（内科学专业论文）威灵仙皂苷诱导mr2细胞凋亡的实验研究.pdf

威灵仙皂苷诱导m r 。细胞凋亡的实验研究 摘 目的：研究威灵仙皂苷是否能够诱导耐全反式维甲酸急性早幼粒 细胞白血病细胞株( m r 2 细胞株) 凋亡，以期望寻找一种治疗急性早 幼粒细胞白血病耐药患者的新药，尽可能的减轻临床症状，提高生存 质量，防止复发转移，延长生存期。方法：根据文献自行提取威灵仙 皂苷。常规培养人m r 2 细胞株于含1 0 小牛血清的，m 1 1 6 4 0 培养 基的2 5 i i l l 培养瓶中，置于3 7 、5 c 0 2 、饱和湿度的培养箱中培养， 每3 5 天传代一次，取对数生长期的细胞作实验对象，将细胞浓度调 整为1 1 0 4 个触的细胞悬液接种于9 6 孔酶标板，每孔加细胞悬液 10 0 u l ，共设8 个实验组( 每组5 个平行孔，并重复实验3 次) ，以终 浓度o 0 1 d m s o 为空白对照组，终浓度1 o l l m o l l 亚砷酸为阳性对 照组，终浓度2 0 0u 咖l 、4 0 0u 【i l l 、6 0 0u 咖l 、8 0 0u 酌：1 1 l 、l o o o u 酌：i l l 、 一 1 2 0 0u g h d 威灵仙皂苷为实验组，用w s t - 1 法观察不同浓度不同时 间威灵仙皂苷对m r 2 细胞的增殖抑制作用；调整细胞浓度为1 1 0 6 个触接种子六孔板，设五个实验组( 每组设三个平行对照，实验重 复三次) ，以终浓度o o l d m s o 为空白对照组，终浓度1 u m o l 枷亚 砷酸为阳性对照组，终浓度8 0 0u g m l 、1 0 0 0 u 咖1 、1 2 0 0u 咖1 威灵 仙皂苷为实验组，作用m r 2 细胞7 2 小时后用流式细胞仪观察m r 2 细胞的凋亡率；调整细胞浓度为4 1 0 5 个m l 接种于六孔板，设五个 实验组( 每组设三个平行对照，实验重复三次) ，以终浓度o ol d m s o 藿i叠毫誓霉，曩1ir 为空白对照组，终浓度1 u m o l l 亚砷酸为阳性对照组，终浓度2 0 0 u g 1 1 1 l 、4 0 0u 酌【i l l 、6 0 0u i i l l 、8 0 0u 酌：1 1 l 、1 0 0 0 u n 1 1 、1 2 0 0u 卧n 1 威 灵仙皂苷为实验组，作用m r 2 细胞7 2 小时后用心m e x i l lv - f i t c 染色 荧光显微镜观察细胞凋亡形态，并应用统计学分析实验结果。结果： w s t - 1 法结果显示不同浓度的威灵仙皂苷( 2 0 0u 酣【1 1 1 、4 0 0u 酌 1 1 1 、 6 0 0u g 触、8 0 0u 咖1 l 、l o o o u 卧1 1 l 、1 2 0 0u 咖1 ) 对蛾细胞均有明 显的增殖抑制作用，且呈时间和浓度依赖性。可明显抑制m r 2 细胞 的增殖并随着威灵仙皂苷浓度的增加、作用时间的延长而抑制作用增 强，且高浓度的威灵仙皂苷组与亚砷酸组对m r 2 细胞增殖抑制作用 无统计学差异；应用流式细胞仪技术可明显检测到m r 2 细胞的凋亡 且随浓度的增加而凋亡率升高，亚砷酸组与皂苷1 2 0 0u 咖l 组之间差 异无统计学意义；亚砷酸组和皂苷1 2 0 0u 咖l 组与皂苷8 0 0u m l 、 1 0 0 0 u 鲂：1 1 1 组间差异有统计学意义；皂苷8 0 0u 鲋m 组与皂苷 1 0 0 0 u 酌：1 1 1 组间差异有统计学意义。知m 耐nv 是一种分子量为 3 5 3 6 i 的c a 2 + 依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和 力，可在细胞凋亡时与翻向外侧的磷脂酰丝氨酸胞膜结合，使其荧光 信号呈绿光；p i 作为_ 种核酸染料，它不能通过完整的细胞膜，但在 细胞凋亡时和细胞死亡时能通过细胞膜使细胞核染色，其荧光信号呈 红光。通过荧光显微镜可以观察到威灵仙皂苷作用m r 2 细胞经 a m l e ) 【i nv - f i t c 染色后出现细胞体积变小，细胞核浓缩，细胞核碎裂 以及凋亡小体形成等细胞凋亡的形态改变。结论：1 威灵仙皂苷能够 明显抑制m r 2 细胞的增殖，且呈时间浓度依赖性。2 威灵仙皂苷能 够诱导m r 2 细胞凋亡，呈浓度依赖性，且高浓度组与亚砷酸的凋亡 率差异无统计学意义。3 威灵仙皂苷单独或联合其它药物可能成为临 床上治疗急性早幼粒细胞白血病及其耐药患者的一种新的经济、有 效、安全的药物。 