（外科学专业论文）水通道蛋白aqp1、aqp4与慢传输型便秘的相关性研究.pdf

r 目录 l i i ii ii iii if l liiii ii il y 18 0 010 0 中文摘要一l 英文摘要”4 英文缩写8 研究论文水通道蛋i 刍a q p 1 、a q p 4 与慢传输型便秘的相关性研究 前言一9 9 日u 舌“ 材料与方法l o 结果l3 附图15 附表2 0 讨论2 1 结 仑2 3 参考文献2 4 综述2 7 致谢4 0 个人简历4 l 中文摘要 水通道蛋白a q p 1 、a q p 4 与慢传输型便秘的相关性研究 摘要 目的：当前社会，随着人们饮食习惯的改变和生活节奏的加快，便秘 已经成为严重影响人们健康和日常生活工作的一种常见疾病。世界卫生组 织专门为此制定了罗马i i i 诊断标准来指导临床便秘的诊断和治疗。其中 慢传输型便秘是其中最为常见和严重的一种类型，具体到临床就是指患者 出现：大便量太少、太硬、排出太困难，或合并一些特殊症状，如：长时 间用力排便、直肠胀感、排便不尽感，甚至需用手法帮助排便；在不使用 泻剂的情况下，7 天内自发性排空粪便不超过2 次或长期无便意。便秘患 者特别是慢传输型便秘患者往往是十分痛苦的，而且常常引起其它疾病， 危害人类健康。因此，如何更好，更彻底的治愈此病就成为医务工作者的 责任，但是治病求因，而当前对于便秘的发病原因的研究尚处于起步阶段， 鉴于此，本研究试从分子生物学角度来探讨慢传输型便秘的发病原因。应 用免疫组化、图像分析等技术来研究a q p 1 、a q p 4 在慢传输型便秘患 者结肠黏膜上的表达与正常人结肠黏膜上表达的差异来推断，水通道蛋白 a q p 1 、a q p 4 在慢传输型便秘患者疾病发生发展中所起的作用及意义。 方法：选取河北医科大学第三医院肛肠外科0 8 年9 月份珈9 年1 1 月份 经初诊，详细询问病史、体格检查、实验室检查等排除肠梗阻和巨结肠等 其它器质性病变，符合罗马i i i 标准，行3 粒标记物1 2 0 d 、时法结肠传输试 验，结果回报7 2 1 2 0 d 、时尚有翌o 的标记物残存于结肠中的慢传输型便 秘患者2 5 t 歹4 ，所有患者均住院行结肠次全切除手术，术后标本取近端升结 肠和远端降结肠，每位患者各取两处；取正常人( 为无便秘及长期服用泻 剂辅助排便病史者，无腹泻等其他类似病史者) 的升结肠和降结肠结肠标 本2 0 歹l j 作为对照组。分组方法：全部标本分为四组，试验组l ：慢传输型 便秘患者2 5 例的升结肠结肠标本，男性2 例，女性2 3 例，年龄3 6 - - - 7 1 岁，平均 年龄4 8 6 0 + 2 0 0 岁，便秘病史1 - - - 2 3 年，平均5 2 5 + 1 5 0 年：试验组2 ：慢传 输型便秘患者的降结肠结肠标本，患者资料同；对照组l ：无便秘史患者 升结肠部位标本2 0 例，男性l 例，女性1 9 例，年龄3 3 6 8 岁，平均年龄 4 3 7 2 + 1 5 0 岁：对照组2 ：同对照组1 ，取其降结肠部位标本。试验组和对 中文摘要 照组的性别、年龄、病史的差别无统计学意义。 所取标本全部用4 多聚甲醛灌流固定，2 4 6 , 时后将固定好的组织块 经常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。接下来把包埋好的石蜡块 在切片机上，连续切片，厚度为5 # m ，取其中四片分别裱于涂有蛋白甘油 ( 用于普通h e 染色) 及多聚赖氨酸( 用于免疫组织化学染色) 的载玻片 上，最后分别用h e 看f f 免疫组化的方式给选取的切片染色。最后在高倍镜 下分别观察a q p 1 、a q p 4 的表达并用人工计数和自动图像分析两种方 法检测其在正常人结肠与慢传输型便秘患者中结肠的表达差别。 结果： la q p 1 在2 5 例慢传输型便秘患者和2 0 例正常人结肠黏膜上皮细胞 顶端、基底侧和腔面都有表达，且主要表达于吸收细胞，杯状细胞有少量 表达，表达阳性率为1 0 0 。表达部位在升结肠和降结肠无明显差异( p o 0 5 ) 。但慢传输型便秘患者( 试验组) 结肠黏膜细胞上的表达明显高 于正常人( 对照组) 结肠黏膜细胞上的表达。统计学分析后显示慢传输型 便秘患者即实验组和正常人即对照组结肠黏膜上a q p 1 表达有显著差 异，差别有统计学意义( p o 0 5 ) 。 结论： la q p 1 在全结肠都有表达，升结肠和降结肠无差异，但慢传输型便 秘患者结肠黏膜与正常人结肠黏膜相比显著高表达。说明a q p 1 在结肠 对于水的重吸收中起了重要作用，可能对于慢传输型便秘的发生、发展有 一定的作用。 2a q p 4 在本实验研究中正常人的升结肠、降结肠均无表达，在慢 传输型便秘患者升结肠有少量表达，而降结肠则无表达。说明a q p 4 在 人体结肠中对于水的重吸收未起到重要的作用，可能仅仅是少量参与了某 些过程，对于慢传输型便秘的发生、发展影响不大。 