（分析化学专业论文）新型电化学酶传感器的研制及其应用研究.pdf

聊城大学硕士学位论文 摘要 目前，用于固定化酶及其它生物活性物质的载体种类繁多，包括各种无机和有机物 质以及各种天然和合成的高分子聚合物。但是要保持固定化酶在电极上的高活性、高稳 定性，还没有一种载体能够达到尽善尽美。壳聚糖是甲壳素在碱性条件下脱乙酰化反应 得到的衍生物，具有机械性能良好，生物相容性好，易成膜以及无毒和良好的牛珲惰性 等优点，特别是分子中存在的大量氨基和羟基，使其既易与蛋白质和酶共价结合，又可 络合金属离子，使酶免受金属离子的抑制。此外，壳聚糖价格低廉且易降解，对人体和 环境无害。自1 9 9 4 年第一次被报道用于修饰电极以来l s l ，在过去的十年巾，壳聚糖作为 一种膜材料在修饰电极及生物传感器的制备方面得到广泛的应用。 本论文研究了以壳聚糖或壳聚糖复合膜为载体在玻碳电极上固定辣根过氧化物酶、 氯化血红素、葡萄糖氧化酶制备过氧化氢和葡萄糖生物传感器，讨论了传感器制各过程 中的各种影响因素，优化了实验条件，丰富了电流型酶传感器的内容。 主要工作如下： i 以壳聚糖为载体固定辣根过氧化物酶制备电流型过氧化氢生物传感器 在玻碳电极( g c e ) 上固定辣根过氧化物酶( h r p ) 制备过氧化氢生物传感器，系统地 研究了传感器制备过程中的各种影响因素，以及过氧化氢在该传感器上的安培响应。壳 聚糖膜的包埋及乙二醛的交联作用可以将h r p 牢固的固定在g c e 上，壳聚糖载体可较 大限度地保持固定化酶的生物活性。实验研究了h r p 电极的选择性和稳定性以及对于 h 2 0 2 的检测灵敏度和检测范围。在0 0 2m o l l 的p h7 0 的磷酸盐缓冲溶液中，工作电 位为一1 0 0m v ( v s s c e ) 时，h r p 电极具有最佳的电化学响应。h r p 电极的还原峰电流随 过氧化氢的连续加入而不断增大，在3 5 1 0 一1 1 1 0 。m o u l 范围内成良好的线性关 系，线性回归方程为：z g a = 0 2 9 + 1 2c ( h 2 0 2 浓度c 的单位为t o o l l ) ，相关系数为，= 0 9 9 9 4 ，检测限为8 0 1 0 4 m o l l ( s n = 3 ) ，计算出米氏常数虬。”为2 0 1 0 一m o l l 。 该h r p 酶电极对于h 2 0 2 的检测灵敏度为1 2 1 8g a m m 。h 2 0 2 浓度为2 0 1 0 。m o u l 时，连续测定6 次，其变异系数( r s d ) 为2 0 。葡萄糖、果糖、蔗糖、柠檬酸、半胱胺 聊城太学硕士学位论文 陵、硝酸钾、草黻、氟化铵8 种物质对于酶电极的响应信号没有干扰，只有抗环血酸对 懿电极嚷迎信号产生明鼹影昀。 2 辣根过氧化物酶在壳聚糖聚乙烯吡咯烷酮复合膜内的固定及其用于过氧化氢安培 传感器。 戳竞蒙糖骤乙爝虢晦烷繇( p v p ) 复合貘灸载俸固定辣根过氧化物酶涮蚤了过氧纯氯 传感器。研究了壳聚糖与p v p 艇合膜的组成比对于传感器响应信号的影响，当1 0 的 蠢聚糖溶滚与2 5 豹p v p 溶滚体袄毯：舞9 ：1 辩，裁褥| l 孽装蒜器其畜爱好豹稍应蘩号 和稳定性，此复合膜适台辣根过氧化物酶的固定。研究了酶电极制备谶程中的一些影响 因素以及酶电蔽对于h 2 0 2 的电流响应。在o 0 2m o l lp h7 4 的磷酸藏缓、摔溶液中，工 乍电位为0m v ( v s s c e ) 时，h r p 电极对h 2 0 2 的电化学响应在5s 内即可达到最大值， 检测范丽为6 0 xl 旷至1 7 1 0 0m o i l ，线性阐归方税为：4 t a = 0 8 9 + o 0 6c ( h 2 0 2 浓度e 瓣单位强m o l l ) ，胡关系数为，= 0 9 9 9 2 ，检测灵敏发为6 2 。5 | t a m m ，检测嫩 为2 5 1 0 石m o y l ，计髀其米氐常数局卿为1 7 1 0 4m o y l 。在h 2 0 2 浓度为1 o 1 0 “ m o l l 辩，连续6 次测定h r p 耄极豹翡盛迄滚，其交髯系数( r s d ) 为l 。8 。激磊疆突 了酶电极的选择性及稳定性。 3 。麓颦糖氧豫戆在袁壤耱麋乙爝懿漆靛黧笺合貘痰戆鬻定菠萁矮予蘩篱穗筵感爨 鞋党聚糖，聚乙烯# 凌峪浣弱麓合膜凳载律藤定蓠莓糖氧张酶( g o d ) ，潮备鬣楚耱镲拣 器，考套了传感器制备过程中的锫种影响因素。在0 , 0 2m a l lp h6 8 的磷酸盐缓冲溶澈 中，王裕电位3 0 0m v ( v s + s c e ) 拜雩，g o d 电凝对于滚滚中裂麓藕静蕊豫惑健奄流与溶滚 中蔼蔼糖浓度在5 0 1 0 d 一8 5 1 0 4 m o l l 范国内成良好的线性关系，线性回归方程为： 新l a 一一5 9 6 5 1 0 3c 1 2 0 3 ( 葡萄糖浓魔c 的单位m o l l ) ，捆关系数为r 一0 , 9 9 3 3 ，梭 灏袋露2 0 x 1 0 5 m o l l ( s f n = 3 ) ，诗算褥寒氏常数噩产举鸯2 8 6 ) ( 1 0 。