关键词：威灵仙皂苷；m r 2 细胞；细胞凋亡 t h es t u d ya b o u tt h ea p o p t o s i so fm l bc e hl i n e si n d u c e db y r a d i xc l e m a t i d i ss a p o n i n s a b s t r a c t ：b j e c 哦，e ： t o i i l v e s t i g a t e t h e a p o p t o s i s o fa c u t e p r o m y e l o c 如cl e u k e i n i al ) r e s i s t a n tm e d i c i n ec e nm r 2c e l ll i n e s i 1 1 d u c e db yr a d i ) 【c 1 e m a t i d i ss a p o n i l l s w r et 巧t of i n dan e wt r e 曲m e n t f o rp a t i e n t sw i t hr e s i s t a n ta c u t ep r o i n y e l o c 舛i cl e u k e m i at oa l l e v i a t et h e i r s 弘n p t o m s ，i m p r o v et h e i rq u a l i t y o fl i f e ， p r e v e n t r e 伽【玎e n c ea n d m e t a s t a s i sa n dp r o l o r 塔t h e i rl i f e m e t h o d ：w ，ee x t r a c t e dr a d i xc l e m a t i d i s s a p o n i n sb 弱e do nd o c u m e n t s m r 2c e l l sw e r ec u l t i l r e dw i t hr p m i 一16 4 0 m e d i u mc o n t a i n e d1o f e t a lb o v i n es e m mi n3 7 h u m i d i f i e d a t m o s p h e r ew i t l l5 c 0 2 锄dp a s s a g e de v e 秽3 5d a y s c e l l si i l l o g a n m m i cp h 嬲ec e l l sw e r eu s e df o r 翩p e r i m e n t s t h ec e l l so n l e c o n c e n t r a t i o no f1 10 4 1 1 1 1w e r es u s p e l l d e da n ds e e d e di i l9 6w e l l i i l i c r o p l a t e s t h e r ew e r ee i g h t 仃l ；a t e dw a y sw i t ho o1 d m s oa st h e b l a 工1 l 【c o n t r o lg r o u pa n d1 ou m o 儿a s 2 0 3a st h ep o s i t i v ec o n t r 0 1g r o u p ( n = 5p a r a l l e ls 锄p l e sf o re v e 可g r o l ：i p ，a n dr 印e a ti ! ) 【p e r i i n e n t 3 t i m e s ) t h ed i f r e r e n tt r e a t e dc o n c e m r a t i o no f 2 0 0u n l l 、4 0 0u g 1 m 、6 0 0 u n l l 、8 0 0u 1 1 1 1 、1o o o u g n d 、12 0 0u h 1 1c l e m a t i d i ss a p o i l i n sw e r eu s e d s 印卸r a t e l ya st h ee x p 耐m e n t a lg r o u p s t l l ep r o l i f e r a t i v ei n l l i b i t i o nr a t eo f m r 2c e l lw a se x a r n j n e du s i n gw s t - 1 c e l l so nm ec o n c e 曲a t i o no f1 1o i ，l i dw e r es u s p e n d e da n ds e e d e di l l6w e np l a t e s t h e r ew i e r e5 4 d i f f e r e n tt r e a t e dw a y sw i mo 0l d m s o 硒t h e b l a r 血c o n t r o lg r o u p a n d1 ou m o 。a s 2 0 3 硒m ep o s i t 押ec o n t 】r 0 1 鲈o u p ( n - 5p a r a l l e ls 鲫叩1 e s f o re v 唧g r o u p ，a n dr 印e a te x p 甜m e n t3t i m e s ) t h ed i 圩e r e n t 仃e a t e d c o n c e n t m t i o n o f8 0 0u 鲈i d 、10 0 0 u 咖1 、12 0 0u 鲈1 1 1c l e m a t i d i ss 印o i l i n s w e r eu s e ds 印a r a t e l y 硒t h ee ) 【p e r i m e n t a l 伊。