（病原生物学专业论文）cgli基因复合体在钝齿棒杆菌中的功能和行为研究.pdf

英文缩略语 8 中国医科大学研究生学位论文独创性声明 本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我 校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 论文作者签名：= 豁丞区日期：丝纽辛岛之扩1 9 中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书 本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究 生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学。本人保 证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科 大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学 校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许 论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容( 保密 内容除外) ，以采用影印、缩印或其他手段保存论文。 论文作者签名： 指导教师签名： 日期： 氅 中文论著摘要 c g l i 基因复合体在钝齿棒杆菌中的功能和行为研究 目的 棒杆菌是工业生产氨基酸的重要菌种。由于发酵生产的规模化和连续性，生 产中极易遭受噬菌体污染，严重影响企业生产过程，并给生产企业带来严重经济 损失。生产中通常采用改进生产工艺，改善卫生条件，控制生产环节等措施预防 噬菌体污染，虽然污染程度有所减轻，但仍时常发生。国内外一直采用菌株诱变 的方法筛选抗噬菌体菌株，试图解决生产中的噬菌体污染问题。由于诱变获得的 突变株存在生长缓慢，或其它生理性状改变，或生产能力下降，或只针对个别噬 菌体有抗性，并易于产生回复突变等问题。所以，很难得到能用于生产的突变株。 因此，噬菌体污染问题一直威胁着氨基酸的发酵生产。本文利用基因工程技术， 在研究c g l i 基因复合体在大肠杆菌中克隆的有效方法基础上，通过将含有源自谷 氨酸棒杆菌的限制修饰系统c g l i 基因复合体导入钝齿棒杆菌构建重组菌株，以探 索c g l i 基因复合体用于构建抗噬菌体基因工程菌的可行性，以期从根本上解决氨 基酸生产中的噬菌体污染问题。同时，对携带c g l i 基因复合体的重组质粒的稳定 性及其对宿主细胞生长代谢的影响进行了研究。 方法 根据g e n b a n k 中c g l i 基因复合体的基因序列设计p c r 引物，并于两端分别 引入b a m h i 酶切位点序列。以谷氨酸棒杆菌c i c c l 0 2 2 6 基因组d n a 为模版，常 规p c r 扩增c g l i 基因片段，与克隆载体p m d l 8 t 连接，构建重组克隆质粒 p m d l 8 t - c g l i 。菌落p c r 筛选转化子，测序分析克隆的基因片段的碱基组成。 b a m h l 分别酶切重组克隆载体p m d l 8 t - c g l i 和棒杆菌穿梭表达载体p j l 2 3 ，将回 收的c g l i 基因片段和p j l 2 3 大片段用d n a 连接酶连接，转化大肠杆菌h b l 0 1 ， 筛选阳性克隆。制备重组质粒p j l 2 3 c g l i ，酶切及p c r 鉴定c g l i 基因片段大小和 连接方向。大量制备重组质粒p j l 2 3 c g l i ，电击转化到钝齿棒杆菌中，用含卡那霉 素的l b 平板筛选阳性克隆。酶切和p c r 鉴定重组质粒后，噬菌体感染实验鉴定 重组钝齿棒杆菌的功能活性。将构建的重组钝齿棒杆菌在无卡那霉素的l b 平板 上连续传1 0 0 次，再从不同传代次数平板上分别挑取1 0 0 个菌落，分别接种到有 和无卡那霉素的l b 平板上，测定重组质粒分离稳定性，将不同传代次数的菌落 接种到无卡那霉素的l b 液体培养基中，利用噬菌体感染实验测定重组质粒的结 构稳定性。以野生钝齿棒杆菌做对照，通过测定生长曲线研究含c g l i 基因复合体 的重组质粒对重组钝齿棒杆菌生长的影响；通过谷氨酸含量测定研究含c g l i 基因 复合体重组质粒对重组钝齿棒杆菌代谢的影响。 结果 实验结果表明，以p 1 p 2 为引物，p c r 扩增得到了与预期大小一致( 2 1 7 7 b p ) 的基因片段。克隆到载体p m d l 8 t 后，经测序分析表明，克隆的基因片段与己知 的c g l i 基因序列同源性达1 0 0 。c g l i 基因与棒杆菌穿梭表达载体p j l 2 3 重组构建 的重组表达质粒p j l 2 3 c g l i ，转化大肠杆菌h b l 0 1 后，获得了阳性克隆菌株。经 酶切和p c r 鉴定证实了重组基因片段大小和正向连接方向。实验发现编码单独限 制酶的基因在大肠杆菌h b l 0 1 中表达了功能活性，但c g l i 基因复合体在大肠杆菌 中未表达功能活性。