（基础兽医学专业论文）小鼠孤雌胚中细胞骨架的动态变化与作用.pdf

摘要 哺乳动物卵母细胞减数分裂成熟和受精是一个重要和复杂的过程，研究卵母细胞的孤雌 激活及其激活过程中细胞骨架组织和结构的动态变化将有助于加深对这一机制的认识。近年 来，有些关于孤雌激活胚胎中细胞骨架分布和作用的报道，但对于不同刺激激活的孤雌胚中 细胞骨架的动态性变化仍有待于更为系统的研究。目前，国内相关研究的报道很少。本实验 主要利用卵母细胞的乙醇激活、胚胎体外培养和免疫荧光细胞化学方法对小鼠卵母细胞乙醇 激活效率、影响因素、孤雌胚类型、发育、原核形成、迁移及早期胚胎卵裂过程中细胞骨架 的组装、作用等进行了系统的研究和分析，结果显示： ( 1 ) 小鼠卵母细胞的乙醇激活结果表明，随着乙醇浓度的升高和作用时间的延长，卵 母细胞激活率和发育率都显著提高，但乙醇浓度过高和作用时间过长会导致卵母 细胞碎裂率的显著增加，7 乙醇作用卵母细胞7 m i n 为最佳激活条件。随着卵龄 增加和温度的升高，卵母细胞激活率、发育率提高，碎裂率增加显著。卵匠细胞 对激活效果影响不大，性成熟小鼠卵母细胞激活效果较好。 ( 2 ) 随着h c g 注射后卵龄增加，卵母细胞第一极体退化比例逐渐上升，无第一极体 卵母细胞数量增加，但有无第一极体对小鼠卵母细胞孤雌激活率、发育率和碎裂 率影响不显著，且有无第一极体卵母细胞具有相同的细胞骨架动态分布规律。 ( 3 ) 免疫荧光细胞化学结果显示，m | i 期卵母细胞微管主要集中在减数分裂纺锤体 上，随着第二极体排出，纺锤体开始瓦解消失，形成富含微管的中体结构，连接 发生分裂的细胞，中体在细胞分裂完成后最终消失。原核形成后逐渐由胞质边缘 迁移到胞质中心。 ( 4 ) 不同发育时期的卵细胞中细胞皮层和极体中始终有微丝聚集。m i i 期卵母细胞 微丝主要集中在染色体所在的皮层区域，原核形成后微丝绕核重新聚集。极体排 出和第一次有丝分裂时微丝在卵裂沟处富集。 ( 5 ) 紫杉醇处理m i i 期卵母细胞时，纺锤体组装异常，胞质中出现大量胞质微管星 体染色体摊列异常，不能分离。洗脱药物后，激活的卵母细胞能够重新恢复减 数分裂，纺锤体重新组装，卵母细胞排出第二极体、形成原核。 实验表明，卵母细胞的孤雌激活受多种因素的影响，选择最佳的激活条件对孤雌激活效 果尤为重要。卵母细胞减数分裂恢复和孤雌激活过程中，细胞骨架的组织和结构发生了一系 列明显的变化，微丝和微管在减数分裂恢复、染色体运动、纺锤体形成、定位及旋转、极体 排放、原核的形成和迁移及早期胚胎卵裂等事件中均具有重要的调控作用。 关键词孤雌激活；乙醇；微管；微丝；紫杉醇 d y n a m i cc h a n g e sa n dr o l e so f t h ec y t o s k e l e t o n i nm o u s ep a r t h e n o t e s a b s t r a c t m e i o t i cm a t u r a t i o na n df e r t i l i z a t i o no fm a m m a l i a no o c y t e sj sa ni m p o r t a n ta n dc o m p l e x p r o c e s s ，t h es t u d i e so fo o e y t e sp a r t h e n o g e n e t i ca c t i v a t i o na n dt h ed y n a m i cc h a n g e so fc y t o s k e l e t o n d u r i n go o c y t e sa c t i v a t i o nw i l lm a k eu sg e tad e e p e ru n d e r s t a n d i n go f t h em e c h a n i s mo f t h i sp r o c e s s r e c e n ty e a r s ，t h e r ea r cs o m er e p o r t sa b o u tt h ec y t o s k e l e t a ld i s t r i b u t i o na n dr o l e so fp a r t h e n o t e s ，b u t t h ed y n a m i cc h a n g e so fc y t o s k e l e t o ni nt h ep a r t h e n o t e sa c t i v a t e db yv a r i o u ss t i m u l ia r es t i l la p r o b l e ml a c k i n gs y s t e m a t i cs t u d i e s t od a t e ，t h e r ea r eo n l yaf e wi n t e m a lr e p o r t sa b o u tt h i sf i e l d t h i se x p e r i m e n ta i m e dt os y s t e m a t i c a l l yi n v e