a n i s s a g h a j a n i ( 1 9 9 4 ，1 9 9 6 ) 等也从事t - r f l p 的研究。其被广泛运用于生物膜 ( w u e r t ze ta 1 ，2 0 0 4 ) 、水体( d o r i g oe ta 1 ，2 0 0 5 ；d a n o v a r oe ta 1 ，2 0 0 6 ) 、农业( t i e d j e e la l ，1 9 9 9 ；b r u c ea n dh u g h e s ，2 0 0 0 ；a r i a se ta 1 ，2 0 0 5 ) 、森林土壤( h a c k le ta 1 ，2 0 0 4 ； l e c k i e ，2 0 0 5 ；n o g u e ze ta 1 ，2 0 0 5 ) 、污染土壤( t u r p e i n e ne ta 1 ，2 0 0 4 ；p a u le ta 1 ， 2 0 0 6 ) 、沉积物( s j o l i n ge ta 1 ，2 0 0 5 ；p e r e i r ae ta 1 ，2 0 0 6 ) 、真菌( k e n n e d ya n dc l i p s o n ， 2 0 0 3 ；a n d e r s o na n dc a i m e y , 2 0 0 4 ；e d e l h e r m a n ne ta 1 ，2 0 0 4 ；a v i se ta 1 ，2 0 0 6 ) 、根 瘤菌( t h i e se t 以，2 0 0 1 ) 、海洋( m o e s e n e d e re ta 1 ，1 9 9 9 ；r e i n t h a l e re ta 1 ，2 0 0 5 ) 、湖 泊( k r i t z b e r ge ta 1 ，2 0 0 6 ；t a n ge ta 1 ，2 0 1 0 ) 等的研究中。末端限制性片段长度多态 性以分子系统学原理为基础，综合运用了p c r 、限制性酶切、荧光标记和d n a 序列分析等技术，通过对特定核酸片段长度多态性的测定来分析微生物群落结构 华中农业人学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 和功能。t - r f l p 是基于r f l p 技术建立起来的( m a r s h ，1 9 9 9 ) 。 该方法的主要原理是：以提取的样品d n a 为模板，利用基因保守区设计的 带有荧光标记的引物进行p c r 扩增。常用的荧光基团有：5 荧光素氨基磷酸酯 ( 6 - f a mp h o s p h o r a m i d i t e 【5 - f l u o r e s c e i np h o s p h o r a m i d i t e ) 、5 一六氯荧光素氨基磷 酸酯( 6 - h e xp h o s p h o r a m i d i t e 5 - h e x a c h l o r o f l u o r e s c e i np h o s p h o r a m i d i t e ) 、5 一四 氯荧光素氨基磷酸酯( 6 - t e tp h o s p h o r a m i d i t e 【5 - t e t r a c h l o r o f l u o r e s c e i n p h o s p h o r a m i d i t e ) 、羧基- x - 罗丹明琥珀酰亚胺酯r o x ( c a r b o x y - x r h o d a m i n e ) 、c y 3 - n 一羟基琥珀酰亚胺酯( c y3a c i d ，m o n o - n h se s t e r ) 、c y5 n 羟基琥珀酰亚胺酯 ( c y5a c i d ，m o n o - n h se s t e r ) 、v i c 等。得到的一端带有荧光标记的p c r 产物， 再经限制性内切酶消化。由于核苷酸序列的差异，不同细菌片断的酶切位点不同， 酶切后得到不同长度的限制性片段。其中末端带有荧光标记的片断将会被自动测 序仪检测到，所得到的图谱中每一个峰理论上代表一种菌。每个峰高所占总高的 百分数就代表了该菌的相对数量( m a r s h ，1 9 9 9 ；2 0 0 0 ；2 0 0 5 ) 。其基本过程如图1 4 所示： - 一 识别标记片 段输出峰图 - 一 测序仪上 片段分离 5 ，litti iiiii = 5 tiiii iiii ： 5 1 | jii iii = 剿? 