重组表达质粒p j l 2 3 c g l i 导入钝齿棒杆菌中后构建的重组钝 齿棒杆菌经鉴定表明重组基因片段大小和连接方向未发生变化。功能活性研究表 明，构建的重组钝齿棒杆菌对其相应的5 种噬菌体显示了很强的限制活性，感染 重组钝齿棒杆菌的噬菌体在胞内均未增殖。重组质粒p j l 2 3 c g l i 在钝齿棒杆菌中 的稳定性研究结果表明，重组钝齿棒杆菌连续传10 0 代次后，重组质粒在钝齿棒 杆菌中的分离稳定性和结构稳定性均达1 0 0 ，表明重组质粒在钝齿棒杆菌中很 稳定。生长曲线测定实验结果表明，与野生钝齿棒杆菌相比重组钝齿棒杆菌达到 对数期的时间约延迟- d , 时左右，但达到稳定期的时间趋于相同。谷氨酸产生量 实验结果表明，重组钝齿棒杆菌和野生钝齿棒杆菌在发酵过程中的谷氨酸积累量 的变化趋势基本一致，显示了相同的谷氨酸产生高峰，3 2 h 的最大产生量分别为 2 7 7 7 4 m g l 和2 6 i 3 9 m g l ，表明重组质粒p j l 2 3 - c g l i 的导入并未影响钝齿棒杆菌 的代谢产酸量。 结论 2 本文以m c r b c 限制系统缺陷的大肠杆菌h b l 0 1 作为宿主菌成功克隆了源自 谷氨酸棒杆菌的限制修饰系统c g l i 基因复合体。将含有c g l i 基因复合体的重组质 粒导入钝齿棒杆菌中，成功构建了抗噬菌体重组菌株，证实了c g l i 基因复合体在 钝齿棒杆菌中的抗噬菌体功能活性。携带c g l i 基因复合体的重组质粒在钝齿棒杆 菌中不但具有结构稳定性，而且具有很好的分离稳定性。重组质粒p j l 2 3 c g l i 导 入钝齿棒杆菌虽然对其早期生长有些影响，但并未影响其产生目的产物谷氨酸， 进而证实了c g l i 基因复合体编码的甲基转移酶对宿主基因组d n a 胞嘧啶甲基化 基本不影响钝齿棒杆菌的生长代谢。本文利用c g l l 基因复合体构建抗噬菌体菌株， 为从根本上解决氨基酸发酵生产中的噬菌体污染问题提供了一种有效方法，同时 为c g l i 基因复合体的进一步应用奠定了理论基础。 关键词 c g l i 基因复合体；钝齿棒杆菌；噬菌体抗性；质粒稳定性；生长代谢 英文论著摘要 f u n c t i o n sa n db e h a v i o ro f c g f l g e n ec o m p l e xi n c o r y n e b a c t e r i u m c r e t a nu m o b j e c t i v e c o r y n e f o r mb a c t e r i aa r ei m p o r t a n ti n d u s t r i a lp r o d u c e r so fa m i n oa c i d t h es t a r t e r c u l t u r e sa r ev e r ys u s c e p t a b l et op h a g ei n f e c t i o nb e c a u s eo ft h el a r g e 。s c a l ea n d c o n t i n u i t yo ft h ef e r m e n t a t i o np r o c e s s a sar e s u l t ，t h ep r o b l e m o fp h a g ei n f e c t i o nh a s s e r i o u si m p a c to nt h em a n u f a c t u r ep r o c e s sa n dc a u s e ss e v e r ee c o n o m i cl o s s m e t h o d s t r d i t i o n a l l yu s e dt op r e v e n tp h a g ei n f e c t i o ni nf e r m e n t a t i o ni n d u s t r y i n v o l v ei n a m e l i o r a t i n gp r o d u c t i o nt e c h n o l o g ya n ds a n i t a t i o nc o n d i t i o n s ，c o n t r o l l i n gm a n u f a c t u r e l i n k sa n ds oo n t h o u g hi n f e c t i o nd e g r e ei sa l l e v i a t e d ，t h ep r o b l e ms t i l lo c c a s i o n a l l y a r i s e s s c r e e n i n gr e s i s t a n tm u t a n t sw a su s u a l l ya d a p t e di no r d e rt os o l v et h ep r o b l e m t h em u t a n t so f t e nh a v et h ep r o b l e m so fl a g g e dg r o w t hr a t