（预防兽医学专业论文）不同宿主足螨的形态学观察及ITS2基因序列分析研究.pdf

论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得 的成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其 他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它 教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何 贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 一躲施嚼谦 汐7 年莎月zg 关于论文使用授权的声明 本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅， 可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可 以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 研究生签名： 导师签名 彩以 篮 伽 年 月日 岳月句e t 摘要 足螨属于痒螨科( p s o r o p t i d a e ) 、足螨属( c h o r i o p t e s ) ，是一种呈世界性分布 的感染家畜及野生动物的体外寄生虫。目前，多数学者认为足螨属的螨可以分为 牛足螨( c h o r i o p t e sb o r i s ) 和德州足螨( c h o r i o p t e st e x a n u s ) 两个种，但是一部 分学者对此分类方法提出了质疑，他们认为此分类方法仅仅依据了足螨的形态学 和生物学方面的特征，而没有考虑到遗传学方面的因素。此外，由于对寄生于一 些动物的足螨的研究还不够深入，如大熊猫足螨( c p 铡d a ，f a i na n d l e c l e r c ，1 9 7 5 ) 、羚羊足螨( c c r e w e i ，l a v o i p i e r r e ，1 9 5 8 ) 以及獾足螨( c m y d a 淞， f a i n , 1 9 7 5 ) 等，这些足螨究竟是牛足螨与德州足螨的同种异名还是独立种还有待 进一步的研究证实。 本试验以采自四川双流黄牛的足螨，洪雅西门达尔奶牛、黑白花奶牛、蒙 贝利亚奶牛的足螨以及成都大熊猫繁育研究基地的大熊猫的足螨为试验材料，首 先对采自黄牛和大熊猫的足螨进行形态学观察，再将寄生于上述五种动物的足螨 i t s 一2 基因进行克隆和序列分析。采用光镜和扫描电镜进行形态学观察，结果表 明：两种足螨的雄螨体末突出物均由大小两节组成，突出物上竹片状刚毛和最外 侧刚毛的长度分别介于1 6 8 i i n 卜- 2 5 5 m 和4 3 1 1 m - - 9 0 t t m 之间，与德州足螨基本 相同，而其中寄生于大熊猫的足螨比寄生与黄牛的足螨虫体大采用p c r 方法 成功扩增出上述五种足螨的i t s - 2 基因全序列，在g e n b a n k 上的注册号分别为： 寄生于西门达尔奶牛的足螨( e f 0 5 3 1 1 9 ) 、寄生于黄牛的足螨( e f 0 5 3 1 2 1 ) 、寄 生于黑白花奶牛的足螨( e f 0 5 3 1 2 0 ) 、寄生于蒙贝利亚奶牛的足螨( e f 0 5 3 1 2 2 ) 、 寄生于大熊猫的足螨( e f 0 5 3 1 2 3 ) ，分析结果显示：采自大熊猫的足螨i t s - 2 基 因全序列长度为2 3 2 b p ，比g e n b a n k 上注册的德州足螨( a f l 2 3 0 8 2 ) 、牛足螨 ( a f l 2 3 0 8 1 ) i t s - 2 基因全序列略长，与之的同源性分别为8 5 觎和9 0 4 。其余 四种足螨的i t s - 2 基因中，采自西门达尔奶牛的足螨i t s - 2 基因全序列为2 2 s b p ， 与德州足螨的i t s - 2 基因全序列长度相同，其余3 种足螨的i t s - 2 基因长度为 2 2 5 b p ，与牛足螨的i t s - 2 基因长度相同。但以上4 种足螨的i t s - 2 基因与德州 足螨i t s - 2 基因同源性较高，介于9 4 2 一9 7 8 之间，而与牛足螨i t s - 2 基因 的同源性较低，仅在8 4 3 9 仁- 8 7 o 之间。 除上述5 种足螨的i t s 2 基因以外，还选用痒螨科( p s o r o p t i d a e ) 痒螨属 ( p s o r o p t e s ) 的兔痒螨( p s o r o p t e sc u n i c u h ) i t s - 2 基因( a b l 0 5 2 0 1 ) 作为外群，加上 g e n b a n k 上公布痒螨科足螨属的德州足螨分离株i t s - 2 基因和牛足螨分离株 i t s - 2 基因的序列构建i t s - 2 基因的各种系统树。从构建的系统树分析；寄生于 大熊猫的足螨与牛足螨、德州足螨的亲缘关系均较远，其余四种足螨与德州足螨 的亲缘关系较近。 