PCR技术的原理操作及应用.ppt

PCR技术的原理、操作及应用,西南大学生命科学学院范迪2013.04.11,分子生物学,什么是PCR,PCR:PolymeraseChainReaction，即聚合酶链式反应是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术,PCR技术的发展历史,关于PCR的文章首次由美国科学家KaryMullis等人在Science杂志上发表Science杂志报道了耐热性DNA多聚酶Taq酶（生活在温泉中的水生嗜热杆菌内提取到的一种耐热的DNA聚合酶）的发现,预示着分子时代的到来。12月Science杂志将PCR和它所使用的聚合酶命名为第一个“年度分子”。1993KaryMullis因PCR的发明获得诺贝尔化学奖。,PCR技术的原理1,遗传物质：细胞核染色体DNA（脱氧核糖核酸和磷酸链和碱基构成)碱基（A、T、C、G）是按双链螺旋排列的，碱基序列的长度和排列的顺序决定了生物的多样性。比如人类体细胞中共有31亿个碱基对，按上述的0.1%的差，人和人之间有3百万个碱基对的差别。DNA双螺旋结构和遗传密码子的发现，开创了分子生物学的时代。,PCR技术的原理2,基本原理DNA的半保留复制原则碱基互补配对原则A=T，G=CPCR的基本工作原理就是以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机理沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。,PCR技术的原理3,PCR反应的体系包括7种基本成分：模板（TemplateDNA）引物（Primer）TaqDNA聚合酶dNTPTaq聚合酶缓冲液（TaqBuffer）,PCR技术的原理4,基本反应步骤：变性(denaturation)-高温下将模板DNA双链打开退火(annealing)-引物在较低温度下以共价键结合到模板DNA互补部位延伸(extension)-Taq酶作用下，不断向引物3端添加dNTP，DNA链不断延伸,PCR技术的原理5,重复13步2535轮,目的DNA片段扩增100万倍以上,DNA双螺旋,DNA单链与引物复性,DNA变性形成2条单链,子链延伸DNA加倍,以温度变化来控制反应阶段,PCR技术的优点,优点:特异灵敏度高皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平能从100万个细胞中检出一个靶细胞病毒检测的灵敏度可达3个RFU简便、快速、自动化一次性加好反应液，24小时完成扩增扩增产物一般用电泳分析对标本的纯度要求低血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA,PCR技术的局限性,为了构建特定引物，使特定DNA序列的选择性扩增，必须有一个庞大的已知序列的数据库。聚合酶链反应效率差异很大，根据不同的因素需要优化反应条件。PCR技术扩增产物的长度有限。,标准的PCR反应体系,10扩增缓冲液5ul模板DNA0.12ug引物各10100pmol4种dNTP混合物各200umol/LTaqDNA聚合酶2.5UMg2+1.5mmol/L加双蒸水至50ul,可以按照比例放大或者缩小体系，不同的PCR反应需要优化按照实验方案进行即可,PCR循环参数,94，3min；94，45s；58，1min；72，1min；循环30次72，10min；16保温,（热力学参数）,94，3min；94，45s；58，1min；循环30次72，1min；72，10min；16保温,94预变性，3min使DNA双链完全打开,退火：58，1min温度由引物长度和GC含量决定。增加温度能减少引物与模板的非特异性结合，降低温度可增加反应的灵敏性。,变性：94变性，45s使双链DNA解链为单链,延伸：72，1min温度为Taq酶最适反应温度72时间由扩增片段的长度决定1min扩增1KB,PCR扩增产物检测1,凝胶电泳缓冲液配方10TBE缓冲液(每升)：Tris107.8gBoricAcid55.0gEDTA(Na2)8.2g10TAE缓冲液(每升)：Tris48.4g冰乙酸11.42g0.5mol/LEDTA20ml用电泳缓冲液制备1.5%琼脂糖凝胶，按每孔8ulPCR产物上样至胶中。100伏电泳30min，紫外观察并拍照记录。,PCR扩增产物检测2,PCR扩增产物检测及结果判定,PCR技术的注意事项,防止污染，建立良好的质量控制，避免污染。引物设计合理Taq酶扩增错误率较高，大约1/100对碱基/20个循环镁离子浓度对反应效率的影响仪器稳定性，升降温速率，管子的密合度等设置对照：PCR反应针对模板有阳性/阴性对照阳性：验证PCR反应体系和条件的正确性阴性：验证PCR反应有无污染,PCR技术的应用,基因克隆、测序和表达等法医学个体识别和亲子鉴定遗传性疾病检测、肿瘤诊断、病原体检测等,基因克隆和表达,DNA指纹技术1,1984年英国的遗传学家AlecJeffreys在进行肌红蛋白的DNA序列研究时，意外发现非功能DNA（不产生蛋白的DNA）上重复着一种小片段DNA，这一含15个左右碱基的DNA片段，在不同个体间重复的频率及位置有明显的不同，Jeffreys首先在自己的DNA上进行研究，验证了这一技术，如果我们有血缘关系，这些不同会大大缩小。,Jeffreys命名这一技术为DNA指纹技术（DNAfingerprint）。,DNA指纹技术2,采集血样（毛发、精液、口腔粘膜细胞），分离DNA，用PCR将选定的DNA片段放大，并进行对比，统计分析，便可得出是否为作案凶手或是否有血缘关系。,分子诊断学,分子诊断学是以分子生物学理论为基础，利用分子生物学的技术和方法研究人体内源性或外源性生物大分子和大分子体系的存在、结构或表达调控的变化，为疾病的预防、预测、诊断、治疗和转归提供信息和决策依据。,分子诊断学的发展阶段,分子诊断学大致经历了3个阶段：（1）利用DNA分子杂交技术进行遗传病的基因诊断；（2）以PCR技术为基础的DNA诊断，特别是定量PCR