上 捎化p c r 产物 i t 5 血- - t t t t t 图1 4 末端限制性片段长度多态性基本过程 f i g u r e1 - 4 t h ep r o c e d u r eo ft e r m i n a lr e s t r i c t i o nf i a g r n e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s mt e c h n o l o g y 如图1 5 ，在微生物群落t - r f l p 图谱中，横坐标表示限制性片段的长度，纵 标表示荧光强度。这种图谱是通过软件生成的。从图中我们可以获得许多定量 数据，如图谱中峰的个数，每个峰的峰高、峰面积以及该峰对应的限制性片段 碱基大小等等。利用这些信息，就可以对所研究的微生物群落进行一些定性或 1 2 畜 一 雯 干扰- 沉积物再悬浮对浮游细菌群落结构和多样性的影响 定量分析。若将建立克隆文库及测序技术与t - r f l p 相结合，就可以建- 节t - r f l p 图谱中峰值与微生物物种的对应关系，从而能够读解t - l 心l p 图谱中每个峰所代 表的微生物的种，并有可能在环境中发现新的微生物菌种。 6 0 0 0 0 5 0 0 0 0 4 0 0 0 0 一 1 3 0 0 0 0 一 鲁2 0 0 0 0 一 支1 0 0 0 0 一 j 。，- ，毒。， 蔓， 。t a n o1 0 。0如 湖i4 0 o由尚 7 0 0 & ( 哟 图1 - 5 t - r f l p 图谱 f i g u r e1 - 5 t - r f l pp e a kv a l u ep a a e m 图谱分析时，首先要确定d n a 片段长度处于一个合适范围( 如9 4 8 2 7 b p ， 峰纳入后续的数据处理。不同的荧光检测阈值会导致微生物群落结构和多样性分 析结果的差异；提高检测阈值，可使平行样品t - r f l p 图谱中的不可重复峰大为 减少，但同时也会使一些可重复峰消失，造成对群落多样性的低估。为了尽可能 使结果准确，d u n b a re ta 1 ( 2 0 0 1 ) 建议尽可能降低检测阈值，通过平行试验，将 那些在平行试验的图谱中重复出现的峰纳入统计分析。带有荧光标记物质的 t - i 讧被d n a 测序仪中的荧光检测器检测出来，反映为t - r f l p 图谱中的各个 “峰”。峰对应的横坐标代表了t r f 的片段长度，是根据该t - r f 与标准样品中 d n a 长度已知的片段在电泳中的位置进行比较后计算得到的；峰对应的纵坐标 代表含有荧光物质t - r f 的荧光强度：峰面积代表了具有相同片段长度所有t - r f 的荧光强度的总和。每一个峰可以作为一个操作分类单元来进行分析，那么 t - r f l p 图谱中就可以包含以下信息： ( 1 ) 物种丰度( r i c h n e s s ) ：s = 图谱中显著峰的总数。这里粗略地认为每个峰对应着 一个不同的物种。 ( 2 ) 多样性指数：描述群落多样性的指数有很多，如通过以上t - r f l p 图谱，可 以计算s h a n n o n w e i n e r 指数：h p = 一p ii np i ，其中r 表示每个峰面积占总面 积的比例。 华中农业大学2 0 1 0 届硕七研究生学位论文 对于试验得到的多个群落的t - r f l p 图谱，可以分别计算上面的这些指标， 进行群落间的比较分析，也可以构造每个群落在一定意义下的距离矩阵，通过计 算群落相似性对不同群落图谱进行定量比较。 1 4 1 1 3 单链构象多态性分析( s i n g l es t r a n dc o n f o r m a t i o n a lp o l y m o r p h i s m ) 单链构象多态性，s i n g l es t r a n dc o n f o r m a t i o n a lp o l y m o r p h i s m ( s s c p ) 本来是用 于鉴定基因突变( o r i t ae la 1 ，1 9 8 9 ) ，近年来被应用于微生物生态学研究( l e ee t 甜， 1 9 9 6 ；f r a n ka n dc h i s t o p h ，1 9 9 8 ；h e a de ta 1 ，1 9 9 8 ；m a r i l l e ye la 1 ，1 9 9 8 ) 。单链d n a 片段呈复杂的空间折叠构象，这种立体结构主要是由其内部碱基配对等分子内相 互作用力来维持的。当有一个碱基发生改变时，会或多或少地影响其空间构象， 使构象发生改变。空间构象有差异的单链d n a 分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻 大小不同。因此，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳( p a g e ) ，可以非常敏锐地将 构象上有差异的分子分离开。