s t i g a t ea n da n a l y z et h ee t h a n o la c t i v a t e dr a t e so f m o u s eo o c y l e s ，a f f e c t e df a c t o r so fo o c y t e sa c t i v a t i o n ，t y p e sa n dd e v e l o p m e n to f p a r t h e n o t e s ，a n d t h eo r g a n i z a t i o na n dr o l e so ft h ec y t o s k e l e t o nd u r i n gp r o n u c l e a rf o r m a t i o na n dm i g r a t i o na n de a r l y e m b r y oc l e a v a g eb ye t h a n o la c t i v a t i o no f o o c y t e s e m b r y oc u l t u r ei nv j 帅a n di m m u n o f l u o r e s c e n c e c y t o c h e m i s t r y t h el t s l d i t s ： ( 1 ) ( 2 ) ( 3 ) t h ee t h a n o la c t i v a t i o no fm o u s eo o c y t a ss h o w e dt h a tt h ea c t i v a t e da n dd e v e l o p m e n t a l r a t e so f o o c y t e si n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l yw i t ht h ei n c r e a s eo fe t h a n o lc o n c e n t r a t i o na n d e x t e n s i o no fe x p o s u r et i m e ，b u to v e rc o n c e n t r a t i o na n de x p o s u r et i m ew o u l dr e s u l ti n i n c r e a s e df r a g m e n tr a t e ss i g n i f i c a n t l y 7 e t h a n o lt r e a t e do o g y t e sf o r7 m i nw a gt h e o p t i m u ma c t i v a t e dc o n d i t i o n w i t ht h ei n c r e a s e so fo o e y t ea g e sa n dt e m p e r a t u r e ，t h e o o c y _ t e sa c t i v a t i o na n dd e v e l o p m e n tr a t e si n c r e a s e d ，w h i l ef m g m e n tr a t e si n c r e a s e d s i g n i f i c a n t l y o v a r i a nc u m u l u sh a dn oo b v i o u se f f e c to nt h ea e t i v a t i o t lo fo o e y t e si n v i t r o o o c y t e so fs e x u a lm a t u r i t yh a db e t t e ra c t i v a t e de f f e c tt h a nu n d e rs e x u a l m a t u r i t ym o u s e d e g r a d e dp r o p o r t i o no fo o e y t e sf i r s tp o l a rb o d y ( p b l ) a n dn u m b e r so fo o c 归s w i t h o u tp b1b o t hi n c r e a s e dw i t ht h ei n c r e a s e so fo o c y t ea g e sa f t e rh c gi n j e c t i o n w i t ho rw i t h o u tp b lh a dn os i g n i f i c a n te f f e c t so nt h ea c t i v a t i o n ，d e v e l o p m e n ta n d f r a g m e n tr a t e s w ea l s oo b s e r v e dt h a to o c y t e sw i t ho rw i t h o u tp b ih a dt h es a l t l e d i s t r i b u t i o