（基础兽医学专业论文）类风湿性关节炎动物模型制备与发病机理的探讨.pdf

1 1 类风湿性关节炎动物模型的研究进展1 1 1 1 单纯诱导性r a 动物模型1 1 1 2 病证结合的k a 动物模型4 1 1 3 转基因r a 动物模型5 1 1 4i i 型胶原抗体诱导的r a 动物模型6 1 2 类风性关节炎主要病因- 6 1 2 1 感染因素6 1 2 2 遗传因素8 1 3 类风湿性关节炎发病机理的研究进展9 1 3 1 细胞水平9 1 3 2 分子水平l l 1 4 几1 7 与r a 疾病：1 3 1 4 1 ，1 7 结构与成员1 4 1 4 2 ，1 7 受体1 4 1 4 3 作用机制15 1 4 4 生物学作用。1 5 1 5 多聚蛋白聚糖酶与r a 疾病17 1 5 1 结构1 7 1 5 2 在r a 关节炎中作用一18 1 5 3 调节机制1 9 1 6 软骨细胞的培养概况1 9 1 7 蛋白质免疫印迹技术研究进展2 1 1 8 实时定量p c r 技术研究进展2 2 1 8 1 原理2 2 1 8 2 在医学研究中的应用一2 4 1 9 本研究的目的与意义2 6 2 材料2 9 2 1 制备r a 动物模型的主要试剂2 9 2 2e l i s a 定量检测主要试剂2 9 2 3 软骨细胞培养主要试剂2 9 2 4 蛋白质免疫印迹主要试剂3 0 舢川删 5 3 5 、 、 ， ， 东北农业大学农学博十学位论文 2 5 实时定量p c r 主要试剂3l 2 6 主要仪器与设备3 1 2 7 试验动物3 2 2 8 引物合成3 2 3 ：e i 法3 z i 3 1 类风湿性关节炎动物模型的制备3 4 3 1 1 造模方法。3 4 3 1 2 血清、踝关节组织的采集3 4 3 1 3 关节炎指数的判定标准与发病率3 4 3 1 4 抗i i 型胶原抗体的检测3 5 3 1 5i l - 1 1 3 的e l i s a 定量检测一3 5 3 1 6i l 一1 7 、t n f a 的e l i s a 定量检测3 6 3 1 7 踝关节组织病理切片的制作。3 6 3 1 8 影像学检查3 7 3 1 9 数据分析：3 7 3 2 软骨细胞的培养j 3 7 3 2 1 原代细胞的分离培养3 7 3 2 2 传代培养3 7 3 2 3 冻存与复苏3 8 3 31 l - 1 7 诱导软骨细胞3 8 3 4 w e s t e r n b l o t 检测软骨细胞a d a m t s - 4 的蛋白质表达3 9 3 4 1 蛋白样品的制备：3 9 3 4 2s d s p a g e 分离a d a m t s - 4 基因表达产物3 9 3 4 3a d 州t s _ 4 的半干式电转移4 0 3 4 4a d j 蝴t s _ 4 的免疫学反应4 0 3 4 5 化学发光检测a d a m t s - 4 的表达4 0 3 5 实时定量p c r 检测软骨细胞a d a l 、仃s _ 4 的转录水平4 1 3 5 1 软骨细胞总r n a 提取和质量鉴定4 1 3 5 2 软骨细胞a d j 蝴t s - 4 基因c d n a 的制备4 1 3 5 3 软骨细胞a d a m t s - 4 基因的p c r 扩增4 l 3 5 4 实时定量p c r 体系确定4 2 3 5 5 软骨细胞a d a m t s 4m r n a 表达的实时定量p c r 检测4 3 3 5 6 数据分析4 3 4 结果4 4 4 1r a 动物模型制备结果4 4 4 1 1 r a 动物模型的临床症状4 4 4 1 2r a 大鼠的体重变化4 4 4 1 3 发病率4 4 渗 _ 目录 4 1 4 关节炎指数结果4 5 4 1 5 抗c 抗体的检测结果4 6 4 1 6 ，1 b 、t n f - a 和，1 7 的水平4 6 4 1 7 踝关节组织病理学检查结果4 7 4 1 8 踝关节影象学检查结果4 7 4 2 软骨细胞培养结果4 8 4 2 1 原代软骨细胞培养结果4 8 4 2 2 传代软骨细胞培养结果4 8 4 2 3 软骨细胞冻存复苏结果4 8 4 3a d a m t s - 4 免疫印迹分析结果4 9 4 3 1 软骨细胞上清液蛋白浓度4 9 4 3 2a d a m t s - 4 蛋白s d s p a g e 电泳结果4 9 4 3 3a d 川t s 4 免疫分析结果：4 9 4 4 软骨细胞的a d a m t s - 4 的实时定量p c r 结果5 1 4 4 1 软骨细胞r n a 提取质量鉴定结果5 1 4 4 2 软骨细胞a d a m t s 4p c r 扩增片段鉴定5 1 4 4 3 实时定量p c r 体系矗5 2 4 4 4a d 舢s _ 4 的实时定量p c r 结果5 5 5 讨论5 7 5 1 r a 动物模型制备；5 7 5 1 1 造模方法的选择5 7 5 1 2 模型动物血清中抗i i 型胶原抗体水平5 7 5 1 3t n f a 在r a 中的作用5 8 5 1 41 1 - 1 1 3 在r a 中的作用5 9 5 1 5r a 疾病模型中i l - 1 7 升高的意义5 9 5 1 6 大鼠组织病理学与影像学改变6 0 5 2 软骨细胞的培养6 0 5 2 1 获取原代软骨细胞的方法选择6 0 5 2 2 培养条件的选择6 1 5 2 3 生长特点6 2 5 2 4r a 中软骨细胞的作用6 2 5 3 a d 