根据形态学特征和i t s - 2 基因序列分析结果综合分析德出：寄生于大熊猫的 熊猫足螨( c p a n d a ) 是不同于德州足螨及牛足螨的另一个神，应为足蟥属中的 一个独立有效种；寄生于四种牛的足螨属于德州足螨。 关键词：足螨；形态学；熊猫足螨；i t s - 2 ；分类 6 l 文献综述 足螨属于痒螨科( p s o r o p t i d a e ) 、足蛹属( c h o r i o p t c s ) ，是一种呈世界性分布 的感染家畜及野生动物的体外寄生虫【l l h l 癍n 酽1 等最早于1 8 4 5 在黄牛体表发现 寄生有该螨，此后陆续在马、奶牛、绵羊、山羊、兔等家斟习及大熊猫f 4 】、骆驼、 驯鹿、瞪羚、麇鹿、美洲羊驼【2 l 、鬣羊嘲等野生动物体表发现该螨的寄生，引起 被感染动物的一种顽固性、传染性皮肤病，严重威胁畜牧业的发展和野生动物健 康。 动物感染足螨初期，其皮肤表面出现鲜红色或淡红色的出血斑点或团块，此 期主要表现为瘙痒，并贯穿于整个感染期；后期出现红斑、皮肤损伤，进而出现 结痂、脱毛和皮肤增厚甚至出现出血、坏死等临床症状。动物轻微感染足螨时通 常不表现出明显的症状，慢性或严重感染时整个感染期均伴有剧痒或瘙痒，迸而 使得病畜终日啃咬、摩擦及烦躁不安，影响其正常的采食和休息，并使消化吸收 功能降低而日渐消瘦，严重影响其生长发育、生产性能，当继发感染严重时可导 致死亡嘲。该病为慢性消耗性疾病。给现代养殖业带来的危害往往被忽视。 国外从事足螨病的研究相对较早，主要集中于流行病学调查及药物治疗上。 在足螨的分类学上，起初许多学者一直认为足螨是宿主特异性寄生虫，并根据其 宿主命名。s w a e t m a n ( 1 9 5 7 ) 网对大量足螨进行了形态学观察和生物学研究后提 出足螨属的螨应该分为牛足螨( c h o r i o p t e sb o v i s ) 和德州足螨( c h o r i o p t e st e x a n u s ) 两个种。上世纪9 0 年代末期，足螨的分类学研究进入了分子水平阶段，主要是 利用分子生物学方法对足螨的一些遗传基因进行研究，由于对寄生于大熊猫的熊 猫足螨( c p a n d a ，f a i na n d l e c l e r c ，1 9 7 5 ) 、寄生于羚羊的羚羊足螨( c c r e w e i ， l a v o i p i e n ，1 9 5 8 ) 以及寄生于獾的獾足螨( c m y d a u s ，f a i n , 1 9 7 5 ) 等的研究很少， 所以这些足螨的分类地位还有待进一步的研究目前国内有关足螨病及其相关内 容的研究报道较少。 1 1 足螨的形态特征、形态学与生物学分类研究 1 1 1 足螨的形态学特征 足螨虫体呈卵圆形，由假头和躯体两部分构成，体表有细纹。假头由背面的 一对螯肢，两侧的一对须肢以及腹面的一个口下板构成，躯体由具有弹性的革状 7 表皮构成足螨可以分为幼螨、若螨( 其中雌螨分为着一螨和若二螨) 、成螨3 个发育阶段，其中幼螨有3 对足，若螨、成螨具有4 对足【3 】。雄螨的4 对足及雌 螨的1 、2 、4 对足末端有酒杯状的吸盘，雌螨的第3 对足上有2 根长刚毛，雄螨 第4 对足不发达：雄螨体后端有2 个突出物，突出物的前方腹面有2 个环状吸盘 忉。 1 1 2 足螨的形态学及生物学分类研究 由于寄生于各种动物的足螨形态都非常相似，因此利用形态学特征来研究足 螨的属下种间分类尚存在一定争议。依据足螨的形态学特征与生物学特性， s w a e t m a n ( 1 9 5 7 ) 即将足螨属的螨划分为牛足螨和德州足螨两个种，这种分类方 法得到大部分学者的认可。然而，一些学者认为这样的分类方法还有待进一步的 研究论证，一方面，这些学者认为在对足螨进行分类时，不仅要依据形态学特征 与生物学特性，更要考虑到分子遗传学方面的因素，因为形态特征与生物学特性 是遗传基因与环境相互作用的产物，基因型相同的个体在不同环境条件下可能表 现出显著的表型差异，给以形态学和生物学为分类依据的分类方法带来不确定 性。基因型则直接反映遗传基因的分子结构特征，这样的分类方法更为科学有效。 另一方面，寄生于一些动物的足螨被发现并研究的次数很少，如羚羊足螨、熊猫 足螨以及獾足螨等，且由于当时的试验条件落后，对这部分足螨的研究就显得相 对落后，难以为足螨的分类提供科学有效的依据，因此还应该对这部分足螨进行 详细研究后再傲结论。 1 9 5 7 年以前，学者们普遍认为足螨具有宿主特异性，其命名根据宿主而定， 如：牛足螨( cb o v s ，h e r i n g ，1 8 4 5 ) 网、山羊足螨( cc a p r a e ，d e l a f o n da n d b o u r g u i g n o n , 1 8 5 7 1 8 5 8 ) 、德州足螨( c t e x a n u s ，h i r s t , 1 9 2 4 ) 嘲、马足螨( c e q u i ， g e r l a c h , 1 8 5 7 ) 、绵羊足螨( c o v i s ，z u r n 1 8 7 4 ) 、大象足螨( c e l e p h i ，g e r l a c h , 1 8 5 7 ) 、 鬣羊足螨( c b o v s v 胛，a m m o t r a g i r a i l l e ta n d m o u q u e t ，1 9 1 9 ) 、兔足螨( c s y m b i o t e s v a t ，c u n i c u l ir a i l l e t ，1 8 9 3 ) 等【2 l 。 