中文摘要 关键词：水通道蛋白；慢传输型便秘；结肠；上皮细胞；免疫组化 英文摘要 ar e s e a r c ho nc o r r e l a t i o nb e t w e e n a q p - 1 、a q p - 4a n ds l o w t r a n s i tc o n s t i p a t i o n a b s t r a c t o b j e c t i v e ：o w e i n gt ot h ec h a n g i n go fd i e t e t i ch a b i ta n da c c e l e r a t i n go f p a c eo fl i v i n g ，c o n s t i p a t i o nh a sa l r e a d yb e c o m eac o m m o nd i s e a s ew h i c h a f f e c t sp e o p l e sh e a l t ha n d d a i l yl i f ea n dw o r ks e r i o u s l yi nc u r r e n ts o c i e t y i n o r d e rt os o l v et h i sp r o b l e m ，w h o ( w o r l dh e a l t ho r g a n i z a t i o n ) e s p e c i a l l y f o r m u l a t e dr o m e i l ld i a g n o s t i cc r i t e r i at og u i d et h ed i a g n o s i sa n dt r e a t m e n t o fc o n s t i p a t i o n a m o n ga l lt y p e so fc o n s t i p a t i o n ，s l o wt r a n s i tc o n s t i p a t i o ni s t h em o s tc o m m o na n ds e r i o u so n ew i t ht h ef o l l o w i n gc l i n i c a ls y m p t o m s ：t h e v o l u m eo fs t o o li st o os m a l l ，h a r df e c e s ，h a v i n gd i f f i c u l t yd u r i n gd e f e c a t i o n ， a n ds o m e t i m e sw i t hs o m es p e c i a ls y m p t o m s ，s u c ha s ：d e f e c a t i n gf o r c i b l y p r o l o n g e d l y 、h a v i n gs e n s a t i o no f r e c t u mf u l l n e s so rs e n s a t i o no fi n c o m p l e t e b o w e le v a c u a t i o n ，e v e nd e f e c t i n gw i t hh a n d sh e l p o rd e f e c t i n gs p o n t a n e o u s l y l e s st h a nt w i c ei no n ew e e k ，o rh a sn oa w a r e n e s so fd e f e c t i o nf o rl o n g t i m ew i t h o u tt h eh e l po fc a t h a r t i c s c o n s t i p a t i o np a t i e n t se s p e c i a l l yt h o s e p a t i e n t sw i t hs l o wt r a n s i tc o n s t i p a t i o nu s u a l l ys u f f e ral o t ，a n di ta l w a y sc a u s e s o t h e rd i s e a s e sd o i n gh a r mt op e o p l e sh e a l t h t h e r e f o r e ，c u r i n gc o n s t i p a t i o n t h o r o u g h l yb e c o m e sar e s p o n s i b i l i t yo fm e d i c a lw o r k e r s m e d i c a lw o r k e r c a nc u r et h ed i s e a s eo n l yi ft h ee t i o l o g yi sf o u n d ，b u tt h er e s