o u p s a r e r7 21 1 0 u r st i e a t i n g ， t h ea p p o p t o s i sr a t e 邯e x a m i n e du s i n gm ef c m a tt 1 1 es 锄et i m e ，t h e c h a n g e dm o 印h o l o g yw a se x a n l i n e du s i n gf l u o r e s c e n c em i c r o s c o p e r e s u l t ：t t l ee 虢c to fr a d i xc 1 锄a t i d i s s 印o n i n s a td i f f 打咖 c o n c e n 臼纵i o no f2 0 0u g m 1 ，4 0 0u m l ，6 0 0u g m l ，8 0 0u i i l l ，1o o o u 酌【1 1 1 ， 12 0 0u g m 1o nm r 2c e l l sg r o w t l li i l l l i b i t i o nw a so b v i o u s l ya n di tw 嬲 a c c o r d a n c ew i mm et r e a t i i 培t i m ea n dc o n c e n t r a t i o no fr a d i xc l e m a t i d i s s a p o n i l l s r a d i xc l e m a t i d i ss a p o i l i n s a td i 虢l r e mc o n c e n t m t i o nc a i l i i l l l i b i tm r 2c e l l sg r o w t h t h ei i l l l a b i t i o nr a t ei n c r e a s e d 萨l d u a l l y 计l e n m e d i c i n ec o n c e n t r a t i o ni 1 1 c r e a s e da n dt r e a t i n gt i m ep r 0 1 0 n g e d r a d 仅 c l e m a t i d i ss a p o l l i n sa th e i g h tc o n c 黜船a t i o nh a dt l l es a n l ee 虢c to nm r 2 c e l l s 弱a s 2 0 3g r o u pd i d t h ea p o p t o s i s r a t ea l s oi n c r e a s e dw h e n m e d i c i n ec o n c e n t r a t i o ni n c r e a s e da n d 仃e a t i n gt i i n ep r o l o n g e d i na s 2 0 3 g r o u pa n dt h es a p o i l i n s 12 0 0 u l l dg r o u pt h e r ew a s n ts i g n i f i c a n t d i 蜀f e r e i l c e c o n l p a r e ds a p o n i n s 12 0 0 u 酌mg r o u pw i t hm es a p o n i i l s 8o o u g n dg r o u pa n d1o o o u g m lg r o u p ，t h e r ew e r es i g n i f i c a n td i 虢r e n c e b e 锕e e ns 印o n i n s8 0 0 u 卧1 1 1g r o u pa n ds a p o m n s1o o o u 咖lg r o u p ，t h e r e w a ss t a t i s t i c a ld i 伍：r e n c e a n n e x i n vi sam o l e c u l a rw e i g h to f3 5 ，3 6 k d 5 o ft h ec a 2 + d 印e n d e n tp h o s p h o l i p i db i n d i n gp r o t e i nw h i c hh a sah i g h a f j f i n i t yf o rp h o s p h a t i a d y l s e r i n e 1 1 1m ea p o p t o s i sc e l l s 加m e x i n - vc 觚 b i n dw i t l lp h o s p l l a t i a d y l s e r i n eo nt h eo u t e rm e n 而啪e 甜l dp r o d u c e s 黜n f l u o r e s c e n c es i g l l a l a san u c l e i ca c i dd y e ，p ic 锄n o tc o i n e 伽o u 曲t h e c o m p l e t ec e l lm e l l l _ b r a n e b ui tc o m et l u o u g ht h em e m b r a n c ea n db i n dt o 姗c l e u sa n d p r o d u c e sr e dn u o r e s c e n c es i g i l a li n 印o p t o s i sc e l l sa n dd e a t l l c e l l s u n d e rf l u o r e s c e n c e “c r o s c o p 弘t h ev o l u i n eo fm et r e a t e dc e l l s w e r ed e c r e a s e d ，n l en u c l e o l u sw e r el l i g l l l yc o n d e n s e da 1 1 de v e nd i s r u p t s o r f o 加1 e d 印叩t o t i cb o d yw m c hw 弱s 锄e 嬲t h ea s 2 0 3g r o u p d i d d i s c u s s i o n ：lr a d i xc l e m a t i d ss a p o n i n sc a ni 1 1 1 1 a b i tc e ng r o w t ha u l d t h ee f r e c ti sa c c o r d a i 】l c ew i mt h et r e a t i r 坞t i m ea i l dc o n c e n t r a t i o no fl h d i x c l e m 砒i d i s s 印o i l i n s 2 i h d i xc l e m a t i d ss a p o n i i l sc a ni n d u c ec e n a p o p t o s i sa 1 1 dm ee f j f e c t i sa c c o r d a n c e w i t hm et r e a t i n gt i i n ea n d c o n c e n t m t i o no fr a d i 】【c l e i n a t i d i s t h e a p o p t o s i sr a t eo fm r 2c e l l s t r e a t e db yr a d i xc l e m a t i d ss 印0 1 1 i i l sa th e i g h tc o n c e n t r a t i o ni ss 锄ea s a s 2 0 3 鲫pd o e s 3r a d i 】【c 1 锄a t i d ss 印o n i n sw i ub e c o m ean e w e c o n o m i c 、e 腩c l i v ea n d1 0 ws i d ee 舵c t so fd m g sw h i c ha l o n eo ri i l c o n l b i n a t i o nw i t ho t h e rd m g s 仃e a 恤e mo fa c u t ep r o m y e l o c y t i c1 e u k e 而a 砒1 dd m gr e s i s t a n c ei np a t i e n t s k e yw o r d s ：r a d i xc 1 e m a t i d i ss a p o n i i l s 瓜们r 2c e l l a p o p t o s i s 6 前言 恶性肿瘤是严重威胁人类健康的一类常见疾病。临床治疗肿瘤， 西医一般采用手术、放疗、化疗三大疗法，疗效快捷，对肿瘤有一定 的治疗效果，但存在明显的损伤和毒副作用。因此，寻找有效且无损 伤和毒副作用小的抗癌药物，是医学界重要的研究课题。中药是祖国 医学用来防治疾病的有力武器，人们发现中药治疗恶性肿瘤，无论是 在减轻临床症状、提高生存质量、防止复发转移和延长生存期，还是 在与放化疗配合，增效减毒等方面均有很好的效果。例如三氧化二砷 ( a s 2 0 3 ) 是砒霜的主要成分，长期以来被认为是一种致癌剂，但现 。在用a s 2 0 3 诱导细胞凋亡而发挥治疗肿瘤的作用 1 1 。一些中药及提取 物有抑制肿瘤血管生成的作用，这可能会为肿瘤治疗，特别是中医药 治疗肿瘤带来契机。如人参皂苷可能通过下调肿瘤血管内皮生长因子 ( v e g f ) 2 1 1 1 】心a 及蛋白的表达量，阻滞肿瘤血管生成从而抑制肿 瘤血管生成圈；刺五加皂苷能够抑制人肝癌细胞株h e p g 2 的 v e g f l i l 】刚a 及蛋白表达，抑制v e g f 介导的肿瘤血管新生，进而抑 制肿瘤转移【3 1 。同时在放化疗过程中因抗肿瘤药的选择性小，大多数 细胞毒性药物在杀伤肿瘤细胞的同时也损伤正常细胞特别是快速增 殖组织( 骨髓、肠粘膜、毛囊等) 。而中医药的扶正固本，健脾养阴， 清热解毒等方法能减轻或消除放化疗的毒副反应。