s w a e t m a n ( 1 9 5 7 ) 1 9 1 对寄生于马、牛、绵羊、山羊和骆驼等动物的足螨的胚 后期形态进行了仔细的观察和研究，并没有发现寄生于不同宿主的足螨存在明显 的形态学差异；同时将上述五种动物所寄生的足螨虫卵进行体外培养( 分别以以 上五种动物的表皮碎屑作为培养基，进行固定培养和交叉培养) 。结果显示其仍 l 然可以发育，周期集中在l 弘_ 2 3 天之闻，因此以上五种宿主韵表皮碎屑都含有 足螨所需要的营养；而且，寄生于以上五种动物的足螨能在已灭菌后的牛或马的 表皮碎屑作为培养基的环境中杂交，产出的卵可以孵化出幼蜻。依据以上试验结 果，s w a e t m a n 认为足螨不具宿主特异性，并提出足螨属的螨可分为牛足螨和德 州足螨，马足螨、山羊足螨、绵羊足螨和牛足螨属于同种足螨，因其首先被发现 寄生于牛体表，所以将其命名为牛足螨。德州足螨应该为另一独立种，最早发现 于美国德克萨斯州家养山羊体表接着又在加拿大驯科埘，巴西、以色列、德国 和美国等国的牛1 刁和波兰驼鹿的体表发现。这两种足螨从幼螨到若一螨、 若二螨、产卵的雌螨在形态上基本相同，其形态差异仅在于雄性成螨的体末突出 物的形状及其上刚毛的长度f 2 】 后期发现的羚羊足螨、熊猫足螨以及獾足螨等，由于发现的次数较少以及当 时的试验条件相对落后等原因，仅对其进行了粗略的形态学观察研究。观察结果 显示：这3 种足螨同牛足螨、德州足螨在形态上存在一定差异，其中羚羊足螨雄 螨末端突出物呈长三角形，而牛足螨、德州足螨雄蟥末端突出物呈四边形，突出 物上的竹片状刚毛也存在一定差异：羚羊足螨雄螨突出物上竹片状刚毛之间的距 离比牛足螨和德州足螨的要大。在雌螨方面，羚羊足螨的第3 对足上无长刚毛， 而牛足螨和德州足螨有长刚毛【。獾足螨于1 9 7 5 年被发现寄生予獾体表，但仅 对其进行了形态学研究，此后没有该足螨的进一步报道。獾足螨与牛足螨相比， 二者雌螨背部一些刚毛长度不同，雄螨方面，獾足螨末端的突出物比牛足螨的更 长更尖，其上的刚毛也更短小；与德州足螨相比，獾足螨雌螨的个体更大，雄螨 的末端突出物更近似于三角形，突出物上的最外侧刚毛也更大更长；獾足螨与羚 羊足螨相比，二者雌螨的部分背部刚毛的长度不同，二者的雄螨末端突出物也有 差异，主要表现在獾是螨的更短更宽，二者突出物上刚毛的位置和长度也不相同 1 9 。熊猫足螨分别与1 9 7 5 年和1 9 8 5 年在法国和中国的大熊猫体表被发现，其 个体比獾足螨和德州足螨的个体都要大，其雄螨末端突出物更长，雄蟥体表相应 刚毛的长度也不相同【4 一卯。目前，这3 种足螨的分类地位尚存在争议。 1 2 分子系统学研究进展 长期以来，对大多数物种的分类主要依靠其形态特征，传统的生物分类和 谱系树的建立是对于生物表型的比较分析，然而表型是基因型与环境相互作用 9 的产物，基因型相同的个体在不同环境条件下可能表现出显著的表型差异，给 分类和谱系分析带来困难和不确定性，基因型则直接反映基因的分子结构特征， 所以有人主张直接将基因型用于分类和系统学研究。分子生物学技术韵兴起促 使了分类学的发展 1 2 1 分子系统学的概念及发展简史 上世纪中叶，m a y r ( 1 9 6 9 ) t 1 刀首先将探索、描述和解释生物多样性及其分类 演化关系的科学定义为系统学( s y s t e m a t i c s ) ，它是分类学( t a x o m o m y ) 翘进化生物 学( e v o l u t i o n a r yb i o l o g y ) 的综合，其最终任务是确定分类群之间的进化关系并描 述进化的形式。随着研究方法的改进，系统学在二十世纪得到了很快的发展l i 矗 硼，大致可以分为如下三个阶段：( 一) 六十年代以前，系统学家多是基于物种 的形态和行为差异来研究物种的系统进化；( 二) 七十年代，数值分类( p h o n e t i c c l a s s i f i c a t i o n ) 和支序分类( c l a d i s t i cc l a s s i f i c a t i o n ) 方法的建立使各种性状特征趋于 量化，系统学家的工作也能更客观地反映物种间的系统进化关系；( 三) 八十年 代以后，随着分子生物学的发展，生物大分子广泛应用于解释物种的遗传结构 和分类关系，由此便诞生了分子系统学( m o l e c u l a rs y s t e m a t i c so rm o l e c u l a r p h y l o g e n y ) 分子系统学是检测、描述和艇释生物体内分子多样性及其演化规律 的学科，是以研究生命普遍性为对象的分子生物学与研究生物多样性的系统学 相结合的新的生物学分支，基于分子水平上的比较来建立分子进化树，进而推 论生物类群问的演化关系( 系统发育树) 1 2 1 恻。