（法医学专业论文）44个snps位点复合分型体系的构建及其法医学应用.pdf

。：f j 二 上 ， lrri 目录 ill lllyll川8lllm0。1117圳8l掣40l飞 弋i 中文摘要1 英文摘要4 英文缩写8 研究论文4 4 个s n p s 位点复合分型体系的构建及其法医学应用 引言9 9弓l 舌 第一部分s n p s 位点的选择与引物设计 前言1 1刖舌l l 材料与方法12 结果1 3 附表1 5 讨论2 1 小结2 5 参考文献2 5 第二部分4 4 个s n p s 位点复合分型体系的构建与优化 前言2 8月u 舌 材料与方法2 9 结果3 6当日术j u 附图3 9 附表_ 4 7 讨论4 9 小结5 2 参考文献5 3 第三部分4 4 个s n p s 位点复合分型体系的法医学应用评估 前言5 5刚吾3 3 材料与方法5 5 结果6 2 附图6 5 附表7 5 讨论7 9 小结8 3 参考文献8 4 结论8 6 综述单核苷酸多态性在法医学应用中的分类8 7 参考文献9 3 致谢9 8 个人简历9 9 中文摘要 4 4 个s n p s 位点复合分型体系的构建及其法医学应用 摘要 目的：目前，常规s t r 分型试剂已基本能够解决大部分个体识别及 亲子鉴定案例。然而，在许多案例中，d n a 样本会由于人为或自然因素 而高度降解，无法进行有效s t r 分型，使案件侦破限于困境。线粒体d n a ( m t d n a ) 高度变异区的分析虽已较为广泛应用，但由于母性遗传，所 携带的信息量小，且个体识别力较低，因此应用具有一定的局限性。 m i n i s t r 基因座分析技术通过将p c r 引物设计得尽可能靠近重复区域而 缩短扩增片段长度，应用于高度降解d n a 样本检测，可提高检测成功率， 然而，尽管将引物尽可能靠近重复区域，对于等位基因较多的s t r 基因 座，扩增产物长度仍然大于1 0 0 b p 。m i n i s t r 还存在另一个不足为了 达到个体识别力，一般需要进行不止一次的多重p c r 反应，但法医工作 者在降解检材中往往得不到足够的可用于模板的d n a 量。单核苷酸多态 性( s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m s ，s n p s ) 指人类基因组中特定部位的 单个碱基序列的变异，其具有突变率低，扩增片段短，适合高通量检测和 易于分型等特点，因此在法医学个体识别应用中具有广阔前景。选用可靠 的多重分型方法，许多s n p s 位点可以在短至4 5 5 5 b p ( 变异位点两侧引 物序列长度) 的扩增片段内分型。在多种s n p s 多重检测技术平台中，基 于s n a p s h o t 试剂盒的引物延伸技术可以一次性检测1 2 个或更多个s n p s 位点，因此，当d n a 样本严重降解或遇到检材微量时，s n p s 分析将更 有价值。然而，由于应用于高度降解检材d n a 个体识别的s n p s 要具备 高杂合度、低分化差异及适合高通量技术分析等特点，目前尚未确定一套 适合的核心s n p s 位点用于个体识别。基于此，本研究的目的是在人类基 因组数据库中筛选出符合个体识别标准的一组常染色体s n p s ( i n d i v i d u a l i d e n t i f i c a t i o ns n p s i i s n p s ) ，使系统达到个体识别的效能；应用多重p c r 联合荧光标记单碱基延伸( s i n g l eb a s ee x t e n t i o n ，s b e ) 反应技术构建复 合分型体系，并对该复合分型体系的法医学应用价值进行评价。 方法：筛选出至少5 0 个符合个体识别条件的常染色体s n p s 位点， 根据h t t p ：w w w n c b i n l m n i h g o v s n p 公布的参考序列，应用引物设计软 、 l， 、t q ；- 1 _ 对、 伊 中文摘要 件，设计5 0 个s n p s 位点的p c r 引物及单碱基延伸引物。构建s n p s 多重p c r 反应体系，将p c r 产物经e x o n u c l e a s ei 和s h r i m pa l k a l i n e p h o s p h a t a s e 反应纯化后，分为2 个体系应用s n a p s h o t 试剂盒进行单碱基 延伸反应，s b e 产物经s a p 去除多余的d d n t p 后，应用a b i3 1 3 0 基因 分析仪进行检测，313 0d a t ac o l l e c t i o nv 3 0 软件收集数据，g e n e m a p p e r i dv 3 2 软件分析结果，同时完成所有s n p s 位点的分型。优化m 9 2 + 和d n t p 浓度、退火温度、循环次数以及各位点引物浓度比例等因素，使各位点 p c r 产物量尽可能均衡，最终构建成s n p s 复合分型体系。应用构建 的s n p s 复合分型体系调查我国河北地区7 9 份健康无关个体的遗传多态 性，通过一系列实验评价该体系的灵敏度、种属特异性和组织统一性；评 估s n p s 复合分型体系在亲权鉴定和陈旧腐败降解检材d n a 分析中的应 用价值。 结果：筛选出了5 0 个常染色体s n p s 位点，设计了5 0 个位点的p c r 引物及单碱基延伸引物：所有多重p c r 反应引物的理论退火温度设计为 6 0 5 c ，产物长度在6 9 1 2 5 b p 之间。