（水生生物学专业论文）蓝藻念珠藻属及其近缘属的分子系统学研究.pdf

论文题目：蓝藻念珠藻属及其近缘属的分子系统学研究 学科专业：水生生物学 学位申请人：刘晶晶 指导教师：王全喜教授 曹建国副教授 摘要 念珠藻属( n o s t o c ) 及其近缘属是蓝藻的重要类群，广泛分布于各种生境。其分类 主要建立在藻丝、营养细胞、异形胞及厚壁孢子等形态特征的基础上，然而这些藻类 结构简单，形态可塑性强，极易受环境影响，因此，仅以形态特征作为分类依据有时 并不可靠，容易造成分类上的混淆。而随着分子系统学的发展，越来越多的核苷酸和 蛋白质序列在系统演化和分类研究中提供了最直接的证据，已广泛用于蓝藻分子系统 学的研究。本研究通过克隆、测序具有“进化计时器”之称的1 6 sr r n a 基因和变异 速率较快的t r n a l c u ( u a a ) 内含子基因，并结合g e n b a n k 数据库中相关的基因序 列对念珠藻属及其近缘属的系统发育关系进行了分析，主要结果如下： 【1 】根据1 6 sr r n a 基因和t r n a k ”( u a a ) 内含子基因的系统发育研究结果表 明念珠藻( n o s t o c ) 和鱼腥藻( a n a b a e n a ) 聚合为两个不同的分支，支持它们为两个 独立的属。 【2 】基于1 6 sr r n a 基因和t r n a k u ( u a a ) 内含子基因序列构建的进化树中， 念珠藻属的拓扑结构基本一致，绝大部分念珠藻聚合在一个单系分支上，表明它们是 单系起源的。 3 】然而，通过系统发育研究表明少数念珠藻( n o s t o cp a l u d o s u mf a c h b 8 8 、 n o s t o cs p o n g i a e f o r m ef a c h b13 0 、n o s t o cp i s c i n a l ec e n a 21 、n o s t o cs p f a c h b 9 7 3 、 n o s t o cs p y k 0 1 和n o s t o cs p h k 0 1 ) 被排除在此单系之外，与少数几株鱼腥藻聚类 成一个分支，此分支位于念珠藻的单系分支和典型的鱼腥藻分支之间，具有清晰的界 限，并且它们之间的遗传距离超过属内水平，不支持现有的分类学地位。这表明该分 支中的种类可能是两属间的过渡类群，或者为一个新的类群，有待进一步研究。 4 】本研究表明分类地位存在争议的满江红鱼腥藻( a n a b a e n aa z o l l a e f a c h b l 9 0 ) 也存在于上述分支中，既不聚类在念珠藻属的单系分支中，也不聚类在 典型鱼腥藻属的分支中，支持满江红鱼腥藻为独立于该两属之外的观点。 【5 】研究发现束丝藻( a p h a n i z o m e n o n ) 总是和鱼腥藻混杂地聚类在一起，且与鱼 腥藻属间的遗传距离较小，建议将束丝藻属并入到鱼腥藻属。 【6 】6 研究结果显示具异形胞的丝状蓝藻聚类在一个单系进化枝中，说明它们是单 系起源的。 【7 】通过1 6 sr r n a 基因和t r n a k ”( u a a ) 内含子基因联合序列的系统发育分 析结果表明我国3 种经济念珠藻普通念珠藻( c o m m u n ) 、发状念珠藻( f l a g e l l i f o r m e ) 和拟球状念珠藻( s p h a e r o i d s ) 应为3 个独立的种，其中，尤以普通 念珠藻与发状念珠藻间的亲缘关系更近。 本研究对念珠藻属及其近缘属的系统发育关系进行了分析，对它们现在的分类地 位进行了评价，重点对一些具有分类争议的种属进行了讨论，并根据研究结果对这些 种属的分类地位提出了修正建议。 关键词：蓝藻；念珠藻；系统发育；1 6 sr r n a 基因；t r n a h “( u a a ) 内含子基因 论文类型：理论研究 t h e s i st o p i c ：s t u d yo nm o l e c u l a rs y s t e m a t i c so fn o s t o c ( c y a n o b a c t e r i a ) a n dr e l a t i v e g e n e r a p r o f e s s i o n a ld i s c i p l i n e s ：h y d r o b i o l o g y d e g r e ea p p l i c a n t ：l i uj i n g - j i n g d i r e c t o r ：p r o f w a n gq u a n x i a s s o p r o f c a oj i a n g u o a b s t r a c t n o s t o ca n dt h er e l a t i v e g e n e r a a r e i m p o r t a n tg r o u p s o fc y a n o b a c t e r i a , w i d e l y d i s t r i b u t e di nv a r i o u sh a b i t a t s t h et a x o n o