eo ro t h e rp h y s i o l o g i c a l c h a r a c t e rc h a n g e s ，l o wp r o d u c t i o nc a p a c i t yo rn a r r o wr e s i s t a n c er a n g ea n dr e v e r s i b l e m u t a t i o n s oi ti sn o ta ne a s yt h i n gt oo b t a i nf i n em u t a t i o ns t r a i n sw h i c ha r es u i t a b l ef o r i n d u s t r i a lm a n u f a c t u r e f o rt h er e a s o n sa b o v e ，t h ep r o b l e mo fp h a g ei n f e c t i o nh a s a l w a y sb e e nt h et h r e a tt oa n l i n oa c i dm a n u f a c t u r e i nt h i sp a p e r , i no r d e r t oe x p l o r et h e f e a s i b i l i t yo fa p p l y i n gc g l ig e n ec o m p l e xt oc o n s t r u c te n g i n e e r e dp h a g e 。r e s i s t a n t s t r a i n s ，a n df u r t h e r ，t r yt or a d i c a l l ys o l v et h ep h a g ei n f e c t i o ni nf e r m e n t a t i o ni n d u s t r y ， c g l ig e n ec o m p l e x ，t h e r e s t r i c t i o n - m o d i f i c a t i o ns y s t e mf r o mc o r y n e b a c t e r i u m g l u t a m i c u m ，w a st r a n s f o r m e di n t oc o r y n e b a c t e r i u m c r e n a t u mt oc o n s t r u c tr e c o m b i n a n t s t r a i nb a s e do ne x p l o r i n gt h ea v a i l a b l ea p p r o a c ho fc l o n i n gc g l ig e n ec o m p l e xi n t o ec o l i a tt h es a m et i m e ，t h es t a b i l i t ya n di n f l u e n c eo fr e c o m b i n a n tp l a s m i dc a r r y i n g c g l ig e n ec o m p l e xo nt h er e c o m b i n a n ts t r a i ng r o w t ha n dm e t a b o l i s mw e r es t u d i e d m e t h o d s 4 p c rp r i m e r sw e r ed e s i g n e da c c o r d i n gt ot h es e q u e n c eo fc g l ig e n ec o m p l e xi n g e n b a n k ，a n dt h eb a m h id i g e s t i o ns i t es e q u e n c e sw e r ea d d e dt ot h e i r5 t e r m i n a l u s i n gc o r y n e b a c t e r i u mg l u t a m i c u mc i c c 10 2 2 6g e n o m ef i t st e m p l a t ed n a ，s t a n d a r d p c ra m p l i f i e dt h ec g l ig e n ef r a g m e n t t h er e c o m b i n a n tp l a s m i dp m d 18 - t - c g l lw a s c o n s t r u c t e db yc o n n e c t i n gt h ep c rp r o d u c t sw i t hc l o n i n gv e c t o rp m d 18 一t t h e t r a n s f o r m a n t sw e r ei d e n t i f i e db yc o l o n i a lp c ra n dt h ec g l ig e n ef r a g m e n tw