该方法主要包括以下步骤：提取基因组d n a ；用 细菌通用引物扩增1 6 sr d n a ；将扩增后的产物变性，形成单链的d n a ；用聚丙 烯酰胺凝胶电泳将不同的片段分离；回收d n a ，测定不同条带的序列，同g e n b a n k 的1 6 sr d n a 序列比较，确定微生物的分类地位。s s c p 法的弱点在于其灵敏性 随p c r 产物d n a 长度的增加而下降。 1 4 1 1 4 限制性片段长度多态性分析( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ) 利用能识别特定d n a 序列的限制性核酸内切酶处理1 6 sr d n a ，基于不同 种群1 6 sr d n a 序列的差异，将得到长度与数量不同的d n a 片段，通常用高分 辨率的聚丙烯酰胺凝胶电泳来分离，并利用溴乙啶等荧光染料进行显色，得到的 特异性的电泳图谱称基因的酶切指纹图谱。此法能够反映多个酶切位点所包含的 d n a 序列信息，因此在进行微生物群落物种多样性比较时能提供较丰富的信息， 适用于较复杂的群落之间的比较，其缺点是：( 1 ) 末端片段所提供的序列信息混 杂在其它片段的信息中，无法判断群落中有多少物种。( 2 ) 和d g g e 法相似， d n a 的荧光染色法的灵敏度较低。0 ) r f l p 分析需要时间较长。 1 4 1 1 5 扩增片段长度多态性分析( a m p l i f i e dr e s t r i c t i o nf r a g m e n tp o l y m o r p h i s m ) 扩增片段长度多态性，a m p l i f i e dr e s t r i c t i o nf r a g m e n tp o l y m o r p h i s m ( a f l p ) 是 研究微生物多样性的一项新技术，它结合了r a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a ( r a p d ) 和r f l p 的优点。a f l p 是1 9 9 3 年由荷兰科学家z a b e a u 和v o s 发展起来 1 4 干扰沉积物再悬浮对浮游细菌群落结构和多样性的影响 的一种检测d n a 多态性的新方法( z b a e u aa n dv o s ，1 9 9 3 ；v o se ta 1 ，1 9 9 5 ) 。由于不 同物种的基因组d n a 大小不同，基因组d n a 经限制性内切酶酶切后，产生分 子量大小不同的限制性片段。使用特定的双链接头与酶切d n a 片段连接作为扩 增反应的模板，用含有选择性碱基的引物对模板d n a 进行扩增，选择性碱基的 种类、数目和顺序决定了扩增片段的特殊性，只有那些限制性位点侧翼的核苷酸 与引物的选择性碱基相匹配的限制性片段才可被扩增。扩增产物经放射性同位素 标记、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后根据凝胶上d n a 指纹的有无来检验多态 性。 1 4 1 2 构建克隆文库( c l o n el i b r a r yp r o f i l i n g ) 评价环境样本中的微生物多样性最精确的方法就是获得其克隆的序列信息。 1 9 9 0 年，g i o v a n n o n i 等用这一方法分析马尾藻海海面浮游微生物的多样性 ( g i o v a n n o n ie ta 1 1 9 9 0 ) 。由于r r n a 序列进化变异频率缓慢，r r n a 基因最经常 被选作克隆的基因，成为细菌系统发生的准绳。 核糖体r n a 有3 种类型：2 3 s 、1 6 s 、5 sr r n a ，1 6 sr r n a 是目前微生物 生态学研究中已经广泛使用的“b i o m a r k e r ，这是因为( 1 ) 核糖体r n a 是蛋白质 合成必需的，所以它们广泛存在于所有的原核生物中，并且结构和功能都是保守 的；( 2 ) 1 6 sr r n a 的序列中包括可变区和高变区，因此既可以利用保守区域来设 计引物，又可以利用高变区来进行序列间的比对；( 3 ) 它们的序列变化比较缓慢 而且在原核生物中不发生水平转移，因此1 6 sr r n a 之间序列的差异可以反映不 同生物之间的进化关系( o l s e ne ta 1 ，1 9 8 6 ) 。从样本中提取总d n a ，采用p c r 来 扩增r d n a 基因，建立基因数据库，通过分析1 6 sr d n a 基因片段用于确定细菌 的系统发育关系，对微生物进行分类鉴定。