m yw a sp r i m a r i l yb a s e do nm o r p h o l o g i c a l f e a t u r e so ff i l a m e n t ，n u t r i t i o nc e l l ，h e t e r o c y s ta n da k i n e t ee t c t h e ya r eal o w e rp r o k a r y o t e w i t hs i m p l es t r u c t u r ea n ds t r o n gp l a s t i c i t y ，w h i c hm o r p h o l o g ya r ev u l n e r a b l et oi n f l u e n c e b ye n v i r o n m e n t s ot h et a x o n o m yb a s e do nm o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c si sn o tr e l i a b l e ，a n d i ti sl i a b l et oc a u s ec o n f u s i o na n dc o n t r o v e r s y w i t hd e v e l o p m e n to fm o l e c u l a rs y s t e m a t i c s ， m o r ea n dm o r en u c l e o t i d ea n dp r o t e i ns e q u e n c e sp r o v i d et h em o s td i r e c te v i d e n c e si n e v o l u t i o na n dc l a s s i f i c a t i o ns t u d y s o ，t h e s es e q u e n c e sh a v eb e e nw i d e l yu s e dc y a n o b a c t e r i a m o l e c u l a rs y s t e m a t i c sr e s e a r c h i nt h i ss t u d y ，16 sr r n ag e n ew h i c hi sc a l l e d ”e v o l u t i o n a r y t i m e r ”a n dt r n a l 。”( u a a ) i n t r o ng e n ew i t hf a s t e rv a r i a t i o nr a t ew e r ec l o n e da n d s e q u e n c e d p h y l o g e n yo fn o s t o ca n dt h er e l a t i v eg e r e n aw e r es t u d i e db a s e do nt h o s e s e q u e n c e sa n do t h e rr e l a t i v es e q u e n c e sf r o mg e n b a n kd a t a b a s e t h em a i nr e s u l t sw e r e s u m m a r i z e da sf o l l o w s ： 【1 】1a c c o r d i n g t ot h ep h y l o g e n e t i cr e s u l t sb a s e do n16 sr r n ag e n ea n d t r n a l 。u ( u a a ) i n t r o ng e n es e q u e n c e ss h o wt h a tn o s t o ca n da n a b a e n ac l u s t e ri nt w o d i f f e r e n tc l a d e s s o ，n o s t o ca n d a n a b a e n aa r et w os e p a r a t eg e n e r a 【2 】2 t h ep h y l o g e n e t i cr e s u l to fn o s t o ci s b a s i c a l l yc o n s i s t e n ti np h y l o g e n e t i ct r e e s b a s e do n16 sr r n ag e n ea n dt r n a l 锄( u a a ) i n t r o ng e n es e q u e n c e s t h em a j o r i t ys p e c i e s o f n o s t o cc l u s t e ri nas i n g l ec l a d e t h i sr e s u l ts h o w st h a tt h e ya r em o n o p h y l e t i c i l l 【3 】h o w e v e r ，t h ea n a l y