e a r c ho ne t i o l o g y o fc o n s t i p a t i o ni ss t i l la tas t a r t i n gs t a g e g i v e nt h i sf a c t ，t h i sr e s e a r c ha t t e m p t s t oi n v e s t i g a t et h ee t i o l o g yo fs l o wt r a n s i tc o n s t i p a t i o nf r o mt h ep e r s p e c t i v eo f m o l e c u l a rb i o l o g y t e c h n i q u e ss u c ha si m m u n o h i s t o c h e m i s t r ya n di m a g e a n a l y s i sa r eu s e dt oi n v e s t i g a t et h ed i f f e r e n c ei na q p - 1 ，a q p 一4e x p r e s s i o no n t h ec o l o n i cm u c o s ao fp a t i e n t sw i t hs l o wt r a n s i tc o n s t i p a t i o na n dn o r m a ls u b j e c t a tl a s t ，t h er o l et h a ta q p - 1a n da q p - 4 p l a yi nt h eo c c u r r e n c ea n d d e v e l o p m e n to f s l o wt r a n s i tc o n s t i p a t i o nw i l lb ed e d u c e df r o mt h ed i f f e r e n c e m e t h o d ：t a k et h ec a s e sf r o mr e c t u m h o s p i t a lo fh e b e im e d i c a lu n i v e r s i t y ( c a s e s s u r g i c a ld e p a r t m e n to ft h et h i r d f r o ms e p ，2 0 0 8 一n o v ，2 0 0 9 ) w h o 4 英文摘要 c o n f 0 1 t nt or o m e i i ic r i t e r i aa n dw i t h o u to r g a n i cd i s e a s e ss u c ha s i n t e s t i n a l o b s t r u c t i o na n dm e g a c o l o na f t e rf i r s tv i s i t ，i n q u i r i n gd i s e a s eh i s t o r yi nd e t a i l ， p h y s i c a le x a m i n a t i o na n dl a b o r a t o r ye x a m i n a t i o n g i v ee a c hp a t i e n to ft h e 2 5c a s e sw i t hs l o wt r a n s i tc o n s t i p a t i o n3m a r k e r sf o r12 0h o u r s ，a n dt h e r e s u l t ss h o w e dt h a tt h e r ea r em o r et h a n2 0 o fm a r k e r ss t i l lr e m a i ni nt h e c o l o no ft h ep a t i e n t sr a n g i n gf r o m7 2 - 12 0h o u r a f t e rt r e a t i n ga l lt h ep a t i e n t s w i t hs u b t o t a lc o l e c t o m ys u r g e r y , t a k et w os a m p l e sr e s p e c t i v e l yf r o mp r o x i m a l a s c e n d i n gc o l o na n dd i s t a ld e s c e n d i n gc o l o no f e a c hp a t i e n t t a k e2 0s a m - p i e so fa s c e n d i n ga n dd e s c e n d i n gc o l o nf r o mn o r m a ls u b je c t ( w i t h o