单碱基延伸引物长度在2 0 一8 3 个碱 基之间，设计其5 端修饰多聚t 或多聚c t 序列，使引物之间长度差异为 3 - 6 个碱基。经过优化，其中有6 个s n p s 位点由于检测结果不稳定被 舍去，将剩余的4 4 个位点成功构建了s n p s 复合分型体系，能够在同一 p c r 反应体系内同时扩增4 4 个s n p s 位点的d n a 片段；4 4 个位点分配 到2 个单碱基延伸反应体系中，复合分型体系1 ( p l e x l ) 包含2 6 个s n p s 位点，复合分型体系2 包含1 8 个s n p s 位点。获得了我国河北地区7 9 份健康无关个体4 4 个s n p s 位点的群体遗传学数据，抽样人群基因型频 率分布符合h a r d y w e i n b e r g 平衡，4 4 个s n p s 位点的随机匹配概率为 5 5 9 x1 0 0 9 ，累积非父排除概率为0 9 9 9 2 6 3 3 4 2 1 。该s n p s 复合分型体系对 标准d n a 样品9 9 4 8 的最低检出量为0 0 6 2 5 n g 。对恒河猴等非人类生物 性检材进行d n a 分析，在恒河猴样本中检出1 6 个位点的延伸产物，而 其它非人类生物样本中均未检出。亲权鉴定结论与a m p f l s n i d e n t i f i l e r t m 试剂盒的结论一致。在分析陈旧腐败降解检材方面，与 a m p f l s t r i d e n t i f i l e r t m 试剂盒及m i n i s t r 分型方法进行比较，4 4 个s n p s 位点复合分型系统的位点检出率明显提高，具有较高的实际应用价值。 结论：本研究通过自主设计p c r 和单碱基延伸反应引物，成功构建 - r 7 中文摘要 一一1 了一个包含有4 4 个高杂合度、低人群分化差异s n p s 位点的复合分型体 系。法医学可行性研究结果显示，该复合分型系统可以应用于法医学实际 检案中，在分析陈旧腐败降解检材时可作为s t r 分析的有效补充。 关键词：单核苷酸多态性；个体识别；s n a p s h o t ；降解d n a 。 、 1 英文摘要 t h ec o n s t r u c t i o na n da p p l i c a t i o no fam u l t i p l e xt y p i n gs y s t e m w i t h4 4s n pl o c i a b s t r a c t o b j e c t i v e ：t h e c u r r e n t c o m m e r c i a l l ym u l t i p l e x s t rk i t su s e di n f o r e n s i cd n a t y p i n gc a l ls o l v em o s tc a s e so fi n d i v i d u a li d e n t i f i c a t i o na n d p a r e n t a g et e s t i n g h o w e v e r ，i nm a n yo t h e rf o r e n s i cc a s e st h a td n as a m p l e s a r e h i g h l yd e g r a d e d d u et o e x p o s u r e t oe n v i r o n m e n t a le l e m e n t so r i n c o r p o r a t i o no fn a t u r a lc o n t a m i n a n t s ，s t ra n a l y s i sb e c o m e si m p o s s i b l ea n d i tm a k e st h ec a s ei n v e s t i g a t i o n sd i f f i c u l t t h ea n a l y s i so fm i t o c h o n d r i a ld n a ( m t d n a ) h y p e r v a r i a b l er e g i o n si st y p i c a l l yu s e d ，b u tg i v e nt h eh a p l o i da n d m a t e r n a l - o n l yt r a n s m i s s i o no fm t d n a , a n d t h ep o w e ro fd i s c r i m i n a t i o ni sl o w ， i t su t i l i z a t i o ni sl i m i t e d m i n i s t ra s s a y s ，w h i c hi st or e d u c et h es i z eo ft h e p c r p r o d u c t sb ym o v i n gp r i m e r sa sc l o s ea sp o s s i b l et ot h er e p e a tr e g i o n ， p r o d u c e sah i g h e rs u c c e s sr a t ef o rg e n e t y p i n gw i t hd e g r a d e dd n as a m p l e s h o w e v e r , w h i l eb r i n g i n gt h ep r i m e r so fs t r sc l o s e rt ot h er e p e