（外科学专业论文）携改良型hbvpresi基因表达载体的构建及相关研究.pdf

i i i i i ii ii i ii l li i ii 卜 y 18 8 9 019 携改良型h b v p r e s 1 基因表达载体的构建及相关研究 摘要 目的：肝脏疾病是世界性的常见疾病，现有的治疗方法却不理想，基 因治疗将可能是治疗最为有效方法。然而，目前肝病的基因治疗进展缓慢， 其中最主要的原因是缺乏高效的、肝细胞特异性的载体。因此，研制出高效 的嗜肝性基因治疗载体，是肝病基因治疗取得实质进展的关键。p r e s 1 蛋白 含有h b v 和肝细胞膜结合的位点，该位点位于第2 1 - - 4 7 位氨基酸，是重要 的免疫介导部位，肝细胞、b 细胞和t 细胞均可表达针对这一肽段的受体， 变异的病毒只要这一区段完好就有传染性。本研究采用基因重组技术，将 h b v 表面蛋白中嗜肝性成分的基因编码作无免疫原性修改后，构建出携改 良型h b v p r e s 1 基因表达载体，为下_ 步嗜肝性重组腺相关病毒微球的制备 提供实验研究基础。方法：以我国h b v 流行株a d r 的d n a 为模板，p c r 法提 取并扩增p r e s 1 的编码基因h b v p r e s 1 ，然后将提取的h b v p r e s 1 基因用定 点突变延伸的方法，通过两个独立的p c r 扩增反应，将预设的突变构建在 重叠区域，同时存在于两个扩增片段中，混合得到的两个重叠d n a 片段， 用两条分别与两个原始片段末端结合的引物进行第二次p c r 扩增，将硬性 较强的脯氨酸用柔性较大的丙氨酸替换，完成h b v p r e s 1 基因的突变。将突 变后的h b v p r e s 1 基因片段通过双酶切，转化到制备好的d h 5 a 感受态细胞 中，在酚氯仿抽提纯化，将重组质粒测序后，用醋酸锂法转化酵母细胞 a h l 0 9 后铺板于s d t r p 进行筛选。挑取( 2 - - - 3 ) m m 大小的菌落过夜培养后， 提取酵母蛋白质，按常规方法分析表达产物并进行十二烷基磺酸钠一聚丙 烯酰胺凝胶电泳( s d s p a g e ) 和w e s t e r n 免疫印迹分析。结果：成功扩增出 l h b v 流行株a d r 的h b v p r e s l 基因片段，p c r 产物经1 5 琼脂糖凝胶电泳分 析显示扩增片段约3 5 7 b p ，基因测序结果显示序列完全正确，与预期片段符 合，且无非特异扩增现象。通过片段重叠延伸法，成功将硬性较强的脯氨 酸替换成柔性较大的丙氨酸，完成h b v p r e s 1 基因的突变。分别用限制性核 酸内切酶e c o r i 及p s t i 进行双酶切，连接到用相同酶切的p g b k t 7 质粒载体 上，经酶切鉴定结果正确，重组质粒p g b k t 7 h b v p r e s1 构建成功。用醋 酸锂法转化酵母后在s d t r p 培养基上筛选生长。培养数天后，挑取一菌 落进行p c r 扩增h b v p r e s 1 蛋白基因，结果显示转化成功。提取未转化质 粒与转化后质粒的酵母蛋白质，进行s d s p a g e 和w e s t e m 免疫印迹分析， 结果显示对照无表达而转化 p g b k t 7 h b v p r e s l 的印迹分析可见明显 目的条带且无杂带。结论：1 成功扩增出h b v p r e s 1 基因片段。2 通过p c r 体外定点突变，对位点c c c 成功进行定点突变至l j g c c ，三次p c r 反应后在 3 5 7 b p 附近出现单一的扩增条带，成功消除h b v p r e s l 蛋白的免疫原性。3 用限制性核酸内切酶e c o r ! 及p s t i 进行双酶切，重组质粒p g b k t 7 h b v p r e s 1 构建成功。4 重组质粒p g b k t 7 h b v p r e - s 1 转化酵母细胞 a h l 0 9 ，在s d t r p 培养基上转化成功。 关键词：r i b v p r e s 1 ；基因突变；真核表达载体；酵母细胞 b r i n gi m p r o v e dh b v p r e - s lg e n ee x p r e s s i o nv e c t o r c o n s t r u c f i o na n dc o r r e l a t i o n a b s t r a c t ：o b j e c t i v e ：l i v e rd i s e a s ei s ac o m m o nd i s e a s ei nt h ew o r l d ， 。