u th i s t o r y o fc o n s t i p a t i o no rt a k i n gc a t h a r t i c sa s s i s t i n gd e f e c a t i o ni nl o n g t e r ma n dd i a r - - r h o e aa n da n a l o g o u sd i s e a s e sh i s t o r y ) a sc o n t r o lg r o u p g r o u pm e t h o d ： s a m p l e sa r ed i v i d e di n t of o u rg r o u p s ：e x p e r i m e n t a lg r o u p 1 ：2 5a s c e n d i n g c o l o ns a m p l e st a k i n gf r o m2 5s l o wt r a n s i tc o n s t i p a t i o np a t i e n t s ( 2m a l e s ，2 3 f e m a l e s ，w i t ha g ef r o m3 6 71 ，a v e r a g i n g4 8 6 0y e a r so l d ；c o n s t i p a t i o nh i s t o r y o f1 2 3y e a r s ，a v e r a g i n g5 2 5y e a r s ) ；e x p e r i m e n t a lg r o u p 2 ：d e s c e n d i n g c o l o ns a m p l e sf r o mt h ea b o v e2 5p a t i e n t s ；c o n t r o lg r o u pl ：2 0c a s e so fa s c e n d i n gc o l o ns a m p l e sf r o mp a t i e n tw i t h o u tc o n s t i p a t i o nh i s t o r y , 1f e m a l e ，1 9 f e m a l e s ，w i t ha g ef r o m3 3 6 8y e a r so l d ，a v e r a g i n g4 3 7 0y e a r s ；c o n t r o l g r o u p 2 ：t a k i n gs a m p l e so fd e s c e n d i n gc o l o nf r o mt h ep a t i e n t so f c o n t r o lg r o u p 1 t h ed i f f e r e n c eo fg e n d e r , a g e ，d i s e a s eh i s t o r yb e t w e e ne x p e r i m e n t a lg r o u p a n dc o n t r o lg r o u pa r en o tc o n s i d e r e dt ob es t a t i s t i c a l l ys i g n i f i c a n t a l lt h ea b o v es a m p l e sa r ep e r f u s i o nf i x e db y4 p a r a f o r m a l d e h y d ef o r 2 4h o u r s ，t h e nt h ef i x e de x p l a n t sw i l lg e tt h r o u g hc o n v e n t i o n a lg r a d i e n td e h y d r a t i o no fa l c o h o l ，x y l e n et r a n s p a r e n c e ，p a r a f f i n - e m b e d d e di nc o n s e q u e n c e t h e n ，t h ee m b e d d e dp a r a f f i nw i l lb es e r i a ls e c t i o n e db ys l i c e r , w i t hat h i c k n e s s o f5 肛m ；n e x t ，f o u rp i e c e so ft h e ma r em o u n t e do ns l i d eg l a s sc o a t e dw i t hp r o t e i ng l y c e r o l ( u s e di no r d i n a r yh es t a i n i n g ) a n dp o l y l y s i n e ( u s e di ni m m u n o h i s t o c h e m i c a ls t