棚s _ 4 蛋白质免疫印迹结果分析6 3 5 3 1 电转印中转膜缓冲液的选择和转膜效率6 3 5 3 2 转移膜的封闭6 3 5 3 3 免疫印迹中抗体的选择6 3 5 3 4 底物化学发光的选择6 4 5 3 5a d 蝴t s _ 4 蛋白质免疫印迹结果分析6 4 5 4 软骨细胞a d 舢v r r s - 4 基因实时p c r 检测结果探讨6 5 氐| 东北农业大学农学博士学位论文 5 4 1 内参基因的选择6 5 5 4 2 相对定量方法的选择6 5 5 4 3 ，1 7 诱导软骨细胞后检测靶标的选择6 6 5 4 4 ，1 7 诱导软骨细胞上调表达a d a m t s _ 4 的探讨6 6 6 结论( ； ； 致 射6 9 参考文献7 0 附录8 2 攻读学位期间发表的论文8 4 c o n t e n t s c o n t e n ts ：h i n e s ea b s t r a c t i e n g l i s ha b s t r a c t j i i i 1i n t r o d u c t i o n 1 1 1t h ed e v e l o p m e n to f r h e u m a t i o da r t h r i t i sa n i m a ld i s e a s em o d e l 1 1 1 1p u r ei n d u c e dr aa n i m a lm o d e l 1 1 1 2i n d u c e da n ds y m p t o mc o m p l e xr aa n i m a ld i s e a s em o d e l 4 1 1 3t r a n s g e n er aa n i m a ld i s e a s em o d e l 5 1 1 4a n t i b o d yo fc o h a g e ni ii n d u c e dr aa n i m a lm o d e l 6 1 2 t h ec a u s eo f r h e u m a t o i da r t h r i t i s 6 1 2 1a f f e c t i o nf a c t o r ；6 1 2 2g e n e t i cf a c t o r 8 1 3t h ed e v e l o p m e n tm e c h a n i s mo f r h e u m a t o i da r t h r i t i s 9 1 3 1c e l ll e v e l 9 1 3 2m o l e c u l a rl e v e l 1l 1 4i l ，1 7a n dr p ld e s e a s e 1 3 1 4 11 f 1 1 cs t r c t u r ea n dm e m b e r so f ，1 7 1 4 1 4 2r e c e p t o r so f 。，1 7 ：l z i 1 4 3a c t i o nm e c h a n i s mi nr a 1 1 ； 1 4 4b i o l o g ya c t i o ni nr a 1 5 1 5a d a m r sf a m i l ya n dr ad e s e a s e 1 7 1 5 1s t r u c t u r e 1 7 1 5 2a c t i o ni n ：i 乙1 8 1 0 5 3r e g u l a t o r ym e c h a n i s m 1 9 1 6o v e r v i e wo fc h o n d r o c y t ec u l t u r e 19 1 7t h ed e v e l o p m e n to f p r o t e i nw e s t e r nb l o t 2 2 1 8t h er e s e a c hd e v e l o p m e n to f r e a lt i m eq u a n t i t a t i v ep c r 2 l 1 8 1p r i n c i p l e 2 2 1 8 2t h ea p p l i c a t i o ni nm e d i c a lr e s e a r c h 一2 4 1 9t h ea i ma n ds i g n i f i c a n c eo f t h i sr e s e a r c h 2 6 2m a t e r i a l 2 9 2 1m a j o rr e a g e n tf o rr h e u m a t o i da r t h r i t i sa n i m a lm o d e l 3 3 2 2m a j o rr e a g e n tf o re u s ad e t e r m i n a t i o n 一3 3 2 3m a j o rr e a g e n tf o rc h o n d r o c y t ec u l t u r e 3 4 2 4m a j o rr e a g e n tf o rp r o t e i ni m m u n o l o g i c a lb l o t t i n gd e t e r m i n a t i o n 3 4 v 东北农业大学农学博十学位论文 2 5 m a j o rr e a g e n tf o rr e a lt i m ep c r 3 5 