m o l l 。该g o d 壤 极对于葡萄糖的检测灵敏度为s 7 2t t a m m 。谯葡萄糖浓度为s 2 1 0 qm o l l 时，遗续 6 次测定g o d 壤缀靛酶壹窀滚，嶷舅袭数( r s a ) 舞2 ，s 。鼗g o d 恕投基毒较好麴稳 定性，缳存于4 麓缓洚溶液中，一个胃蠢露绦持7 0 虢活瞧；翅莱g o d 亳投藏予4 空气中保存，两个胄肉g o d 魄辍胃保持8 5 静漭靛。鞫辩研究了魏g o d 电极熬选 择性及对于实际样晶的测定，结襞满意。 2 聊城大学硕士学位论文 4 氯化血红素在壳聚糖n a t i o n 复合膜内的固定及其用于电流型过氧化氢传感器 以壳聚糖n a f i o n 复合膜为载体在玻碳电极上固定氯化血红素制各过氧化氢传感器。 实验结果显示，1 o 的壳聚糖乙酸溶液与1 o 的n a t i o n 乙醇溶液的体积比为6 ：4 时， 所得复合膜最适于血红索的固定。研究了传感器制各过程中的影响因素及血红索电极的 电化学性质，在1 0m o u lp h9 8 的n h 3 n h 4 c i 缓冲溶液中，工作电位为4 5 0m v ( v s s c e ) 时，血红素电极对h 2 0 2 的催化还原峰电流与h 2 0 2 浓度在4 0 1 0 一1 5 1 0 。 m o l l 范围内成良好的线性关系，线性回归方程为：铆l a = 3 3 4 + 3 6c ( h 2 0 2 浓度c 的 单位为t o o l l ) ，相关系数为，= 0 9 9 6 0 ，检测灵敏度为3 5 4 儿a ，m m ，检测限为3 5 1 0 一m o i l ( s n = 3 1 ，计算得米氏常数。删为1 8 4 1 0 一m o l l 。利用同一支血红素电极， 在相同条件下连续6 次测定浓度为1 0 1 0 。m o l l 的h 2 0 2 溶液，变异系数( r s d ) 为 6 5 。相同方法重复制备6 支血红素电极，在相同条件下测定修饰电极的可重现性，得 变异系数为8 0 。同时研究了血红素电极的稳定性和选择性。 关键词：壳聚糖，聚乙烯吡咯烷酮，n a t i o n ，辣根过氧化物酶，葡萄糖氧化酶，氯化 血红素，生物传感器 赣域丈掌矮喾谴诠交 a b s t r a c t n o w a d a y s ，m a n yi n o r g a n i ca n do r g a n i c ( n a t u r a lo rs y n t h e t i c ) m a t e r i a l sh a v eb e e n c o n s i d e r e da n di n v e s t i g a t e df o ri m m o b i l i z i n ge n z y m ea n do t h e rb i o l o g i c a lm o l e c u l e s 。b u t t h e r ei sn oo n ep e r f e c ts u p p o r tm a t e r i a lc a nb eu s e df o ra l le n z y m e s c h i t o s a ni sa n - d e a c e t y l a t e dd e r i v a t i v eo fc h i t i n ，an a t u r a l l yo c c u r r i n gb i o p o l y m e rf o u n di nt h e e x o s k e l e t o no fc r u s t a c e a n s ，i nf u n g a lc e l l w a i l s ，a n di no t h e rb i o l o g i c a lm a t e r i a l s 。 c h i t o s a ni ss e l e c t e da st h em a t r i xf o ri m m o b i l i z a t i o no fe n z y m eb e c a u s eo ft h eu n u s u a l c o m b i n a t i o no fi t sp r o p e r t i e s ，w h i c hi n c l u d e se x c e l l e n tm e m b r a n e f o r m i n ga b i l i t y , h i g h p e r m e a b i l i t y t o w a r d w a t e r , g o o da d h e s i o n ，b i o c o m p a t i b i l i 镇n o