t i c a lr e s u l t ss h o wt h a taf e ws p e c i e s ( n o s t o cp a l u d o s u m f a c h b 8 8 , n o s t o cs p o n g i a e f o r m ef a c h b 13 0 ，n o s t o c p i s c i n a l ec e n a 2 1 , n o s t o cs p f a c h b 9 7 3 , n o s t o cs p y k 0 1a n dn o s t o cs p h k 一0 1 ) a r ee x c l u d e df r o mt h em o n o p h y l e t i c c l a d e t h e s es p e c i e sa n ds o m ea n a b a e n as p e c i e sc l u s t e ri nac l a d e ，a n dt h i sc l a d el o c a t e di n b e t w e e nam o n o p h y l e t i cc l a d eo f n o s t o ca n dc l a d eo f a n a b a e n a ，w i t hc l e a rb o u n d a r i e s t h e g e n e t i cd i s t a n c eb e t w e e nt h e mi sm o r et h a nt h a to ft h eg e n e r a o u rr e s u l ti sn o ts u p p o r tt h e e x i s t i n gt a x o n o m i cs t a t u s t h i sc l a d em a yb eat r a n s i t i o n a r yg r o u pb e w e e nn o s t o ca n d a n a b a e n a ，o ri ti san e wg r o u p ，i ti sw o r t hf u r t h e rs t u d y i n g 4 】t h ep h y l o g e n e t i cr e s u l t ss h o wt h a ta n a b a e n aa z o l l a ef a c h b 19 0i sa l s oc l u s t e ri n t h ea b o v e - m e n t i o n e dc l a d e ，a n di tc l u s t e ri nn e i t h e rn o s t o cn o ra n a b a e n a s o ，t h er e s u l t s u p p o r tt h a ta n a b a e n aa z o l l a ef a c h b l9 0i sas p e c i e si n d e p e n d e n to f t h et w og e n e r a ( 5 】t h er e s e a r c hf i n dt h a ta p h a n i z o m e n o na n da n a b a e n aa r em i x e d ，a n dt h eg e n e t i c d i s t a n c eb e t w e e nt h e mi s s m a l l s o ，t h er e s u l ti n d i c a t e sa p h a n i z o m e n o ns h o u l d b e i n c o r p o r a t e di n t oa n a b a e n a 【6 】t h er e s u l t ss h o wt h a tah e t e r o c y s to ff i l a m e n t o u sc y a n o b a c t e r i ac l u s t e ri nas i n g l e c l a d e ，a n dt h e ya r em o n o p h y l e t i c 7 】t h ep h y l o g e n e t i cr e s u l t sb a s e do no f16 sr r n ag e n ea n dt r n a ( u a a ) i n t r o n g e n ec o m b i n e ds e q u e n c e ss h o wt h a tn c o m m u n e 、n f l a g e l l i f o r m ea n dn s p h a e r o i d sa r e t h r e e s e p a r a t es p e c i e so fn o s t o c ，w h i c ha r et h r e ee c o m o m i cs e p c i e so fn o s t o ci n c h i n a b u t , n c o m m u n ea n