e x i s t i n gt r e a t m e n t sa r en o ti d e a l ，g e n et h e r a p yi st h em o s te f f e c t i v et r e a t m e n t h o w e v e r ，t h ec u r r e n ts l o wp r o g r e s si ng e n et h e r a p yo fl i v e rd i s e a s e ，o fw h i c h t h em o s ti m p o r t a n tr e a s o ni sl a c ko fe f f i c i e n t ，l i v e rc e l l s p e c i f i cc a r d e r t h e d e v e l o p e da n d e f f i c i e n th e p a t o t r o p i cg e n et h e r a p yv e c t o ri st h ek e yt ot h el i v e r g e n et h e r a p ym a d es u b s t a n t i a lp r o g r e s s p r e - s 1 p r o t e i nc o n t a i n sh b va n d l i v e rc e l lm e m b r a n eb i n d i n gs i t e s ，t h es i t e si d e n t i f i e di ns e c t i o n2 1 4 7a m i n o a c i d s ，t h er e g i o ni sa ni m p o r t a n tp a r to fi m m u n e - m e d i a t e d ，l i v e rc e l l s ，bc e l l s a n dtc e l l sa l lc a nb ee x p r e s s e df o rt h i sp e p t i d er e c e p t o r s ，t h ep e p t i d ei sr a t h e r c o n s e r v a t i v e ，m u t a t i o no ft h ev i r u sa sl o n ga si nt h i sw h o l es e c t i o nh a s i n f e c t i o u s i nt h i sr e s e a r c h ，w eu s er e c o m b i n a n td n a t e c h n o l o g y ，m a k i n gt h e s u r f a c ep r o t e i no f h e p a t o t r o p i ch b vc o m p o n e n t si nt h eg e n ee n c o d i n gf o rt h e m o d i f i e dn o n i m m u n o g e n i c ，b u i l d i n gap o r t a b l em o d i f i e dh b v p r e s1g e n e e x p r e s s i o nv e c t o r , p r o v i d i n ge x p e r i m e n t a lr e s e a r c hb a s ef o rt h en e x th e p a t o t r o p i co f r e c o m b i n a n ta d e n o a s s o c i a t e dv i r u sm i c r o p r e p a r a t i o n m e t h o d ：u s i n g h b vs t r a i n sa d ro ft h ed n aa sat e m p l a t e ，p c ra m p l i - f i c a t i o ne x t r a c t e da n d e n c o d e dh b v p r e - s1 ，a n dt h e nu s e ds i t e - d i r e c t e dm u t a g e n e s i sp r o g r a mw h i c h s e g m e n to v e r l a pe x t e n s i o nm e t h o dm a k e sam o r er i g i df l e x i b l ea n ds t r o n g l a r g ep r o l i n ea l a n i n es u b s t i t u t i e d c o m p l e t e dh b vp r e s 1g e n em u t a t i o n s t h e m u t a t e dh b v p r e - s1g e n ef r a g m e n t b yr e s t r i c t i o ne n z y m ed i g e s t i o n ，t r a n s f o r m e di n t od h 5 ac o m p e t e n tc e l l so fp r e p a r e d ，i nt h ep h e n o l c h l o r o f o r m e x t r a c t i o na n dp u r i f i c a