n t o x i c i 壤h i g h m e c h a n i c a ls t r e n g t h ，a n ds u s c e p t i b i l i t yt oc h e m i c a lm o d i f i c a t i o n sd u et ot h ew i d e l y p r e s e n c eo fa m i n og r o u p s ，w h i c hf a c i l i t a t ei m m o b i l i z a t i o no fe n z y m e so i lc h i t o s a nb y c o v a l e n t b i n d i n g 。m o r e o v e b a sa b i o d e g r a d a b l ep o l y m e r , c h i t o s a n m a t e r i a li s c c o - f r l e n d i y ，s a f ef o rh u m a u sa n dn a t u r a le n v i r o n m e n t f r o mt h ef i r s tr e p o r t e d a p p l i c a t i o no fc h i t o s a ni ne l e c t r o a n a l y t i c a lc h e m i s t r yi n1 9 9 4 ，c h i t o s a na n di t sd e r i v a t i v e s h a v eb e e nw i d e l yu s e di nt h em o d i f i c a t i o no fe l e c t r o d ea n dt h ef a b r i c a t i o no fb i o s e n s o ri n t h ep a s td e c a d e 。 i nt h i sa r t i c l e ，h y d r o g e np e r o x i d ea n dg l u c o s eb i o s e n s o r sw e r ef a b r i c a t e db a s e do n t h ei m m o b i l i z a t i o no fh o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ，h e m i n ，a n dg l u c o s eo x i d a s eo n p u r e c h i t o s a n c a r r i e ro rc h i t o s a nh y b r i dm a t r i c e s 。t h ec o n d i t i o n si nt h e p r o c e d u r eo f b i o s e n s o r sf a b r i c a t i o na n de l e c t r o c h e m i c a ld e t e c t i o nw e r eo p t i m i z e d t h em a i nw o r ki s a sf o l i l o w s ： 1 ab i o s e n s o rb a s e do ni m m o b i l i z a t i o no fh o r s e r a d i s hp c r o x i d a s ei nc h i t o s a nm a t r i x c r o s s l i n k e dw i t hg l y o x a if o ra m p e r o m e t r i cd e t e r m i n a t i o no fh y d r o g e np e r o x i d e ， a na m p e r o m e t r i cb i o s e n s o rf o rh y d r o g e np e r o x i d e ( 0 2 ) w a sd e v e l o p e dv i aa n e a s ya n de f f e c t i v ee n z y m ei m m o b i l i z a t i o nm e t h o dw i t ht h e s a n d 融 i c h ”c o n f i g u r a t i o n ： f e r r o c e n e - c h i t o s a n ：h r p ：c h i t o s a n g l y o x a lu s i n gag l a s s yc a r b o ne l e c t r o d ea st h eb a s i c e l e c t r o d e i no r d e rt