（微生物与生化药学专业论文）放线菌共培养效应及活性产物诱导的研究.pdf

摘要 放线菌共培养效应及活性产物诱导的研究 摘要 放线菌，尤其是链霉菌，是天然活性物质与药物的重要微生物资 源，是研究微生物生长、发育和次生代谢功能的良好材料。由于其复 杂的形态、独特的代谢途径及次生代谢产物的多样性，放线菌已成为 人们关注和研究的重点对象，显示了放线菌在科学、经济以及社会领 域巨大的研究价值。 本文为探讨共培养对放线菌产生活性次生代谢产物的影响并利 用这一策略诱导筛选活性次生代谢产物。对选取的4 0 株不同来源的 放线菌菌株进行了发酵液的抗菌活性筛选，并测定了活性较好的菌株 发酵液脂溶性提取物的抗菌活性。结合h p l c p d a 分析，研究了其中 2 2 株放线菌的单培养及其与枯草芽孢杆菌的共培养发酵代谢产物的 h p l c 图谱差异，发现f x j 2 0 1 4 、f x j l 2 9 6 、a s4 1 2 5 2 三株菌与枯 草芽孢杆菌共培养时产生其在相同条件下单培养时没有的物质。 本文在共培养试验的基础上选取了抗菌活性较好的菌株 f x j 2 01 4 进一步研究其活性代谢产物。对f x j 2 0 1 4 进行放大单培养 与共培养，并分别提取及分离其活性代谢产物，发现f x j 2 0 1 4 单培 养时主要产生的活性产物为f x j 2 0 1 4 3 ，经紫外光谱、质谱、核磁共 振谱分析鉴定为醌霉素a ；f x j 2 0 1 4 与枯草芽孢杆菌共培养时，活性 产物中除了醌霉素a 成分外，还产生了另一活性物质f x j 2 0 1 4 h b ， 经紫外光谱、质谱分析以及与醌霉素a 性质比较，推测为醌霉素a 的结构类似物。 进一步对活性产物醌霉素a 与f x j 2 0 1 4 h b 的抗菌、抗肿瘤活 北京化工人学硕士学位论文 性分析与测定，结果表明两者的生物活性有较显著的差异，且两者的 抗菌谱也明显不同。醌霉素a 因细胞毒性较大，其临床应用受到了 限制，而f x j 2 0 1 4 h b 对多种肿瘤细胞系的抑制活性则普遍弱于醌霉 素a ，为有潜力的细胞毒性较小的抗肿瘤抗生素。可见共培养诱导产 生的活性物质f x j 2 0 1 4 h b 为临床上进一步筛选高效，低毒，有潜力 的抗肿瘤抗生素提供了良好的化合物基础。 由于抗生素的广泛及长期应用，细菌对抗生素的耐药性问题日益 严重，因此迫切需要进一步发现和开发新型、高效、低毒的抗耐药菌 抗生素。作为一种很有潜力的发掘新抗生素的途径，共培养诱导方法 为现有微生物资源的开发与利用揭示了新思路。 关键词：放线菌，链霉菌，枯草芽孢杆菌，共培养，活性产物诱 导，醌霉素a i l s t u d yo ne f f e c to fa c t i n o m ? y c e t e c o c u l t u r ea n di n d u c t i o n o fb i o a c t i v e p r o d u c t s a b s t r a c t a c t i n o m y c e t e s ，e s p e c i a l l ys t r e p t o m y c e t e s a r et h em a i nm i c r o b i a l s o u r c eo fb i o a c t i v en a t u r a ls u b s t a n c ea n dd r u g s ，a n da r ec o n s t a n t l yu s e d a s t y p i c a lb i o l o g i c a l m a t e r i a l sf o r s t u d y i n g m i c r o b i a l g r o w t h ， d e v e l o p m e n ta n ds e c o n d a r ym e t a b o l i cf u n c t i o n s w i t hi t sc o m p l i c a t e d m o r p h o l o g y , d i s t i n c t i v e m e t a b o l i c p a t h w a y sa n dd i v e r s es e c o n d a r y m e t a b o l i t e s ，a c t i n o m y c e t e sh a v eb e e nt h ek e yo b je c to fa t t e n t i o na n d r e s e a r c h ，s h o w i n gi t si m m e n s ev a l u ei nt h ef i e l d so fs c i e n c e ，e c o n o m y a n ds o c i e t y t oe x p l o r et h ee f f e c to fc o c u l t u r i n ga c t i n o m y c e t e sw i t hb a c i l l u s s u b t i l i so nt h ep r o d u c t i o no fb i o a c t i v es e c o n