np a t t e r n so f c y t o s k e l e t o n o u rf l u o r e s c e n c eo b s e r v a t i o nr e s u l t si n d i c a t e dt h a tm i c m t u b u l e sw e r er e s t r i c t e dt ot h e r e g i o no f t h em e t a p h a s e1 1 ( m i d m e i o t i cs p i n d l e w i t ht h ee x t r u s i o no f t h es e c o n d p o l a rb o d y ( p b 2 ) ，m l ls p i n d l eb e g a nt od i s i n t e g r a t ea n dd i s a p p e a rs l o w l y , a n dt h e c o m p a c tm i c r o t u b u l e c o n t a i n i n gs t r u c t u r ek n o w na st h em i d b o d yw a sf o m e d t h e m i d b o d yl o c a t e di nt h ec o n t a c ts u r f a c e so fc e l l st h a td i v i d e d ，a n df i n a l l yd i s a p p e a r e d ， ，。，查些些塑竺耋些堂塑圣，。一。一 a f t e rc e l ld i v i s i o nc o m p l e t e d p r o n u c l e im i g r a t e dt ot h ec e n t e ro fc y t o p l a s ma f t e rt h e i r f o r m a t i o na tt h ee d g e ( 4 ) m i c r o f i l a m e n t sc o n c e n t r a t e dt ot h eo o c y t ec o r t e xa n dp o l a rb o d ya tt h ed i f f e r e n t d e v e l o p m e n t a ls t a g e so fe g g s m i c r o f i l a m e n t sw e r em a i n l yd i s t r i b u t e di nt h ec o d e x a r e aw h i c hc h r o m o s o m e sl o c a t e da tm a m p h a s eo fs e c o n dm e i o s i s ( m i t ) a n d c o n c e n t r a t e da r o u n dp r o n u c l e ia f t e rp r o n u c l e a rf o r m a t i o n a f t e re x t r u s i o no fp o l a r b o d ya n dt h ec o m p l e t i o no ft h ef i r s tc e l lc y c l e , m i c r o f i l a m e n t sc o n c e n t r a t e dt ot h e c l e a v a g ef h r r o w s ( 5 ) t h em i is p i n d l es h o w e da b n o r m a la s s e m b l y , a n dm u l t i p l em i c r o t u b u l ea s t e r sf o r m e d i nt h ec y t o p l a s m ，c h r o m o s o m e sw e r en o tb e i n gn o r m a lm i g n e da n dc o u l d n ts e p a r a t e d e a c ho t h e ra f t e rt r e a t i n gt h eo o g y t e sw i t ht a x 0 1 w h i l ew a s h e dt a x o lc o m p l e t e l y , t h e a c t i v a t e do o c y t e sc o u l dr e s u m em e i o s i s1 1 ，t h em i is p i n d l er e o r g a n i z e d ，t h eo o c ”e s e x t r u d e dp b 2a n df o r m e dp r o n u c l e i o u rr e s u l t ss h o w e dt h a tt h ep a r t h e n o g e n e t i ca c t i v a