分子系统学主要包括两大领域： 种群遗传学( p o p u l a t i o ng e n c t i c s ) 和系统发生学( p h y l o g e n e t i c s ) ，前者主要研究种内 分化，后者主要研究物种多样性及种间系统发生阱l 。 分子系统学使得系统发育和进化的研究进入了在分子水平上对演化机制的 本质进行探讨的阶段，根据其研究方法的发展可分为如下三个阶段：( 一) 2 0 世 纪5 0 - 6 0 年代，分子系统学的研究主要在蛋白质水平上进行5 0 年代以免疫学 方法为主，并在脊椎动物亲缘关系的研究上取得了一定成果瞄1 ；6 0 年代中期 h l l b b 严6 】等应用同工酶电泳证明了动物自然群体中存在着大量的遗传变异，等位 酶、同工酶电泳技术开始成为分子系统学的热点技术。( 二) 7 0 年代，分子系统 学研究进入核酸水平时期。7 0 年代末期，线粒体d n a 的限制性片段长度多态性 技术开始在脊椎动物和无脊椎动物的种群结构研究中应用。( 三) 8 0 年代以来， 以多聚酶链式反应和s o u t h e r n 杂交为基础发展了一系列衍生技术，如随机扩增 多态性d n a 技术、d n a 指纹图谱技术和扩增片段长度多态性技术等，近几年 来又发展了微卫星d n a 指纹图谱技术及核酸序列测定技术，分子系统学在d n a 水平的研究得到飞速发展并取得了大量的显著性成果。 1 2 2 分子系统学的发展趋势 随着分子系统学的发展，一些有重大意义的问题的解决必将日益紧迫。首 先，如何用恒定进化速率和进化距离来更为准确地估计分歧时间和推断进化历 史是分子进化遗传学中一个重要的研究课题；其次，现阶段的分子系统学研究 很少把基因组进化与表型进化联系起来，因此今后的研究中，为了追踪从d n a 进化到表型进化的途径，需要研究结构基因与它们的调控基因问的关系及变化， 需要分子水平的比较解剖学和比较胚胎学，分析蛋白质在结构和功能上如何进 化，以及分析它们在不同组织或不同发育阶段中的表达是如何被调控的，从而 将分子水平与形态水平的研究有机结合起来。随着分子生物学知识和技术的积 累发展，系统学家已将生物信息学大分子看作重要的演化，同时人们在不断寻 找新的、有良好检测功能的分子标记及检测手段，随着技术的不断进步，来自 分子方法的数据在将来可能成为系统学研究中最主要的数据来源，并将引起分 类、系统、发育和进化研究中的又一次革命性变化，而且关于种群遗传结构方 面的研究必将为保护生物学提供遗传变异证据，在生物多样性的研究和保护中 起到重要的指导作用鲫。 1 3d n a 序列分析在螨类分类学上的研究 寄生虫是自然界中普遍存在、种类繁多的一类生物群体。寄生虫分类的目 的是找出不同寄生虫之间的亲缘关系，追溯各种寄生虫演变的线索，从这种关 系的参照对比中，比较全面准确地认识和了解它们。具体地说，了解寄生虫的 分类系统，通过比较各类( 种) 寄生虫的生理学、生态学以及其他各方面的个 性和共性，才能较全面地了解某类、某种寄生虫的本身。 长期以来，动物寄生虫的分类是一个复杂而有争议的问题。当前寄生虫主 要依据形态学特征进行分类，这样的分类具有很大的片面性和局限性，很难反 映一个种群的真正面貌，更不用说解释种间的亲缘关系，因而寄生虫分类系统 很不稳定，同种( 物) 异名和异种( 物) 同名非常多伫s 】。此外，在近缘种或中 间种的分类鉴定冽、宿主及地理环境等因素导致虫株的遗传变异的研究口o l 等方 面，传统研究方法的局限性也日益明显。随着分子生物学技术的发展，d n a 技 f 术也被广泛地应用于动物寄生虫的分类学研究。在d n a 一级结构水平上进行生 物分子标记的最直接方法是d n a 序列分析，即采用某种策略测定核苷酸基因组 d n a 特定区域的排列顺序。序列分析可以提供高度重复的、信息丰富的数据， 适合于中等和高层次分类群的系统学研究。由于该方法操作简单，结果准确可 靠，现已广泛应用于系统发生学研究。 与其他动物寄生虫一样，螨类是一种多细胞生物，其生物基因组数量庞大， 无法进行全面的序列分析，需要针对基因组中个别特征基因片段进行研究核 酸分子标记基因种类很多，目前线粒体d n a 0 1 3 3 1 、核糖体d n a ( r d n a ) ( ：“- y r j 、 微卫星d n a ! 撸3 9 l 等特征基因作为分子标记被广泛用于动物寄生螨类的分类鉴定 和系统发育研究，其中核糖体d n a 的研究相对较多。 真核生物的核糖体d n a 是细胞核内编码核糖体r n a 的基因，以串联多拷贝 的形式组成的庞大的多基因家族，呈团块聚集在特定染色体中，每个拷贝有非转 录区，转录区组成。其中，两个内部转录间隔区i t s 1 和i t s 2 将1 8 s 、5 8 s 和2 8 s 隔 开。 1 3 1 核糖体d n a 转录区的研究 核塘体d n a 转录区包括核糖体小亚基( 1 8 sr d n a ) 和核糖体大亚基( 2 8 s r d n a ) ，属于功能基因，进化速率较慢，常用于高级水平的系统发生学研究。 在动物寄生螨类的研究方面至今还未见有关1 8 sr d n a 的报道，仅有一篇研贫2 8 s r d n a 基因的报道。