随着免疫学、分子 生物学技术和中药药理学的不断发展，以及中药提取技术的日益成 熟，相信中药能在预防和治疗恶性肿瘤中发挥更大的作用。 急性早幼粒细胞白血病( a c u t ep r o m y e l o c y t i cl e u k e m i a ，a p l ) 是 急性髓细胞白血病( a c u t em y e l o i dl e u k e m i a ，a m l ) 中的一个特殊亚 型，在临床上以易发d i c 为特点，占a m l 的1 0 1 5 【4 】。9 0 以上 的急性早幼粒细胞白血病患者具有t ( 1 5 ；1 7 ) ( 1 5 q 2 2 ；1 7 q 2 2 ) 染色体移 位，形成融合基因p m i 庥a r a ，并表达p m i 依a r a 融合蛋白，此融 合蛋白可干扰r a r a 信号传导，使髓细胞分化停滞在早幼粒阶段【5 1 。 全反式维甲酸可诱导急性早幼粒细胞白血病细胞分化和成熟，缓解可 达8 0 穆o 左右，但缓解期短，易出现耐药，并在一些病例中用药 后出现发热、呼吸困难、胸腔或心包积液以及发作性低血压即维甲酸 综合症，除此还可引起骨痛、皮肤瘙痒、鼻塞、肝酶升高、脑压升高、 白细胞计数升高、组胺升高等【6 】，且单独使用全反式维甲酸不能清除 白血病细胞的恶性克隆和出现耐药忉。三氧化二砷是治疗急性早幼粒 细胞白血病的另外一个有效药物，对复发或急性早幼粒细胞白血病耐 药的患者也有较高的缓解率，但其明显的毒副作用如食欲减退、恶心、 呕吐、口腔溃疡、手足麻木、心脏神经毒性、白细胞升高、皮肤瘙痒、 关节肌肉痛、腹泻等，而且对初发的患者可能会有致命的肝损害嘲。 所以如何利用中医中药寻找一种新的、价格低廉的治疗急性早幼粒细 胞白血病患者特别是治疗耐维甲酸的急性早幼粒细胞白血病患者药 物成为一个经济适用的研究方向。 威灵仙为中华本草所载毛莨科植物，根茎呈柱状，长1 5 1 0 c m ， 直径o 3 1 5 c m ；表面淡棕黄色；顶端残留茎基；质较坚韧，断面纤 维性；下侧着生多细根。根呈细长圆柱形，稍弯曲，长7 1 5 c m ，直 径o 1 o 3 c m ；表面黑褐色，有细纵纹，有的皮部脱落，露出黄白色 木部；质硬脆，易折断，断面皮部较广，木部淡黄色，略呈方形，皮 部与木部间常有裂隙。气微，味淡。国内分布较广，四川、江苏、安 徽、浙江、山东、广东、福建均为其产地，其根及茎入药具有风湿、 通经络、消骨埂之功效。中医临床又摸索出其可以用于治疗根骨骨刺、 足跟痛、胆结石、面神经麻痹、外伤性神经损伤、痔疮出血、偏头痛。 药理学证实其具有抗菌作用、镇痛作用、抗炎作用、松弛平滑肌的作 用、利胆作用、免疫抑制作用、抗肿瘤作用、降压作用、降糖作用、 降血清胆固醇作用、抗利尿作用、抗疟作用、引产作用。其根含原白 头翁素及以常春藤皂苷元( h e d e r 玛e n i n ) 、表常春藤皂苷元 ( 印i h e d e r a 喀e 1 1 i n ) 和齐墩果酸( 0 1 e a i l o i ca c i d ) 为苷元的皂苷：威灵 仙2 3 o 邛可拉伯糖皂苷( c p o ) 、威灵仙单糖皂苷( c p l ) 、威灵仙二糖 皂苷( c p 2 ) 、威灵仙三糖皂苷( c p 3 ) 、威灵仙三糖皂苷( c p 4 ) 、威 灵仙三精皂苷( c p 5 ) 、威灵仙三糖皂苷( c p 6 ) 、威灵仙四糖皂苷 ( c p 7 ) 、威灵仙四糖皂苷( c p 8 ) 、威灵仙五糖皂苷( c p 9 ) 、威灵仙 五糖皂苷( c p l o ) 、威灵仙2 3 o 葡萄糖皂苷( c p 2 a ) 、威灵仙表二糖 皂苷( c p 3 a ) 、威灵仙四糖皂苷( c p 7 a ) 、威灵仙四糖皂苷( c p 8 a ) 、 威灵仙五糖皂苷( c p 9 a ) 、威灵仙五糖皂苷( c p l o a ) 、威灵仙二糖皂 苷( c p 2 b ) 、威灵仙二糖皂苷( c p 3 b ) 等。 威灵仙的主要成分皂苷( s a p o n i n ) 是由皂苷元和糖、糖醛酸或其 他有机酸组成的。组成皂苷的糖常见的有d 葡萄糖、l 鼠李糖、d 半乳糖、l 邛可拉伯糖、l 木糖。常见的糖醛酸有葡萄糖醛酸、半乳糖 醛酸，这些糖或糖醛酸往往先结合成低聚糖糖链，然后与皂苷配基分 子中c 3 o h 相缩合，或由两个糖链分别与皂苷配基分子中两个不同 位置上的o h 相缩合，皂苷配基分子中的c o o h 也可能与糖连接， 形成酯苷健。根据皂苷配基的结构分为两大类，一类为甾族皂苷，其 皂苷配基是螺甾烷的衍生物，多由2 7 个碳原子所组成。这类皂苷多 存在于百合科和薯蓣科植物中。另一类为三萜皂苷。其皂苷配基是三 萜( 见萜) 的衍生物，大多由3 0 个碳原子组成。三萜皂苷分为四环 三萜和五环三萜。这类皂苷多存在于五加科和伞形科等植物中。皂苷 能降低液体表面张力而产生泡沫，可以乳化油脂，作为乳化剂、去垢 剂。皂苷内服能刺激消化道粘膜，反射地促进呼吸道和消化道粘膜液 腺的分泌，故具祛痰止咳的功效，不少皂苷还有降胆固醇、抗炎、抑 菌、免疫调节、兴奋或抑制中枢神经、抑制胃液分泌等作用。