t i o n ，t h er e c o m b i n a n tp l a s m i dw a ss e n dt os e q u e n c e ， t h eu s eo ft r a n s f o r m e dy e a s tc e l l sa h 10 9b yl i t h i u ma c e t a t em e t h o dt h e n t r a n s f o r m e dc e i l i n go ns d t r ps c r e e n i n g p i c k ( 2 3 ) m ms i z eo ft h e c o l o n i e sa f t e ro v e r n i g h tc u l t u r e ，t h ey e a s tp r o t e i ne x t r a c t i o n ，a n a l y z e db y c o n v e n t i o n a lm e t h o d sa n dt h ee x p r e s s i o np r o d u c to fas o d i u md o d e c y ls u l f a t e p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s ( s d s - p a g e ) a n dw e s t e m b l o ta n a l y s i s r e s u l t s ：t h eh b vs t r a i n sa m p l i f i e da d r sh b v p r e s1g e n ef r a g m e n t ，p c r p r o d u c t sw e r e1 5 a g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i sa n a l y s i sr e v e a l e dt h a ta m p l i - f l e df r a g m e n t so fa b o u t3 5 7 b p ，c o n s i s t e n tw i t ht h ee x p e c t e df r a g m e n t ，a n d n o t h i n gs p e c i f i ca m p l i f i c a t i o np h e n o m e n o nb yp c ra m p l i f i c a t i o nh b v p r e s1g e n es e q u e n c ea n a l y s i ss h o w e dt h a ts e q u e n c ei sc o r r e c t b yo v e r l a p e x t e n s i o nm e t h o d ，u s i n gt w oi n d e p e n d e n tp c ra m p l i f i c a t i o no fd n a o b t a i n e dt w o o v e r l a p p i n gf r a g m e n t s ，t h ed e f a u l t b u i l di nt h eo v e r l a pr e g i o n f o u n d 。n o l i f i e df r a g m e n t s m i x e do v e r l afragmentsmutations f b u n di nt w oa m p l l t i e dt r a g m e n t sm i x e do v e r l a p p i n gf r a g m e n t s ， ， r e s p e c t i v e l yw i t ht h et w oc o m b i n a t i o no f t h et w oe n d so ft h eo r i g i n a lf r a g m e n t o fas e c o n dp r i m e rp c r ，s u c c e s s f u l l yr e p l a c e db yh a r ds t r o n gf l e x i b l ep r o l i n e a l a n i n el a r g e r ，a n dc o m p l e t e l yh b v p r e - s ig e n em u t a t i o n s t h er e s t r i c t i o n e n d o n u c l e a s e se c o r ia n dp s t lw e r ed i g e s t e da n dc o n n e c t e dt ot h es a m e p l a s m i dv e c t o rp g b k t 7 b y r e s t r i c t i o ne n z y m ea n a l y s i sr e s u l ti sc o r