a tr e g i o n r e d u c e so v e r a l la m p l i c o ns i z e s ，t h ep r o d u c t i o nl e n g t h so fl o c iw i t ht h el a r g e s t r a n g eo fa l l e l e s w i l l b es t i l ln o tl e s st h a n10 0 b p a n o t h e rd r a w b a c kt o m i n i s t r a p p r o a c hi st h a tm o r et h a no n em u l t i p l e xa m p l i f i c a t i o na r er e q u i r e d i no r d e rt om a t c ht h ed i s c r i m i n a t i o np o w e r , b u ta ne x a m i n e rm a yn o th a v et h e l u x u r yo fo b t a i n i n ga na b u n d a n c eo fd e g r a d e dd n a f r o mal i m i t e df o r e n s i c s a m p l e s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m s ( s n p s ) a r eat y p eo fp o l y m o r p h i s m i n v o l v i n gv a r i a t i o no fo n es i n g l eb a s ep a i rt h a to c c u r sa ta p p r e c i a b l eg e n e t i c s e q u e n c e i nh u m a ng e n o m e s n p sh a sl o wm u t a t i o nr a t e sa n dc a nb e g e n o t y p e d w i t h h i g h t h r o u g h p u tt e c h n o l o g i e s a n d a n a l y s e d a f t e rp c r a m p l i f i c a t i o no fv e r ys h o r td n ar e g i o n s ，t h u sm a k e st h e mi d e a lm a r k e r sf o r h u m a ni d e n t i f i c a t i o n w i t har e l i a b l em u l t i p l e xp r o c e d u r e ，m a n ys n p sc a l l p o t e n t i a l l yb et y p e du s i n gv e r ys h o r tr e c o g n i t i o ns e q u e n c e s - - i nt h er a n g eo f 4 5 - - 5 5b p ( m e r e l yt h el e n g t ho ft h et w of l a n k i n gp c rp r i m e r s ) o t h e r w i s e ， t h e r ea r ev a r i o u ss n pm u l t i p l e xt y p i n gp l a t f o r m st h a ta r ea v a i l a b l ef o r 4 英文摘要 s i m u l t a n e o u sm u l t i p l e xd e t e c t i o no f12o rm o r es n p s ，s u c ha st h ec o m m e r c i a l r e a g e n tk i ts n a p s h o tw h i c hb a s e so nt h ep r i n c i p l eo fs i n g l eb a s ee x t e n t i o n t e c h n i c t h u s ，s n p sa n a l y s i sw i l lc l e a r l yb ee x t r e m e l yv a l u a b l ew h e nd n a s a m p l e s a r e s e v e r e l y l i m i t e do r d e g r a d e d h o w e v e r ，f o r i n d i v i d u a l i d e n t i f i c a t i o ns n p sr e q u i r e sh i g h h e t e r o z y g o s i t ya n dl o wc o e f f i c i e n t o f i n b r e e d i n g ，a n ds h o u l db eg e n o t y p e dw i t hh i g h t h r o u g h p u tt e c h n o l o g i e s ，t h e r e i sn o taf i n a lp a n e lo fi n d i v i d u a li d e n t i f i c a t i o ns n p st h a