a i n i n g ) ；a tl a s t ，s t a i nt h ec h o s e ns l i c ew i t hh ea n di m m u - n o h i s t o c h e m i s t r y f i n a l l y , o b s e r v et h ee x p r e s s i o no fa q p 1 a n da q p - - 4 t h r o u g hh i g h - p o w e r e dm i c r o s c o p ea n dd e t e c tt h ed i f f e r e n c eo fa q p 一1a n d a q p 一4e x p r e s s i o ni nt h ec o l o no fn o r m a ls u b j e c ta n dp a t i e n tw i t hs l o wt r a n s i t 5 英文摘要 c o n s t i p a t i o nu s i n gm a n u a lc o u n t i n ga n da u t o m a t i ci m a g ea n a l y s i s r e s u l t s ： 1 a q p 一1 h a se x p r e s s i o n si nc o l o n i cm u c o s ae p i t h e l i a lc e l l t o p 、 b a s o l a t e r a la n dc a v i t ys u r f a c eo f 2 5c a s e so f s l o wt r a n s m i tc o n s t i p a t i o na n d2 0 c a s e so fn o r m a lp e o p l e s ，a n dm a i n l ye x p r e s s e si na b s o r p t i v ec e l lw i t hs m a l l a m o u n to fe x p r e s s i o ni ng o b l e tc e l l s ，w i t ht h ep o s i t i v ee x p r e s s i o nr a t eo f 10 0 i t se x p r e s s i o ni na s c e n d i n gc o l o na n dd e s c e n d i n gc o l o nh a sn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c e ( p 0 0 5 ) h o w e v e r ，a q p 一1e x p r e s s i o ni nc o l o n i cm u c o s a lc e l l o fp a t i e n t sw i t hs l o wt r a n s i tc o n s t i p a t i o n ( e x p e r i m e n t a lg r o u p ) i so b v i o u s l y h i g h e rt h a nt h a ti nn o r m a ls u b j e c t ( c o n t r o lg r o u p ) s t a t i s t i c a la n a l y s i ss h o w e d t h e a q p - 1e x p r e s s i o ni nc o l o n i cm u c o s ao fp a t i e n t sw i t hs l o wt r a n s i tc o n s t i p a t i o ne x p r e s s i o n ( e x p e r i m e n t a lg r o u p ) a n dn o r m a ls u b j e c t ( c o n t r o lg r o u p ) h a ss i g n i f i c a n td i f f e r e n c e ，p 0 0 5w a sn o t c o n s i d e r e dt ob es t a t i s t i c a l l ys i g n i f i c a n t c o n c l u s i o n ： 1 a q p 一1h a se x p r e s s i o ni nt o t a lc o l o na n dt h ee x p r e s s i o ni na s c e n d i n g a n dd e s c e n d i n gc o l o ni ss a m e ，b u ti t se x p r e s s i o ni nt h ec o l o nm u c o u so f p a t i e n tw i t hs