dn f l a g e l l i f o r m eh a v ec l o s e rr e l a t i o n s h i p i nt h i ss t u d y ，t h ep h y l o g e n yo fn o s t o ca n dr e l a t i v eg e n e r aw e r er e s e a r c h e d ，a n dt h e c u r r e n tt a x o n o m yo ft h e mw e r ee v a l u a t e d s o m ec o n t r o v e r s i a ls p e c i e sw e r ed i s c u s s e d i n a d d i t i o n ，t h er e s u l t ss h o wt a x o n o m i cs t a t u so fs o m eg e n e r aa n ds p e c i e sn e e dt ob er e v i s e d k e yw o r d s ：c y a n o b a c t e r i a ；n o s t o c ；p h y l o g e n y ；1 6 sr d n a ；t r n a 啪( u a a ) i n t r o n t h e s i st y p e ：t h e o r yr e s e a r c h i v 学位论文独创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除了特 别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或机构已经发表或撰写过的研究成果。其 他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中做了明确的声明并表示了谢意。 论文作者签名痢晶晶只期： 如寥年岁月移日 论文使用授权声明 本入完全了解上海师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容， 可以采用影印、缩印或其它手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此规定。 论文作者签名：蕊晶日期： 导师签名：三冷疡挚日期： 黟7 月月 譬上7年年 砌肿 上海师范大学硕士学位论文 第一章文献综述 第一章文献综述弟一早义陬综尬 蓝藻( c y a n o b a c t e r i a ) 也称蓝细菌，是一类形态结构简单的原核生物。有化石记 录蓝藻早在3 5 亿年前就出现在地球上，是地球上现存最古老的原核生物之一【1 j 。蓝 藻种类繁多、适应力强，广泛分布于地球上各种类型的水环境和一些陆生环境，在终 年冰冻的南北两极、荒芜贫瘠的沙漠甚至在水温高达8 5 。c 的温泉，都发现有蓝藻的 分布1 2 , 3 1 。蓝藻在生命起源和生态系统中起着重要的作用，除了光合放氧外，蓝藻中 的固氮种类( 大多数为念珠藻目的种类) 对自然界氮素的平衡起了重要作用；另外许多 蓝藻种类具有食用和药用价值( 如螺旋藻、发菜、葛仙米等) ；而蓝藻在水体中过量 增殖引起的水华，给水生生态环境带来危害。在蓝藻的各项研究中蓝藻系统分类研究 工作始终伴随其中，并发挥重要的作用。 1 1 蓝藻的分类学研究和系统进化研究 蓝藻是绿色自养的原核生物，具有能以水作为电子来源进行光合作用放氧，低的 内源呼吸率，有限的利用有机物作为能源和碳源等属于植物界主要属性的能力，使许 多藻类分类学家采用植物分类方法对它进行分类。而1 9 7 1 年法国s t a n i e r 等基于蓝藻 在原核、细胞壁组成，脂肪酸和d n a 碱基组成等特性上与细菌相近似，提出蓝藻应 命名为蓝细菌。因此，蓝藻的分类和命名是在植物学和细菌学两方面的规则下进行的， 或者是两方面的结合。蓝藻的分类学研究正处于过渡时期，存在多个分类系统，这些 分类系统主要是遵循蓝藻植物分类系统和蓝细菌分类系统建立起来的，其中有一些分 类体系至今对蓝藻的系统分类具有重要的意义。随着分类手段和技术的发展，利用生 化组成作为指标的化学分类方法和利用d n a 和蛋白质为指标的分子系统学分类方法 应运而生，在一定程度上弥补因形态学证据不足而造成的分类困难。 1 1 1 植物学分类方法 植物分类系统主要根据固定的野外标本，以形态学特征为基本的分类系统。对于 蓝藻分类最早的研究是g o m o n t t 4 】以及b o m e t 和f l a h a u t 【5 】对于丝状蓝藻和丝状异形胞 蓝藻的分类及命名。1 9 3 2 年g e i t l e r 出版的“蓝藻纲”( c y a n o p h y c e a e ) 主要基于样品 分离物的形态学特征作为分类标准，共描述了蓝藻的1 4 5 个属、1 3 0 0 余个种，使蓝 藻新类群的数量大量增加，1 9 3 2 年g e i t l e r 的分类系统至今仍然是许多蓝藻分类工作 的基础【6 】。