d a r ym e t a b o l i t e sa n ds c r e e n b i o a c t i v es e c o n d a r ym e t a b o l i t e sf r o ma c t i n o m y c e t es t r a i n s ，a n t i b a c t e r i a l a c t i v i t yo ff e r m e n t a t i o nl i q u o ra n df e r m e n t a t i o ne x t r a c t sw h i c hh a v eg o o d a n t i b a c t e r i a la c t i v i t yf r o m4 0a c t i n o m y c e t es t r a i n so fd i f f e r e n ts o u r c e s w e r es t u d i e d w ea l s os t u d i e dt h eh p l cs p e c t r o g r a md i f f e r e n c e sb e t w e e n t h ef e r m e n t a t i o np r o d u c t so fm o n o c u l t u r e sa n dc o r r e s p o n d i n gc o c u l t u r e s o f 2 2a c t i n o m y c e t e ss t r a i n sb yh p l c - p d a a n a l y s i s ，a n df o u n da d d i t i o n a l m e t a b o l i t e si nt h ef e r m e n t a t i o ne x t r a c t so fc o c u l t u r e so fs t r a i n sf x j 2 014 ， f x j1 2 9 6a n da s4 12 5 2r e s p e c t i v e l yw i t hb s u b t i l i s ，w h i c hw e r en o t f o u n di nm o n o c u l t u r eo ft h e mi nt h es a m ec o n d i t i o n s s t r e p t o m y c e ss t r a i nf x j 2 0 14w i t hh i g hb i o a c t i v i t yw a ss e l e c t e df o r 北京化工大学硕士学位论文 f u r t h e ra n a l y s i so fi t sb i o a c t i v em e t a b o l i t e si nc o c u l t u r e s b ya m p l i f i e d m o n o c u l t u r ea n dc o c u l t u r eo fs t r a i nf x j 2 014 ，e x t r a c t i o na n ds e p a r a t i o n o fb i o a c t i v em e t a b o l i t e s ，w ef o u n dt h em o n o c u l t u r eo fs t r a i nf x j 2 014 m a i n l yp r o d u c e d f x j 2 01 4 - 3a st h eb i o a c t i v em e t a b o l i t e b yu v e s i - m sa n dn m r a n a l y s i s ，f x j 2 0 14 3w a si d e n t i f i e da sq u i n o m y c i na w h i l et h ec o c u l t u r eo fs t r a i nf x j 2 。014w i t hb s u b t i l i sp r o d u c e dan e w c o m p o n e n tn a m e df x j 2 0 14 - h bo t h e rt h a nq u i n o m y c i na b y 吣 e s i - m sa n a l y s i sa n dc o m p a r i s o nw i t hq u i n o m y c i na ，f x j 2 014 一h bw a s i d e n t i f i e da saq u i n o m y c i na l i k ec o m p o u n d f u a h e ra n a l y s i sa n da s s a yo fa n t i m i c r o b i a la n da n t i t u m o ra c t i v i t i e so f f x j 2 014 一h ba n dq u i n o m y c i nai n d i c a t e dt h a tt h e yh