a s s e q u e n c e d t h er e c o m b i n a n tc l o n i n gv e c t o rp m d 18 一t - c g f la n dc o r y n e f o r mb a c t e r i a s h u t t l ev e c t o rp j l 2 3w e r eb o t hd i g e s t e db yb a m h i t h er e c o v e r e dc g f lg e n ef r a g m e n t a n dp j l 2 3b i gf r a g m e n tw e r ec o n n e c t e db yd n al i g a s e ，a n dt h ep r o d u c t sw e r e t r a n s f o r m e di n t oe c o l ih b101 t h er e c o m b i n a n tp l a s m i dw a se x t r a c t e d ，t h es i z ea n d l i g a t i o no r i e n t a t i o no fc g f lg e n ef r a g m e n tw e r ei d e n t i f i e db ye n z y m ed i g e s t i o na n d p c r a m p l i f i c a t i o n t h ep l a s m i dd n a o fl a r g e s c a l ep r e p a r a t i o nw a st r a n s f o r m e di n t o c o r y n e b a c t e r i u mc r e n a t u mb ym e a n so fe l e c t r o t r a n s f o r m a t i o na n dt h et r a n s f o r m a n t s w e r es c r e e n e do nl bp l a t ew i t hk m a f t e ri d e n t i f i e dt h er e c o m b i n a n tp l a s m i db y e n z y m ed i g e s t i o na n dp c ra m p l i f i c a t i o n ，t h ep h a g ei n f e c t i o ne x p e r i m e n tw a s p e r f o r m e dt oi d e n t i f yt h ef u n c t i o na c t i v i t yo fr e c o m b i n a n tc o r y n e b a c t e r i u mc r e n a t u m t h er e c o m b i n a n tc o r y n e b a c t e r i u mc r e n a t u mw a sc o n t i n u o u s l yt r a n s f e r r e d10 0t i m e s 0 1 1l bp l a t ew i t h o u tk m t h ep l a s m i ds e g r e g a t i o ns t a b i l i t yw a sm e a s u r e db y i n o c u l a t i n g10 0c o l o n i e ss e l e c t e df r o me a c ht r a n s f e r r e dt i m et ol bp l a t ew i t ha n d w i t h o u tk m t h ec o l o n i e so fd i f f e r e n tt r a n s f e r r e dt i m e sw e r ei n o c u l a t e dt ol bl i q u i d c u l t u r em e d i aw i t h o u tk m ，a n dt h e np h a g ei n f e c t i o ne x p e r i m e n tw a sc a r r i e do u tt o m e a s u r et h ep l a s m i ds t r u c t u r es t a b i l i t y t h ei n f l u e n c eo ft h er e c o m b i n a n tp l a s m i d c a r r y i n gc g f lg e n ec o m p l e x o nt h eg r o w t ha n dm e t a b o l i s mo fr e c o m b i n a n t c o r y n e b a c t e r i u mc r e n a t u mw a ss t u d i e db ym e a s u r i n gt h eg r o