th a db e e nd e f i n e dy e t t h u s ，t h eo b j e c t i v eo ft h i ss t u d yi st os e l e c tas u f f i c i e n tn u m b e ro fa u t o s o m a l s n pl o c i t h a tm e e tt h ec r i t e r i ao fi n d i v i d u a li d e n t i f i c a t i o n ( i n d i v i d u a l i d e n t i f i c a t i o ns n p s ，i i s n p s ) a n dm a t c ht h ed i s c r i m i n a t o r yp o w e r , t h e n d e v e l o p a h i g h l y e f f i c i e n td n at y p i n g s t r a t e g y f o r a n a l y z i n g a l ll o c i s i m u l t a n e o u s l yb yu s i n gm u l t i p l e xp c ri n a s s o c i a t i o nw i t hf l u o r e s c e n t l a b e l l e d s i n g l e b a s e e x t e n s i o n ( s b e ) t e c h n i q u e ，a n dp e r f o r m as e r i e s e x p e r i m e n t s t oa s s e s st h ef o r e n s i c a p p l i c a t i o n o ft h e h i g h - t h r o u g h p u t s n p t y p i n gm e t h o d s m e t h o d s ：a tl e a s t5 0a u t o s o m a ls n pl o c it h a tm e tt h ec r i t e r i ao f i n d i v i d u a li d e n t i f i c a t i o nw e r es e l e c t e d p r i m e r sf o rp c r a m p l i f y i n ga n ds i n g l e b a s ee x t e n t i o nw e r ed e s i g n e du s i n gp r i m e rd e s i g n i n gs o f t w a r ea c c o r d i n gt o t h er e f e r e n c es e q u e n c ef r o md b s n p ( h t t p ：w w w n c b i n l m n i h g o v s n p ) t h em u l t i p l e xp c rs y s t e mw i t ha l ls n p sw a sd e v e l o p e d ，t h e nt h ep c r p r o d u c tw a sd i v i d e di n t ot w os b em u l t i p l e x e sa f t e rp u r i f i e db ye x o n u c l e a s ei a n ds h r i m pa l k a l i n ep h o s p h a t a s e t h es b er e a c t i o nw a sp e r f o r m e db y s n a p s h o tk i ta n dt h ee x c e s sd d n t p sw e r er e m o v e db ya d d i t i o no fs h r i m p a l k a l i n ep h o s p h a t a s et ot h es b em i x t h es b e p r o d u c tw a sd e t e c t e db ya b i 313 0g e n e t i ca n a l y z e r ，a n dt h ed a t aw a sc o l l e c t e db y313 0d a t ac o l l e c t i o n v 3 0s o f t w a r e ，f r a g m e n ts i z ed e t e r m i n a t i o na n dg e n o t y p i n go fa l lt h es n p s l o c iw e r ed o n ew i t hg e n e m a p p e ri dv 3 2s i m u l t a n e o u s l y t h ea m p l i f i c a t i o n c o n d i t i o n ss u c ha st h ec o n c e n t r a t i o no fm g 肿，d n t pa n d p r i m e r s ，t h ea n n e a l t e m p e r a t u r ea n dt h ec y c l et i m e sw e r eo p t i m i z e dt ob a l a n c et h ep c rp r o d u