t i o no f m o u s eo o c y t e sw a sa f f e c t e db ym a n y f a c t o r s ，s ot h es e l e c t i o no fo p t i m u ma c t i v a t e dc o n d i t i o n sw a sv e r yi m p o r t a n tf o rt h ee f f e c to f a c t i v a t i o n t h eo r g a n i z a t i o na n ds t r u c t u r eo f c y t o s k e l e t o nc h a n g e do b v i o u s l yd u r 崦t h er e s u m p t i o n o f m e i o t i ca n dp a r t h e n o g e n c t i ca c t i v a t i o no f m a m m a l i a no a c y t e s m i c r o t u b u l e sa n dm i c r o f i l a m e n t s p l a y e di m p o r t a n tr e g u l a t e dr o l e si nm a n ye v e n t ss u c ha st h em s u m p f i o no fm e i o t i c ，c h r o m o s o m a l m o v e m e n t ，t h ef o r m a t i o n , l o c a t i o na n dr o t a t i o no f m e i o t i cs p i n d l e ，p o l a rb o d ye x t r u s i o n , p r o n u c l e a r f o r m a t i o na n dm i g r a t i o na n da l s oe a r l ye m b i y oc l e a v a g e k e yw o r d s ：p a r t h e n o g e n e t i ca c t i v a t i o n ；e t h a n o l ；m i c r o t u b u l e s ；m i c r o f i l a m e n t s ；t a x o l p o s t g r a d u a t e ：s uj i n g y a n s p e c i a l i t y ：b a s i cv e t e r i n a r ys c i e n c e s u p e r v i s o r ：y a hy u n q i n 1 引言 1 1 卵子的孤雌激活 1 1 1 孤雌生殖的概念 孤雌生殖( p a r t h e n o g e n e s i s ) 一词展早由o w e n ( 1 8 4 9 ) 提出，是指没有雄性参与，由单个 卵细胞产生个体的繁殖。后又重新定义为无雄性配子的任何作用，由雌性配子产生的胚胎， 不论其是否发生成个体，称为孤雌生殖( m hk a u f m a n ，1 9 8 3 ) 。在自然界中，孤雌生殖现象在 无脊椎动物和低等脊椎动物中较为常见，在鱼类、两栖类、爬行类及鸟类等脊椎动物中也存 在孤雌生殖现象。到目前为止，尚未见到自然状况下哺乳动物孤雌生殖的报道。 实验诱导哺乳动物孤雌发育的研究始于1 9 世纪3 0 年代，近年来，随着哺乳动物细胞核 移植、精子( 或精细胞) 注射等胚胎工程技术的迅速发展，人们对影响细胞核移植和精子( 或 精细胞) 注射成败的关键技术环节卵母细胞的活化也愈加重视，卵母细胞的孤雌激活得 以较为系统的研究，取得较大进展。 1 1 2 孤雌激活的方法 哺乳动物处于第二次减数分裂中期的成熟卵母细胞在没有精子作用，而是通过其它理化 因素刺激恢复并完成减数分裂的过程，称为激活或孤雌活化( r sp r a t h e r , 2 0 0 1 ) 。目前已用于 科学研究的人工激活方法可归纳为物理性刺激和化学性刺激两类。前者包括机械刺激，即卵 母细胞的体外操作和穿刺处理；温度刺激，即低温和高温处理；以及电刺激处理。化学性刺 激包括乙醇处理、酶刺激如采用透明质酸酶或链酶蛋白酶处理：渗透压即低渗和高渗处理： 离子如二价阳离子或钙离子载体处理：麻醉剂处理：蛋白质合成抑制剂处理；以及蛋白磷酸 化抑制剂处理等( 陈大元，2 0 0 0 ) 。采用上述方法处理可激活卵母细胞继续发育，激活效率则 因动物种类或其他多种因素影响而不同。不同激活方法之间的激活效率也有所差异，使用电 脉冲、蛋白磷酸化抑制剂6 - 氨甲基嘌呤( 6 - d i m e t h y l a r n i n o p u r i n ，6 - d m a p ) 、钙离子载体 a 2 3 1 8 7 、乙醇及蛋白质合成抑制剂亚胺环己酮( c y e l o h e x i m i d e ，c h x ) 激活猪卵母细胞分别得 到的激活率为9 7 、8 3 、7 4 、5 5 和4 1 ，激活效率依次降低( hs u z u k ie ta 1 2 0 0 2 ) 。