w t hc a l v ea n dt h e g l u t a m a t ep r o d u c t i o no fr e c o m b i n a n ts t r a i n s ，r e s p e c t i v e l y r e s u l t s t h er e s u l to fc l o n i n gc g l ig e n ec o m p l e xi n d i c a t e dt h a tt h ep r o d u c to fa m p l i f i c a t i o n 5 b yp c ru s i n gp 1 p 2a sp r i m e r sw a st h es a m ea sh a de x p e c t e d ( 2 1 7 7 b p ) s e q u e n c e a n a l y s i ss h o w e dt h eh o m o l o g yb e t w e e n t h ec l o n e dg e n ef r a g m e n ta n dt h ek n o w ng e n e s e q u e n c ew a s10 0 p o s i t i v ec l o n e sc o n t a i n i n gt h er e c o m b i n a n te x p r e s s i o nv e c t o r p j l 2 3 c g l lw e r eo b t a i n e da f t e rc g l ig e n ef r a g m e n ta n dc o r y n e f o r mb a c t e r i as h u t t l e v e c t o rp j l 2 3w e r el i g a t e da n dt h e nt r a n s f o r m e di n t oe c o l ih b10 1 t h eg e n es i z ea n d l i g a t i o no r i t e n t a i o na r ec o r r e c ta c c o r d i n gt oe n z y m ed i g e s t i o na n dp c ra m p l i f i c a t i o n i d e n t i f i c a t i o n i tw a sf o u n dt h a tt h ec g l ir e s t r i c t i o ne n z y m ea l o n eh a dt h ef u n c t i o n a c t i v i t yi ne c o l ih b io1 ，b u tn oa c t i v i t yw a sf o u n df o rt h ew h o l ec g l ig e n ec o m p l e xi n e c o l ih b101 t h er e c o m b i n a n tc o r y n e b a c t e r i u mc r e n a t u mw a sc o n s t r u c t e db y t r a n s f o r m i n g r e c o m b i n a n t e x p r e s s i o np l a s m i dp j l 2 3 - c g l i i n t oc o r y n e b a c t e r i u m c r e n a t u m n oc h a n g e sw e r eo b s e r v e di nt h eg e n es i z ea n dl i g a t i o no r i t a t i o na c c o r d i n g t ot h ei d e n t i f i c a t i o nr e s u l t s t h er e s e a r c ho ff u n c t i o na c t i v i t yo fc g l ig e n ec o m p l e xi n c o r y n e b a c t e r i u mc r e n a t u ms h o w e dt h a tt h er e c o m b i n a n tc o r y n e b a c t e r i u mc r e n a t u m h a ds t r o n gc a p a c i t yo fr e s t r i c t i o na c t i v i t yt o5k i n do fr e l a t i v ep h a g e s i tw a si n d i c a t e d t h a tt h ep h a g e si n f e c t i n gt h er e c o m b i n a n tc o r y n e b a c t e r i u mc r e n a t u m f a i l e dt o p r o p a g a t ei n s i d et h eh o s tc e