l o wt r a n s i tc o n s t i p a t i o ni so b v i o u s l yh i g h e rt h a n i nt h ec o l o n m u c o u sm e m b r a n eo fn o r m a ls u b j e c t t h i sp h e n o m e n o ni n d i c a t e sa q p 一1 p l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei nt h ep r o c e s so fc o l o nr e a b s o r b i n gw a t e ra n da q p 一1 6 英文摘要 m a yi n f l u e n c et h eo c c u r r e n c ea n dd e v e l o p m e n to fs l o wt r a n s i tc o n s t i p a t i o n 2 a q p - 4h a sn oe x p r e s s i o ni nn o r m a ls u b je c t st o t a lc o l o n ，b u th a ss m a l l a m o u n to fe x p r e s s i o ni ns l o wt r a n s m i tc o n s t i p a t i o np a t i e n t sa s c e n d i n gc o l o n a n dn oe x p r e s s i o ni nt h e i rd e s c e n d i n gc o l o n t h i si n d i c a t e sa q p 4d o e s n t p l a ya ni m p o r t a n tr o l ei nc o l o n sr e - a b s o r p t i o no fw a t e r , o n l yp a r t i c i p a t i n ga l i t t l e t h e r e f o r e ，a q p 一4i m p a c t st h eo c c u r r e n c ea n dd e v e l o p m e n to fs l o w t r a n s m i tc o n s t i p a t i o nl i t t l e k e yw o r d s ：a q u a m a r i n e ；s l o wt r a n s m i tc o n s t i p a t i o n ；c o l o n ；e p i t h e l i a l c e l l s ；i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y 7 英文缩写 一一_一一一 英文缩写 a q p 1 a q p 4 n t c s t c 0 0 c m c y p 英文缩写 英文全称 a q u a p o r i n s 一1 a q u a p o r i n s 一4 n a t u r et r a n s a v ec o n s t i p a t i o n s l o wt r a n s a v ec o n s t i p a t i o n o u t l e to b s t r u c t i v ec o n s t i p a t i o n m i x t i v ec o n s t i p a t i o n p e r c e n t a g eo fp o s i t i v ec e l l s 中文全称 水通道蛋白1 水通道蛋白4 传输时间正常型便秘 慢传输型便秘 出口梗阻型便秘 混合型便秘 阳性细胞分析百分比 m dm a c s s c l i n ec e l la v e r a g eo p t i c o l 阳性细胞平均光密度 d e n s i t y c g c o n t r o lg r o u p对照组 t g t e x tg r o u p实验组 一一一 8 研究论文 水通道蛋白a q p 1 、a q p 4 与慢传输型便秘的相关研究 - 屿t 刍 丽吾 水通道蛋白( a q p s ) 是上世纪8 0 年代末9 0 年代初发现的一类对水 具有高度通透性的通道蛋白，它普遍存在自然界，尤其是在哺乳动物某些 组织和细胞中，其所介导的水分子的快速被动跨生物膜转运，已被证实是 水进出细胞的主要途径之一。到目前为止，在哺乳动物中己发现存在1 3 种不同亚型的a q p 蛋白( a q p 0 - - 一1 2 ) ，每一亚型都有其结构特点、组织 位点、通透性及调节特性。而在消化系统中共发现有l o 种水通道蛋白亚 型表达，分别是a q p 1 - - - 5 及a q p 7 1 0 、a q p 1 2 ，结肠中发现了上述 中前八种亚型表达并被试验所证实。