r e c t t h a t t h er e c o m b i n a n tp l a s m i dp g b k t 7 一h b v p r e - s 1w a sc o n s t r u c t e ds u c c e s s f u l l y t r a n s f o r m a t i o no fy e a s tb yl i t h i u ma c e t a t em e t h o da f t e rt h es d t r pm e d i u m 4 f o rs e l e c t i n ga n ds c r e e n i n g t r a i n i n gaf e wd a y sl a t e r ，c o l o n i e sw e r ep i c k e d f o rp c r ，t h ec o n s e q u e n c es h o w e dt h a tt h et r a n s f o r m a t i o ni ss u c c e s s a n a l y s i s e de x p r e s s i o np r o d u c t so ft h es d s - p a g ea n dw e s t e r nb l o t ，e x t r a c t i e d p l a s m i da n dt r a n s f o r m e dn o ti n t ot h ey e a s tp l a s m i dp r o t e i n sf o rs d s p a g e a n dw e s t e r nb l o ta n a l y s i s i n g ，s h o w e dn oe x p r e s s i o ni nc o n t r o lb u tt r a n s f o r m - e dp g b k t 7 - h b v p r e - s1o ft h ew e s t e r nb l o ta n a l y s i st a r g e tb a n dc a nb es e e n c l e a r l ya n dw i t h o u th y b r i dz o n e c o n c l u s i o n ：1 s u c c e s s f u l l ya m p l i f i e dg e n e f r a g m e n t sh b v p r e s 1 2 i nv i t r os i t e - d i r e c t e dm u t a g e n e s i sb yp c r ，s u c c e s s f u l l ys i t e - d i r e c t e dc c cm u t a g e n e s i st og c c ，n e a r l y3 57 b pd i s p l a y e das i n g l e a m p l i f i e db a n d sa f t e rt h r e er e a c t i o n s ，s u c c e s s f u l l ye l i m i n a t i a t e dh b vp r e s 1 p r o t e i ni m m u n o g e n i c i t y 3 w eu s e dr e s t r i c t i o ne n d o n u c l e a s ee c o r ia n dp s t i d o u b l ed i g e s t i o n ，p l a s m i dp g b k t 7 一h b v p r e s1i sc o n s t r u c t e ds u c c e s s f u l l y 4 p l a s m i d p g b k t 7 - h b v p r e - s 1t r a n s f o r m e dy e a s tc e l l sa h l 0 9t ow h i c h s u c c e s s f u l l ys h i f t e di nt h es d t r pm e d i u m k e yw o r d s ：h b v p r e - s 1 ；g e n em u t a t i o n ；e u k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o r ； y e a s tc e l l s 5 上一j - 刖置 肝脏疾病是世界性的常见疾病，现有的治疗方法却不理想，基因治疗 将可能是治疗最为有效的方法。然而，目前肝病的基因治疗进展缓慢，其 中最主要的原因是缺乏高效的、干细胞特异性( 即嗜肝性) 的载体。因此 研制出高效的、嗜肝性基因治疗载体，是肝病基因治疗取得实质进展的关 键1 嬲。 乙型肝炎病毒( h e p a t i t i sbv i r u s ，h b v ) 分为包膜与核心两部分。包 膜厚约7 n m ，内含乙型肝炎表面抗原( h b s a g ) 、糖蛋白与细胞脂肪，具有 天然嗜肝性d 1 。