2 6m a j o ri n s t r u m e n ta n d e q u i p m e n t 3 5 2 7e x p e r i m e n t a la n i m a l 3 6 2 8p r i m e rs y n t h e s i s 3 6 ：im e t h o d 3 4 3 1t h ep r e p a r a t i o no f r h e u m a t i o da r t h r i t i sa n i m a lm o d e l 3 4 3 1 1m e t h o df o rt h em o d e lp r e p a r a t i o n 3 4 3 1 27 1 1 l ec o l l e c t i o nf o rt h es e n l ma n da n k l et i s s u e 。3 4 3 1 3t h es t a n d a r do f a r t h r i t i si n d e xa n di n d i c e n c e ：。3 4 3 1 4d e t e r m i n a t i o nf o rt h ea n t i b o d yo fc o l l a g e ni i 3 5 ， 3 1 5d e t e r m i n a t i o no f i l - l f lw i t he l i s a 3 5 3 1 6d e t e r m i n a t i o no f ，1 7 、1 n f aw i t he l i s a 3 6 3 1 7p r e p a r a t i o no f p a t h o l o g i c a ls e c t i o no f a n l d e 3 6 3 1 8d e t e c t i o no f i m a g e o l o g yf o rt h ea n k l e 3 7 3 1 9d a t aa n a l y s i s j ：；7 3 2t h ec u l t u r eo fc h o n d r o c y t e 3 7 3 2 1p r i m a r yc h o n d r o c y t ei s o l a t i o na n dc u l t u r e 3 7 3 2 2p a s s a g ec u l t u r e ：一3 7 3 2 3f r e e z ea n dr e c o v e r yf o rc h o n d r o c y t e 3 8 3 ：；，1 7i n d u c e dt h ec h o n d r o c y t e 3 8 3 4w e s t e r nb l o td e t e r m i n gt h ee x p r e s s i o n o f a d a m t s - 4p r o t e i n 3 9 3 4 1n 圮p r e p a r a t i o no f p r o t e i ns a m p l e 3 9 3 4 2s d s p a g ei s o l a t i n ga d a m t s - 4p r o t e i n ：3 9 3 4 3a d a m t s - 4h a l f - d r ye l e c t r i ct r a n s f e r 4 0 3 4 4a 】： a m t s - 4w e s t e r nb l o td e t e r m i n a t i o n 4 0 3 4 51 1 舱c h e m o l u m i n e s c e n c ed e t e r m i n gt h ea d s m t s - 4e x p r e s s i o n ：4 0 3 5r e a lt i m ep c r d e t e r m i n g ea d a m t s - 4m r n a l e v e l 。4 1 3 5 1t h et o t a lr n ae x t r a c t i o na n di d e n t i f y 4 1 3 5 2 i h ep r e p a r a t i o no fc d n ao f 卢l da ! f r s - 4g e n e 4 1 3 5 3t h ea p p p l i c a t i o no f a d a m t s - 4g e n e 4 1 3 5 4t h ed e t e r m i n a t i o no f r e a lt i m es y s t e m 4 2 3 5 5r e a lt i m ep c rd e t e r m i n a t i o na dam ：t s - 4m r n a1 e v e l 4 3 3 5 6d a t aa n a l y z e 。