目前大 量的研究还证明，皂苷类成分具有良好的抗肿瘤作用，而且其抗肿瘤 作用的靶点和途径比较广泛。如在阻遏肿瘤的启动、杀伤和抑制肿瘤 细胞的生成，增强机体免疫功能、阻滞肿瘤细胞有丝分裂、诱导肿瘤 细胞凋亡、抑制肿瘤血管生成、抑制肿瘤细胞的转移，协同其他治疗 手段提高疗效等多个方面具有良好的活性，提示皂苷有很好的研究和 开发前景。 由于体内组织细胞成分复杂，存在许多不可预知的因素和条件， 且也没有对不同时期粒细胞进行直观的检测和分析，而体外培养的细 胞虽然不能完全反映体内细胞的生长状态和生物学特征，但具有成分 单一，实验条件容易控制等优点，我们采用在体外建立细胞株方法来 研究。因此本研究通过利用威灵仙皂苷干预耐全反式维甲酸的m r 2 细胞株，通过w s t - l 、荧光显微镜、流式细胞仪的方法定量、定性了 解其有无诱导m r 2 细胞凋亡的效应，并应用统计学分析差异，进而 为寻找新的安全、有效、经济的治疗急性早幼粒细胞白血病或耐药急 性早幼粒细胞白血病提供实验基础。 材料与方法 1 实验材料： 细胞株：耐全反式维甲酸急性早幼粒细胞白血病细胞株( m r 2 细胞) 引自四川大学华西医学院。 2 实验试剂： 2 1 根据文献威灵仙皂苷( 在泸州医学院药研所) 自行提取【9 】。 2 2r p m i l 6 4 0 培养基( g i b c o 公司) 2 3 新生小牛血清( 中美合资兰州民海生物工程有限公司) 2 4 二甲基亚砜d m s o ( s i g m a 公司) 2 5 青霉素( 华北制药集团有限责任公司) 2 6 链霉素( 华北制药集团有限责任公司) 2 7w s t - 1 细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒( 江苏碧云天生物技 术研究所) 2 8 加m e x i nv - f i t c 细胞凋亡检测试剂盒( 南京凯基生物科技发 展有限公司) 2 99 5 乙醇( 成都金山化学试剂公司) 2 1 0d l o l 大孔树脂( 天津海光化工有限公司) 2 1 1 齐墩果酸对照品( 中国药品生物制品检定所) 2 1 22 5 氨水( 成都科龙化工试剂厂) 2 1 3 香草醛( 成都科龙化工试剂厂) 2 1 4 冰醋酸( 成都陈金化学试剂公司) 2 1 5 高氯酸( 天津西青鑫源公司) 2 1 6 亚砷酸( 黑龙江哈尔滨医大药业有限公司，l o m g 支) 3 实验器材： 3 1 生物安全柜( t d g c 2 j 1 o 5 型，苏州净化设备厂) 3 2 c 0 2 细胞电热恒温培养箱( s 删g 日本产) 3 3 倒置显微镜( 日本o i 脚u s 公司) 3 4 8 3 2 0 型低温高速离心机( 白洋离心机厂) 3 5 普通冰箱( 海尔公司) 3 6 血细胞计数板( 国产) 3 7 微量加样器( 芬兰b i o m t 百得移液公司) 3 8 酶联免疫检测仪( 美国，n l e n n o 公司l o - 2 4 0 v a c 型) 3 9 荧光显微镜( 德国l e i c as 7 0 ) 3 1 0 流式细胞检测仪( 美国b e c k m a nc o u l l 飞r ) 3 1 1 紫外分光光度计( 北京瑞利u 2 1 0 0 ) 3 1 2 电子天平( 上海民桥精密科学仪器有限公司，f a l l 0 4 型) 4 实验方法： 4 1 威灵仙皂苷的提取与测定： 4 1 1 取威灵仙1 千克，以两倍量7 0 乙醇浸泡2 小时。 4 1 2 将威灵仙装柱，用八倍量7 0 乙醇渗滤提取收集滤液8 0 0 m l 。 4 1 3 蒸馏回收乙醇并至无醇味，加蒸馏水稀释成浓度为o 2 咖l 的威灵仙样品溶液，放置过夜。 4 1 4 离心3 5 0 0 转分钟，2 0 分钟，抽滤，收集滤液。 4 1 5 大孔树脂d l o l 处理： a 取d l o l 大孔树脂3 5 0 9 ，用9 5 乙醇浸泡4 8 h 。 b 倾去上浮物后湿法装柱( 柱长3 2 c m ，体积5 5 7 “) 。 c 依次用1 0 0 0 觚7 0 、3 5 、2 0 乙醇淋洗杂质并控制流速 为1 2 m i n ，洗至1 1 1 1 l 洗脱液与2 m l 蒸馏水混合澄清为止。 d 再用蒸馏水洗至洗脱液无醇味时即可，备用。 4 1 6 取滤液上柱。 4 1 7 用六倍体积的1 氨水洗涤，洗至无色或洗脱液不再变色即 可，流速为1 2 m 1 m i n 。 4 1 8 分别用蒸馏水、2 0 乙醇、7 0 乙醇洗涤，流速为1 2 m 1 m i n ，收集滤液。 4 1 9 常温常压下挥醇半小时，收集液体，水浴蒸干，6 0 真空 干燥。共收集粗皂苷2 2 7 4 9 3 9 。 4 1 1 0 用电子天平称量齐墩果酸3 1 3 9 ，用2 5 i i l l 无水乙醇稀释。 分别取o r n l 、o 5 1 i l l 、1 o i i l l 、1 5 m 1 、2 o 耐、2 5 i i l l 于具塞试管中，水 浴挥干。 4 1 1 1 分别加入新制香草醛冰醋酸2 1 1 1 1 ，高氯酸8 m 1 。震荡混匀 后于7 0 水浴加热2 0 分钟，冰水中冷却3 分钟。 