随着蓝藻种类增加和深入研究，d r o u e t 认为蓝藻中存在生态表型 ( e c o p h e n e ) ，即具有相同基因型的种类在环境因子的影响下能够表现不同的形态特 征，基于不受环境影响的稳定的形态特征，他修改了蓝藻的分类系统，将蓝藻划分为 6 2 个种【7 1 ，d r o u e t 分类系统现在已经很少使用。2 0 世纪7 0 年代以来，蓝藻超微结构 及分子系统学研究迅速发展，积累了大量资料，为深入研究蓝藻分类系统奠定了坚实 第一章文献综述上海师范大学硕士学位论文 的基础。1 9 8 5 年以来，a n a g n o s t i d i s 和k o m a r e k 对蓝藻分类系统进行了全面的修订， 他们的工作主要在属的水平上，试图通过整合形态、生化、超微结构及部分分子数据 完善蓝藻分类系统【8 1 。根据他们拟定的系统，蓝藻门改称为“蓝原核藻目” ( c y a n o p r o k a r y o t a ) ，分4 目：色球藻目( c h r o o c o c c a l c s ) 、颤藻目( o s i l l a t o r i a l e s ) 、 念珠藻目( n o s t o c a l e s ) 及真枝藻目( s t i g o n e m a t a l e s ) 。“目”的名称沿用过去长期使 用的名称，但“目”下“科”、“属”的划分则有许多变化，新设许多“科 、“亚科”、 “属”和“亚属”。 1 1 2 细菌学分类方法 蓝藻的细菌学分类最早是由法国s t a n i e r 等人提出鲥9 1 。细菌学规则下的蓝细菌分 类是建立在藻种纯培养的基础上，分类标准包括形态特征、繁殖方式、亚显微结构、 生理特征、化学特征和基因特征等，如色素组成，脂肪酸成分，能否异养生长，固氮 酶活性，d n a 碱基组成和基因组大小等【1 0 以4 1 。r i p p k a 等人用细菌学分类方法对巴斯 德培养物保藏中心的蓝藻进行了属以上水平的分类学研究【12 1 。r i p p k a 等人根据繁殖， 细胞分裂方式以及特化细胞的出现与否，将蓝藻划分为五个亚群。其中亚群i 和属 于单细胞蓝藻，亚群i i i ，和v 属于丝状蓝藻，各亚群的典型特征如下：( i ) 为以 二分裂或出芽生殖为繁殖方式的单细胞蓝藻，对应形态学分类标准中的色球藻目 ( c h r o o c o c c a l e s ) 和管孢藻目( c h a m a e s i p h o n a l e s ) ；( 1 1 ) 为以多平面分裂或二分裂 繁殖的单细胞种类，对应宽球藻目( p l e u r o c a p s a l e s ) ；( i i i ) 包括无细胞分化的丝状种 类，对应形态分类中的颤藻目( o s c i l l a t o r i a l e s ) ；( i v ) 为异形胞丝状蓝藻种类，对应 念珠藻目( n o s t o c a l e s ) ；( v ) 为具有异形胞且产生分支的丝状种类，对应为真枝藻 目( s t i g o n e m a t a l e s ) 。 1 1 3 化学分类方法 微藻的分类学研究大多是从形态、结构等方面予以分类，但随着藻类生理、生化 研究的不断深入，发现许多形态相似的藻类在化学组成上有着相当大的差别。因此， 利用细胞的各种生化组成( 如脂肪酸，脂类，胺类等) 作为分类标记的化学分类方法 在藻类分类学上得到了越来越重要的应用【1 5 , 1 6 】1 。其中，脂肪酸的聚类分析研究已经被 广泛应用于微生物的化学分类学研究1 7 , 1 8 、微生物与环境之间适应性研究1 1 9 2 0 j 和确定 某些海洋生物食物选择性的研究中【2 1 1 。脂肪酸也是在蓝藻分类中运用得最多的生化指 标。最早提出用脂肪酸作为分类标记的是k e n y o n 等人【l o 】，他们研究了6 6 株蓝藻的脂 肪酸组成，其中鱼腥藻( a n a b a e n a ) 和眉藻( c a l o t h r i x ) 具有相同的脂肪酸组成，推 断它们有较近的亲缘关系。g u g g e r 等人利用脂肪酸作为分类标记分析了鱼腥藻属 ( a n a b a e n a ) 、束丝藻属( a p h a n i z o m e n o n ) 、微囊藻属( m i c r o c y s t i s ) 、念珠藻属( n o s t o c ) 和浮丝藻属( p l a n k t o t h r i x ) 的亲缘关系。2 0 0 3 年，g u g g e r 等人又利用脂肪酸组成分析 了发状念珠藻( n o s t o c f l a g e t t i f o , r m e ) 与其近缘种类鱼腥藻( a n a b a e n a ) ，微囊藻 2 上海师范大学硕士学位论文第一章文献综述 ( m i c r o c y s t i s ) 和集胞藻( s y n e c h o c o c c u s ) 的亲缘关系，认为脂肪酸组成在念珠藻属 分类和亲缘关系的研究中具有一定的分类价值，可以弥补因形态分类证据不足时而造 成的分类困难【2 2 1 。此外，脂肪族多胺也可以用作分类研究。蓝藻主要含有亚精胺 ( s p e r m i d i n e ) 和单亚精胺( s y m h o m o s p e r m d i n e ) 两种多胺。