4 3 4r e s u l t s ：j ：j 4 4 4 1r e s u l mf o rt h er aa n i m a lm o d e l 4 4 4 1 1t h ec l i n i c a ls y s t e mo f r ? l a n i m a lm o d e l 4 4 4 1 2t h eb o d yc h a n g eo f r a b o d yw e i g h to f r a t s 4 4 4 1 3i n c i d e n c e 4 4 c o n t e n t s 4 1 4t h ea r t h r i t i si n d e x 4 5 4 1 5t h er e s u l t so f a n t i b o d yf o rt h ec a l l a g e ni il e v e l 4 6 4 1 6t h el e v e lo f ，l b ，1 小陌aa n d ，17 4 6 4 1 7t h er e s u l t so fa n k l eh i s t o p a t h o l o g y 4 7 4 1 8t h ei m a g i n gr e s u l t so fa n k l e 4 7 4 2r e s u l t sf o rt h ec h o n d r o c y t ec u l t u r e 2 8 4 2 1t h ep r i m a r yc h o n d r o c y t e 4 8 4 2 2t h ep a s s a g ec h o n d r o c y t e 4 8 4 2 3 硼1 er e s u l t so ff r e e z i n ga n dr e c o v e r yo fc h o n d r o c y t e 4 8 4 3r e s u l t sf o rt h ea d a m t s - 4w e s t e r nb l o td c t e r m i n a t i o n 。4 9 4 3 1t h ec o n c e n t r a t i o no f s u p c r n a t a n to f c h o n d r o c y t e 4 9 4 3 2r e s u l t sa d a m 盯s _ 4s d s - p a g ee l e c r t o p h o r e s i s 4 9 4 3 3r e s u l t so f a d a m t s d - 4w e s t e r nb l o t 4 9 4 4d e t e r m i n a t i o nr e s u l t so f a d a m t s _ 4b yr e a l lt i m ep c r 51 4 4 1i d e n t i t yo fi t n ae x t r a c t 5l 4 4 2i d e n t i t yo f c d n a 5 l 4 4 3t h ed e t c r m i n a t i o no f r lt i m es y s y t 锄5 2 4 4 4r e s u l t so f a d a m t s - 4m r _ n ad e t e r m i n e db yr e a lt i m ep c r 5 5 5d i s c u s f i o n 5 7 5 1t h ep r e p a r a t i o no fr aa n i m a lm o d e l 5 7 5 1 1s e l e c t i o no f p r e p a r a t i o nm o d e lm e t h o d 5 7 5 1 2 t h e l e v e lo f a n f i b o d y o f c o l l a g e n i i 5 7 5 1 3t h ea c t i o no f 皿呵f ai nr a 5 8 5 1 4t h ea c t i o no f ，1 bi l lr a 5 9 5 1 51 1 l l es i g n i f i c a n c eo f 一1 7l e v e li n c r e a s ei nr a 5 9 5 1 6t h ec h a n g eo f h i s t o p a t h o l o g ya n di m a g e l o l g y 。6 0 5 2t h ec u l t u r eo f c h o n d r o c y t e 6 0 5 2 1 皿1 es e l e c t i o no f m e t h o df o ro b t a i np r i m a r y c h o n c y r t e 6 0 5 2 2t h es e l e c t i o no fc u l t u r ec o n d i f i o n 6 1 5 2 3t l h ec h a r a c t e r i s t i co fg r o w t ho fc h o n d r o c y t e 6 2 5 2 4t h ea c t i o no fc h o n d r o c y t ei nr a 6 2 5 4a n a l y s i sf o rt h ea d a m t s - 4w e s t e r nb l o tr e s u l t s 6 3 5 4 1t h es e l e c t i o no ft r a n s m e m b r a n eb u f f e r 6 3 5 4 2t h eb l o c km e t h o do f m e m b r a n e 6 3 5 4 3t h es e l e c t i o no fa n t i b o d yi nw e s t e r nb l o t 6 3 5 4 4t h es e l e c t i o nf o rt h ec h r o m o g e n i cm e t h o d 6 4 5 4 5a n a l y s i sf o rt h ea d a m t s _ 4w e s t e r nb l o tr e s u l t s 6 4 5 3t h ea p p r o a c ho f a d a m t s _ 4g e n cd e t e r m i n e db yr e a lt i m ep c r 6 5 东北农业大学农学博士学位论文 曼曼曼曼舅舅皇曼曼曼曼曼曼量曼曼曼曼曼曼量曼鼍篁曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼蔓曼! 