a ds i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e si nt e r m so fb i o a c t i v i t ya n da n t i b a c t e r i a ls p e c t r u m t h ec l i n i c a l a p p l i c a t i o no fq u i n o m y c i na i sl i m i t e db e c a u s eo fi t sh i 曲c e l lt o x i c i t y w h i l et h ei n h i b i t o r ya c t i v i t yo ff x j 2 014 - h bt oav a r i e t yo ft u m o rc e l l l i n e sw a sw e a k e rt h a nq u i n o m y c i na ，i n d i c a t i n gi t sp o t e n t i a lt ob ea n a n t i t u m o ra n t i b i o t i cw i t hl o wc e l lt o x i c i t y s of x j 2 01 4 一h bi n d u c e db y c o c u l t u r ep r o v i d e sag o o dc o m p o u n db a s i sf o rf u r t h e rs c r e e n i n go f c l i n i c a l l ye f f i c i e n t ，l o wt o x i ca n dp o t e n t i a la n t i t u m o ra n t i b i o t i c s d u et ot h ee x t e n s i v ea n dp r o l o n g e du s eo fa n t i b i o t i c s ，t h ep r o b l e mo f b a c t e r i a lr e s i s t a n c et oa n t i b i o t i c sh a sb e c o m em o r ea n dm o r es e r i o u s ， h e n c ei ti su r g e n tt od i s c o v e ra n de x p l o i ta n t i r e s i s t a n ta n t i b i o t i c so fn o v e l t y p e ，h i g he f f i c i e n c ya n dl o wt o x i c i t y a sap r o m i s i n gw a yt od i s c o v e r n e wa n t i b i o t i c s ，c o c u l t u r ei n d u c t i o nm e t h o dr e v e a l san e wi d e af o rt h e d e v e l o p m e n ta n du t i l i z a t i o no fe x i s t i n gm i c r o b i a lr e s o u r c e s k e y w o r d s ：a c t i n o m y c e t e s ，s t r e p t o m y c e s ，b a c i l l u ss u b t i l i s ，c o c u l t u r e ， b i o a c t i v ep r o d u c ti n d u c t i o n ，q u i n o m y c i na 符号说明 i h p l c p d a e s i - m s n m r u v r t t l c b s c a e c s a m d r m r s a m d r e c m d r p a v c m g k p i c 5 0 c g m c c 符号说明 链霉菌素培养基 高效液相色谱 光电二极管阵列检测器 电喷雾质谱 核磁共振技术 紫外光谱 保留时间 薄层层析法 枯草芽孢杆菌 白色念珠菌 大肠杆菌 金黄色葡萄球菌 多药耐药性 耐药金黄色葡萄球菌 耐药大肠杆菌 耐药铜绿假单胞菌 霍乱弧菌 浅黄分枝杆菌 肺炎克雷伯氏菌 半抑制浓度 中国普通微生物菌种保藏管理中心 v n 北京化工大学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本 论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文 的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本 人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 作者签名：盔，羔日期： 关于论文使用授权的说明 湘| 镑b s 学位论文作者完全了解北京化工大学有关保留和使用学位论文 的规定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属北 京化工大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印 件和磁盘，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全 部或部分内容，可以允许采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编 学位论文。 