p r o b e b a s e ( h t t p ：w w w m i c r o b i a l e c o l o g y d e p r o b e b a s e ) ( l o ye ta 1 ，2 0 0 7 ) 、r i b o s o m a ld a t a b a s e p r o j e c ti i ( r d p i i ，h t t p ：r d p c m e m s u e d u h t m l ) ( c o l ee ta 1 ，2 0 0 3 ；2 0 0 5 ) 、e u r o p e a n m o l e c u l a rb i o l o g yl a b o r a t o r y ( e m b l ，h t t p ：w w w e b i a c u k e m b l ) 、n a t i o n a lc e n t e r f o rb i o t e c h n o l o g yi n f o r m a t i o n ( n c b i ，h t t p ：w w w n c b i n l m n i h g o v ) 、d n ad a t a b a n ko fj a p a n ( d d b j ，h t t p ：w w w d d b j n i g a c j p ) 等数据库中已经登录了大量来 自不同生物的核酸序列。在获得细菌1 6 sr d n a 序列信息以后，就可以在上述数 据库中进行序列比对，找到这些序列相应微生物的系统发育地位。这种方法可以 2 0 0 6 ) 、m a r f i s h ( w a g n e r e ta 1 ，2 0 0 6 ) 、r a m a n f i s h ( h u a n ge ta 1 ，2 0 0 7 ；2 0 0 9 ) 。 非原位杂交主要包括：菌落杂交( c o l o n yh y b r i d i z a t i o n ) 、狭缝杂交、反向线点杂交 ( z w a r te ta 1 ，2 0 0 3 ) 等。 分子杂交技术应用于环境中特定微生物群落鉴定、群落数量分析及其特异微 生物跟踪检测，是目前在分子微生物生态学领域应用比较广泛的方法之一。与其 它方法相比，其特点是不需要对目标基因进行p c r 扩增，因此可以避免p c r 过 程中产生的误差；但是同样由于未对目标基因进行扩增，目标基因浓度较低，有 时会给检测带来困难；且有时目标类群的目标基因序列并非完全同一，而是有亚 类群之间的差异，结果所设计的探针d n a 序列与某些亚类群的目标基因互补性 较差，从而导致对该类群的估计过低；另外，微生物自发荧光会干扰f i s h 检测 信号，造成假阳性，使得研究结果变得复杂；细胞的生理状态可能影响到杂交结 果，休眠的细胞或代谢不活跃的细胞导致信号强度降低，出现假阴性的结果。更 重要的不足之处是，使用分子杂交技术的前提是要有已知种类的标记序列作为探 针，因为探针是经过特异选择的，它的特性决定了它所能检测的微生物范围 ( b e r g q u i s t ，1 9 9 9 ；h o s h i n o ，2 0 0 3 ) 。对于大量潜在的未知种类，分子杂交方法则无 法研究。 1 6 干扰沉积物再悬浮对浮游细菌群落结构和多样性的影响 1 4 1 4 其他方法 1 4 1 4 1 实时定量p c r ( r e a l t i m ep c r ) 美国应用生物系统公司自1 9 9 6 年推出世界首台荧光定量p c r 仪之后，其迅 速进入到生物研究的各个领域( h e i d e ta 1 ，1 9 9 6 ；s c h m i t t g e n ，2 0 0 1 ；k u r m a y e ra n d k u t z e n b e r g e r , 2 0 0 3 ；v a i t o m a ae ta 1 ，2 0 0 3 ) 。实时定量p c r ( r e a l - t i m ep c r ) 技术，是 指在p c r 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个p c r 进程， 最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。经典p c r 一般分为扩增和 检测两个阶段，常用溴化乙锭染色，凝胶电泳为定性检测手段。由于定性实际上 就是定量的一种粗约表现，因此只要对检测手段进行改进就可以实现精确定量。 荧光染料或荧光标记物与扩增产物结合后，被激发的荧光强度和扩增产物成正 比。而根据扩增原理，扩增是呈指数增长，因此在反应体系和反应条件完全一样 的情况下，样本含量应与扩增产物的对数成正比，故在一定的条件下荧光强度和 样本含量成正比。 