其 中乙醇法被看作是一种对哺乳动物孤雌激活比较有效且方便的方法，因而得以广泛应用。刘 红林等( 1 9 9 6 ) 用乙醇激活小鼠卵母细胞取得了8 8 9 的激活率。兰国成等( 2 0 0 2 ) 实验小 鼠卵母细胞乙醇激活率为8 5 6 。一些研究表明，不同孤雌激活因素联合作用有可能提高激 活效率( jp e t re ta i 1 9 9 6 ；ht a t e n oe ta l 。1 9 9 7 ) 。李光鹏等( 2 0 0 1 ) 用乙醇、s r c l 2 、电脉冲和 c h x 联合作用激活猪卵母细胞得到了8 1 8 的激活率。谭信等( 2 0 0 2 ) 发现亚胺环己酮( c h x ) 与s r c l 2 联合作用时，可以明显提高卵母细胞的激活率。 1 1 3 卵母细胞孤雌激活类型 东北农业大学农学硕士学位论文 正常受精时，m i i 期卵母细胞将有一半的染色质以第二极体的方式排出。而在孤雌激活 时，由于刺激因素、刺激强度、培养液的渗透压以及实验条件的不同，往往使第二极体不能 排放，由此得到的孤雌卵( 或孤雌胚) 的核型也会不一致( o n e i l l n a l 1 9 9 1 ；f a n b i q i n ，1 9 9 9 ) 。 一般有以下儿种核型：( 1 ) 激活卵排出第二极体，发育成一个单倍体原核，称为均质单倍体 ( u n i f o r mh a p l o i d ) ；( 2 ) 激恬卵速即分裂( i m m e d i a t ec l e a v a g e ) 成两个均等的卵裂球，一个含有 雌原核，个含有第二极体的核，构成嵌合单倍体( m o s a i c h a p l o i d ) ；( 3 ) 卵母细胞在完成第 二次成熟分裂时，第二极体未排出，出现异常的延迟卵裂( d e l a y e dc l e a v a g e ) ，同样构成嵌合 单倍体：( 4 ) 激活卵的第二极体未排出，由两个混合的单倍体原核组成一个二倍体核，称为 杂合二倍体( h e t e r o z y g o u sd i p l o i d ) ；( 5 ) 激括卵的第二极体排出，其雌原核加倍形成纯合二倍 体( h o m o z y g o u sd i p l o i d ) 。研究认为具有二倍体核的孤雌胚的发育效果更好一些。因而，在 研究孤雌激活卵发育时，通常加入细胞松弛素b ( c b ) 或d ( c d ) ，或抑制第一次卵裂，使 孤雌胚成为二倍体。 通过对各种刺激因子的配台使用可以得到各种不同倍体的孤雌激活胚胎。不同激活方案 诱导卵母细胞发生激活的类型不同，可能是由于刺激作用于卵母细胞微管、微丝及有丝分裂 器的方式和程度不同，而导致第二次减数分裂过程的改变。 1 1 4 影响卵母细胞激活的因素 卵龄是影响卵母细胞激活的重要因素。在对小鼠、兔、牛等卵母细胞激活的研究中均有 报道，活化率随卵母细胞的老化而增加。另外，化学介质的浓度、处理时间、激活处理后的 培养液等对激活效果都有影响( ht a t e n oe ta l ，1 9 9 7 ；李光鹏等1 9 9 8 ) 。乙醇对小鼠卵的活化 作用与卵龄有关。新排卵子对乙醇激活处理不敏感，其活化能力随卵龄增加而提高( 谭景和 等1 9 8 8 ：k u b i a k , 1 9 8 9 ：杨红等2 0 0 3 ) 。谭信等( 2 0 0 2 ) 用s r c l 。和乙醇激活大鼠卵母细胞， 发现激活率随卵龄的增加而增加。尽管乙醇对卵母细胞的激活无种间特异性，但不同动物卵 母细胞对乙醇激活的反应不同。 1 1 5 孤雌胚的发育 卵母细胞被激活后如果培养条件适宜。孤雌活化卵将同受精卵一样开始卵裂和发育。 研究表明，小鼠、兔、牛、猪等的激活卵，在体外培养条件下均可发育到囊胚。刘林等( 1 9 9 8 ) 研究绵羊孤雌胚体外发育得到了7 8 3 的卵母细胞分裂率和3 0 的桑椹胚囊胚发育率。杨素芳 等( 2 0 0 0 ) 研究水牛孤雌胚发育得到了5 16 的卵激活率和4 0 7 的桑椹胚及囊胚发育率。孟 庆刚等( 2 0 0 2 ) 研究小鼠卵母细胞激活及孤雌发育，最高激活率及囊胚发育率分别达到9 5 9 7 、 及4 6 7 7 。杨红等( 2 0 0 3 ) 研究小鼠卵母细胞孤雌活化卵母细胞激活率和囊胚率分别为8 8 和4 3 3 3 。g r a h a m 于1 9 7 0 年将激活卵移入受体小鼠首次得到小鼠孤雌发育囊胚，但其发育最 长也未能超过1 1 天：兔孤雌胚也同样发育到妊娠的第1 l 天( mo n o d e r ae ta 1 1 9 8 9 ) ；羊孤雌激 活囊胚最多发育到妊娠的第2 5 或2 6 天( p l o ie t a l 1 9 9 8 ) ：猪卵母细胞孤雌激活后则仅发育到 桑椹胚或胚泡期( sk u r e b a y a s h ie t a l 2 0 0 0 ) ，这些研究都说明孤雌胚的发育是有限的。然而， 将孤雌胚与正常胚胎构成嵌合体后，孤雌胚可以参与机体的全程发育，可使动物发育到期。 2 引言 自! ! ! j ! e 目t e e ! ! ，! ! 