保密论文注释：本学位论文属于保密范围，在上年解密后适用 本授权书。非保密论文注释：本学位论文不属于保密范围，适用本授 权书。 作者签名：叠) 宝日期：趁f ! ：盘：支 导师签名：j 蚺日期：蛐也 第一e 绪论 第一童绪论 着巨大的利用价值，特别是在抗生紊以 圈1 之放线营孢于丝 及药物研发领域方面显示了巨大的科研 f i g l os p mh 坤h ao f a 曲锄y c “酋 和应用潜力。 1 1 放线菌活性天然产物研究进展 1 9 2 8 年f l e m i n g 发现青霉索以及1 9 4 5 年w 如m a r i 发现链霉索的研究成果相 继获得诺贝尔奖，进而推动丁抗生索研究在全世界范围内的广泛兴起。2 0 世纪 s 0 - 6 0 年代是抗生素研发的重要时期。这段时期内科学家从放线菌中发现了大量 北京亿t 大学确l 学位论卫 抗生素并投入工业化生产，成功治疗了大量临床传染性疾病。接着一些抗肿瘤、 抗病毒和其它的非抗生素物质在微生物中相继被发现。这些活性物质有7 0 y 一8 0 是由放线苗产生的，进一步显示了放线菌作为药物生产者的巨大研究价值( 图 1 3 ) 。 放线菌是活性天然产物与药物的 重要微生物资源。绝大多数放线苗都能 产生活性代谢产物，如抗生素、氨基酸、 有机酸、维生素、甾体、酶及酶抑制剂、 免疫调节剂等；放线苗是一类具有多种 实际用途和巨大经济价值的微生物资源 【2 】；到目前为止所发现的2 万余种微生物 来源的生物活性物质中，放线菌产生的 约占一半；而在获得实际应用的微生物 来源的生物活性物质中，7 0 以上来源 干放线茴，其中如蒽环类、b 内酰胺类、 圈i - 3 艘线龉次生代谢产物 f i g 1 4s e o o d a r y m e m b d l t 鹤 氨基塘苷类、氯霉索类、四环素娄和大环内酯类物质都具有巨大的经济和药物价 值。放线菌中以链霉菌产生的抗生素种类最为丰富占l 抗生素总数的7 0 以上， 另外小单孢菌、糖多孢苗、马杜拉苗和拟无枝菌酸苗等稀有放线菌也占有相当大 的比例。其次像分枝杆菌、棒杆菌与戈登氏菌等放线苗中存在多种与生物大分子 降解有关的酶类，可以降解环境中的大分子物质、芳香烃化合物以及有机磷农药 等，这些酶类在生物修复和环境保护中发挥着重要的作用。 表卜i 为各类微生物产生的生物活性物质的统计p 】。目前从微生物发现的抗 生素类活性物质约1 6 5 0 0 种，非抗生素类活性物质约6 0 0 0 种。放线茁产生的抗 生素类活性物质8 7 0 0 种，占抗生豢类物质总数5 3 ：其中链霉菌属产生8 3 6 6 种，占全部抗生素类物质的5 1 ，是任何其它种属放线茁无法比拟的；放线菌产 生的非抗生素话性物质有t 4 0 0 种，占全部非抗生索活性物质的2 3 【三【上。 表i - i 微生物产生的生物活性物质 t h b l e i - i b i o a c f i v es u b s t a c c f r o r a m i c r o b e s 来源 抗生素非抗生襄活性物质总教 细苗 真细菌 芽抱杆菌属 假单抱茁属 2 9 0 0 2 1 7 0 7 9 5 6 l o 9 0 0 5 8 0 6 5 3 8 0 0 2 7 5 0 8 6 0 7 鲇 第一章绪论 粘细菌 篮细菌 放线菌 链霉菌属 稀有放线菌 真菌 小型真菌 青霉菌属曲霉菌属 担子菌 酵毋 蘑菇 总数 在放线茵产生的所有生物活性物质中，链霉菌科共产生8 3 6 6 种4 】；小单孢 茵科共产生1 0 5 9 种；假诺卡氏菌科共产生3 6 7 种；诺卡氏菌科共产生3 7 0 种； 束丝放线菌科共产生11 9 种；链孢囊菌科共产生1 9 2 种；高温单孢菌科共产生 3 7 5 种：放线细菌科共产生1 1 3 种；拟诺卡氏菌科共产生4 1 种；其它放线菌共 产生1 8 0 种( 表1 2 ) 。 表1 2 各类放线菌产生的生物活性物质及比例 t a b l e1 - 2b i o a c t i v es u b s t a n c e sf r o ma c t i n o m y c e t e s 值得特别强调的是，从微生物中发现的2 2 5 0 0 多种生物活性物质中，得到 应用只有1 4 0 1 7 0 种，不到总数的1 ，可见研发难度极大，工作也异常艰巨。 在细菌产生2 9 0 0 种生物活性物质中，只有1 0 - 1 2 种应用在临床与农业领域，占 o 0 砌 弛；晕 如铂帅 o 砌 们 枷 圳 硎 蝴 测 ：舍 嗍 剃 m 必 oo，0 m 鲫 m m 趁 拍 蛾 鳄 强 加 瑚 渤 拗 啪 m 啪 咖 晒 。 刚 4 3 8 6 2 4 3 “ l 1 3 l 北京化工大学硕上学位论文 应用总数的8 1 0 。