1 4 1 4 2 宏基因组( m e t a g e n o m e ) 宏基因组( m e t a g e n o m e ) ( 也称微生物环境基因组学m i c r o b i a le n v i r o n m e n t a l g e n o m i c s ，宏基因组学、元基因组学m e t a g e n o m i c s ，生态基因组学e c o g e n o m i c s ) 是由h a n d e l s m a n 等1 9 9 8 年提出的新名词，其定义为 t h eg e n o m e so ft h et o t a l m i c r o b i o t af o u n di nn a t u r e ”( h a n d e l s m a n ，19 9 8 ) ，即生境中全部微小生物遗传物质 的总和。它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，目前主要指环境样品中 的细菌和真菌的基因组总和。而所谓宏基因组学( m e t a g e n o m i c s ) 就是一种以环境 样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和测序分析为研究手段， 以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间 的关系为研究目的的新的微生物研究方法。生物学和化学的结合孕育了宏基因组 学的诞生，而宏基因组学的发展需要最大限度的利用现代生物技术和实用筛选技 术。一般包括从环境样品中提取基因组d n a ，克隆d n a 到合适的载体，导入 宿主菌体，筛选目的转化子等工作。 目前，环境宏基因组的研究多集中在海洋( d e l o n ge ta 1 ，2 0 0 6 ) 等环境中。湖 泊环境的宏基因组研究还处于起步阶段。部分学者从湖泊真的宏基因组文库中筛 选得到了编码几丁质酶、脂肪酶、甘油脱水酶、甲烷单加氧酶、脱氢酶等的基因 1 7 华中农业入学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 ( r i c h a r d s o ne ta 1 ，2 0 0 2 ；k n i e t s c he la 1 ，2 0 0 3 ；n e r c e s s i a ne ta 1 ，2 0 0 5 ) 。国内方面， w ue ta 1 ( 2 0 0 9 ) 从长江表层水的宏基因组文库中筛选得到了一种新的酯酶。特定 生物种基因组研究使人们的认识单元实现了从单一基因到基因集合的转变，宏基 因组研究将使人们摆脱物种界限，揭示更高更复杂层次上的生命运动规律。在目 前的基因结构功能认识和基因操作技术背景下，细菌宏基因组成为研究和开发的 主要对象。细菌宏基因组细菌人工染色体文库筛选和基因系统学分析使研究者能 更有效地开发细菌基因资源，更深入地洞察细菌多样性。 以上分子生物学方法在微生物分子生态学研究中较为流行，每种方法各有其 优缺点，在进行微生物群落生物多样性研究时，往往将两种以上的方法联合使用 以确保试验的真实性和准确性。例如，有人将s s c p + r f l p ；r f l p + t - r f l p ； d g g e + t - r f l p 克隆、测序+ 分子杂交+ d g g e ；克隆、测序+ 分子杂交+ t - r f i p ； 克隆、测序+ 分子杂交+ 传统的微生物培养技术+ t - r f l p 等组合应用到微生物多 样性的实际研究中，取得了良好的效果( m o e s e n e d e re ta 1 ，1 9 9 9 ；d i e ze ta 1 ，2 0 0 1 ； n i k o l c h e v ae ta 1 ，2 0 0 3 ；n u n a ne ta 1 ，2 0 0 5 ) 。在实际应用中，要根据实际情况和研 干扰沉积物再悬浮对浮游细菌群落结构和多样性的影响 而且一旦将这些有机体从环境中分离出来，微生物原有生存环境将被改变，因而 所获得的物种丰度和物种均匀度数据无法准确地反映原始群落结构和微生物多 样性。所以本研究将综合利用t - r f l p 、p c r d g g e 和克隆等方法研究浮游细菌 群落结构及其动态变化。 本研究主要内容包括以下2 个方面： ( 1 ) 运用t - r f l p 、p c r - d g g e 和构建克隆文库等方法，通过微宇宙的模拟 试验研究夏季在相同外源负荷下沉积物再悬浮对浮游细菌群落结构的影响。探讨 沉积物再悬浮对富营养化浅水湖泊浮游细菌群落结构的影响。 ( 2 ) 本研究将利用t - r f l p 方法分析生态恢复区浮游细菌的群落结构，及其 动态变化。判断不同生态恢复区浮游细菌的生物多样性和群落结构是否有差异? 