h e g e w a l d 等人发现 o s c i l l a t o r i a ，p h o r m i d i u m ，c a l o t h r i x 和c h r o o c o c c u s 含有这两种类型的多胺1 23 。h a m a n a 等人则发现固氮蓝藻含有高浓度的单亚精胺【2 4 1 。化学分类方法利用生化组成可以对基 于形态学的分类研究进行弥补和补充，但藻类的培养条件会改变其生化组成，使得化 学分类方法在微藻分类学研究上的应用受到一定程度的限制。 1 1 4 分子生物学方法 随着分子生物学的深入开展，d n a 序列和蛋白质资料的积累日益丰富，促使了 利用核苷酸序列和氨基酸序列的同源性来研究物种间的演化关系。核苷酸和蛋白质是 遗传信息的载体，因此它们可能成为推断系统发生关系最直接的证据。分子生物学技 术成功地应用于植物系统学领域，使分子生物学技术在系统学领域的应用成为上一世 纪后5 0 年内比较生物学和进化生物学领域的研究热点【2 5 。2 7 1 ，- - f - j 新兴的交叉学科一 分子系统学迅速成为生命科学中的一个异常活跃的生长点。d n a 序列广泛用于各种 生物类群的遗传多样性分析、种属关系以及系统进化的分析，一方面是因为分子资料 方便获取和分析，另一个重要的原因是利用分子资料可以在形态学资料以外独立的推 导出某一类群的系统发育假设，同时也为检测形态进化的假说提供了一个独立的证据 来源。 分子系统学早期主要应用于陆地生物，在2 0 世纪7 0 年代后才在藻类中得到广泛 应用，通过藻类分子信息的分析比较研究藻类系统发生的学科，称为藻类分子系统学。 2 0 世纪8 0 年代藻类分子系统学兴起以后，应用各种分子手段研究蓝藻的系统发生、 亲缘关系及地理分布已成为热点【2 8 , 2 9 1 。近1 0 多年来，蓝藻分子系统学研究越来越广 泛、深入。k o m a r e k 和k a s t o v s k y 根据超微结构( 特别是类囊体排列方式) 和分子系 统学资料进行综合比较，分析表明，分子标记分析与超微结构特征基本上是吻合的， 甚至与以显微形态建立的“目”、“科”也基本一到3 0 】。 蓝藻分子系统学的发展建立在分子标记技术的基础上。分子标记主要包括蛋白质 标记、d n a 序列分析、d n a 指纹分析及d n a 的构象变化与s s c p 分析 3 q 。蓝藻分 子系统学研究方法主要包括：蛋白质标记、d n a 碱基组成、d n a d n a 杂交、d n a 指纹分析及基因序列。这些工作有助于理解不同表型的遗传基础以及解决某些蓝藻鉴 定问题，各有优劣。例如，d n a 碱基组成能够揭示分类类群的异质性，但是不能揭 示亲缘关系；d n a d n a 杂交实验能够反映近缘物种的遗传相似程度，但是对于远缘 物种的作用有限。 1 , 1 4 1 蛋白质标记 第一章文献综述上海师范大学硕士学位论文 在蛋白质多态性基础上发展的分子标记称为蛋白质标记。藻胆蛋白是蓝藻、红藻 和隐藻等特有的光合作用的天然色素蛋白，在不同藻类的种类和含量是不同的。因此， 蓝藻藻胆蛋白的组成及光谱特性在分类研究中也有一定的指示作用。g u g i l e l m i n 和 c o h e n b a z i r e 在1 9 8 1 年根据藻胆蛋白的亚基组成定义了假鱼腥藻属，并认为p c c 7 4 0 3 藻株不属于这个属，这一结果后来被其他分子标记的研究结果所支持【3 2 1 。s u d a 等人 对7 5 株颤藻进行了化学分类的研究，发现不同种类在是否含有藻红蛋白及其与藻蓝 蛋白的比例上存在差异【3 3 1 。此外，同工酶是催化同一生化反应，在电泳中有不同迁移 率的一种酶的多种形式，酶谱分析具有深刻的遗传学意义【3 引。同工酶电泳分析在蓝藻 的分类学研究中也得到了广泛应用，在种内遗传多样性分析、系统发育重建、遗传变 异与地理分布关系等方面都具有一定的意义。m u s a c c h i o 等人得出了7 株鱼腥藻 ( a n a b a e n a ) 的酯酶、苹果酸脱氢酶、磷酸酶和醛缩酶的同工酶谱带。通过酶电泳谱 带的分析结果，提示了它们之间的系统进化关系，并根据酯酶和苹果酸脱氢酶的同工 酶电泳建立了系统进化树【3 5 1 。蛋白质序列分析积累的许多数据，在系统与进化研究中 也起到了重要作用，但由于氨基酸序列分析在技术上较麻烦，在系统与进化的研究中 逐渐被核苷酸的序列分析代替。 1 1 4 2d n a 碱基组成 d n a 碱基组成也是一种用于系统学研究的分子标记。一般来说，相同物种的 g c 是相近的，但是具有相同g c 的物种却不一定有较近的亲缘关系，g c 相差较 大的物种则不可能有较近的亲缘关系。“检测了5 0 株纯培养的鱼腥藻的g c ，并比 较了依据g c 分类与应用形态学、生理和生化分类的结果。总体来说，相同物种的 g c 是相近的，但是也发现鱼腥藻a n a b a e n ae u c o m p a c t a 的g c ( 4 5 5 ) 与其形 态结构极其相近的a c o m p a c t a 的g c ( 3 9 5 ) 有显著差异【3 6 1 。而如果应用形态 分类方法，这两株藻有可能属于同一个物种。 