c to f e a c hl o c u s ，s ot h a tt h ef i n a lm u l t i p l e xt y p i n gs y s t e mw i t ha l ls n p sw a s d e v e l o p e d g e n e t i cp o l y m o r p h i s md a t ao f7 9s a m p l e sf r o mu n r e l a t e d 5 i 英文摘要 - _ 一一 h e a l t h yi n d i v i d u a l si nh e b e iw a si n v e s t i g a t e dw i t ht h es n p sm u l t i p l e xt y p i n g s y s t e m as e n e so fe x p e n m e n t sw e r ep e r f o r m e dt ov a l i d a t et h ec h a r a c t e r i s t i c o ft h es n p sm u l t i p l e xt y p i n gs y s t e m ，s u c ha ss e n s i t i v i t y ，s p e c i e ss p e c i f i c i t v a n dc o n c o r d a n c eo fd i f f e r e n tt i s s u ef r o mas a m eb o d y p e r f o r m a n c eo ft h e s n p sm u l t i p l e xt y p i n g s y s t e mi np a t e m i t yt e s t i n ga n dh i g h l yd e g r a d e d s a m p l e sw a s a s s e s s e di ns a m ec a s e s r e s u l t s ：0 ) 5 0a u t o s o m a ls n pl o c iw e r es e l e c t e da n dt h ep r i m e r sf o r p c r a m p l i f y i n ga n ds i n g l eb a s ee x t e n t i o nw e r ed e s i g n e d a l lm u l t i p l e xp c r p r i m e r sw e r es e l e c t e dt oh a v et h e o r e t i c a lm e l t i n gt e m p e r a t u r e so f6 0 5 a n dt h el e n g t h so ft h ep r o d u c t sr a n g e df r o m6 9t o 12 5 b p t h el e n g t h so ft h e s b e p r i m e r sw e r eb e t w e e n2 0a n d8 3n u c l e o t i d e s ，w i t hs i z ei n t e r v a l so f3t o6 n u c l e o t i d e s ，w h i c h s e db y5 o fp o l y to rp olyctnucleotldes w h i c hw e r ei n c r e a s e d5e n da d d i t i o n d o l vto rd o lvt ， 一 6s n p sw e r ee l i m i n a t e db e c a u s eo fi n s t a b i l i t yt y p i n gr e s u l t s ，t h e nt h e m u l t i p l e xt y p i n gs y s t e mw a ss u c c e s s f u l l yd e v e l o p e dw i t h4 4s n p sr e m a i n e d a f t e ro p t i m i z e d a l lt h ea m p l i c o n sw i t h4 4s n p l o c ic o u l db es i m u l t a n e o u s l v a m p l i f i e di nas i n g l et u b ea n dw e r ea s s i g n e di n t ot w os b e r e a c t i o n s ，w i t h2 6 l o c ii np l e x1a n d18l o c ii np l e x2r e s p e c t i v e l y t h ep o p u l a t i o ng e n e t i c s d a t ao f7 9u n r e l a t e di n d i v i d u a l sf o rt h e4 4s n pl o c i w a sc 0 1 l e c t e d t h e g e n o t y p e so fa l ls n pl o c is t u d i e dw e r ed i s t r i b u t e da se x p e c t e db a s e do nt h e a s s u m p t i o no fh a r d y _ w e i n b e r ge q u i l i b r i u m t h ea v e r a g em a t c h p r o b a b i l i t yi s 5 5 9 x10 。