自自鼍i i i i ! ! e ! e | 目t e 日! ，g ! ! j ! ! 皇 孤雌胚能参与形成包括生殖细胞在内的各种组织。 孤雌胚可完成着床前的早期发育而形成形态正常的囊胚，体外条件下少数二倍体孤雌胚 能发育至前羊膜腔甚至圆筒期，但是孤雌胚附植后发育到一定阶段便发生死亡，这可能是由 于孤雌胚的细胞质和细胞核的功能存在一定程度的缺陷。对内源性基因和外源性导入基因表 达特性的研究发现，来源于父母的基因在配子发生过程中发生修饰作用，从而使二者在发育 中具有不同的功能。雌雄原核间存在染色体不同修饰说明雌雄原核间存在互补作用，它们的 共同存在和不同表达对胚胎正常发育具有重要作用。研究证实，孤雌胚成分限于原始外胚层 系，即胚体和卵黄囊中胚层。 1 1 6 卵母细胞孤雌激活机制 卵母细胞激活过程中，细胞内c a “节律性脉冲升高起关键的介导作用，c a ”波动是启动卵 母细胞周期和继续发育的前提，直接注射c a ”或用c a “载体a 2 3 1 9 7 、乙醇、电刺激、s r 刺激均 能引起卵母细胞质内c a 2 + 多次波动性升高。卵母细胞内c a ”升高产生膜的超极化反应，皮质颗 粒释放至卵周隙导致染色体解聚，启动减数分裂排出第二极体，促进原核形成、卵裂和早期 胚胎发育( hi g a r a s h ie ta l1 9 9 7 ) 。 在小鼠卵受精时，精子诱导卵内c a ”发生集聚变化，先出现一次持续约5 分钟的c a 波， 之后出现若干短时的重复波动，并一直延续数小时( dk l h l e 1 9 9 4 ；h g a r a s h ie ta i 9 9 7 ) 。 细胞内c a ”浓度的升高是卵母细胞被激活后的初始信号。乙醇是发现较早的一种化学激活剂， 其对卵母细胞的激活主要是通过水解细胞膜上4 ，5 一二磷酸磷脂酰肌醇( p i p 2 ) 产生1 ，4 ， 5 一三磷酸肌醇( i p 3 ) ，从而诱发细胞内源钙释放到细胞质，提高了细胞胞内的钙浓度。研究 表明，乙醇对小鼠卵母细胞的激活与受精一样，均能使卵母细胞内游离c r 0 衣度有规律的多 次升高( ab o s m i “c he a i 1 9 9 5 ) 。 已知成熟促进因子( m a t u r a t i o np r o m o t i n g f a c t o r , m p f ) 和细胞静止因子( c y t o s t a t i c f a c t o r , c s f ) 参与哺乳动物卵母细胞m i i 期的维持( q ys u ne ta 1 1 9 9 9 a ) 。c s f 直接或间接维持m i i 期卵内m p f 的高活性因此使卵母细胞发育阻滞在m i i 期( ym a s u i ，1 9 9 9 ) 。研究认为当m i i 期卵母细胞受精时，立刻激发卵内c a ”升高，破坏了已存在的c s f ，从而导致m p f 活性降低； c d + 水平提高也可能引起了对c a 2 + 敏感的周期蛋白的降解，而导致m p f 水平1 ：降或消失，引起 卵子活化，促使卵母细胞离开m i i 期，完成减数分裂并进行孤雌发育。一些相关信号转导级 联途径如丝裂原活化蛋自激酶( m i t o g e n - a c t i v a t e dp r o t e i n k i n a s e m a p k ) 、蛋白激酶c ( p r o t e i n k i n a s ec ，p k c ) 等也参与了卵母细胞减数分裂的恢复和完成( h yf a ne ta 1 2 0 0 4 ) 。 1 2 细胞骨架与卵母细胞成熟和受精 1 2 1 细胞骨架在卯母细胞成熟和受精中的作用 哺乳动物卵母细胞发育停滞在第一次减数分裂前期的双线期，即生发泡( g e r m i n a l v e s i c l e ，g v ) 期。当卵母细胞恢复减数分裂时，发生生发泡破裂( g e r m i n a lv e s i c l eb r e a k d o w n ， g v b d ) ，继而染色体凝集，组装成m i 期纺锤体然后排出第一极体并阻滞在第二次减数 分裂中期( m i i 期) ，直到受精或孤雌激活后，卵母细胞才突破m i i 期阻滞，完成第二次减数 分裂，排出第二极体，染色体重新去凝集，形成原核。通常把从卵母细胞恢复减数分裂到 m i i 期这发育过程称为卵母细胞核成熟。受精是雌雄生殖细胞相结合形成台子的过程，是 个体生命的起点。 哺乳动物卵母细胞成熟和受精过程中，伴有许多动态性事件以确保细胞的正常和充分发 育。在这一过程中卵母细胞必须经历一系列的核和胞质变化以最终发育成具有受精能力和充 分发育能力的细胞。核和胞质变化主要包括生发泡破裂、极体排放、精子穿入、雌雄原核形 成、迁移及雌雄原核融合。有丝分裂的重新启动标志着胚胎发育的开始( h yf a ne ta 1 2 0 0 2 ： d f a l b e r t i n ie t a l 1 9 9 3 ) 。 卵母细胞成熟和受精过程中发生广泛的胞质骨架重组所有发育事件都高度依赖细胞骨 架系统的调控，如减数分裂恢复、染色体凝集、纺锤体形成、极体排放、精子穿入以及原核 的形成和迁移等。