1 1 4 3d n a d n a 杂交 d n a d n a 杂交度己作为定义真细菌物种的一种标准，d n a d n a 杂交度同样也 被作为定义蓝藻种的标准。通过d n a 分子杂交测定t m 值，能够推断分子系统发育 关系的远近。最早应用d n a d n a 杂交分析蓝藻系统发育关系的是s t a m ，他利用 d n a d n a 杂交研究了2 1 种鱼腥藻，这些鱼腥藻根据g e i l t l e r 分类系统确定为同一物 种，结果显示它们之间的d n a d n a 杂交率达到1 0 0 3 7 j 。w a y n e 等人认为同一物种 不同株系问的d n a d n a 杂交率至少要达到7 0 ，同属的不同种类间的d n a d n a 杂交率至少要达到2 0 3 8 , 3 9 】。 1 1 4 4d n a 指纹分析 1 9 8 5 年，j e f f e r e s 等第一次在人类基因组上发现了高变的“小卫星 区域，正式 提出这个“小卫星”术语，奠定了d n a 指纹技术的基础【4 们。他们利用卫星d n a 作 4 上海师范大学硕士学位论文第一章文献综述 探针，与多种限制性内切酶酶切片段杂交，形成特异性的杂交图谱，这种杂交图谱即 为d n a 指纹。这种技术可以检测d n a 水平上的差异并且具有高度特异性( 即使同 一物种2 个随机个体的指纹相似系数仅为0 2 2 ) ，因此，这一方法被广泛应用于物 种鉴定及基因进化分析。由于p c r 技术的广泛应用，d n a 的多态性可通过体外克隆 方法快速、高效而灵敏地检测出来。于是，d n a 指纹分析不仅局限于杂交的方法， 基于p c r 之上的d n a 指纹技术层出不穷，这些在p c r 基础上发展起来的检测d n a 多态性的分子标记技术也称为d n a 指纹技术。蓝藻分子系统学应用的d n a 指纹分 析主要有：r f l p 、r a p d 、a f l p 和指纹图谱分析。 限制性片断长度多态性( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，r f l p ) 是 2 0 世纪8 0 年代中期发展起来的一种d n a 多态性分析技术。该技术是用限制性内切 酶消化p c r 扩增产物，从而构建出多态性图谱，用于进一步分析。9 0 年代初p c r 技 术在分子生物学诸多领域广泛应用后，r f l p 分析受到生物系统与进化学家的青睐。 目前r f l p 已有效地应用于蓝藻分类及系统演化的研究中，用于r f l p 分析的d n a 片段主要包括1 6 sr r n a 基因，i t s 序列，藻蓝蛋白编码基因及其间隔序列( p c i g s ) 笙 4 0 - 4 6 1 可 。 随机扩增多态性d n a ( r a n d o m a m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a ，r a p d ) 是2 0 世纪 末发展起来的建立在p c r 技术基础上的一种分子标记手段。r a p d 技术是以一个1 0 碱基的任意序列的寡核苷酸片段为引物在未知序列的基因组d n a 上进行随机的p c r 扩增。r a p d 的多态性是由引物与模板的结合位点及可扩增区域片段的长度决定的。 r a p d 方法已被广泛应用于种群间亲缘关系、分类和系统发生的研究中，使蓝藻属、 种、株系3 个水平的鉴定成为可能。目前，在蓝藻中，r a p d 技术已成功地应用于螺 旋藻( s p i r u l i n a ) 、满江红鱼腥藻( a n a b a e n aa z o l l a e ) 和颤藻目种类等遗传多样性和 亲缘关系的分析【4 7 , 4 8 j 。 扩增片段长度多态性( a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，a f l p ) 是荷兰 k e y g e n e 公司z a b e a u 等、z a b e a u 和v o s 等发展的一种新的d n a 指纹技术。a f l p 结 合了r f l p 的稳定性和p c r 技术的高效性，同时又避免了r f l p 受探针限制的因素， 因而可产生丰富而稳定的遗传标记，被认为是一种理想有效的分子标记技术，现已被 广泛应用于遗传图谱构建、遗传多样性分析、系统进化及分类学、遗传育种和种质鉴 定以及基因定位等方面【4 乒 j 。由于该标记是通过选用不同的内切酶达到选择性扩增的 目的，因此又被称作选择性限制片段扩增标记( s e l e c t i v er e s t r i c t i o nf r a g m e n t a m p l i f i c a t i o n ，s r f a ) 5 4 j 。首先基因组d n a 用限制性内切酶切割，然后将双链接头 连接到d n a 片段的末端，接头序列和相邻的限制性位点序列，作为引物结合位点。 限制性片段用2 种酶切割产生，一种是罕见切割酶，一种是常用切割酶。由于a f l p 扩增可使某一品种出现特定的d n a 谱带，而在另一品种中可能无此谱带产生，因此， 5 第一章文献综述上海师范大学硕士学位论文 这种通过引物诱导及d n a 扩增后得到的d n a 多态性可作为一种分子标记。