l l t h es t a b i l i t yr e s e a r c ho fr e c o m b i n a n tp l a s m i dr e v e a l e d t h a tt h e s e g r e g a t i o n a n ds t r u c t u r a ls t a b i l i t i e so fr e c o m b i n a n tp l a s m i d i nt h e c o r y n e b a c t e r i u mc r e n a t u mr e a c h e dt o 10 0 a f t e r10 0t i m e so fc u l t u r et r a n s f e r r e d c o n t i n u o u s l y t h em e a s u r eo fg r o w t hr a t ed e m o n s t r a t e dt h a t ，c o m p a r e d w i t hw i l d c o r y n e b a c t e r i u mc r e n a t u m ，t h et i m e o fr e c o m b i n a n tc o r y n e b a c t e r i u mc r e n a t u m r e a c h i n gt ol o g a r i t h m i cp h a s el a g g e da b o u t1h ，b u tt h et i m er e a c h i n gt os t a t i o n a r y p h a s et e n d e dt ob ei d e n t i c a l t h em e a s u r eo fg l u t a m a t ep r o d u c t i o nm a n i f e s t e dt h a t r e c o m b i n a n tc o r y n e b a c t e r i u mc r e n a t u ma n dw i l dc o r y n e b a c t e r i u mc r e n a t u mh a dt h e s a m et e n d e n c yi ng l u t a m a t ea c c u m u l a t i o n b o t ho ft h e mh a dt h es a m et o pp e a ko f g l u t a m a t ea c c u m u l a t i o na t3 2hw i t h2 7 7 7 4 m g la n d2 6 1 3 9 m g l ，r e s p e c t i v e l y t h i s i n d i c a t e st h a tt h ei n t r o d u c t i o no fr e c o m b i n a n tp l a s m i dp j l 2 3 - c g f lh a sn oi m p a c to nt h e m e t a b o l i s mo fc o r y n e b a c t e r i u mc r e n a t u mw i t hr e s p e c tt ot h ea c i dp r o d u c t i o n c o n c l u s i o n 6 u s i n gm c r b cr e s t r i c t i o ns y s t e md e f i c i e n c y e c o l ia sh o s t ，t h er e s t r i c t i o n - m o d i f i c a t i o ns y s t e mc g i ig e n ec o m p l e xf r o mc o r y n e b a c t e r i u mg l u t a m i c u mw a s s u c c e s s f u l l yc l o n e di nt h i sp a p e r p h a g er e s i s t a n c es t r a i n sw e r es u c c e s s f u l l yc o n s t r u c t e d b yt r a n s f o r m i n g t h er e c o m b i n a n t p l a s m i dc a r r y i n gc g l ig e n e c o m p l e x i n t o c o r y n e b a c t e r i u mc r e n a t u m t h ef u n c t i o na c t i v i t ya n db r o a dr e s i s t a n c es p e c t r u mt h a t c g f lg e n ec o m p l e xh a di n t h ec o r y n e b a c t e r i u mc r e n a t u mw a