op r e v e n tt h el o s so fi m m o b i l i z e dh r pu n d e ro p t i m i z e dc o n d i t i o n s ， 5 聊城大学硕士学位论文 t h eb i o s e n s o rs u r f a c ew a sc r o s s l i n k e dw i t h g l y o x a i f e r r o c e n ew a ss e l e c t e d a n d i m m o b i l i z e do nt h eg l a s s yc a r b o ne l e c t r o d es u r f a c ea sam e d i a t o r 7 u h ef a b r i c a t i o n p r o c e d u r ew a ss y s t e m a t i c a l l yo p t i m i z e dt oi m p r o v et h eb i o s e n s o rp e r f o r m a n c e t h e b i o s e n s o rh a duf a s tr e s p o n s eo fl e s st h a n1 0sa n dl i n e a rc a l i b r a t i o nr a n g eo f3 5 xt 0 4t o l l x l 0 。3m o l lw i t had e t e c t i o nl i m i to f8 0 x 1 0 6m o l lb a s e do ns n = 3 t h es e n s i t i v i t y o ft h eb i o s e n s o rf o rh 2 0 2w a s1 2 1 8p am m a n dt h ea p p a r e n tm i c h a e l i s m e n t c n c o n s t a n t ( 凰一w a sc a l c u l a t e dt o b e2 0 1 0 m o f l w h e nt h ec o n c e n t r a t i o no fh 2 0 2 w a s2 0 x 1 0 一m o l l t h er e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o no fs i xs u c c e s s i v ed e t e r m i n a t i o n sw a g 2 0 ( u = 6 ) w i t ham e a nc u r r e n to f4 2 肛a t h es e l e c t i v i t ya n ds t a b i l i t yo ft h e b i o s e n s o rw e r es t u d i e d 2 h y d r o g e np e r o x i d eb i o s e n s o rb a s e do nh o r s e r a d i s hp e r o x i d a s ei m m o b i l i z e d o n c h i t o s a n p o l y v i n y l p y r r o l i d o n e ( p v p ) c o m p o s i t em e m b r a n e s c h i t o s a n p v ph y b r i dm a t e r i a lw a si n t r o d u c e dt oi m m o b i l i z eh o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e a n df e r r o c e n ef o rt h ef a b r i c a t i o no fan e wa m p e r o m e t r i ch y d r o g e np e r o x i d eb i o s e n s o l t h eo p t i m u mp a r a m e t e r sf o rt h ef a b r i c a t i o na n dt h ea n a l y t i c a lp e r f o r m a n c eo ft h e b i o s e n s o rw e r ee x p l o r e d t h en e wb i o s e n s o re x h i b i t e dar e l a t i v e l yf a s tr e s p o n s e ( 1 e s st h a n 5s 、a n dal i n e a rc u r r e n tr e s p o n s et oh 2 