细胞骨架是遍布于卵母细胞胞质中的一种复杂的蛋白纤维网络，其中微丝 和微管是卵母细胞成熟和受精中的两种主要细胞骨架成分。微丝是组成细胞皮层的肌动蛋白 纤维网络，使细胞表面具有应力并决定细胞形状和极性；微管是细胞的一种支撑结构，在减 数分裂结构形成、染色体重组和胞质细胞器迁移中具有重要的作用( ba l b e r t se ta 1 1 9 9 4 ) 。 1 2 2 微管与卵母细胞成熟和受精 微管是一种直径为2 5 n m 的细胞骨架成分，它对于细胞运动、染色体的运动和细胞质结构 的维持是必需的。大量研究表明，微管对于哺乳动物卵母细胞第一次和第二次减数分裂的完 成、精子的运动以及受精过程中雌、雄原核的结合都是必不可少的。 在哺乳动物未受精m i i 期卵母细胞中，含有微管的最明显的结构是减数分裂纺锤体。它 是个位于卵母细胞皮质区的桶状结构与染色体、中心体一起构成减数分裂器。在小鼠卵 母细胞的减数分裂纺锤体周围还有数十个胞质微管星体。一般认为，纺锤体中的微管负责卵 母细胞中染色体排列、分离和极体排放，而胞质微管星体则负责受精后原核的迁移和靠近( h s c h a t t e ne ta 1 1 9 8 6 ：s mm e s s i n ge ta 1 1 9 9 1 ) 。 在大多数哺乳动物，受精时精子引入主要的微管组织结构中心体。这一细胞器进入 卵子后，产生精子星体，负责雌、雄原核的迁移靠近。然而，小鼠精子进入卵子后，并没有 微管组织成星体( cs i m e r l ye ta 1 1 9 9 5 ) ，而是卵子自身的胞质星体随着原核的发育体积增 大在胞质中微管蛋白聚集到原核表面而形成浓密的基质，使原核相互靠近。小鼠受精卵的 原核并不发生融合，在第一次分裂间期末，浓密基质解散，在相互靠近的原核周围形成核周 微管鞘。如果用秋水仙素破坏微管精子穿入卵子，精核去致密及雄原核形成不受影响，而 卵子染色体排列以及分离都受到破坏( 刘辉等1 9 9 4 ) 。 1 2 3 微丝与卯母细胞成熟和受精 微丝是一种直径7 n m 的细胞骨架成分，由肌动蛋白组成。在哺乳动物卵母细胞成熟和受 精过程中，微丝对于细胞表面结构的维持、遗传物质的迁移等都发挥重要的作用。具体地讲， 卵母细胞中，微丝主要分布于质膜下l 一5 9 m 的皮质区，对于减数分裂器位置的维持、减数分 4 裂器的旋转、受精锥的形成s 第一和第二极体的形成和排放、原核迁移及胚胎卵裂等都具有 重要作用，但对精子穿入卵子无影响。 小鼠m i i 期卵子受精前，纺锤体与卵表面平行；精子入卵后，m i i 期纺锤体需旋转9 0 。 才能排放第二极体。在小鼠，m i i 期纺锤体定位子卵子皮质区，第二次减数分裂恢复后纺锤 体的旋转和第二极体的排放都依赖于微丝的作用。精子入卵后，激发第二次减数分裂启动， 伴随着雄原核的形成，减数分裂器发生旋转。细胞松弛素b ( c b ) 的作用主要是抑制细胞内 微丝的形成，使得卵母细胞内细胞骨架松弛，增加细胞的柔韧性；同时，c b 破坏纺锤体的 形成，抑制极体的形成和染色体的排出，从而形成双倍体原核，保证了胚胎的染色体倍数。 如果用细胞松弛素b ( c b ) 破坏微丝，减数分裂器的旋转就受到抑制。 微丝在受精过程中的另一个重要的作用是参与原核的靠近即配子配合( s y n g a r n y ) 。小鼠 精子入卵不需微丝的作用，但其对于精子尾部进入卵子是必要的( c s i m e r l ye ta 1 1 9 9 3 ) 。精 子入卵后，精卵融合处也有微丝聚集，参与受精锥形成。小鼠原核形成后向一起迁移是由微 丝支配的。小鼠原核迁移阶段，原核周围分散分布的核周微丝束与微管一道，使原核相互 靠近，如破坏微丝，配子配合就受到抑制。同样有丝分裂纺锤体的旋转及卵裂的发生也依 赖于微丝的作用。 1 3 紫杉醇的作用机理 紫杉醇( p a c i l i t a x e l ，商品名t a x 0 1 ) 是美国化学家w a l l 和w a n i 等于1 9 6 3 年首先从太 平洋紫杉( 短叶红豆杉，t a x u s b r e v i f o l i a ) 树皮中提取得到的天然产物，是一种具有独特结 构和独特作用机制的抗肿瘤药物，尤其进入9 0 年代以来，对紫杉醇的研究成为抗肿瘤药物研 究的热门课题。研究发现，紫杉醇可稳定微管抑制其解聚，从而导致微管束的排列异常， 形成星状体，使纺锤体失去正常功能、导致细胞死亡。紫杉醇通过抑制微管动力学，干扰有 丝分裂纺锤体的装配，导致有丝分裂阻滞，使染色体分离失败，是唯能促微管形成而抑制 微管蛋白解聚的植物次生代谢产物。微管是真核细胞的一种组成部分其功能为构成细胞的网 状支架，维持细胞形态，参与细胞的收缩伪足运动，参加细胞器的位移及胞内物质运输等， 其中尤为重要的染色体的分裂和位移，需在微管的帮助下进行。正常情况下，微管和微管蛋 白二聚体之间存在动态平稳，微管在钙离子的作用下解聚，有丝分裂时形成纺锤体和纺锤丝 牵引染色体向两极移动。紫杉醇依赖性地、可逆地结合在微管下，诱导和促进微管蛋白的聚 合，稳定微管、防止解聚，导致染色体断裂并抑制细胞复制和移行，从而阻碍细胞复制( 翁 开敏等2 0 0 2 ) 。临床应用表明，紫杉醇对卵巢癌、乳腺癌、宫颈癌、肺癌、c n s 癌、黑色素瘤、 肝癌和白血病细胞系等有细胞毒作用，尤其对耐常规药物的肿瘤也取得了较好的疗效。