sc o n f i r m e d i nt h e c o r y n e b a c t e r i u mc r e n a t u m ，t h er e c o m b i n a n tp l a s m i d sc a r r y i n gc g f lg e n ec o m p l e x w e r en o to n l ys t r u c t u r a ls t a b i l i t y , b u ta l s os e g r e g a t i o ns t a b i l i t y t h o u g ht h ei n t r o d u c t i o n o fr e c o m b i n a n tp l a s m i dp j l 2 3 一c g l ii n t oc o r y n e b a c t e r i u mc r e n a t u mh a ds o m ei m p a c t s o nt h ee a r l yg r o w t ho ft h er e c o m b i n a n ts t r a i n s ，n oi m p a c tw a sf o u n do nt h ep r o d u c t i o n o fg l u t a m a t e t h u s ，i tw a sc o n f i r m e dt h a tc y t o s i n em e t h y l a t i o ni nt h eh o s tg e n o m e w h i c hw a sm e t h y l a t e db yt h em e t h y l t r a n s f e r a s e se n c o d e db yt h ec g t ig e n ec o m p l e xh a d n oi m p a c to nt h eg r o w t ha n dm e t a b o l i s mo fc o r y n e b a c t e r i u mc r e n a t u m i nt h i sp a p e r , a ne f f e c t i v em e t h o dw a sp r o v i d e dt or a d i c a l l ys o l v et h ep h a g ei n f e c t i o np r o b l e mi n f e r m e n t a t i o ni n d u s t r y a l s o ，t h e o r e t i c a l f o u n d a t i o nw a se s t a b l i s h e df o rf u r t h e r a p p l i c a t i o no fc g l ig e n ec o m p l e x k e y w o r d s c g l ig e n ec o m p l e x ；c o r y n e b a c t e r i u mc r e n a t u m ；p h a g er e s i s t a n c e ；p l a s m i ds t a b i l i t y ； g r o w t ha n dm e t a b o l i s m 7 论文一 限制修饰系统c g l l 基因复合体的克隆 上- j 刖吾 棒杆菌属( c o r y n e b a c t e r i u m ) 的一些菌株是氨基酸生产中的重要菌种，可用于 生产多种氨基酸，如谷氨酸棒杆菌( cg l u t a m i c u m ) 可用于生产l 一谷氨酸、l 一 赖氨酸、l 苯丙氨酸、l 色氨酸、l 一缬氨酸和l 亮氨酸等，钝齿棒杆菌( cc r e n a t u m ) 可用于生产l 一谷氨酸、l 苯丙氨酸、l 一精氨酸等，北京棒杆菌( cb e i j i n g ) 可 用于生产l 脯氨酸等【l2 1 。国内谷氨酸生产用菌种多为钝齿棒杆菌t 6 1 3 的衍生 菌株【3 1 。棒杆菌不仅用于氨基酸的生产，而且因其特有的生理特性，该属部分菌 种如谷氨酸棒杆菌已在环境治理中得到了应用【4 j 】。此外尚有谷氨酸棒杆菌表达外 源抗原的报道，有可能成为一种新型外源基因表达系统1 6 ，7 j 。 然而，由于发酵生产的规模化和连续性，生产过程中极易出现噬菌体感染， 并且一直是影响棒杆菌发酵生产的关键因素之一。生产中如果受到噬菌体的轻度 污染，会使正常生产受到困扰，产酸下降，成本提高，影响企业的效益。若受到 严重污染，常常造成“倒罐”，使生产紊乱，甚至被迫停产，企业将为此付出昂贵 代价。因此，探索治理棒杆菌生产中噬菌体污染的有效措施，对于企业降低生产 成本，提高经济效益具有重要的实践意义。 多年来，生产企业非常重视对噬菌体的防治工作，并采取一系列防治措施， 使噬菌体的污染得到了一定的控制，污染程度逐步减轻，但仍时有发生【五引。国内 一直通过菌株诱变的方法筛选抗噬菌体菌株【9 - 1 2 1 ，以期解决生产中的噬菌体污染 问题，但很难得到能用于生产的突变株。