0 2c o n c e n t r a t i o ni nt h er a n g eo f6 0 x 1 0 4t o 1 7 x 1 0 一m o l l t h es e n s i t i v i t yo ft h eb i o s e n s o rf o rh 2 0 2w a s6 2 5 am m ad e t e c t i o n l i m i to f2 5 x 1 0 m o l lh 2 0 2w a so b t a i n e dw i t has i g n a l t o n o i s er a t i oo f3 t h ea p p a r e n t m i c h a e l i s m e n t e nc o n s t a n t ( 。卯) w a sc a l c u l a t e dt ob e1 7 x 1 0 一m o l l o n ee n z y m e e l e c t r o d ef o rs i xr e p l i c a t ed e t e r m i n a t i o n sg a v e sar e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o no f1 8 i n t h ep r e s e n c eo f1 0 x 1 0 一m o l f lh 2 0 2 t h es e l e c t i v i t ya n ds t a b i l i t yo ft h eb i o s e n s o rw e r e s t u d i e da n ds a r i s f i e dr e s u l t sw e r eo b t a i n e d 3 g l u c o s eb i o s e n s o rb a s e do ng l u c o s eo x i d a s ci m m o b i l i z e do nc h i t o s a n p v pc o m p o s i t e m e m b r a n e s t h ee l e c t r o c h e m i c a lp e r f o r m a n c eo fau e wg l u c o s eb i o s e n s o rw a sr e p o r t e d t h e g l u c o s eb i o s e n s o rw a sd e v e l o p e db a s e do n t h ei m m o b i l i z a t i o no fg l u c o s eo x i d a s ei n c b i t o s a n p v ph y b r i dm a t r i x t h ee l e c t r o c h e m i c a lb e h a v i o ro ft h en e wg l u c o s eb i o s e n s o r h a db e e ne x a m i n e d b yc y c l i cv o l t a m m e t r ya n d t h ef a b r i c a t i o n p r o c e d u r ew a s 6 聊城大学顿士学位论文 s y s t e m a t i c a l l yo p t i m i z e dt oi m p r o v et h eb i o s e n s o rp e r f o r m a n c e 。t h ec a t a l y t i cc u r r e n t r e s p o n s et og l o e o s cw a sl i n e a ri nt h er a n g eo f5 0 x 1 0 一8 5 x 1 0 。4m o l lw i t had e t e c t i o n l i m i to f2 0 1 0 4m o l l ( s n = 3 t h es e n s i t i v i 姆, o ft h eb i o s e n s o rf o rg l u c o s ew a ss 7 2i r a m m a n dt h ea p p a r e n tm i c h a e l i s m e n t e nc o n s t a n t ( 繇罗) w a sc a l c u l a t e dt ob e2 8 6 x 1 0 。3 m o l l 。ar e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o no fb i o s e n s o rw a s2 5 f o rt h e5 。2 x 1 0 m o l i 。 