憎，a n dt h ec u m u l a t i v ee x c l u s i o n p o w e ri s0 9 9 9 2 6 3 3 4 21 ac o m p l e t e s n pp r o f i l ew a so b t a i n e df o r9 9 4 8 s t a n d a r dd n af r o mo n l y0 0 6 2 5 n g s p e c i e ss p e c i f i cs t u d yr e s u l t ss h o w e dt h a t16l o c iw e r ed e t e c t e di nr h e s u s m o n k e ys a m p l e sw h i l en os i g n a lw a sd e t e c t e di no t h e rs p e c i e s c o n c l u s i o n s f r o mt h e4 4s n p s m u l t i p l e xt y p i n gs y s t e mi n p a t e r n i t yt e s t i n gw e r e c o n c o r d a n c ew i t ht h a tf r o ma m p f l s 畔i d e n t i f i l e r t mk i t w h i l et h e4 4s n p s m u l t i p l e xt y p i n gs y s t e mp r o d u c e dah i g h e l s u c c e s sr a t ef o rg e n e t y p i n gw i t h d e g r a d e dd n as a m p l e sc o m p a r e dw i t ha m p f l s 豫黟i d e n t i f i l e r t mk i ta n d m i n i s t r t y p i n ga s s a y , i tw o u l db em o r ev a l u a b l ei na n a l y z i n gs a m p l e sw h i c h l o o s e ds i g n a l sb ys t r t y p i n g c o n c l u s i o n s ：b yt l l ew a yo fd e s i g n i n gp c ra n ds b ep r i m e r s ，w e 英文摘要 s u c c e s s f u l l yd e v e l o p e das n p sm u l t i p l e xt y p i n gs y s t e m ，w h i c hi n c l u d i n g4 4 s n p sw i t hh i g hh e t e r o z y g o s i t ya n dl o wc o e f f i c i e n to fi n b r e e d i n g t h e a p p l i c a t i o ns t u d yi n d i c a t e dt h a tt h e4 4s n p sm u l t i p l e xt y p i n gs y s t e mc o u l d b e a p p l i e di nf o r e n s i cr o u t i n ew o r k ，a n di tw o u l ds e r v ea i li m p o r t a n tr o l e f o r a n a l y z i n gc h a l l e n g i n gf o r e n s i cs a m p l e s k e y w o r d s ：s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m s ；i n d i v i d u a li d e n t i f i c a t i o n ； s n a ps h o t ；d e g r a d e dd n a 7 、 r 旷 英文缩写 央又聋百与 j 。 s n p s s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m s单核苷酸多态性 ，s t r s h o r tt a n d e mr e p e a t 短串联重复序列 m i n i s t rm i n is h o r tt a n d e m r e p e a t小片段短串联重复序列 i i s n p si n d i c i d u a li d e n t i f i c a t i o ns n p s 个体识别s n p s p c r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n多聚酶链式反应 i s b e s i n g l eb a s ee x t e n s i o n单碱基延伸反应 e x oie x o n u c l e a s ei 核酸外切酶i s a p s h r i m pa l k a l i n ep h o s p h a t a s e虾碱性磷酸酶 研究论文 4 4 个s n p s 位点复合分型体系的构建及其法医学应用 法医检案工作中，由于高温、潮湿、暴晒、微生物等因素的影响，生 物性检材中的d n a 分子经常被损坏，发生断裂，分子变小，大片段丢失。 