s a t i s h 等利用2 1 1 个a f l p 位点研究了不同生境的6 1 株林氏念珠藻( n o s t o cl i n c k i a ) ，提出 生态压力和选择对原核基因组的演化有显著影响【5 5 】。 指纹图谱的方法是运用p c r 技术直接从基因组d n a 扩增得到一组长度不同的 d n a 片段来反映种间差别。蓝藻的基因组中有多种类型的重复元件能够用于指纹图 谱的分析，包括短串联重复序列( s h o r tt a n d e m l yr e p e a t e dr e p e t i t i v es e q u e n c e s ， s t r r ) 、长串联重复序列( l l o n gt a n d e m l yr e p e a t e dr e p e t i t i v es e q u e n c e s ，l t r r ) 和 回文重复序列( i t e r a t e dp a l i n d r o m i cs e q u e n c e s ，如h i p l ) ，这三种重复序列都已经被 应用到蓝藻种类鉴定的研究中【5 6 - 5 9 1 。 1 1 4 5d n a 序列 在d n a 一级结构水平上检测多态性最直接的方法是进行d n a 的序列分析，即 测定核苷酸在基因组d n a 特定区域的排列顺序。序列分析可提供高度重复的、信息 丰富的数据，适合于中等和高层次分类群的系统学研究，近年来用于居群水平的研究 也逐渐增多。随着p c r 技术和d n a 测序技术的发展，应用d n a 序列分析的分子系 统学获得了前所未有的发展，越来越多的基因序列被获得并用于遗传多样性分析和系 统发育的研究。下面简述了蓝藻分子系统学中常用的d n a 序列： ( 1 ) 1 6 sr r n a 基因 1 6 sr r n a 基因( 1 6 sr d n a ) 是原核生物染色体上编码核糖体小亚基r n a 的基因。 在长期的进化过程中，分子功能几乎保持恒定，在结构上既具有保守性，又具有高变 性。保守性能反映出生物物种的亲缘关系，为系统发育重建提供线索；高变性则能提 示出生物物种的特征核苷酸序列，是属种鉴定的分子基础。1 6 sr r n a 基因由于结构 与功能上的保守性，其分子演化速率相对较慢故常被用于蓝藻各纲间、各目间、各科 间的系统发育关系及演化规律的研究。 ( 2 ) i t s 序列 内转录间隔区( i n t e m a lt r a n s c r i b e ds p a c e r ，i t s ) 序列是一类进化速率较快的d n a 序列，广泛应用于较低分类阶元的系统发育研究。原核生物中编码核糖体的3 种 r r n a ，即5 sr r n a 1 6 s r r n a 和2 3 sr r n a 的基因按顺序排列在一条核d n a 上，这 段有特定转录功能的d n a 片段被称为r d n a 操纵子( 即r r n 操纵子) 【6 0 1 。一般而言， 1 t n 操纵子中不同小亚基的排列顺序是1 6 s 2 3 s 5 s ，只有极少数小基因组的寄生生物 例外【6 。在各个小亚基之间，有不同长度的核苷酸片段作为间隔，称为i t s ( 图1 1 ) 。 1 6 sr r n a 2 3 sr r n a 5 sr r n a 图1 - 1 核糖体d n a 中的i t s 区域 f i g 1 1t h ei t sr e g i o no fn r d n a 6 上海师范大学硕士学位论文 第一章文献综述 在不同种之间，这段间隔片段的长度差异可能很大，即使在同一基因组内不同操 纵子上的间隔片段长度都可能是不同的。l e b l o n db o u r g e t 等人发现i t s 序列的进化速 率是1 6 sr r n a 基因的l o 倍，提供了i t s 序列能用于物种分类鉴定的理论基础1 6 2 j 。 这种变异不仅表现在长度上的差异，更表现在序列上的差异，具有较高的突变速率， 这些丰富的变异使它可作为精细的分子指标，用于揭示蓝藻中较低分类阶元上( 如属 间、种间) 的系统发育问题【6 3 1 。o t s u k a 等人利用1 6 s 2 3 sr r n a 基因间隔区i t s 序列 分析了4 7 株微囊藻，表明1 6 s 2 3 sr r n a 基因间隔区序列可以区分近缘种和株系之 间的关系m 】。史全良等测定了共生念珠藻的i t s 序列，结果表明地衣中共生念珠藻的 i t s 序列存在着多拷贝现象，各拷贝间的i t s 序列在结构和碱基组成上都存在差异， 在分子进化上存在着不同步现象，并初步认为这种多拷贝的形成是由于不等交换产生 的1 6 5 。陈月琴等人测定了颤藻科o s c i l l a t o r i as p 的1 6 s 2 3 sr r n a 基因间隔区序列， 获得了4 2 7 个核苷酸序列。通过与颤藻科其它种的i t s 序列进行比较分析，从分子水 平对颤藻科属问的某些分类学问题进行了讨论，并根据序列中核苷酸差异值探讨了颤 藻科属问界定的分子标准，提出了r d n a 基因间隔区是良好的分子标记，可用于“赤 潮”或“水华 蓝藻专一性核酸分子探针的研制l 。 ( 3 )