本研究应用微生物免疫原理，利用基因 工程技术构建含有限制修饰系统c g l i 基因复合体的抗噬菌体菌株，探索治理氨基 酸生产中噬菌体污染的有效策略，以期从根本上解决生产中的噬菌体污染问题。 c g l i 基因复合体是在谷氨酸棒杆菌染色体中发现的i i 型限制修饰系统基因，并 严格存在于三株谷氨酸棒杆菌中【1 3 】。该基因系统是由2 1 1 7 b p 组成的连锁基因，分 9 别编码6 6 8 k d a 的甲基转移酶( m 酶) 和3 9 8 k d a 的相应限制性内切酶( r 酶) 【1 4 1 。根据c g l im 基因编码的氨基酸基序分析，推测的c g t lm 酶的识别序列为 5 。g c s g c ( s = c 或g ) 1 4 1 。虽然s c h a f e r 等人利用谷氨酸棒杆菌限制缺陷突变株作 为宿主菌，通过互补实验克隆了c g l ir 基因，证实了其限制活性【1 3 1 ，之后，他们 利用质粒挽救技术在大肠杆菌中克隆了c g l im 基因，证明了其修饰活性 1 4 1 ，但到 目前为止，尚未见到有关两个基因同时被克隆的报道。 在本研究中为了利用c g l i 基因复合体构建抗噬菌体基因工程菌，以及为今后 利用基因工程菌大量制备c g l i 限制酶用于研究和应用，我们首先对c g l i 基因复合 体在大肠杆菌中的克隆进行了研究。 l o 一、实验材料 材料与方法 ( 一) 菌株、质粒和噬菌体 实验所用菌种、质粒及噬菌体见表1 。 表1 ，实验所用菌株、质粒和噬菌体 ( 二) 主要试剂 1 、培养基及抗生素1 6 】 l b 和s o c 培养基；氨苄青霉素和卡那霉素。 2 、工具酶类 实验所用主要工具酶见表2 。 3 、试剂盒和缓冲液 ( 1 ) 试剂盒：本研究所用主要试剂盒见表3 。 ( 2 ) 缓冲液【1 6 】：1 0 x k 缓冲液；6 核酸电泳缓冲液( p h 6 o ) ；5 0 x t a e 缓冲液 ( p h 8 5 ) ；1 0 x t e 缓冲液。 表2 ，实验所用工具酶 表3 ，实验所用试剂盒 4 、实验用引物 引物设计采用o l i 9 0 6 0 软件，由宝生物工程( 大连) 有限公司合成，实验所 用引物见表4 ( 其中p 1 p 2 的5 端加有b a m h i 酶切位点序列) 。 ( 三) 主要仪器设备 p c r 仪( t a k a r a ) ，电泳仪( a d v a n c e b i oc o ，l t d ) ，电泳成像装置( p h a r m a c i a b i o t e c h ) ，紫外切胶装置( 北京市六一仪器厂) ，d n a 测序仪( p e r k i ne l m e r ) ， 质粒提取真空泵( y a m a t o ) ，立式离心机( t o m y ) ，冷冻离心机( 美国科峻仪器公 司) ，高速冷冻离心机( b e c 儿蝌) ，恒温水浴槽 1 2 也器困醐忌世器函醐世暴困糊世嚣函醐 世磊函醐导议醐匣o罢世器坦豫波酬幺u山娶世嚣魈慑忌 耱卜掣尽溢咛_【9nd跫赫糖q迥尽溢工-【q乏厶蕊辐崆函糊 慢函醐慢函郴热卜函醐匣热函醐乏 - o ou0卜毫ogv o o u o o h - u o uo卜ouou-ib b o o o u u o o h no、】nu u o o o 裔b u f u o ” 、o o s 、u uo-iuoou一1n-obo卜oooouuoo一n 、c - u 卜o bo卜o-vou p o l uu卜幽圆圈翻洌猢皆oh co工工v工uuu u v v v v u v工oo扣鑫鎏霜露孑on 卜寸。n【窆苫；配n 山寸山 n 山n 山 则旺 哪堪 碌世 器示 雾而暖龠林 吲僻 ( 上海衡平仪器仪表厂) ，电子分析天平( 北京赛多利斯仪器系统有限公司) ，恒 温振荡器( 东联电子技术开发有限公司) 。 二、实验方法 ( 一) 细菌培养 固体平板培养时，挑取大肠杆菌单菌落“三段”划线接种到l b 平板培养基上 ( 需要时添加抗生素) ，3 7 c 过夜培养。液体培养时，挑取大肠杆菌单菌落或一环 培养物接种于装有液体培养基的三角瓶中( 需要时添加抗生素) 。 ( 二) c g i 基因克隆及鉴定 l 、d n a 模板制备 用灭菌牙签挑取平板上新鲜培养的谷氨酸棒杆菌( c g l u t a m i c u mc i c c l 0 2 2 6 ) 单菌落，加到含有l o p , 1 裂解缓冲液的2 0 0 i t le p 管中，振荡破碎5 m i n 后，9 9 c 变 性l o m i n ，取2 “l 上清作为p c r 反应模板液。 2 、p c r 扩增 以谷氨酸棒杆菌c i c c l 0 2 2 6 基因组d n a 为模板，用引物p 1 p 2 进行p c r 扩 增。p c r 反应条件为：9 4 c 预变性5 m i n ，9 4 。c 变性3 0 s e c ，5 5 。c 退火3 0 s e c ，7 2 c 延伸2 m i n ，3 0 个循环后，7 29 c 再延伸2 m i n 。取5 k t lp c r 反应液在1 琼脂糖凝胶 中进行电泳。 3 、p c r 扩增产物回收 切下琼脂糖凝胶电泳后的p c r 产物，按试剂盒说明书回收p c r 扩增产物。 4 、p c r