在这些情况下应用s t r 技术不能成功地得出结论，经常会出现“优势扩 增 或者“无效扩增”，给正确的d n a 分型带来困难。目前，法医d n a 分析中研究解决高度降解检材d n a 样本分型的技术通常主要集中在两个 方面：即小片段s t r ( m i n i s t r ) 技术和s n p s 分析技术【1 2 】。m i n i s t r 技 术通过将s t r 遗传标记的扩增引物设计的尽可能接近重复区域而缩短 p c r 产物片段长度，应用于高度降解检材和微量检材中可以提高d n a 分 型的成功率【3 4 】。但在分析高度降解检材方面，m i n i s t r 基因座分析的d n a 片段范围在8 0 一- 1 5 0 b p ，对于 1 0 0 b p 的高度降解d n a ，m i n i s t r 基因座 分析技术仍然具有局限性。而且，由于扩增片段长度和荧光染料种类的限 制，在一个复合扩增体系中只可以同时扩增较少的m i n i s t r 基因座，一 般为一种荧光物质标记一个基因座，一个扩增体系最多可同时复合4 个 m i n i s t r 基因座。因此，要想达到个体识别效能，就必须增加复合扩增系 统的数量，至少需要3 - - 4 个复合扩增系统【5 6 】，因此，不适合微量检材的 应用。单核苷酸多态性( s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m s ，s n p s ) 是继限 制性片段长度多态性( r e s t r i c t i o n 行a g m e n gl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，r e l p ) 和 短串联重复序列( s h o r tt a n d e mr e p e a t s ，s t r s ) 之后被发现的又一种人类遗 传性标记，被称为第三代遗传标记，其在人类基因组中分布极为广泛，大 约每1 0 0 0 个碱基中就存在一个s n p ，估计在人类基因组中大约有数百万 个s n p s ，数量超出s t r 基因座数目的几个数量级 7 】，且s n p s 突变率低， 适合高通量、多重反应检测，因此能够克服m i n i s t r 所具有的上述局限 性，更适用于分析高度降解或微量检材。在法医学上，用于个体识别的一 类研咿s 被称为个体识别s n p s ( i n d i c i d u a li d e n t i f i c a t i o ns n p s ，i i s n p s ) ， 在已发现的s n p s 中，符合i i s n p s 位点筛选标准的只占很少的一部分【8 】。 i i s n p s 可用于d n a 检材的个体识别和亲权鉴定，需要具有较高的个体识 别能力以及较低的等位基因频率人群分布差异等特点，其筛选具有特定的 1。，。k = = 飞 研究论文 标准降1 1 1 。作为二等位基因遗传标记，目前普遍认为4 0 - 0 6 0 个s n p s 位点 可达到1 3 1 5 个s t r s 基因座的个体识别能力 1 2 1 4 1 ，2 0 0 6 年s a n c h e z 等 报道了5 2 个常染色体s n p s 复合分型系统，但大多数位点在全球各大人 群中的基因频率分布存在较大差异，无法在全球范围内通用【15 1 。2 0 0 7 年， 耶鲁大学遗传学系的瞄d d 教授实验室p a k s t i s 等调查了4 3 2 个s n p s 位点 在全球4 0 个人群中的基因分布，从中筛选出基因频率人群差异较小的4 0 个s n p s ，但这4 0 个s n p s 位点中只有2 5 个s n p s 处于连锁平衡状态，其 余1 5 个s n p s 位点由于遗传距离较近，不能排除与其它位点的连锁关系 1 6 1 。2 0 0 9 年，p a k s t i s 等人又在原有研究基础上筛选了9 2 个i i s n p s ，这 些位点的杂合度较高且基因频率人群分布差异较小，其中4 5 个i i s n p s 分布于2 2 条常染色体上，处于连锁平衡状态，但该研究中所有s n p s 位 点均应用t a q m a n 技术检测，并未构建一个可以在多数法医学实验室推广 的同步检测的方法【1 7 1 。目前，单核苷酸多态性检测技术较多，每种技术 各有优势及局限性，基于a b 公司s n a p s h o t 试剂盒的单碱基引物延伸技 术可以一次性检测1 2 个或更多个s n p s 位点，平均成本较低，且其依赖 的多色荧光检测设备已经应用于大多数法医学d n a 实验室，实用性强， 利于推广 1 9 , 2 0 1 。因此，本研究拟通过参考文献报道，在人类基因组数据库 中筛选出5 0 个常染色体s n p s 位点自主设计引物，应用多重p c r 联合 单碱基延伸技术构建一个可用于个体识别的s n p s 复合分型体系，并检验 该体系的灵敏度、种属特异性和组织同一性，同时对亲权鉴定、降解样本 模型和陈旧样本等方面的法医学应用进行初步研究，为解决高度降解等疑 难检材的d n a 分型难题提供新方法，为打击犯罪、维护社会治安做出贡 献。 研究论文 。 第一部分 s n p s 位点的选择与引物设计 上-j- 刖吾 单核苷酸多态性( s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m s ，s n p