4 1 1 2 光谱扫描回示在5 3 2 姗处有最大吸收峰，计算回归方程 为a _ 5 1 18 咖0 8 2 2 ，r = o 9 9 6 。 4 1 1 3 取粗皂苷o 0 4 7 l g ，无水乙醇2 5 武稀释搅拌充分混匀，取 o 2 5 砌加入具塞试管中水浴挥干，加入新制香草醛冰醋酸2 1 1 1 1 ，高 氯酸8 m l 。震荡混匀后于7 0 水浴加热2 0 分钟，冰水中冷却3 分钟。 在5 3 2 m n 处测得吸收值o 4 7 5 0 。计算总皂苷含量为2 3 1 4 。 4 2 药物配制： 威灵仙皂苷粉末用二甲基亚砜( o 0 1 d m s o ) 溶解，配制浓度 为2 0 0u m 、4 0 0u 咖、6 0 0u 咖1 、8 0 0u 咖1 l 、1 0 0 0 u 鲋【1 1 1 、1 2 0 ou 幽 1 1 l ，备用。 4 3 细胞培养： 4 3 1 含1 0 新生小牛血清的r p m l l 6 4 0 培养基的配制：常规消 毒生物安全柜后，将l 心m i l 6 4 0 培养基和新生小牛血清置于安全柜 中，用灭菌用水将i 冲m n 6 4 0 稀释至9 0 0 i i l l ，加入青霉素和链霉素使 之浓度为1 0 0 u 1 1 1 1 ，将培养基用蔡式滤器过滤后按9 0 n 彤瓶进行分装， 新生小牛血清则按1 0 n 1 1 瓶分装，放置2 0 冰箱保存，使用时解冻后 在生物安全柜中将1 0 m 1 血清加入r p m i l 6 4 0 即可，放4 冰箱保存。 4 3 2m r 2 细胞培养：将复苏好的m r 2 细胞以5 1 0 浓度接 种于培养基中，置于3 7 、5 c 0 2 、饱和湿度培养箱培养。每2 3 天换液传代。 4 4 实验分组：以o 0 1 d m s o 作用m r 2 细胞为空白对照组，用 1 o u m o 亚砷酸作用m r 2 细胞为阳性对照组，以不同浓度威灵仙皂 苷作用m r 2 细胞为实验组。 4 5w s t - 1 法检测威灵仙皂苷对m r 2 细胞的增殖抑制作用： 4 5 1w s t - 1 溶液的配制：把1 毫升电子耦合剂加入w s t - 1 粉末 中完全溶解即成w s t - 1 溶液，分装2 0 避光保存。 4 5 2 取对数生长期的细胞，将细胞浓度调整为1 1 0 4 个m l 的细 胞悬液并接种于9 6 孔酶标板，每孔加细胞悬液1 0 0 u l ，共设8 个实验 组( 每组5 个平行孔，并重复实验3 次) ，以终浓度o 0 1 d m s o 为 空白对照组，终浓度1 o u m o 亚砷酸为阳性对照组，终浓度2 0 0u 蚰、4 0 0u 皿、6 0 0u g m l 、8 0 0u 咖l 、1 0 0 0 u g m l 、1 2 0 0u “威 灵仙皂苷为实验组。 4 5 3 置于3 7 、5 c 0 2 、饱和湿度培养箱分别培养2 4 h 、4 8 h 、 7 2 h 。 4 5 4 每孔加入1 0 u 1w s t - 1 溶液，继续在细胞培养箱孵育2 h 。 4 5 5 把9 6 孔板置于摇床上摇一分钟，以充分混匀待检测体系。 4 5 6 在4 5 0 m n 测定，按以下公式计算抑制率。 细胞增殖抑制率( ) = ( 1 一然) 1 0 0 4 6 流式细胞仪检测凋亡率： 4 6 1 取对数生长期的细胞，调整细胞浓度为l 1 0 6 个触接种于 六孔板，设五个实验组( 每组设三个平行对照，实验重复三次) ，以 终浓度o 0 1 d m s o 为空白对照组，终浓度1 u m o l l 亚砷酸为阳性对 照组，终浓度8 0 0u g 埘、1 0 0 0 u 咖l 、1 2 0 0u 鲋【i l l 威灵仙皂苷为实验 组。 4 6 2 置于3 7 、5 c 0 2 、饱和湿度培养箱分别培养7 2 h 。 4 6 3 细胞离心( 2 0 0 0 印m 离心5 m i n ) 收集。 4 6 4 用p b s 洗涤细胞二次( 2 0 0 0 印m 离心5 i i l i n ) 收集细胞。 4 6 5 加入5 0 0 u l 的b i n d i n gb u 舵r 悬浮细胞。 4 6 6 加入5 u l 加m e x i nv - f i t c 混匀后，加入5 u lp r o p i d i u mi o d i d e ，混匀；室温、避光、反应2 0 曲。 4 6 7 用流式细胞仪检测，激发波长e x = 4 8 8 l 吼；发射波长e m 寻 5 3 0 n m 。a 1 i l e x i nv - f i t c 的绿色荧光通过f i t c ( f l l ) 通道检测；p i 红色荧光通过p i ( f l 3 ) 通道检测。并使用未经凋亡处理的正常细胞， 作为对照进行荧光补偿调节去除光谱重迭和设定十字门的位置。 4 7 i nv - f i t c 染色荧光显微镜观察凋亡： 4 7 1 取对数生长期的细胞，调整细胞浓度为4 1 0 5 仙接种 t 于六孔板，设五个实验组( 每组设三个平行对照，实验重复三次) ， 以终浓度o 0 1 d m s o 为空白对照组，终浓度1 u i n 0 1 l 亚砷酸为阳性 对照组，终浓度2 0 0u 酌 1 1 1 、4 0 0u i i l l 、6 0 0u 鲥【i l l 、8 0 0u 咖l l 、l o o o u 咖l 、1 2 0 0u 酌：i l l 威灵仙皂苷为实验组口 4 7 2 置于3 7 、5 c 0 2 、饱和湿度培养箱分别培养7 2 h 。 