g l u c o s es o l u t i o ni n6r e p e a t e dm e a s u r e m e n t s t h ec a t a l y t i cc u r r e n tr e s p o n s ec o u l dr e t a i n a b o u t7 9 o fi t so r i g i n a lv a l u ea f t e r1m o n t hs t o r a g ei np h o s p h a t eb u f f e rs o l u t i o na t4 w h i l et h er e s p o n s ec o u l dr e t a i n8 5 a f t e r2m o n t h sw h e ns t o r e da t4 u n d e rd r y c o n d i t i o n 。t h eg o db i o s e n s o rh a db e e nu s e df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fg l u c o s ei br e a l s a m p l e sa n ds a t i s f i e dr e s u l t 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o n s eo ft h e b i o s e n s o rt oh 2 0 2w a sl i n e a ri nt h er a n g eo f4 0 x 1 0 一一1 5 x 1 0 。m o l lw i t has e n s i t i v i t yo f 3 5 4g a m m t h ed e t e c t i o nl i m i to ft h ee l e c t r o d ew a sf o u n dt ob e3 5 x 1 0 。m o l l ( s n = 3 ) a n dt h ea p p a r e n tm i c h a e l i s m e n t e nc o n s t a n t ( 唧) w a sc a l c u l a t e dt ob e1 8 4 x 1 0 一m o l l t h er e p r o d u e i b i l i t yo fc u r r e n tr e s p o n s eo ft h ee n z y m ee l e c t r o d ew a se x a m i n e da tah 2 0 z c o n c e n t r a t i o no f1 0 x 1 0 m o l l ，a n dt h er e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o nw a sc a l c u l a t e dt ob e 6 5 ( n = 6 ) t h ef a b r i c a t i o nr e p r o d u c i b i l i t yw a se s t i m a t e df r o mt h er e s p o n s ef o rh 2 0 2 a ts i xd i f f e r e n th e r o i ne l e c t r o d e s a n dt h er e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o nw a s8 0 k e y w o r d s ：c h i t o s a n ，p o l y v i n y l p y r r o l i d o n e ，n a t i o n ，h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ，g l u c o s e o x i d a s e ，h e m i n ，b i o s e n s o r 7 聊城大学硕士学位论文 刖昂 1 9 6 2 年c l a r k i l l 在氧电极的基础上提出了研制葡萄糖酶传感器的设计原理，在1 9 6 7 年u p d i k e z l 研制出世界上第一支葡萄糖传感器。1 9 9 1 年，国际学术权威机构i u p a c ( 国 际纯粹和应用化学联合会) 发表了关于化学、生物传感器的名词、术语的文件。我国对生 物传感器的研究始于1 9 8 7 年【3 i ，1 9 8 8 年梁逸曾将其全面系统地介绍给了国内化学界i 4 。 生物传感器具有专一的识别功能，可在复杂的有机、生化样品中进行快速分析检测，甚 至生物活体测定的独到优势，自问世以来得到迅速发展。时至今日，生物传感器的发展 已大致经历了3 个阶段。目前，被广泛研究的是第二代生物传感器，此类传感器是基于 人为修饰的具有电化学活性物质为电子媒介体的电催化过程。