在真菌产生的8 6 0 0 种活性物质中，只有3 0 3 5 种得到应用， 占应用总数的1 3 1 5 。而在放线菌产生的1 0 1 0 0 种活性物质中，得到应用的 多达1 0 0 1 2 0 种，占应用总数的7 0 7 5 之多。因此，可以看出放线菌是开发抗 生素药物潜力最大的微生物资源【5 】。 放线菌产生的次生代谢产物具有及其丰富的生物活性多样性和结构多样性。 其中多烯、大环内酯、氨基糖葱环类抗生素每类至少都有4 0 0 5 0 0 种不同的化合 物【6 】。聚醚类抗生素有将近2 5 0 种，链丝菌素类、新生霉素糖芳类、类棘霉素肤 类、放线菌素类每类各有8 0 1 2 0 种，戊二酞亚胺类、e l f a m y d n 类、o r t h o s o m y c i n 类每类各有5 0 - 6 0 种。稀有放线菌产生的糖肽类抗生素有1 2 0 余种。来源于放线 菌的1 8 6 0 元大环聚内脂的衍生物就有1 0 0 0 种之多。其次还有苯并醌类的衍生 物2 0 0 种、安沙内酯衍生物1 5 0 种、硫链丝菌噻唑基肤类1 4 0 种、b e n z d i a z e p i n e 6 0 种、多环内酯4 0 种、四环素类4 0 种均是由放线菌产生的。 放线菌中总类最大最丰富的链霉菌可产生多种次生代谢产物，包括水解酶与 抗生素等物质，其在医药、饲料添加剂等领域有广泛的应用，而且在植物保护方 面发挥了相当大的作用。链霉菌基因组是目前己知的最大的原核生物基因组，其 基因组染色体呈线状，而且具有复杂的结构。基因组中g c 含量平均为7 3 。天 蓝色链霉菌假c o e l i c o l o r ) 作为链霉菌属的典型代表种，其全基因组序列已于2 0 0 1 年7 月在英国剑桥s a n g e r 中心测序完成【7 1 ，这是第一个完成的全基因组测序的链 霉菌，也是第一个完成全基因组测序的放线菌。目前己完成全基因组测序的链霉 菌还有阿维链霉菌( s a v e r m i t i l i s ) 8 1 、灰色链霉菌( s g r i s e u s ) 9 1 、诺尔斯氏链霉菌假 n o u r s e i ) 、波塞链霉菌( s p e u e e t i u s ) 、疮痂链霉菌( s s c a b i e s ) 、生二素链霉菌 ( s a m b o f a c i e n s ) 等，随着越来越多的基因组序列数据的不断补充，链霉菌基因组 的研究将进一步深入。天蓝色链霉菌基 因组全长8 6 7m b ，共7 8 2 5 个开放阅读 框架( o r e s ) ，基因平均长度为9 9 1 b p ，编 码密度约为8 8 9 ，比真核酿酒酵母 ( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s a i e ) 的基因组( 约 6 2 0 0 个o r f s ) 还要大，其大小约为原核 生物大肠杆菌( e c o l i ) 的两倍。在同属的 阿维链霉菌染色体则长达9m b 以上，至 少含有7 5 7 3 个开放阅读框架，基因平均 长度为8 9 8 b p ，编码密度约为7 9 1 7 j 。 链霉菌基因组中含有丰富的次生代 图l - 4 放线菌天然产物基因簇 f i g 1 - 4b i o s y n t h e t i cg e n ec l u s t e r s 谢物生物合成基因簇( 图1 - 4 ) 。根据链霉菌全基因组分析显示，其所编码的次生 4 第章绪论 代谢途径远远多于我们目前己知的，并且某一特定次生代谢途径相关的基因通常 以基因簇【1 0 】的形式存在线状染色体上，只有个别基因簇存在质粒上【l l 】。天蓝色 链霉菌基因组中共有2 3 个基因簇参与次生代谢产物的形成，约占其基因组总量 的5 t 1 2 】，阿维链霉菌中有3 0 个次生代谢生物合成基因簇，约占全基因组总量 的6 6 t 引。链霉菌基因组含有丰富的编码调控蛋白的基因，例如在天蓝色链霉菌 基因组中有9 6 5 种编码蛋白的基因参与遗传调节，约占全基因组总量的1 2 3 t 1 2 】。 链霉菌这种特殊的基因组组成特点是与其生存在高度竞争的土壤环境相适应的， 其基因组富含编码调控蛋白的基因有利于其感应各种环境信号和生理信息并作 出相应的反应，从而行使各种复杂生理功能，进而能在具有高度竞争的土壤环境 中得以良好生存。 1 2 微生物天然活性物质筛选技术的新趋势 天然产物是药物的重要来源。自1 9 8 1 年以来，新报道的新化学实体中多于 4 0 来源于微生物的天然产物1 1 3 , 1 4 。更令人关注的是，现今在临床中使用的多于 6 0 的抗肿瘤药物和多于7 0 的抗生素药物都是天然产物或以天然产物为基础 合成的的衍生物。抗生素作为天然产物的重要组成部分，在过去的几十年中，抗 生素在治疗微生物感染性疾病方面起到相当重要的作用。但是随着抗生素在临床 治疗上的广泛应用，一些对药物具有抗性的病原微生物相继出现，如链球菌、葡 萄球菌、结核分支杆菌等，尤其在现今携带h i v a i d s 的病例不断涌现的前提下， 这些病原微生物的出现对现有的医药体系提出了严峻挑战，迫切要求人们进一步 寻找出更多、更高效的抗生素药物。 