c m i c k s h 姐k 等( 1 9 9 9 ) 【柏】根据2 8 sr d n a 两个基因区域的d n a 序列探讨了皮刺螨属( d e r m a n y s s i n a ) p i j 的亲缘关系，研究获得了一个完整的进化 树，但是每个节点( n o d e ) 的自举值( b o o t s t r a p ) 却很低，另外在所扩增的长度 为7 5 1 b p 的两个基因区域中也仅有8 的变异位点因i l 也2 s s r r n a 不适于作为低 水平的分类标记。 1 - 3 2 核糖体d n a 内部转录间隔区( r i s ) 的研究 核糖体内部转录间隔区包括i t s 1 、i 1 5 - 2 两个区域，二者进化速率快，不 编码蛋白质，而转录区d n a 的进化速率慢，序列保守性强，因此便于设计i t s 区域的通用引物，同时i t s 各个拷贝的进化方式一致，便于进行分类分析。近年 来的研究表明，核糖体d n a 的i t s 区域是物种分类鉴定的非常有用的分子标记， 尤其适用于亲缘关系较近且形态非常类似的属下种间物种的分类及遗传关系研 究，因此，近年来该基因被广泛运用于螨类的分类学研究。 z a h l e r 等( 1 9 9 8 ) 洲探讨了来自德国、比利时、英国、莫桑比克、荷兰、南 非、意大利、新西兰、柏林、美国的兔、山羊、绵羊和牛的痒螨( p s o r o p t e s ) 的亲缘关系，研究发现根据刚毛长度不同可将这些痒螨样品为3 个种，即兔瘁螨 僻c u n i c u l 0 、绵羊痒螨僻钟动和鹿痒螨僻c e r v i n u s ) ；i t s - 2 基因序列分析发现：这 些来自4 个不同洲的痒螨样品的i t s - 2 基因序列具有高度同源性，因此认为来自 兔、山羊、绵羊和牛的痒螨是同一个种；基因序列分析发现其中根据形态分类 属于户c e r v i n u s 的牛的痒螨与形态分类属于r c u n i c u l i 的柏林株的兔的痒螨i t s 2 基 因序列同源性高于其他分离株；根据i t s 2 基因序列构建系统树，进化树中根据 形态命名为p o v i s 的牛和绵羊体上的3 个痒螨样品并未聚集在一起，但它们各自却 与来自不同地区的山羊、兔的p c u n i c u h 样品的i t s - 2 基因序列具有高度同源性。 o e h s 等( 1 9 9 9 ) 阅用i t s 2 基因序列作为遗传标记对来自同一地区兔和羊的瘁螨 ( p s o r o p t e s ) 的亲缘关系进行研究，发现不同羊体上的痒螨i t s - 2 碱基组成完全 相同，其序列与兔的痒螨的碱基组成仅有1 个核营酸的差异，表明兔痒螨和羊痒 螨是同一个种；但形态学观察结果显示；兔痒螨和羊痒螨的刚毛长度有所差别， 从形态学来看兔痒螨和羊痒螨为两个不同种，分别归属于只c u n i c u l i ( 分离自兔) 和p o v s ( 分离自羊) 由此可见传统的形态学分类与d n a 序列分析所得出的结 论存在分歧。z a h l e r 等( 1 9 9 9 ) 口7 】通过分析i t s - 2 基因序列探讨来自4 个洲的猪、 牛、犬、红狐、银狐、袋熊、猞凋、骆驼、狸和羚羊的疥螨( s a r c o p t e s ) 的亲缘 关系，研究发现疥螨i t s - 2 区域共存在2 4 个变异位点，序列同源性在9 7 3 一9 9 8 之间，虽然这些样品存在一定表型上的区别( p h e n o t y p i cd i f f e r e n c e s ) ，但仍可 排除是由不同种的疥螨所引起的，且与不同宿主及不同地理位置等因素没有相 关性。实验表明这4 个洲的l o 种不同动物体上的疥螨是同一个种。b e r r i l l i 等( 2 0 0 2 ) 1 3 q 利用i t s - 2 基因和线粒体1 6 sr r n a 作为遗传标记对来自阿尔卑斯山岩羚羊、比 利牛斯山岩羚羊和红狐的疥螨的亲缘关系进行研究表明，来自同一区域的寄生 与岩羚羊的疥螨和寄生与红狐的疥螨种群的i t s - 2 基因序列同源性较高且没有明 显的遗传变异，表明这两种疥螨是同一个种；而意大利西北部的红狐疥螨的1 t s - 2 基因序列与东北部的岩羚羊和红狐的疥螨的序列发生了明显的变异，且同一区 域的岩羚羊并没有发生疥螨病。表明东北部的岩羚羊和西北部的红狐疥螨为两 个不同的种。 在足螨的分类学研究中，以第二内部转录间隔区( i t s - 2 ) 基因的研究为主。 a n k e 等( 1 9 9 9 ) 【4 1 】对采自德国、以色列、美国、荷兰、冰岛等5 国的牛、马、 骆驼和绵羊的1 4 个足螨样品( 其中l o 个样品采自牛2 个样品采自马，1 个样品采 自骆驼，1 个样品采自绵羊) 的第二内部转录间隔区基因进行克隆测序并构建进化 树。结果显示：一共得到六条不同的i t s - 2 基因序列( 分别为c i 、c 2 、c 3 、c a 、 c 5 、c 6 ) ，依据其同源性的高低可以把这六条基因分为2 组，c 1 、c 2 、c 3 、c 4 为一组，这4 条基因的同源性高达9 4 0 0 - - 9 7 ，c 5 与c 6 为另一组，其同源性也 高达9 6 ，而这两组基因的同源性仅有8 9 o _ 9 3 ，同时，这两组基因分别对应 的足螨之间也存在一定的形态学差异，因此把以上足螨分为牛足螨和德州足螨， 其中9 种采自牛的足螨属于德州足螨，其余5 种足螨属于牛足螨。