曼曼曼曼_ n 曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼蔓 5 3 1t h es e l e c t i o no f r e f e r i n c eg e n e 6 5 5 3 2t h es e l e c t o no f r e l a t i v eq u a n t i t a t i v em e t h o d 6 5 5 3 3t h et a r g e ts e l e c t i o nf o ri l - 1 7i n d u c e dc h o n d r o c y t e 6 6 5 a 4a n a l y s i sf o r l l - 1 7i n d u c e dc h o n d r o c y t ei n c r e a s i n g ee x p r e s s i o na d a m t s - 4 6 6 6c o n c l u s i o n 6 8 a c k n o w l o d g e m e n t 6 9 r e f e r e n c e s 7 0 a p p e n d i x 8 2 p u b l i s h e da c a d e m i ca r t i c l e s 8 4 研究生学位论文独创声明和使用授权书 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 ( 洼；麴遗查墓丝益墨缱型直塑笪：奎拦卫窒2 或其他教育机构的学位或证书使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：王穰嚯日期：知口年石月6e l 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解 密后适用本授权书) 学位论文作者签名：王责鼹 日期：l o 加年钿石日 导师签名：溅装 嗍如解石月多日 摘要 摘要 类风湿性关节炎( r h e u m a t o i da r t h r i t i s ，r a ) 是一种以关节滑膜炎、破坏性关节病变为主 要特征的慢性、自身免疫性疾病，致畸、致残率极高。对于r a 至今尚无特效疗法，东北农 业大学生命科学学院生物制药教研室正在研发的治疗r a 的重组基因工程抗体药物，是以抗 引起r a 主要致炎因子i l - 1 b ，i _ , - 1 7 为靶标的双价抗体药物，它的研制成功将填补国内治疗 r a 疾病的双价抗体药物的空白，缩短我国生物制药与世界总体制药水平的差距。为了保证 生物技术药物的安全，有效和质量监控，需要进行临床前药理学的研究，动物模型的构建则 是其中最为重要的组成环节之一，本研究的首要目的是建立能较全面反映r a 特点的动物疾 病模型。 i l - i b 在r a 炎的发病进程中的主要作用机理已经得到了明确的阐述，主要是使滑膜细胞 和软骨细胞合成和释放胶原酶和其他蛋白溶解酶，并抑制软骨细胞合成蛋白多糖基质，从而 在r a 炎的发病进程中起重要作用；而近年来在r a 病人滑膜上清液中发现大量存在的具有 生物活性的i l - 1 7 ，能显著促进炎症细胞分泌t n f a 、i d l b ，与其他炎症细胞因子有协同作 用，间接促进r a 炎症的发展。而多聚蛋白聚糖酶，即带有血小板凝血酶原敏感基序的解整 连素和金属蛋白酶( ad i s i n t e g r i na n dm e t a l l o p r o t e i n a s ew i t ht h r o m b o s p o n d i nm o t i f s ，a d a m t s ) a d a m t s _ 4 对r a 疾病中细胞外基质蛋白聚糖的降解起着重要的作用。在构建动物模型的基 础上，本研究将通过i l - 1 7 诱导体外培养的软骨细胞，检测a d a m t s - 4 的表达情况，深入的 研究1 7 在r a 疾病中的是否在关节局部发挥直接作用，以期进一步探讨r a 在分子水平 的发病机理，更好的为创新药物的临床前药理学研究提供基础。 首先建立类风湿性关节炎动物模型，方法为：4 5 只s d 大鼠随机分成3 组：免疫诱导组， 免疫诱导加寒湿刺激组和对照组。免疫诱导组用鸡i i 型胶原和弗氏完全佐剂乳化混合后 0 2 5 m l 注入大鼠足跖部和背部皮下，7 d 后以0 1 m l 乳化剂加强免疫一次。寒湿刺激组在免 疫诱导的基础上，每天将大鼠放入冰水中1 h ，连续1 4 d 。以相同体积的溶剂冰醋酸注射做为 对照组。诱导后每周测量大鼠体重和足爪肿胀程度，2 1 d 和