微生物活性物质筛选的传统方法的基础是进行微生物分离，以获得纯培养， 其研究流程主要包括微生物分离纯化、大量培养、活性检测、活性物质的分离纯 化直至最后的开发与利用。然而这种做法的缺点在于：首先，现在已知的微生物 中有很多天然产物生物合成基因簇在普通实验室条件下一般不表达f ”，】6 】，比如， 有学者对6 0 株放线菌菌株进行全基因组序列分析，发现次生代谢产物生物合成 基因簇约有7 0 0 个，这说明每个放线菌菌株平均具有十几个次生代谢产物生物合 成基因簇，这个数字远远超过了其利用传统的筛选方法所获得的天然产物的数 量；其次，即使这些天然产物在实验室条件下可以表达，其表达量可能低于传统 检测的限度；尤其重要的是，利用传统方法进行生物活性物质筛选时所造成的重 复发现，使得此方法更为低效。 鉴于天然产物筛选技术的重要性以及传统筛选技术方法的低效，人们一直在 寻找更为快速、高效的发现新天然产物的途径。近些年，基于新发现的菌种很可 能产生新化合物的假设，不断有人尝试利用可以提高分离放线菌或其他分离菌株 5 北京化工大学硕 ：学位论文 数量的选择性培养基以及新的培养生境来获得新的菌株以及其产生的新天然产 物【1 7 , 1 8 】；由于部分放线菌在实验室条件下无法生长或无法表达次生代谢产物生物 合成基因簇，也有部分学者利用宏基因组学技术以及产抗基因簇的异源表达来获 得新天然产物【1 9 1 。尽管这些方法都在研究新天然产物的筛选过程中产生了重大影 响，但是其筛选效率还是远低于人们的期望。 微生物中这些未被开发的资源迫切需要一种新的方法来得以开发和利用。近 年来基于结构相似的次生代谢产物的生物合成基因簇也有一定程度相似性的假 设【2 0 1 ，基因筛选技术成为寻找新化合物的研究热点【2 1 1 。通过将特定基因作为筛 选标记，可以在基因水平上重新评估相应菌株的生物活性物质产生能力，从而筛 选到在初始条件下菌株低表达或不表达的活性物质；另一方面，通过对基因筛选 所获得的次生代谢产物生物合成相关基因( 簇) 进行生物信息学分析，可以初步 预测其产物结构，在一定程度上避免化合物的重复发现田】。这种革命性的新思路 改变了人们对于药物开发的传统观念，增加了人们对于天然产物作为药物来源的 信心。 常规的抗生素的筛选步骤一般包括以下3 个方面：1 ) 分离和培养微生物；2 ) 抗生素检测；3 ) 抗生素物质的化学分析及结构鉴定【2 3 1 。以前抗生素的筛选流程 一般是采用常规的工厂式操作，科学家在筛选抗生素中往往依据生产菌株的形 态学指标与抗菌谱筛选先分离出各种链霉菌菌株，然后用来生产抗生素，以及 作为潜在的产生新的抗生素的候选者，然后提纯抗生素物质，接着进一步对其 进行化学描述和结构鉴定。但是，随着抗生素总量的不断积累，新的抗生素的 发现已变得越来越困难。因此，革新和变化抗生素的筛选方法势在必行。 1 2 1 改进培养基或条件筛选新抗生素 链霉菌是抗生素产生最丰富最多的放线菌种属，长期以来一直被开发各种用 途的抗生素，随着天然产物化学和病理学研究的不断深入，人们从链霉菌中逐渐 发现的生物活性物质除了抗生素外，还有酶制剂、免疫调节物质、药理活性物质、 抗菌剂、植物生长调节剂、杀虫杀螨和除草剂等多种物质。随着抗生素数量的不 断增加，从链霉菌中筛选到的新抗生素就变得越来越困难，筛选得到的化学物质 重复率非常高。然而这并不意味着链霉菌中可发掘的资源没有了，根据天然产物 趋势推测【2 4 】，链霉菌中还存在大量未知的抗生素有待进一步挖掘。这需要科研人 员运用特殊的培养基以及特殊的培养条件来挖掘这些未知的抗生素基因资源，据 报道，当研究放线菌在贫营养( 寡营养) 培养与富营养培养的条件下培养时，日 本学者从中发现了一种新抗生素除疟霉素( a p l a s m o i n y c i n ) 【2 5 l 。该放线菌在富培养 条件下并不能产生a p l a s m o m y c i n ，但在正常培养基下被稀释了1 6 倍的贫营养( 寡 6 第一章绪论 营养) 培养基中却能产生此抗生素。 1 2 2 利用海洋微生物筛选新抗生素 海洋中存在种类极其丰富的微生物，海洋微生物主要包括海洋细菌，海洋放 线菌以及海洋真菌，其种类约为陆生微生物的2 0 倍以上【2 6 】。海洋微生物由于其特 殊的生境( 高盐、高压、低温、寡营养与低光照) ，能够合成一些陆生微生物很 少见的结构独特且新颖的抗生素。1 9 8 0 年至u 1 9 8 4 年的5 年间全世界所报道的微生 物来源的新化合物与1 9 8 8 年至u 1 9 9 2 年5 年间的报道相比，来源于陆生链霉菌的新 化合物由原来的的7 4 7 下降到5 0 5 ；与之相反，来源于海洋微生物产生的新 化合物在1 9 8 0 1 9 8 4 的5 年间报道极少，在1 9 8 8 1 9 9 2 年的这5 年间却上升到 1 2 7 【2 3 1 。海绵是富集海洋微生物的一种特殊生境，因此从海绵微生物中筛选新 抗生素具有相当大的潜在研究价值。 1 2 3 从极端环境微生物中筛选新抗生素 随着人类对自然环境的不断探索和发现，极端环境微生物逐渐被认为是新抗 生素的宝贵来源之一，尽管极端环境微生物产生的抗生素相对较少。但其能够产 生丰富多样的化学物质，虽然大部分通常无明显的生理作用，但有时从中也可以 发现几个具有高生物活性的物质。