o c h s 等( 1 9 9 9 ) 】对奶牛、骆驼、绵羊的足螨i t s - 2 基因进行分析研究。结果显示：采自骆驼和 绵羊的足螨i t s - 2 基因长度均为2 2 5 b p ，且序列完全相同，采自奶牛的足螨的 i t s - 2 基因长度为2 2 8 b p ，两组基因的同源性仅为8 2 1 ，结合相应的形态学特 征将采自骆驼和绵羊的足螨鉴定为牛足螨，采自奶牛的足螨鉴定为德州足螨。 1 4 展望 动物寄生螨类的分类还是一个颇具争议的话题。学者们对于寄生在不同宿主 体上的螨分离株属于不同种还是同一个种的不同亚种持有不同的观点。寄生虫的 分类和鉴定是寄生虫学研究的基础，若想有效的防治寄生虫病，必须对寄生虫种 和虫株作出准确的分类弦一3 】。在应用于螨分类的多种分子生物学方法中，d n a 序列分析为进行系统发生学研究的最直接的方法。该方法具有提供的信息直接丰 富、操作简便、快速可靠等优点。根据所测定的序列数据，应用序列分析软件， 可计算遗传距离、同源性、碱基突变类型等，还可根据遗传距离得到亲缘关系的 进化树，是种、株鉴定的有力工具，尤其对形态学上难以区分或根据传统的分类 学方法存在争议的螨类的分类方面同样适用。为了有效地防治动物螨病及准确地 进行动物寄生螨类的分类，还需要不断寻找新的、合适的分子标记基因及检测手 段。我们相信随着分子生物学技术的进步以及新的分子标记基因的出现，动物寄 1 4 生螨的分类将会取得突破性的进展。 1 5 本试验的目的和意义 本试验利用形态学与d n a 序列分析相结合的研究方法对四川双流黄牛的 足螨，洪雅西门达尔奶牛、黑白花奶牛、蒙贝利亚奶牛的足螨以及成都大熊猫繁 育研究基地大熊猫体表的足螨进行种属分类学研究。探讨这些足螨的亲缘关系及 分类地位，从而可以从分子水平上为以形态学分类为基础的传统分类系统提供科 学依据，同时也为足螨的属下种问分类提供科学依据，亦可为足螨的临床医学、 免疫学、流行病学监控以及防治策略的制定等方面研究提供参考。 2 材料与方法 2 1 试验材料 足螨( 分别采自双流县黄牛体表；洪雅县黑白花奶牛、西门达尔奶牛、蒙贝 利亚奶牛体表；成都大熊猫繁育研究基地的大熊猫体表) 2 。2 试验方法 首先对以上五种足螨中的任意一种进行形态学观察( 本试验选择最先采到的 样品：采自于黄牛的足螨) 然后分别对五种足螨的i t s - 2 基因进行克隆和序列 分析，以首先进行了形态学观察的足螨i t s - 2 基因为参照，将其他4 种足螨的 i t s - 2 基因与该足螨的i t s 2 基因进行对比分析，发现有与之差异较大的足螨 i t s - 2 基因，再对相对应足螨进行形态学观察。结果发现采自熊猫的足螨i t s - 2 基因与其它四种足螨i t s - 2 基因差异较大，因此再对采自熊猫的足螨进行形态学 观察，观察重点是虫体大小、雄螨尾部突出物形状及剐毛的长度等。 2 3 足螨的形态学观察 2 3 1 试验材料与主要试剂 2 3 1 1 试验材料及其采集 ( 1 ) 试验材料足螨，分别采自黄牛和大熊猫体表 ( 2 ) 采集 寄生于黄牛的足螨的采集、分离纯化；用消毒处理后的钝刀片将感染了足螨 的黄牛痂皮刮下，放置于培养皿中，在3 7 c 温箱中作用1 5 2 h ，足螨受到高温 作用后将自动爬出痂皮此时，把培养皿中的痂皮倒入另一培养皿中。由于足螨 足上吸盘的吸附作用，从痂皮中爬出的足螨仍然在第一个培养皿中，此时用自制 的塑料毛刷将培养皿中的足螨收集，将其中一部分进行形态学观察，剩余的7 0 c 保存，供下一步研究所用。 寄生与大熊猫的足螨的采集、分离纯化：由于大熊猫的足螨一般寄生在眼部 等少毛的地方，感染足螨的量相对较少，加之大熊猫的特殊地位使得采样时不能 对其造成身体上的伤害因此采集过程为：首先在干的棉签上加少量的水，然后 用棉签在熊猫的感染部位来回涂抹，使足螨粘到棉签上，再用解剖针把足螨从棉 签上取下，将其中一部分进行形态学观察，剩余的7 0 c 保存，供下一步研究所 用。 2 3 1 2 试验试剂 5 0 的甘油蒸馏水、2 5 的戊二醛、磷酸缓冲液、3 0 - - - 1 0 0 的乙醇、乙酸 异戊脂 2 3 1 3 主要仪器设备 普通光学显微、k y k y l 0 0 0 b 型扫描电子显微镜 2 3 2 试验方法 2 3 2 1 光学显微镜下足螨形态的观察研究 滴加1 滴5 0 的甘油蒸馏水透明液于载玻片上，挑取一定数量的足螨置于透 明液中，盖上盖玻片，待足螨透明完全以后，置于光学显微镜下观察与测量。 2 3 2 2 扫描电子显微镜下足螨形态的观察研究 参照吴聪明等的方法，将足螨置于2 5 的戊二醛内，4 冰箱内固定2 h ， 磷酸缓冲液换洗3 次，3 0 0 o - - - 1 0 0 的乙醇梯度脱水，乙酸异戊脂置换1 5 m i n ，经 过二氧化碳临界点干燥和真空镀膜后，在k y k y l 0 0 0 b 型扫描电子显微镜下观 察。 