4 7 3 离心( 2 0 0 0 印m 离心5 m i n ) 收集细胞。 4 7 4 用p b s 洗涤细胞二次( 2 0 0 0 印m 离心5 m i n ) 收集细胞。 4 7 5 加入5 0 0 u 1 的b i n d i n gb u 脓悬浮细胞。 4 7 6 加入5 u la l u l e x i nv - f i t c 混匀后。 4 7 7 力口入5 u lp r o p i d i u mi o d i d e ，混匀。 4 7 8 室温、避光、反应1 5 m i n 。 4 7 9 滴一滴上述染色后的细胞悬液于载玻片上，并用盖玻片盖 上细胞；将盖玻片置于荧光显微镜下观察，a n n e x i nv - f i t c 荧光信 号呈绿色光，p i 荧光信号呈红色。 5 统计学分析： 实验数据计算采用均值标准差( x 士s ) ，各组应用方差分析， 以a - o 0 5 为检验水准，p o 0 5 为差异有统计学意义。 实验结果 l 威灵仙皂苷对m r ：细胞有明显的生长抑制作用： 不同浓度的威灵仙皂苷( 2 0 0u g 1 1 1 l 、4 0 0u i i l l 、6 0 0u g 枷、8 0 0 u 咖l 、l o o o 删、1 2 0 0u 1 1 1 1 ) 对m r 2 细胞均有明显的生长抑制作 用，且呈时间和浓度依赖性。经统计学分析表明，亚砷酸阳性对照组 与皂苷实验组总的差异有统计学意义；亚砷酸阳性对照组与皂苷2 0 0 u 咖1 1 ( p o 0 1 ) 、4 0 0u r n l ( p o 0 1 ) 、6 0 0u n d ( p o 0 5 ) 、8 0 0u 咖l ( p o 0 5 ) 、1 0 0 0 u 酌：1 1 l ( p o 0 5 ) 组差异有统计学意义，与皂苷1 2 0 0 u 蛐组差异无统计学意义；皂苷2 0 0u g 触组与皂苷4 0 0u 以、6 0 0 u 幽1 1 1 组差异无统计学意义，与皂苷8 0 0u 咖1 1 、1 0 0 0 u 咖l 、1 2 0 0u 咖l 组差异有统计学意义( p o 0 5 ) ；皂苷4 0 0u g h d 组与皂苷6 0 0u 酌m 组差异无统计学意义，与皂苷8 0 0u 酣 1 1 l ( p o 0 5 ) 、1 0 0 0 u 酌：i l l ( p o 0 1 ) 、1 2 0 0u 鲂 1 1 1 ( p o 0 1 ) 组差异有统计学意义；皂苷6 0 0u 酌：1 1 l 组与皂苷8 0 0u 鲋【i l l 、1 0 0 0 u 咖l 组差异无统计学意义，与皂苷1 2 0 0 u 咖1 l 组差异有统计学意义；皂苷8 0 0u g m 1 、l o o o u 酌：i l l 、1 2 0 0u 1 1 1 l 组间差异均无统计学意义。威灵仙皂苷对m r 2 细胞生长抑制作用随 威灵仙浓度的增加和作用时间的延长而增强。见表l 与图1 。 2 流式细胞仪a n n e x i nv f i t c p l 双染检测细胞凋亡： 分别用亚砷酸组与皂苷8 0 0u 咖l 、1 0 0 0 u 咖l 、1 2 0 0u 酌m 组作 用m r 2 细胞7 2 小时后应用流式细胞仪检测凋亡率分别为3 9 4 、 2 3 1 、2 7 3 、3 6 7 。统计学分析：亚砷酸组与皂苷1 2 0 0u g 1 1 1 1 组 之间差异无统计学意义；亚砷酸组和皂苷1 2 0 0u 咖1 l 组与皂苷8 0 0 u 鲋【1 1 1 、1 0 0 0 u m l 组间差异有统计学意义；皂苷8 0 0u “组与皂苷 1 0 0 0 u 鲋【1 1 1 组间差异有统计学意义( 见表2 与图2 ) 。 3a 1 1 1 1 e x i nv - f i t c 染色荧光显微镜观察细胞凋亡形态： 在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸( p s ) 只分布在细胞膜脂质双层 的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸( p s ) 由脂膜 内侧翻向外侧。a 【u l e x i i lv 是一种分子量为3 5 3 6 k d 的c a 2 + 依赖性 磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，可在细胞凋亡时与翻 向外侧的磷脂酰丝氨酸胞膜结合，使其荧光信号呈绿光；p i 作为一种 ， 核酸染料，它不能通过完整的细胞膜，但在细胞凋亡时和细胞死亡时 能通过细胞膜使细胞核染色，其荧光信号呈红光。并可见细胞体积缩 小细胞核固缩，继而形成核碎裂和凋亡小体( 见图3 ) 。 表1 不同时间不同浓度威灵仙皂苷作用m 2 细胞的抑制率( x 士s ) ： t 出l e1d i 虢r e n tt i l n e s 、撕t hd i 任- e