本论文研究了几种电流型 酶传感器的制备与应用，亦属于第二代生物传感器。二茂铁作为电子媒介体，以壳聚糖 为载体将其固定于玻碳电极上制备了过氧化氢生物传感器。为了克服二茂铁易从电极表 面流失的问题，论文中以壳聚糖e v p 复合膜代替纯壳聚糖膜，分别制备了过氧化氢和 葡萄糖生物传感器。第三代生物传感器是基于酶与电极之间直接电子传递的电催化过 程，已逐渐成为研究的热点，本论文在这方面进行了尝试，以壳聚糖n a t i o n 复合膜为 载体固定氯化血红素制备了过氧化氢牛物传感器。 限于作者水平，本文难免存在不少缺点和错误，敬请各位专家批评指正。 潘芊秀 2 0 0 5 年4 月 聊城大学硕士学位论文 1 绪论 1 1 电化学生物传感器简介 生物传感器由生物识别元件和信息转换器件组成。利用生物活性物质的分子识别功 能，将其引起的化学或物理变化，借助转换器变换成可测量的电信号、光信号等。许多 活性物质，如酶、抗体、微生物、细胞和组织等对某一待测物质有专一的选择性及很高 的灵敏度，采用同定化技术能将这些活性物质固定在载体上，形成功能薄膜，制成分子 谚 别元件。转换器是生物传感器中的基本元件，它经常可以单独作为一个电化学传感器 或物理传感器存在。信号转换器主要有电化学器件，如0 2 、h ：o ：、p h 等各种电极及半 导体、离子敏场效应管i s f e t 等；光学器件，如光纤传感器、光敏二级管、表面等离子 体谐振器件等：压电声波器件，如声表面( s a w ) 器件、石英品振( q c m ) 器件及热敏器件 如热敏电阻等。当转换器什为电化学器件时，所得传感器为电化学生物传感器。它是利 j i j 电化学反应进行信号转换而制成的，所测量的参数是两个电极之间的电位、电导或电 流，通常分为电位型、电导型和电流型。电位型传感器是对溶液中电极电位的测量，根 据能斯特公式，电位与电活性物质的浓度的对数成比例。离子选择性电极和离子敏场效 应晶体管是典型的电位型传感器。电导型传感器是测量溶液中两电极之问的电导，测量 时电极j ：力l l 有小的交流电位，避免电极的极化，溶液中离子浓度的变化可以检测到电导 的变化。电流型传感器是基1 ：测量在溶液巾由电极组成的电化学反应池中电流电压的关 系，当传感器加上一个电压时，产生的电流值与电活性物质的浓度成一定的比例关系， 电流型传感器是目前较为成熟和研究比较广泛的一种生物传感器。生物传感器构造中最 主要的一个部分是生物识别元件，也就是固定了生物活性物质的功能膜，而要制备理想 的功能膜，取决于两方面的因素：固定化方法及理想的载体。目前，用于固定生物活性 材料的载体种类繁多，常用的载体有玻璃( 包括硅藻凝胶、硅胶、石英和多孔玻璃微球等) 、 纤维素、琼脂糖、高分子聚合物( 包括聚乙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚乙 _ 二醇、聚乙烯醇、聚丙烯酸酯、尼龙等) 、离了交换膜、渗析膜、壳聚糖、牛血清蛋白等 1 6 。其中壳柴糖( c h i t o s a n ) ，又名脱乙酰甲壳素，学名为i ( 1 ，4 ) 2 氨基2 脱氧d 一葡聚糖1 1 7 i ， 是由甲壳素经脱乙酰化反应后得到的一种生物高分子物质。1 8 1 1 年，甲壳素被法国的 b r a c o n n o t 发现，1 8 2 3 年法国的o d i e r 将其命名为“甲壳素”。1 8 5 9 年，法国的r o u g e t 发现将甲壳素放入浓k o h 溶液中煮沸，洗净后可溶于有机酸中，1 8 9 4 年，h o p p e s e l e r 聊城大学硕士学位论文 将其命名为“壳聚糖”。甲壳素广泛存在于节肢动物的翅膀和外壳中，以及真菌和藻类 的细胞壁中，地球上存在的天然有机化合物中，甲壳素数量仅次j i 纤维素，每年生物合 成的甲壳素将近1 0 0 亿吨1 8 1 。1 9 9 4 年首次报道壳聚糖用于修饰电极，自此以后，壳聚糖 作为膜材料在修饰电极和生物传感器的制备中逐渐引起人们重视。 1 2 开展本研究的意义及目的 生物传感器结合了生物技术，材料技术，纳米技术，微电子技术等，是一门交叉学 科的研究与应用技术，也是当今科学发展的前沿，引起世界各国的重大关注。生物传感 器具有灵敏度高、选择性好、测定简便迅速、可微型化、便j 二携带、可现场检测等优点， 因而在生物医学、环境检测、食品、医药及军事医学等领域有着重要应用价值。 在生物传感器的制备中，固定载体的选择尤为重要。经过查阅大量的文献资料，了 解到壳聚糖及其衍生物作为膜材料在化学修饰电极和生物传感器的制备方面得到厂泛 应用，是一种很有发展潜力的生物高分子材料。本课题拟以壳聚糖为基础材料制备用于 固定酶的复合膜，进而制备性能较好的电流型酶传感器，希望此工作能为生物电分析化 学提供一种分析手段，丰富电化学酶传感器的内容。 