通过多元统计方法，分析干扰沉积物再悬浮对浮游细菌群落结构的影响。 1 5 2 研究意义 干扰与生物多样性关系众说纷纭，近年来，由于人类活动的干扰大大加快了 全球性物种灭绝速度，生态系统中生物多样性的降低会对生态系统造成什么影响 成为备受关注的一个问题。同时随着全球变化，尤其是气候变暖，不仅影响到降 雨和淡水资源的分布，还影响到淡水生态系统和水环境的变迁。随着湖泊富营养 化过程的加快，我们想了解水生生态系统中干扰对生物多样性( 浮游细菌多样性) 及其群落结构的影响。阐明沉积物再悬浮这一干扰对浅水湖泊微食物网有重要影 响。 1 9 华中农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 2 0 水湖泊 ，湖面开阔，湖底地形平坦。在一般天气条件时浪高0 5m 左右，5 - 6 级 风时浪高可达lm ，在风浪作用下表层沉积物极易再悬浮( 蔡启铭1 9 9 8 ) 。沉积物 再悬浮可以使沉积物中的营养盐释放到水体中，提高水中营养盐浓度，同时沉积 物再悬浮也可以降低水体的透明度，改变水下的光照条件。已有的研究发现，沉 积物再悬浮对大型浅水湖泊以及沿海的微食物网结构有重要的影响( g a r s t e c k ie t a 1 ，2 0 0 2 ；w ue ta 1 ，2 0 0 7 a ) ，另外也有对浮游植物、浮游动物存在显著影响的报道 ( s h e r re ta 1 ，1 9 8 6 ；c a r r i c ke ta ，1 9 9 3 ) 。然而目前专门针对沉积物再悬浮对浮游细 菌群落结构影响的研究开展的较少。 湖泊系统中，浮游细菌数量众多，种类丰富，在生态系统中扮演着重要的角 色。浮游细菌群落结构的动态变化可能受到多种生物和非生物环境因子的调控， 如温度、无机营养盐、可溶性有机物、浮游植物、浮游动物等( k i s a n da n dn o g e s ， 2 0 0 4 ；s c h a l l e n b e r ga n db u m s ，2 0 0 4 ；l e v i n ee ta 1 ，2 0 0 5 ) 。因此，沉积物再悬浮引起 的环境因子的变化可能对浮游细菌群落结构产生影响。然而由于细菌缺少明显的 分类学特征，采用传统的分离培养方法无法获得细菌组成的原位信息。目前分子 生物学技术如d g g e ( m u y z e re ta 1 ，1 9 9 3 ；m u y z e ra n ds m a l l a ，1 9 9 8 ；m u y z e r , 1 9 9 9 ) 和t - r f l p ( l i ue ta 1 ，1 9 9 7 ) 等已广泛应用于水生态系统浮游细菌群落的基因多样 性的研究。同时运用2 种及以上的分子指纹图谱方法分析样品可以提高结果的可 靠度( d i e ze ta 1 ，2 0 01 ；n i k o l c h e v ae ta 1 ，2 0 0 3 ) 。 本研究通过微宇宙的模拟实验，运用t - r f l p 和d g g e2 种分子指纹图谱技 术分析了在相同的外源负荷下不同的沉积物再悬浮程度对浮游细菌群落结构的 影响特征，并分析影响浮游细菌动态变化的主要的环境因子。本研究的开展有助 于认识沉积物再悬浮对富营养化浅水湖泊浮游细菌群落结构的影响及其机制。探 讨沉积物再悬浮这种浅水湖泊中的干扰对浮游细菌多样性的影响。 2 l 华中农业大学2 0 1 0 届硕十研究生学位论文 2 2 材料与方法 2 2 1 实验设计 实验在9 个塑料桶( 上底直径6 0c m ，下底直径4 5c m ，高7 5c m ) q b 进行，取 一定量的太湖表层1 0 1 5c m 沉积物和湖滨带黄泥，以一定体积比充分混匀后加 入到9 个塑料桶中，使各桶中沉积物厚度为1 0c m 。然后用抽水泵抽取湖泊近岸 混合湖水，实验桶内水量约为1 5 0l ，加湖水后让系统稳定2 4h 。在水下放置潜 水泵，其出水口的动力作用可以使桶内表层沉积物发生再悬浮。实验设3 组处理： ( 1 ) 强再悬浮( s r ) ，每天扰动1 0h ；( 2 ) 弱再悬浮( w r ) ，每天扰动5h ；( 3 ) 无再悬 浮的对照组( c ) 。每组设3 个平行。 2 2 2 样品采集 2 0 0 8 0 6 0 9 2 0 0 8 0 6 2 9 每5d 采样一次，共采集5 次。分别标记为a 、b 、c 、 d 、e 。水样取水面下2 0c m ，重复3 次然后等体积混合。为获得环境中尽可能丰 富的细菌样本，须对水样进行预处理。具体步骤如下：水样经超声波处理后，经 孔径为6 4 “m 的浮游生物滤9 q ( 2 5 号) 过滤去处大型浮游动物。滤液再经过超声波 处理( v e l j ia n da l b f i g h t ，1 9 9 3 ) ，