事实上，这种能够产生多样化化学物质的能力 在一定程度上肯定能够提高微生物产生稀有化合物的几率，即筛选新抗生素的几 率。一些学者认为嗜盐微生物产生抗生素的能力一般高于其它来源的极端环境微 生物，可见嗜盐微生物在筛选新抗生素中的潜力。 1 2 4 激活沉默基因筛选新抗生素 沉默基因是指在自然条件下存在于生物体中的一般不表达或以极低水平表 达，并在某些特定条件下可被激活从而得到表达产生活性产物的d n a 序列【2 7 】。 h o p w o o d 【2 s 】在1 9 8 0 年初提出通过诱变处理、基因克隆、原生质体融合、菌株或 种间自然接合等方法可以激活某些沉默的抗生素相关基因，从而在获取新抗生素 和新活性物质的策略中又多了一条途径。 链霉菌p g a 6 4 正常生长情况下一般不产生角环素类抗生素，然而其突变株 p g a 6 4 r 4 却能产生此类抗生素。k e t e l a 等t 2 9 】分别对两个菌株中包括飓口a ，b ，c ， d ，f ，l 在内的连蜘基因序列以及代谢产物进行比对，结果表g , , 日p g a y 是使角 环素类抗生素基因簇处于沉默状态的沉默基因，下游的p g a a ，b ，g ，d ，f ，l 7 北京化工大学硕二 ：学位论文 基因由于p g a y 的存在而不能正常表达。该研究结果证明了运用遗传学手段可以 从链霉菌中获得通过传统培养方法无法得到的抗生素。 天蓝色链霉菌( s c o e l i c o l o r ) 与变铅青链霉菌假l i v i d a n s ) 亲缘关系较近，但通常 前者能产放线紫红素( a n t i n o r h o d i n ) ，而后者却不能产生。研究表明，变铅青链霉 菌也含有合成该抗生素的基因簇，然而其在通常条件下处于沉默表达状态。余贞 等【3 0 】在天蓝色链霉菌基因组中发现了一个特殊的基因n s d a ，它对天蓝色链霉菌 的形态分化以及抗生素合成均具有负调控作用的。通过阻断变铅青链霉菌的n s d a 基因可以使处于沉默状态的放线紫红素基因簇得到表达进而产生放线紫红素。 1 2 5 诱导微生物产生新的活性物质 放线菌中次级代谢产物几乎都是通过聚酮( p o l y k e t i d e ，p k s ) 途径和非核糖体 肽( n o n r i b o s o m a lp e p t i d e ，n r p s ) 途径合成的【3 l 】。e h 于实验室培养条件与微生物 实际生长的环境条件不同，因此很多微生物在实验室培养条件下并不表现出活 性，这就需要我们在实验室通过一些方法来诱导放线菌产生生物活性物质。 k u r o s a w a 等【3 2 l 利用链霉菌( 勋印幻叼懈p a d a n u s ) 与红球菌( r h o d o c o c c u s f a s c i a n s ) 共培养时发现了两种新的抗生素r h o d o s t r e p t o m y c i n sa 与b 。因此可见，共培养 诱导方法在筛选新抗生素的实践中具有一定的应用潜力。 1 3 放线菌活性天然物质的诱导及筛选技术 影响微生物生长与代谢的外部因素主要包括：营养、温度、p h 值、溶氧、 渗透压等诸多因素，根据最新的研究发现，微生物一般在生长环境不适于自身生 存的状态下会产生某些抗生素，比如营养缺乏，生长率降低等环境下会大量分泌 抗生素，有时自然环境状态下的微生物也会产生各种抗生素，既然常规的纯培养 不足使微生物产生抗生素，那么人们可以模拟自然状态下的微生物生长环境特点 来培养微生物，进而研究其所产活性次生代谢产物的状况和机制。 1 3 1 共培养诱导的优点 自然生态环境中不同微生物群体之间的相互作用主要有以下几种：如偏利作 用、互惠共生、协同作用、中立生活、寄生捕食、偏害作用、竞争作用等3 3 1 。 微生物及微生物技术已广泛应用于工业、农业、医药、环保等领域。但自然界中 许多重要的生化、代谢及分解过程仅仅依靠单种微生物通常不能完成，或只能微 弱作用进行，更多是则是依靠两种或多种微生物在共存的环境条件下，共荣、。共 8 第一章绪论 生以及共养来协同完成的。当前微生物的共培养已经取得了一些新的研究成果和 进展。 共培养在陆生微生物研究中已建立了一些研究方法，通过微生物菌株之间共 生互惠、协同或竞争等相互作用可以影响次生代谢产物的生产。然而共培养在海 洋微生物的开发利用中是一个被忽视的方法【3 4 1 ，尤其对于海绵这样复杂的微生态 体系，微生物菌株彼此之间的关系也非常复杂，从海绵中分离到的微生物可能更 易于在共培养条件下相互影响，并产生些菌株单培养时没有的次生代谢物质。 郭鹏飞掣3 5 】通过抗菌活性筛选，薄层层析显色以及生物自显影方法对来源于 海绵的十株放线菌在菌株单培养与共培养两种不同培养条件下，对其代谢产物的 活性与分布进行了相关研究，研究表明多数海绵相关菌株均能与h p - 0 5 3 相互作 用以实现菌株间共培养，并且能提高菌株的抗菌活性；这说明海绵来源的微生物 共培养时除了可以增强海绵相关微生物的生物活性，还可以产生新的活性代谢产 物。由于这十株菌均来自于海绵，因此该试验结果同时也验证了文献中的结论： 来自于同一环境的微生物比不同环境的微生物更易产生相互作用。从海绵相关微 生物菌株之间较强的相互作用，可以推测：海绵相关微生物之间可能更多的是通 过相互作用或与宿主海绵的相互作用共同来完成一些重要的代谢功能。