1 3 壳聚糖作为固定化载体制备生物传感器的研究 1 3 1 壳聚糖作为酶固定化材料的优势 壳聚糖是生物界中大量存在的唯一的一种碱性多糖，壳聚糖膜是一种网状载体，作 为膜材料具有以下优点： ( 1 ) 对酶蛋白具有较强的亲和力，含有可以和酶发生作用的活性功能团并易于化 学修饰。 ( 2 ) 具有较好的亲水性和机械强度。 ( 3 ) 有良好的生物相容性、渗透性。 ( 4 ) 无毒、可生物降解。 ( 5 ) 分子中存在的大量氨基，可络合金属离子和其它有机物质，使酶免受金属离 子的抑制和有机物的毒害。 ( 6 ) 资源丰富、价格低廉。 4 聊城大学硕士学位论文 ( 7 ) 壳聚糖可以与无机物或者有机物在电极上形成多层膜或复合膜，从而改变或 者改善聚合物膜的稳定性，提高其灵敏度或者赋予其特殊的性能。 目前已成功的在壳聚糖上固定了葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶、磷酸酶、淀粉酶、 天门冬氨酸酶及纤维素酶等十几种酶，独特的性能使壳聚糖可以作为载体用于制备生物 传感器。 1 3 2 壳聚糖类生物传感器的制备 1 3 2 1 壳聚糖载体的形式 壳聚糖作为载体制备生物传感器可分为两种形式：一是纯壳聚糖膜为载体，壳聚糖 溶于稀的盐酸、硝酸等无机酸和大多数的有机酸，溶剂挥发后成膜，最常见的是溶r 稀 醋酸溶液。另一一种形式为壳聚糖与其它物质组成的复合膜。壳聚糖可以与聚乙烯醇、聚 乙一：醇、海藻酸钠、醋酸纤维、尼龙、聚丙烯酰胺、羧甲基纤维素等有机高分子物质组 成复合膜。也可与四甲氧基硅烷( t m o s ) 、四乙氧基硅烷( t e o s ) 、甲基三甲氧基硅烷 ( m t o s ，m t m o s ) 、a p d m o s 等无机硅烷材料组成复合膜。壳聚糖作为载体，一般需 交联剂的存在。交联剂为双功能团物质，有戊二醛、环氧氯丙烷等，其中最常用的交联 剂为戊二醛溶液。 1 3 2 2 传感器所片j 电子媒介休 壳聚糖作为载体制备生物传感器，一般需固定电活性物质作为媒介体在电极与酶活 性中心问传递电子。常用媒介体有：二茂铁及其衍生物、亚甲基蓝等各种染料、锇络合 物、钌络合物、四硫富瓦烯及其衍生物、醌类物质、酞菁、亚钬氰化物等，其中具有不 同功能的一茂铁衍生物尤其引人注目。 i 3 2 3 所用基体电极 壳聚糖制备生物传感器所需基体电极有：玻碳电极、铂电极、金电极、碳糊电极， 石墨电极等。 制备传感器的过程中，生物活性物质的固定化方式，交联剂和媒介体的浓度，支持 电解质的种类及其浓度，所用电极材料等因素都对传感器的性能具有很大影响。而且壳 聚糖的醋酸溶液若长时问放置或在超声的情况下，壳聚糖长链将逐渐降解，溶液粘度下 聊城大学硕士学位论文 降，所以在制各过程中应特别注意。 1 3 3 有关甲壳素、壳聚糖作为载体制各生物传感器的文献： 载体活性物质基体应用文献 壳聚糖t e o s 复合 辣根过氧化物a u 电极过氧化氢生物传感器【9 j 膜 酶( h r p l 壳聚糖m t o s 复合 葡萄糖氧化酶 电沉积普鲁葡萄糖生物传感器 【1 0 】 膜( g o d ) 士蓝( p b ) 的 g c e 壳聚糖硅钨酸麻黄碱 i s f e t 分析麻黄碱片剂含量【1 1 】 丁酰壳聚糖丙烯酰h r pa u 电极检测过氧化氢1 1 2 1 氧基丙基二甲氧基 硅烷 壳聚糖m t o s g o d p b ，g c e 葡萄糖生物传感器1 1 3 】 n a f i o n 壳聚糖g o dp t 电极葡萄糖生物传感器【1 4 j 壳聚糖凝胶g o dg c e葡萄糖生物传感器1 1 5 l 壳聚糖p t a a有机磷水解酶石英片检测对氧磷 【1 6 j 壳聚糖a y 9g o dp t 电极测定葡萄糖【1 7 】 壳聚糖 h r p 鲁米诺测定h 2 0 2【1 8 】 阴离子 交换树 脂 壳聚糖酪氨酸酶g c e检测样品中的酚 【1 9 】 壳聚糖庚二酸 压电石英晶制作三甲胺探针，检测【2 0 】 体鱼的鲜度 壳聚糖 脲酶 氨离子选择尿素生物传感器，测m【2 1 】 电极 清中的尿素 聊城大学硕士学位论文 壳聚糖g o d氧电极 检测葡萄糖浓度1 2 2 】 壳聚糖t e o s 复合 h r pa u 电极 h 2 0 2 生物传感器 1 2 3 】 膜 壳聚糖接枝聚苯胺g o dp t 电极葡萄糖生物传感器 【2 4 1 壳聚糖乳酸氧化酶p t 电极生物传感器1 2 5 】 壳聚糖 h r p 碳糊电极h 2 0 2 传感器1 2 6 i 壳聚糖t m o s h r p 碳糊电极h 2 0 2 传感器 1 2 7 l 壳聚糖s s d n ag c e检测其互补s s d n a 1 2 8 l 壳聚糖核酸 碳糊电极核酸传感器1 2 9 】 壳聚糖a p d m o s h r pa u 电极 h 2 0 ：传感器，【3 0 j 壳聚糖蔗糖异构酶g c e监测溶液中蔗糖浓度 【3 1j z r 0 2 壳聚糖n a t i o ng o dp t 电极h 2 0 2 传感器，酶的活性1 3 2 l 比交联酶提高