2 4 足螨i t s - 2 基因克隆测序及序列分析 2 4 1 试验材料与主要试剂 2 4 i 1 材料及采集 采自四川双流黄牛的足螨，洪雅西门达尔奶牛、黑白花奶牛、蒙贝利亚奶牛 的足螨以及成都大熊猫繁育研究基地的大熊猫的足螨。寄生于三种奶牛的足螨的 采集方法与寄生与黄牛的足螨的采集方法相同。 2 4 1 2 主要试剂及载体 s d s ( t 二烷基磺酸钠) 、氨苄青霉素、胰蛋白胨、酵母提取物、氯化纳、氯 化钙、n a a c ( 醋酸钠) 、冰乙酸、苯酚、氯仿、异戊醇，无水乙醇、蛋白酶k 、t r i s 碱、琼脂耱等均为国产分析纯级产品。p c r 扩增试剂盒( s k l 4 9 2 ) 、u m q 1 0 d n a 胶回收试剂盒为上海生物工程公司产品；d l 2 0 0 0m a r k e r 、g o l d v i e w 、l o d d i n g b u f f e r 为北京天为时代公司产品。宿主菌d h 5 a 由本实验室保存，p m d i s - t 载体 购买于大连宝生物公司。 2 4 1 3 主要仪器设备 仪器名称型号及生产厂家 p ( 聚扩增仪 电子天平 暗箱紫外透射仪 凝胶成象系统 冷冻离心机 电泳仪 电泳槽 t g r a d i e n t 9 6 、德国b i o m e t r a s h a n g p i n gf a 2 0 0 4 ，上海仪器厂 s a b c - 2 0 0 ，华美生物工程公司产品 b i o r a d 公司产品 5 8 0 4 r ，e p p c n d o r f 公司产品 d y y 二6 b 北京市六一仪器厂 d y y - i i 型北京市六一仪器厂 2 4 1 4 培养基及常用液体 l b 培养基：t r y p t o n ( o x o i d 公司) 1 9 ，y e a s te x t r a c t ( o x o i d 公司) 0 5 9 ， n a c l l g ，加蒸馏水8 0 m l ，调p h 值至7 0 ，定容至1 0 0 m l ，1 1 5 高压蒸汽灭菌 1 5 m i n 后于4 c 保存。 氨苄青霉素( a m p ) ：用灭菌的蒸馏水配制后，用0 2 2 u r n 滤器过滤除菌。贮 存液为1 0 0 m g m l ，t 作浓度为1 0 0 p g m l 。 w r g ( 2 4 m g m 1 ) ：用灭菌的蒸馏水配制后，用0 2 2 u r n 滤器过滤除菌。贮存液 为2 4 m g m l ，工作浓度为2 5 g m l 。 x g a l ：用二甲基甲酰胺充分溶解，贮存液为2 0 m g m l ，工作浓度为4 0 p g m l 。 l m o f l 的t r i s h c i 储存液( p h = 8 o ) ：将1 2 1 1 克的 i r i s 碱溶解于8 0 0 m i 蒸 馏水中，加浓h c l 调到p h 值8 0 ，再定容到1 0 0 0 m l ，分装高压灭菌后备用。 1 7 0 s m o l l 的e d t a 溶液( p h = 8 o ) ；在8 0 m l 水中加入1 8 6 1 9e d t a - n a 。2 h 2 0 ， 充分搅拌；以n a o h 调p h 到8 0 ，定容到1 0 0 m l ，分装灭菌。 2 0 的s d s 溶液：2 0 8s d s 。8 0 m l 水，加热到6 8 助溶，加入几滴浓盐酸 调节溶液的p h8 0 ，加水定容到l o o m l ，分装备用。 质粒d n a 的碱裂解缓冲液： 溶液a ：5 0 m m o f l 葡萄糖。2 5 m m o v lt r i s c 1 ( p h = 8 o ) ，l o m m o l le d t a ( p h = 8 o ) ； 溶液b ：0 2 m o l l n a o h ，1 ( w v ) s d s ，临用前配制； 溶液c ：5 m o l l n a a c6 0 m l ，1 1 5 m l 冰乙酸，2 8 5 m l 去离子水。 5 0 x t a e 缓冲液：称取t r i s 碱2 4 2 9 ，先用3 0 m l 重蒸水加热搅拌溶解后，加 入5 7 1 m l 冰乙酸，加入1 0 m 1 5 0 0 m m o l l 的e d t a 溶液( p h = 8 0 ) ，用冰乙酸调 节p h 到8 0 ，定容到1 0 0 m l 。 1 0 x t e 溶液：取l m o l l ( p h8 o ) 的t r i s - c l 溶液1 0 0 m l 和0 5 m o l l ( p h = 8 0 ) 的e d t a 溶液2 0 m l 用超纯水定容到1 0 0 0 m l ，高压灭菌，室温保存 足螨d n a 抽提裂解液：o 0 1 m l 的t r i s h c l 溶液( p h = 8 o ) ；o i m l 的e d t a 溶液( p h = 8 o ) ；o 5 的s d s 溶液( m v ) 。 