因此，共 培养方法是一条重新开发和利用一些无活性或低活性菌株的新途径，是一种有效 的开发和利用海绵来源微生物的方法。 高学文掣3 6 】对苏云金芽孢杆菌b t l 和b t 2 菌株分别与枯草芽孢杆菌b s 5 5 和 b s 9 0 菌株在共培养条件下的菌体生长、杀虫活性物质伴孢晶体蛋白、抗菌活性 物质脂肽类化合物和的产生状况进行了研究。研究表明b t 与b s 5 5 共培养的菌 体生长及脂肽类化合物的产生与单独培养的b s 5 5 相似，可检测出b t 特异性蛋 白存在，但未检测到伴孢晶体蛋白；b t 与b s 9 0 共培养的菌体生长及脂肽类化合 物的产生与单独培养的b s 9 0 有较大差别，可检测出伴孢晶体蛋白存在。表明b t 与b s 可以共生，按一定方式组合培养时能产生各自的生物活性物质。 贾振华等【3 7 1 主要是将工程菌e c o l ix l l b l u e ( p k s a b c ) 与工程菌e c o l i x l l b l u e ( p k s s e 5 3 ) 一起共培养，p k s a b c 携带生产p ( 3 h b ) 基因，p k s s e 5 3 携带4 羟基丁酸辅酶a 转移酶和p h a 合成酶基因，培养基以葡萄糖为唯一碳 源，检测发酵产物中含有3 h b 和4 h b 的聚合物的状况。结果表明2 种工程菌混 合培养能产生强度更大与韧性更强的p h a ，其生物量占总生物量的4 4 4 。 维生素c 二步发酵法最早是由我国的中国科学院微生物研究所和北京制药 厂合作于7 0 年代初发明的【3 引，是目前唯一成功应用于维生素c 工业化生产的微 生物转化法。在维生素c 二步发酵工艺中，第一步为醇糖转化，即d 山梨醇在 葡糖杆菌作用下转化为l 广山梨糖；第二步为糖酸转化，【广山梨糖在普通生酮基 9 北京化工大学硕士学位论文 古龙酸菌( 俗称小菌) 与其伴生菌巨大芽孢杆菌( 俗称大菌) 组成的混合菌体系 的作用下转化为维生素c 的前体2 酮基l - 古龙酸( k g a ) p 9 】。在第二步混合菌 发酵中，有产酸菌氧化葡萄糖酸杆菌和巨大芽孢杆菌2 个菌株，二者生理代谢相 互关系非常复杂。魏东芝等t 4 0 利用静息细胞实验证明氧化葡萄糖酸杆菌中具有转 化【厂山梨糖生成2 酮基l 古龙酸的细胞酶活力，而伴生菌巨大芽孢杆菌则没有 产酸生物酶活力。深入研究发现，巨大芽孢杆菌胞外液能促进产酸菌产酸，伴生 菌胞内液主要促进产酸菌生长，一旦伴生菌形成芽孢菌体破裂，释放其胞内物质 能促进产酸茵产酸。研究表明混合菌发酵体系中l 山梨糖的消耗是产酸茵生长 代谢的结果，且伴生菌不能代谢利用l 山梨糖。l 山梨糖在氧化合成2 酮基l 古龙酸的同时也形成c q 和h 2 0 或其它副产物【4 l 】。 1 3 2 共培养技术中存在的主要难题 尽管微生物菌株之间的共培养在许多领域中已得到了应用，但对共培养体系 中菌株之间的相互关系以及作用机制的研究还不清楚。因此，目前筛选和组合具 有协同作用关系的菌株还是一个随机的过程，缺乏有效的文献作为参考，同时协 调菌株之间的关系，以达到最佳生态水平和发挥共培养最大效应是一个复杂且不 容易攻克的难题，目前对于共培养体系来说也不能有效的解决所有出现的问题 4 2 。因为共培养条件下的营养、氧化还原电位，p h 值、离子强度以及培养温度 等对混合菌种不都是最适生长条件，可能会导致各种菌株的生长速率不一致。经 过不断生长以及繁殖，混合菌群的种群、菌株的数量及比例会随生长速率不一致 而发生变化，菌株经多次传代后，最适生长的菌株必定成为优势菌株，某些菌株 由于生长条件限制，造成混合茵群各菌株数量以及比例的失调而最终影响其应用 4 3 j o 因此，共培养技术存在的这些难题严重地阻碍了共培养的发展和进一步应 用。只有从遗传、生理和代谢角度对混合培养体系中菌株之间相互关系以及协同 作用机制进行深入研究，共培养技术的理论和应用才能取得更大的突破。 1 4 本文的研究目的与内容 1 4 1 研究目的及意义 放线菌是产生诸多抗生素和其他生物活性物质的重要微生物资源，但随着大 量微生物次生代谢产物的分离，从自然界直接分离具有新结构、新活性化合物已 变得越来越困难，已知结构化合物分离的重复性相当高；另一方面，临床上病原 1 0 第一章绪论 微生物的耐药性问题日益严重，而且伴随着多耐药性、高耐药性病原菌以及艾滋 病、s a r s 、禽流感等新型疾病不断涌现，因此，如何充分利用已有的微生物资 源，诱导并筛选出新的微生物活性次生代谢产物，并开发出新的微生物药物已成 为微生物研究的重要方向。 另外，尽管放线菌能产生如此之多的活性次级代谢产物，但是从已知放线菌 中发现的活性物质还远远不够，据报道不足其实际存在数量的1 0 ，一个原因可 追究为目前研究的微生物次生代谢产物的筛选模型，传统的筛选模型一般是通过 富营养的纯培养发酵产生次级代谢，这种培养基的局限性容易造成活性代谢产物 的漏筛，另一个主要是次生代谢产物生物合成相关基因( 簇) 并非全部为组成型 表达，而是需要特殊胞外环境的诱导才能表达，然而目前微生物菌株发酵的培养 基大多是富营养型的，与自然界中存在的微生物菌株的实际生存环境存在很大差 异；而且人工培养大多是纯培养型，而自然界的微生物菌株却不