不同病毒株均含有4 个开放阅读框架结构分别为s 、c 、 p 及x 基因区，s 基因区又分为s 基因，p r e s l 基因和p r e s 2 基因3 段，它 们读码框相位相同，连续串连排列，分别编码s 蛋白、p r e s l 蛋白和p r e s 2 蛋白。其中s 蛋白称为主要蛋白或小蛋白，p r e s 2 + s 蛋白称为中蛋白， p r e s l + p r e s 2 + s 蛋白称为大蛋白，s 基因区所编码的3 种产物都参与h b v 病毒颗粒的装配。( 图1 ) 。其中，大蛋白n 端l - 1 0 8 或1 0 9 个氨基酸残 图1h b v 基因结构图 基( a a ) 段p r e s 1 位于病毒外壳表面，能与肝细胞上p 8 0 蛋白特异性结合， 形成配受体( l r ) 关系，是h b v 嗜肝性的主要分子机制n 5 1 。由h b v p r e s 1 基因编码的p r e s 1 位于病毒外壳表面，以h b vd n aa y w 亚型基因组的 e c o r i 限制性内切酶位点为+ 1 ，位于2 8 4 8 - - 一，31 7 2 n t 之间，n 末端游离“1 ， 大约一半分子指向病毒颗粒外部，另一半则指向颗粒内部。p r e s 1 蛋白含 有h b v 和肝细胞膜结合的位点，该位点位于第2 1 4 7 位氨基酸，是重要 的免疫介导部位7 1 ，肝细胞、b 细胞和t 细胞均可表达针对这一肽段的受 体，这个肽段相当保守，变异的病毒只要这一区段完好就有传染性。在病 毒颗粒装配中主蛋白起主要作用，p r e s 1 的c 末端也参与装配8 9 1 ，如其 末端残基缺失，仅能形成病毒颗粒。 消除h b v 的p r e s i 蛋白的免疫原性是本课题研究的重要内容。h b v 的 p r e s 1 蛋白具有较强的免疫原性，可以诱导机体产生免疫反应，并引起肝细 胞的免疫性损伤n0 1 1 1 。本研究中，我们设法采用基因定点突变技术，在基 因水平对p r e s 1 蛋白的抗原决定簇( e p t i o p e ) a a 的编码基因做无免疫原性修 改。h b v 的p r e s 1 0 0 2 1 4 7 a a 是与肝细胞特异性结合的主要部位，有两个淋 巴细胞识别位点，是主要的嗜肝性区域。消除e p t i o p e 的免疫原性，通常只 需要改变其中一个个关键a a ，就可能改变整个e p t i o p e l 拘空间结构而使其免 疫原性消失n 幻。目前有三种方法消除p r e s 1 区域识别位点：( 1 ) 改变e p t i o p e 内a a 的亲水性：e p t i o p e - - 般是7 9 个亲水性a a 组成结构域，如果能将e p t i o p e 结构域内2 个亲水性a a 变成疏水性a a ，便可能使e p t i o p e 失去与t 细胞的结合 能力，导致其抗原性消失。( 2 ) 改变e p t i o p e 的空间结构：脯氨酸( p ) 是 硬性较强的a a ，可能是维持e p t i o p e 空间结构的基础a a ，如果将此位的p 换做 柔性较大的丙氨酸( a ) ，就可能使两个e p t i o p e 空间结构同时发生变化而失 去抗原性。( 3 ) 使e p t i o p e l 勾a a 糖基化：将e p t i o p e 结构域内的一般a a 变成糖基 化的a a 并构建糖基化结构域，使其在体内表达过程中与糖链相连，用糖链 来遮蔽e p t i o p e 内的a a ，从而阻碍t 淋巴细胞的识别n 3 1 钉。 筛选出既有嗜肝性又无免疫原性的p r e s 1 蛋白的编码基因片段，是构 建r a a v 2 h b v p r e s l 的关键。我们拟将h b v p r e s 1 基因经无抗原性定点突变 后，先整合到真核表达载体p g b k t 7 中，经转染酵母表达出新型p r e s 1 ，然 后用生物素标记p r e s 1 ，进行免疫原性和嗜肝性等一系列体外细胞试验和动 物实验，从中筛选出既有嗜肝性又无免疫原性的新型p r e s i ，并找到它的编 码基因“5 1 。最后用筛选出的新型p r e s l 的编码基因去替换p a a v r c 的c a p 基因编码中嗜肝性的基因段，经2 9 3 细胞包装并生成既有嗜肝性又无h b v 免疫原性的r a a v 2 h b v p r e s 1 n 阳。 本研究以目前基因治疗肝病最为急需的嗜肝性载体为目标，采用基因 重组技术，将h b v 表面蛋白中嗜肝性成分的基因编码) ( h b v p r e s 1 ) 作 无免疫原性修改后，替换r a a v 2 包装蛋白中嗜组织性的编码基因段，构建 出携改良型h b v p r e s 1 基因表达载体，在r a a v 2 包装过程中自然表达出无 h b v 免疫原性的嗜肝性包装蛋白( 新型p r e s 1 ) ，为下一步生成嗜肝。 生r a a v 2 ( r a a v 2 h b v p r e s 1 ) ，再以p e l a 微球包载，为生成r a a v 2 h b v p r e s 1 微 球的制备提供实验基础。