另有 最近研究也表明，紫杉醇有显著的抗人肝癌活性。对紫杉醇的作用机制深入研究发现，紫杉 醇能够阻断细胞有丝分裂中后期转换，从而导致细胞凋亡( m aj o r d a ne ta 1 t 9 9 6 ) 。紫杉醇 也能激活巨噬细胞，产生免疫调节活性( j hy u a n ，r pz h a n ge ta 1 2 0 0 0 ：my u a n ，x ww a n ge t a 1 2 0 0 0 ) 。因此，紫杉醇的抗癌作用可能是各种作用或相互作用的结果。 研究表明，当紫杉醇浓度较高时能够促进微管聚台。稳定微管，抑制其解聚( w dh o w a r d e ta l ，1 9 8 8 ) ：而当浓度较低时，紫杉醇主要是通过结合在微管的( + ) 端，抑制微管( + ) 端去组装， 一 查兰型坚丝堂型兰型鎏一一 使微管聚合体适度增长，抑制微管的动态稳定性( w bd e r r ye ta 1 1 9 9 8 ) 。5 - 1 0 n m 的紫杉醇 处理细胞时，细胞有丝分裂指数稍有增长( 1 3 - - 4 2 ) ，细胞由中期向后期的发育进程减慢， 3 1 的细胞增殖被抑制，但并未发生发育阻断。可能微管在低浓度紫杉醇作用下，仍有足够的 动态性可通过减数分裂检测点，继而进入分裂后期。由此说明，当浓度较低时，紫杉醇可能 不是通过有丝分裂阻断来抑制细胞增殖的，而是另有其它抑制机制。这种机制可能与紫杉醇 处理后，细胞中形成的多极纺锤体有关，多极纺锤体导致异常的染色体分离，不能完成胞质 分裂( kj o n a t h a ne ta 1 2 0 0 3 ) 。有些细胞系中，细胞分裂后期加入低浓度紫杉醇处理后，导致 细胞中染色体分离异常、d n a 含量和细胞大小异常、出现非整倍体细胞及细胞死亡( kt o n e s e ta 1 1 9 9 8 ；j gc h e ne ta 1 2 0 0 2 ) 。高浓度紫杉醇( 1 0 0 a m ) 能够明显抑制由纺锤体产生的着丝 粒动态性，降低附着在姐妹染色单体上的两着丝粒间的分离距离，两着丝粒间的伸缩频率也 比正常细胞明显减少，使9 0 以上的细胞阻断在有丝分裂中后期，完全抑制细胞增殖。这 些实验结果证实微管动态性对于细胞的中后期转换是必需的，同时紫杉醇的这种浓度依赖性 也表明紫杉醇阻断有丝分裂的主要机制是抑制着丝粒微管动态性( kj o n a t h a ne ta 1 2 0 0 3 ) 。 1 4 本研究的目的和意义 近年来人们对受精机制的研究取得了很大进展，但由于对哺乳动物受精过程的研究难度 较大，故有关的受精机制仍有待于进一步深入的探讨。其中卵母细胞激活作为发育生物学研 究的一项基本课题，研究不同理化因素对卵母细胞的激活作用和过程既有利于对细胞周期阻 滞的恢复、激活胚胎的发育、激活过程中的信号偶联过程、激活动力学等的生理机制深入了 解，也有利于解决胚胎细胞核移植过程中卵母细胞的激活这一关键问题。哺乳动物卵母细胞 成熟和受精过程中，细胞骨架的组织和结构发生了一系列明显的变化，在遗传物质的迁移、 极体的排放、原核迁移及早期卵裂等事件中均发挥重要的作用。研究表明，哺乳动物卵母细 胞和早期胚胎中细胞骨架具有其独特的分布和功能，使卵母细胞和胚胎呈现出不同的变化特 点。卵母细胞激活过程中，细胞骨架的组织也与这一系列的动态性事件相关，但目前，对于 这些形态变化与其伴随的生化事件之间的关系仍了解不多，而且对于不同刺激激活的孤雌胚 中细胞骨架的动态性变化也有待于更为系统的研究。 本实验主要利用卵母细胞的乙醇激活、胚胎体外培养和免疫荧光细胞化学方法对小鼠卵 母细胞乙醇激活效率、影响因素、孤雌胚类型、发育、原核形成、迁移及早期胚胎卵裂过程 中细胞骨架的组装、作用等方面情况进行了系统的研究和总结，分析理化因素激活与精子激 活的特征，了解哺乳动物卵子在受精后的发育机制，以期进一步加深人们对哺乳动物生殖和 受精机制的认识，同时也可为提高哺乳动物细胞核移植成功率、加速动物育种、治疗人类不 孕症等提供一定的理论和实验依据。 6 2 材料与方法 2 1 主要器材和试剂 2 1 1 主要器材 电子分析天平( 瑞士m e t f l e r t o l e d o ) 自动双重纯水蒸馏器( 上海玻璃仪器一厂) 恒温磁力搅拌器( 江苏医疗仪器厂) 酸度计( 瑞士m e t r l e r ) 台式高速离心机( 上海安亭) 生物超净工作台( 苏州净化设备有限公司) c 吼培养箱( 美国f o r m a ) 实体显微镜( 国产m o t l c ) 倒置显微镜( 日本o l y m p u s ) 荧光显微镜( 日本o l y m p u s ) 2 1 2 主要试剂 孕马血清( p r e g n a n t m a r es e r u mg o n a d o t r o p i n ，p m s g ) 购白天津市华孚高新生物技术公司 人绒毛膜促性腺激素( h u m a nc h o r i o n i c g o n a d o t r o p i n ，h c g ) 购自天津市中宝药业有限公司 r a b b i ta m i - a c t i n ，购自博士德生物工程有限