2 4 2 试验方法 2 4 2 1 足螨基因组d n a 的提取 足螨基因组d n a 的提取方法参考文献【4 圳，并结合本实验的条件，加以改 进，具体操作如下； ( 1 ) 取低温保存的足螨置于预冷的研钵中充分研磨，将研磨以后的虫体转入无菌 e p 管中，按1 0 0 r a g 虫体加入4 0 0 u l 足螨d n a 抽提裂解液的比例向e p 管中加入 足螨d n a 抽提裂解液，3 t c 水浴1 小时。 ( 2 ) 向上述e p 管中加入蛋白酶k 至终浓度1 0 0 u g m l ，用玻棒温和地使蛋白酶k 混入粘滞的溶液中，5 0 c 水浴3 h ，不时旋动该粘滞溶液。 ( 3 ) 待该溶液冷却至室温后加入等体积的苯酚( p h8 。o ) ，缓慢上下摇匀5 r a i n ，于 4 c ，1 0 0 0 0 r l m i n 离心5 r a i n ，用吸管小心吸出上层液转入另外一只无菌e p 管中， 下层液体和蛋白质丢弃。 ( 4 ) 向上述e p 管中加入等体积的酚氯仿( 苯酚：氯仿：异戊醇的比例为2 5 ：2 4 ； 1 ) ，缓慢上下摇匀5 r a i n ，于4 ，1 0 0 0 0 r r a i n 离心5 r a i n ，用吸管小心吸取上层 液转入另外一无菌e p 管中，下层液体和蛋白质丢弃。 ( 5 ) 向上述e p 管中加入等体积的氯仿( 氯仿：异戊醇的比例为2 4 ：1 ) 缓慢上下 摇匀5 m i n ，于4 c ，1 0 0 0 0 r r a i n 离心5 r a i n ，用吸管小心吸取上层液转入另外一 无菌e p 管中，下层液体和蛋白质丢弃。 ( 6 ) 向( 5 ) 中所保存的液体中加入0 2 倍体积的3 m o l l 醋酸钠及2 5 倍体积的无 水冻乙醇，- 2 0 放置3 0 r a i n 以上。 ( 7 ) 取出经过冻存沉淀的样品，于4 01 2 0 0 0 r m i n 离心1 0 1 5 r a i n 。弃去上清液； 加入适量7 0 0 6 的冻乙醇，用吸管吹打沉淀数次，于4 1 2 1 2 0 0 0 r m i n 离心5 m i n ，重 复2 - 3 次，倒置自然干燥。 ( 8 ) 加入适量t e ( p h ：8 o ) 溶解沉淀，加入1 0 m g m l 的r n a s e a 至终浓度 2 0 u e d m l ，3 7 0 作用3 0 分钟。1 o 琼脂糖凝胶中电泳检测d n a 的提取结果， 将d n a 保存于- 2 0 ，备用。 2 4 2 2i r s - 2 基因的p c r 扩增 ( 1 ) 引物设计 根据国际生物信息中心( h t t p ：w w w n e b i n i h h i m g o v ) o c h s t 3 5 】等1 9 9 9 年发 布的德州足螨、牛足螨的第二内部转录间隔区基因的核苷酸序列，运用p r i m e r 5 0 设计引物如下： 上游引物：5 t c ct a tg g ct i c g t r t g tc t ( _ - 3 ； 下游引物：5 一a a c t t ct g cg g gt a at c tc g - _ 3 ； 其e p 上游引物长度为2 l b p ，下游引物长度为2 0 b p 。由德州足螨的第二内部 转录间隔区基因( a f l 2 3 0 8 2 ) 序列推测上下游引物之间的跨度为2 9 7 b p ：由牛足 螨的第二内部转录间隔区基因序列( a f l 2 3 0 8 1 ) 推测上下游引物之间的跨度为 2 9 4 b p ，均包含了足螨整个1 t s - 2 基因序列。该引物由上海生物工程技术服务有 限公司合成。 ( 2 ) p c r 扩增 i t s 2 基因的p c r 扩增，参照上海生物工程公司p c r 扩增试剂盒( s k l 4 9 2 ) 的使用说明，在5 0 山反应体系中依次加入以下组分： 1 0 x p c rb u f f e r 5 0 p l m g c h ( 2 5 r a m ) 矾t pm i x t u r e ( 2 r a m ) 上游引物( 1 0 m m ) 下游引物( 1 0 m m ) 模板d n a t a qd n ap o l y m e r a s ( 5 u i _ t l ) 3 c i u l 1 o u l 2 o p l 2 o 灿 2 0 t t l 0 5 u l d i s t i l l ed u l t r a p u r ew a t e rt 0 5 0 o u l 将上述反应体系的各种试剂混合均匀，瞬时离心后加入2 0 t t l 矿物油，进行 p c r 反应，条件如下：9 4 预变性3 r a i n ，9 4 变性l m i n ，5 0 退火3 0 s ，7 2 延伸l m i n ，循环3 0 次；然后7 2 作用1 0 m i n 。p c r 产物在1 o 的琼脂糖凝胶 中电泳，g o l d - v i e w 染色，凝胶成相系统观察结果 2 北3p c r 产物的回收 采用上海生物工程技术服务有限公司生产的u n i q l o 柱式d n a 胶回收试 剂盒回收，并按试剂盒给定的操作步骤进行操作，具体步骤如下： ( 1 ) 用于净的手术刀割下含有要回收d n a 片段的琼脂糖凝胶，放入1 5 m l 离心管 中。 ( 2 ) 每1 0 0 m