其中a q p 1 是所有a q p s 最先被发 现的一个具有水转运功能的亚型，也是目前为止发现的在组织中表达最广 泛，被研究最全面、深入的一种亚型。a q p 4 是之后被发现的一种亚型， 目前研究发现其与水肿的发生、发展有密切的相关性。但其是否在结肠中 表达，目前尚无定论，与肠道水代谢的关系，特别是与便秘腹泻等水代谢 异常所致疾病的相关性仍无明确报道。本实验通过应用免疫组织化学技 术，检测a q p 1 和a q p 4 在慢传输型便秘患者结肠上的表达及分布，初 步探讨其在慢传输型便秘发生、发展中的作用及意义，从分子生物学角度 研究此病的发病机制。 研究论文 材料与方法 l 材料 1 1 结肠标本来源： 取河北医科大学第三医院2 0 0 8 年9 月 - 2 0 0 9 年1 1 月间2 5 例临床资 料完整行结肠传输试验明确诊断为慢传输型便秘的患者的升结肠和降结 肠标本，其中男性2 例，女性2 3 例，年龄3 6 - 7 1 岁，平均年龄为4 8 6 0 - 士2 0 0 岁，便秘病史1 - 2 3 年，平均5 2 5 + 1 5 0 年。其中术前结肠传输试验检查 标记物大部分残留于升结肠部位，诊断为升结肠传输迟缓的1 3 例；标记 物大部残留于降结肠，诊断为降结肠传输迟缓的1 2 例。所有患者均未发 现有其他消化系统器质性病变存在，均顺利行结肠次全切除手术。同时取 同期2 0 例结肠传输试验正常未诊断为慢传输型便秘的患者或无便秘病史 的患者的升结肠和降结肠标本，其中男性1 例，女性1 9 例，年龄3 3 - 6 8 岁，平均年龄4 3 7 2 + 1 5 0 岁。 1 2 分组方法 全部标本分为四组，试验组1 ：慢传输型便秘患者2 5 例的升结肠结 肠标本，男性2 例，女性2 3 例，年龄3 6 7 l 岁，平均年龄4 8 6 0 - a ：2 0 0 岁，便 秘病史l 2 3 年，平均5 2 5 - 4 - 1 5 0 年；试验组2 ：慢传输型便秘患者的降 结肠结肠标本，患者资料同；对照组1 ：无便秘史患者升结肠部位标本 2 0 例，男性1 例，女性1 9 例，年龄3 3 , - , 6 8 岁，平均年龄4 3 7 2 + 1 5 0 岁；对照 组2 ：同对照组l ，取其降结肠部位标本。试验组和对照组的性别、年龄、 病史的差别无统计学意义。 2 主要实验仪器和试剂： 2 1 主要实验仪器： 电热干燥箱d g b 2 0 水浴箱2 0 1 0 恒温水浴震荡器c u 6 0 0 冰箱b d l2 0 移液器、染色缸、湿盒等 o l y m p u s 全能显微镜b x u c b l e i c ar m 2 2 4 5 石蜡切片机 上海光华仪器厂 天津泰斯特仪器有限公司 姜堰市医疗器械有限公司 青岛海尔股份有限公司 北京中山有限公司 日本奥林巴斯公司 莱卡上海分公司 研究论文 m o t i c 6 0 数码医学图象分析系统厦门麦克奥迪仪器仪表有限公司 2 2 主要实验试剂： a q p 一1 、a q p 4 一抗( 兔抗人) i g g 多克隆抗体，二抗( 山羊抗兔) i g g 抗体，购于武汉博士德生物技术有限公司。 s p 9 0 0 1 试剂盒及d a b 显色剂，购于北京中衫生物技术有限公司。 其他试剂：4 多聚甲醛、多聚赖氨酸、乙醇、苏木精、枸橼酸缓冲 液、辣根过氧化物酶标记链酶卵白素工作液，均由河北医科大学组培教研 室提供。 3 方法 3 1 普通光镜、及免疫细胞化学切片制备： ( 1 ) 取材：取手术切下的结肠全层标本，冲洗干净后，立即完全浸 入4 多聚甲醛溶液中，并马上放于4 冰箱中待用。 ( 2 ) 固定：将用于光镜的结肠标本固定于4 多聚甲醛并记录标本 的来源位置。 ( 3 ) 脱水及包埋：2 4 小时后将固定好的组织块经常规梯度酒精脱水， 二甲苯透明，石蜡包埋。 ( 4 ) 切片：连续切片，厚度为5 # m ，取4 片蜡带分别裱于涂有蛋白 甘油( 用于普通h e 染色) 及多聚赖氨酸( 用于免疫组织化学染色) 的载 玻片上。 3 2h e 染色步骤： ( 1 ) 切片常规脱腊至水。 二甲苯i ，二甲苯i i ，10 0 酒精i ，1 0 0 酒精i i ，各1 0m i n 。9 5 酒精，9 0 酒精，8 0 酒精，7 0 酒精各1 0m i n ，蒸馏水冲洗。 ( 2 ) 苏木精染色3m i n ，自来水冲洗。 ( 3 ) 1 盐酸分化，自来水冲洗。 ( 4 ) 伊红染色2m i n 。 ( 5 ) 常规梯度酒精脱水7 0 酒精，8 0 酒精，9 0 酒精，9 5 酒精， 各2m i n ，1 0 0 酒精1 ，1 0 0 酒精1 l ，各1 0m i n ( 6 ) 1 0 0 酒精：二甲苯= 1 ：1 ，约1 0m i n 。 ( 7 ) 二甲苯i ，二甲苯i i 透明约1 0m i n 。 ( 8 ) 中性树胶封片。 