新生成的微球既具有h b v 的嗜肝性，又无h b v 的 免疫原性，且能长期稳定释放表达，将成为肝脏疾病基因治疗的理想载体， 对提高肝病的治疗水平具有重要的社会价值、客观的经济效益和广泛的应 用前景。 材料与方法 一、材料 1 主要仪器 p c r 扩增仪：b i o r a d ，美国 可调式微量移液器：g i l s o n ，美国 电泳仪、水平电泳槽：b i o r a d ，美国 电子天平：a e l 2 0 0 ，中国湘仪天平仪器厂 颗粒制冰机：g r n a t ，美国 紫外凝胶成像系统：b i o r a d ，美国 分光光度计：b i o r a d ，美国 台式高速离心机：s a n y o ，日本 冰箱：海尔，中国 微波炉：格兰仕，中国 电热恒温水浴锅：上海市跃进医疗器械一厂，中国 纯水器：m i l l i p o r e 公司，美国 电转膜仪：b i o r a d 公司，美国 无菌超净工作台：苏州净化设备公司，中国 2 主要试剂 p c r 引物p 1 ，p 2 ，p 3 ，p 4 由上海生工生物工程有限公司合成 内切酶e c o r i ，p s t i 及t 4 d n al i g a s e 购于t a k a r a 公司 h b v 流行株a d r 的模板由成都晶肽生物工程公司提供 2 x t a qp c rm a s t e rm i x 购于t i a n g e nb i o t e c h 公司，其组成含有：o 1 u t a qp o l y m e r a s e ，5 0 0 u md n t p ，2 0 u mt r i s h c i ，3 m mm g c l 2 ，10 0 m mk c l 电泳缓冲体系t r i s ，e d t a 、硼酸、过硫酸胺、s d s 、溴酚蓝均为b i o r a d 公司产品 电泳染色齐l j g o l d v i e w 购于北京赛百盛生物工程有限公司 d n am a r k e r 禾h 蛋白m a r k e r 购于t i a n g e nb i o t e c h 公司 琼脂糖、饱和酚、氯仿、异丙醇、无水乙醇、氢氧化钠、卡那霉素、氯霉 素、琼脂糖、c a c l 2 、p b s 、甘油、葡萄糖等均为国产或进口分装试剂 d h 5 感受态细胞、抗m y c 的鼠单抗、兔抗鼠i g g e h 四川大学华西医院细胞与 分子生物学实验室提供 胶回收试剂盒为t a k a r a 公司 酵母菌株a h l 0 9 、酵母表达载体p g b k t 7 、酵母转化试剂盒购i 刍c l o n t e c h 公 司 e c l 化学发光试剂盒购于美国m i l l i p o r e 公司 3 常用试剂配置 ， ( 1 ) l b 液体培养基：1 0 9 n a c l ，1 0 9 蛋白胨，5 9 酵母提取物，加水至1 0 0 0 m l ， 调p h 至7 4 ，1 0 3 4x1 0 5 p a 高压蒸汽灭菌2 0 m i n 。 ( 2 ) l b 固体培养基；l g n a c l ，l g 蛋白胨，o 5 9 酵母提取物，力1 1 n 1 5 9 琼脂， 溶于1 0 0 m lh 2 0 ，离压蒸汽灭菌，待温度降至5 0 。c 左右，加入1 0 0 u l 卡那霉 素( 母液4 0 m g m 1 ) ，轻轻混匀，铺制平板，凝围后，4 c 贮存备用。 ( 3 ) 碱裂解法提取质粒溶液 s o l i ： 葡萄糖5 0 m m t r i s c i ( p h 8 0 ) e d t a ( p h 8 0 ) 2 5 m m 1 0 m m 1 0 3 4 x1 0 5 p a 高压蒸汽灭菌2 0 m i n s o l i i ( 使用时新鲜配制) ： s d s ( 贮存液i o s d s ) 1 n a o h ( 贮存液5 mn a o h ) 0 2 m s o l i i i 5 m 乙酸钾 冰乙酸 h 2 0 6 0 m l 1 1 5 m l 2 8 5 m l 1 0 3 4 x10 5 p a 高压蒸汽灭菌2 0 m i n ( 4 ) t e ( p h 8 o ) ： t r i s c i ( p h 8 0 ) e d t a ( p h 8 o ) 1 0 m m l m m 1 0 3 4 x10 5 p a 高压蒸汽灭菌2 0 m i n ( 5 ) 氨苄青霉素：用纯水配制5 0 m g m l 贮存液，过滤除菌，2 0 。c 保存备用， 使用浓度1 0 0 p g m l 。卡那霉素：用纯水配制5 0 m g i n l 贮存液，过滤除菌， - 2 0 保存备用，使用浓度3 5 u g m l 。链霉素：用纯水配制5 0 m g m l 贮存 液，过滤除菌，一2 0 。c 保存备用，使用浓度3 5 u g m l 。 ( 6 ) s d s p a g e 的制备： 配匍j s m l10 分离胶和2 m l5 浓缩胶具体方案如下： h 2 0 3 0 a c r y l a m i d e 1 5 m o l lt r i s h c i ( p h 8 8 ) 1 0 s d s t e m e d 1 0 过硫酸铵 ( 7 ) 1 5 琼脂糖凝胶 分离胶( 5 m 1 )浓缩胶( 2 m 1 ) 1 9 0 0 u l 1 7 0 0 u l 1 3 0 0 u l 5 0 u l 1 u l 5 0 u l 1 4 0 0 u l 3 3 0 u l 2 5 0 u 1 ( 1 0 m o l l ，p h 6 8 ) 1 0 u l l u l 1 0 u l 将1 5 9 琼脂糖粉末溶解于4 0 m l ，lx t b e q b ，微波炉加热至溶解。均匀加 入5 u lg o l d v i e w 核酸染色剂，混匀，倒入搭好的模具中。室温凝固，4 0 c 储 存备用。 ( 8 ) 5 x t b e 电泳缓冲液： t r i s 碱5 4 9 硼酸 2 7 5 9 0 5 m m o l le d t a2 0 m l h ，o加至1 0 0 0 m l 临用时用水稀释1 0 倍至0 5 x t b e 。 ( 9 ) 免疫印迹所需试剂 上样缓冲液：4 s d s ，o 2 溴酚兰，2 0 甘油，1 0 0m m o l lt r i s - c 1p h 6 8 ， 1 0 1 3 - 巯基乙醇。 转膜缓冲液：3 9m m o l l 甘氨酸，4 8m m o l lt r i s c 1 ，0 0 3 7 s d s ，2 0 甲醇。 1 2 p b s t 缓冲液：i x p b s 、0 5 t w e e n2 0 。 牛奶封闭液：脱脂奶粉以5 的浓度溶于p b s t 中。 二、方法 1 h b v p r e s 1 基因的提取：以我国h b v 流行株a d r 的d n a 为模板，p c r 法提 取并扩增p r e s1 的编码基n h b v p r e s i 。 1 从g e n b a n k 中查询h b v a d r 嗜肝肽段p r e s l 的编码基因。h b v p r e s l ( 2 8 4 6 3 2 0 3 ) ，序列号为m 3 8 6 3 6 1 ，其序列为3 5 7 b p 。序列如下所示： 2 8 4 6a t g g ga g g t t g g t c tt c c a a a c c t cg a c a a g g c a t 2881g g g g a c g a a tc t t t c t g t t cc c a a t c c t c tg g g a t t c t t tc c c g a t c a c ca g t t g g a c c c 2 9 41t g c g t t c g g ag c c a a c t c a aa c a a t c c a g at t g g g a c t t ca a c c c c a a c aa g g a t c g t t g 30 01 g c c a g a g g c aa a t c a g g t a gg a g c g g g a g ca t t c g g g c c ag g g t a c c c c cc a c c a c a c g g 30 61c g g t c t t t t gg g g t g g a g c cc t c a g g c t c ag g g c a t a t t ga c a a c c g t g cc a g c a g c a c c 3121 t c c t c c t g c ct c c a c c a a t cg g c a g t c a g ga a g a c a g c c ta c t c c c a t c tc t c c a c c t c t 3181a a g a g a c a g tc a t c c t c a g gc c 2 p c r 扩增出h b v p r e s 1 。 2 1 根据编码基因，使用p r i m e r 5 0 软件设计引物： 引物设计的原则 ( 1 ) 引物长度通常在2 0 2 5 b p ，引物中g c 含量通常为4 0 0 0 6 0 ，t m 值 在5 5 “5 为佳。可按下式粗略估计引物的解链温度：t m = 4 ( g + c ) + 2 ( a + t ) ； ( 2 ) 4 种碱基应随机分布，应避免出现4 个以上相同碱基，3 端不应超过3 个； ( 3 ) 在引物内，尤其在3 端应不存在二级结构或发卡结构； 1 3 ( 4 ) 引物的3 端避免使用碱基a ，同时避免出现3 个以上g c 对； ( 5 ) 两引物之间尤其在3 端应避免连续4 个以上碱基互补，以防出现引物二 聚体，减少产量； ( 6 ) 为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子，片段长度以 1 0 0 - 一2 5 0b p 为宜。 上游引物p l ：5 a a g 鱼鱼塑a t g g g a g g t t g g t c t t c c a a3 ，下游 引物p 4 ：5 g g c i 鱼q t t a g g c c t g a g g a t g a c t g t c t c 3 ( 下戈0 线为 引入的e c o r i 及p s t i 酶切位点) 。