研究论文 3 3 免疫组织化学染色： ( 1 ) 切片常规脱蜡至水 ( 2 ) 0 0 1 mp b s 清洗3 次，每次5m i n ( 3 ) o 3 甲醇过氧化氢室温下孵育2 0m i n ，以消除内源性过氧化物 酶。 ( 4 ) 蒸馏水清洗3 次，每次5m i n ( 5 ) 0 1 m 枸橼酸缓冲液( p h6 o ) 微波炉内修复，9 8 。c 维持2 0m i n ( 6 ) 自然冷却至室温 ( 7 ) 1 0 正常山羊血清封闭，3 7 。c 温箱湿盒内孵育3 0m i n ，目的是 减少非特异性染色。 ( 8 ) 滤纸吸去多余血清，加入a q p 1 的一抗( 兔抗人，稀释 1 ：1 0 0 ；) ，湿盒中于4 冰箱过夜。 ( 9 ) 0 0 1mp b s 清洗3 次，每次5m i n ( 1 0 ) 滴加生物素化二抗( 山羊抗兔) 工作液，3 7 。c 温箱湿盒内孵育 3 0r n i n 。 ( 1 1 ) 0 0 1 mp b s 清洗3 次，每次5m i n ( 1 2 ) 滴加辣根过氧化物酶标记链酶卵白素工作液，3 7 。c 温箱湿盒 内孵育3 0m i n ( 13 ) 0 0 1 mp b s 清洗3 次，每次5m i n ( 1 4 ) d a b 显色2 5 分钟 ( 1 5 ) 显微镜下控制显色程度，自来水充分冲洗，终止显色 ( 1 6 ) 苏木素复染细胞核3m i n ，自来水冲洗，去除多余染料。 ( 1 7 ) 梯度乙醇脱水：7 0 ，8 0 ，9 0 酒精5 m i n ，9 5 酒精1 0m i n ， 1 0 0 酒精i 、i i 各15m i n ( 18 ) 二甲苯i 、i i 、i i i 各15m i n 透明 ( 19 ) 中性树胶封固 阴性对照用0 0 1 mp b s 替代一抗，其余步骤同上。 a q p 4 实验方法完全相同。 4 结果判定： 阳性产物为棕黄色颗粒，位于细胞质中，细胞浆及细胞核周围呈棕黄 色者判为阳性。先在低倍镜下对组织切片全面观察，随后于2 0 0 倍光镜下， 研究论文 随机观察l o 个视野，以病理图像分析系统计算平均光密度值。 所有操作步骤都经去脱氧核糖核酸处理，并防止被核糖核酸污染。 5 对免疫组化染色的阳性细胞进行图像分析和统计学处理： 慢传输型便秘试验组和正常人对照组每个标本均从升结肠和降结 肠取5 张切片，每张切片随机取1 0 个高倍视野( 2 0 0 x ) ，每个视野至少计 数1 0 0 个细胞，计算阳性细胞所占计数细胞的百分比，取其平均数作为该 切片的阳性细胞百分比( y p ) 。另将y p 分为3 级：阳性细胞0 - - - 2 5 为 一；2 5 - - 一7 0 为+ ； 7 1 为+ + 。每个标本记录其y p 和所属级别，以 + 和十+ 为阳性标本，作为定量研究。 同时用m o t i c 6 0 数码医学图象分析系统进行阳性细胞平均光密度分 析( m d ) 作为定性研究。以m d 驾4 0 0 0 为表达阳性，以m d 0 4 0 0 0 为表 达阴性。 将所有数据输入计算机，用e x c e l 进行数据整理，用s p s s l 3 0 f o r w i n d o w s 统计分析软件进行统计处理。集中趋势及离散趋势用均数及标准 差描述，数据经正态检验呈正态分布，采用两个独立样本的t 检验，检验水准 ( o = 0 0 5 ) 。 结果 1a q p 1 、a q p 4 的h e 染色结果 慢传输试验正常的无便秘病史患者结肠黏膜上皮细胞呈高柱状，排列 紧密、规则，细胞核椭圆形，靠近细胞的基底部，腔面内可见杯状细胞( 见 f i g 1 - - 。2 ) 。 传输试验证实属慢传输型便秘患者的结肠黏膜上皮细胞排列较正常 组明显稀松，间隙宽大，不规则，部分上皮细胞变薄，且黏膜基底部、腔 面内吸收细胞含量明显增多( 见f i g 3 - - 一4 ) 。 2a q p 一1 、a q p 一4 的免疫组化染色结果 本染色显示：( 1 ) a q p 。l 在2 5 例慢传输型便秘患者和2 0 例正常人升 结肠、降结肠结肠黏膜上皮细胞顶端、基底侧和腔面都有表达，且主要表 达于吸收细胞( 见f i g 5 6 ) 。但慢传输型便秘患者( 试验组) 结肠黏膜 研究论文 细胞上的表达量明显高于正常人( 对照组) 结肠黏膜细胞上的表达量。 ( 2 ) a q p 4 在正常人( 对照组) 升结肠和降结肠结肠黏膜上皮细胞上 未见表达，在慢传输型便秘患者( 试验组) 升结肠结肠上皮细胞有少量表 达( 见f i g 7 8 ) ，降结肠上无表达。其中2 5 例慢传输型便秘患者仅有 4 例发现有少量a q p 4 在升结肠结肠黏膜上皮细胞的基底部位有少量表 达。 3a q p 1 、a q p 一4 在实验组( 便秘组) 和对照组( 正常人组) 中的表达 便秘患者组a q p 1 ( 试验组1 ) y p 为( 5 3 2 2 4 - 1 7 1 5 ) ， ( 试验组2 ) 为( 5 1 0 2 4 - 1 5 2 3 ) ，与对照组1y p 为( 3 1 2 4 4 - 1 9 0 3 ) 相比，