引物由上海生工生物工程有限公司合成。 反应体系：在0 2 5 m l p c r 管中依下列体系加入试剂 模板( a d r 的d n a ) l u l 2 x t a qp c r m a s t e rm i x12 5 u l 引物p i l u l 引物p 4 l u l 加入d d h 2 0 使反应体系为 2 5 u l p c r 反应参数：9 4 3m i n ，9 4 。c 3 0 s ，5 5 。c 3 0 s ，7 2 l m i n ，共3 0 个 循环后，7 2 。c 保温5 m i n 。 2 2 扩增产物经1 5 琼脂糖凝胶电泳分离、回收，获得h b v p r e s l 基因片段。 2 2 1 经1 5 琼脂糖凝胶电泳分离 ( 1 ) 将新鲜配置好的电泳缓冲液倒入电泳槽； ( 2 ) 将琼脂凝胶放入微波炉熔化； ( 3 ) 熔化后的琼脂糖凝胶倒入插好梳子的模具中； ( 4 ) 静置l d , 时左右，等琼脂糖凝胶凝固后垂直拔去梳子； ( 5 ) 将琼脂糖凝胶放入电泳槽中； 1 4 ( 6 ) 点样，上样量为6 l o a d i n gb u f f e rl u l ，d n a 样品3 u l 混匀，点入凝胶孔内； ( 7 ) 电泳参数：电压1 0 0 v ，电流2 5 0 m a ，功率2 5 0 w ，4 0 分钟后，放入紫外 可见装置分析。 2 2 2 p c r 产物的胶回收 p c r 产物按常规在1 5 琼脂糖凝胶上进行电泳后，在紫外灯下用刀 片切下含预期区带的凝胶块，用日本t a k a r a 公司凝胶回收试剂盒从中回收 d n a 。具体方法如下：( 按凝胶回收试剂盒操作) ( 1 ) 将切下的凝胶块，放入e p 管中，每1 0 0 m g 凝胶块加入5 0 0 u l d r lb u f f e r ， 置于7 5 。c 水浴1 0 m i n ，在此过程中每隔2 3 m i n 摇晃一下使胶完全溶解； ( 2 ) 往溶液中加入2 5 0 u l 的d r i ib u f f e r 充分混匀； ( 3 ) 往溶液中加入2 0 0 u l 异丙醇充分混匀； ( 4 ) 将样本( 分2 次) 吸, k s p i nc o l u m n 柱中，1 2 0 0 0 r m 离一i 二, l m i m ( 5 ) 弃去柱底中的液体，加5 0 0 u l 的r i n s ea ，1 2 0 0 0 r m 离心3 0 s ； ( 6 ) 弃去柱底中的液体，加入7 0 0 u l r i n s eb ，1 2 0 0 0 r m 离一0 3 0 s ； ( 7 ) 重复步骤6 ； ( 8 ) 弃去柱底中的液体，空转，1 2 0 0 0 r m 离一i 二, l m i m ( 9 ) 将s p i nc o l u m n 柱放入一新的1 5 m le p 管中，往柱的膜中部加入3 0 u l 超纯 水，室温静置2 m i n 后，1 2 0 0 0 r m 离一t , 1 m i n ，收集管中离心液； ( 1 0 ) 将回收产物2 0 。c 冻存，送上海生工生物工程有限公司进行基因测序。 2 h b v p r e s 1 基因的突变：将提取的h b v p r e s 1 基因通过改变e p t i o p e 的空 间结构，将3 0 位脯氨酸的密码子( c c c ) 突变为柔性较大的丙氨酸的密码子 ( g c c ) ，使两个e p t i o p e 空间结构同时发生变化而失去抗原性，用片段重叠 法( o v e r l a p p i n g ) 致突变，p c r 扩增突变后l 拘h b v p r e - s l 基因片段( 图2 ) 。 8 导入载体 图2 两步p c r 体外定点突变原理 按照引物设计原则，采用p r i m e r 5 0 7 1 物设计软件，根据h b v p r e s 1 基 因序列设计两对引物，p 1 幂1 1 p 2 ，p 3 禾n p 4 。其中p 1 引入限制性内切酶位点 e c o r i ；p 2 $ h p 3 互补，且都带有一个突变位点，即将p r e s 1 基因的第3 0 位脯 氨酸的密码子c c c 突变为丙氨酸的密码子g c c ；定点突变由c _ g ，p 4 引入限 制性内切酶位点p s t i 。两对引物分别是： p 1 ：5 aa g g aa t t c a t g g g a g g t t g g t c t t c c a a3 p 2 ：5 c a t t g c c c t g g g c q 匹t g g c t g g a a c a c t t g 3 ( 引入突变点) p 3 ：5 g t a a c g g g a c c c g g c c a c c g a c c t t g t g a a c 3 ( 引入突变点) p 4 ：5 g g c c t g c a g t t a g g c c t g a g g a t g a c t g t