（预防兽医学专业论文）抗禽流感病毒H5亚型血凝素单克隆抗体的研制.pdf

中文摘要本研究通过鸡胚尿囊腔接种，繁殖h 5 亚型禽流感病毒，将收获的尿囊液用0 1 甲醛灭活。用著速离心和凝胶过滤方法纯化病毒后免疫b a l b c 小鼠，取免疫鼠脾细胞，与s p 2 0 骨髓瘤细胞融合，融合率达到9 9 1 。用血凝抑制试验( 瑚) 进行筛选，选择其中3 个较优阳性孔，采用有限稀释法对其进行克隆，经过三次克隆，最后获得两株能稳定分泌抗禽流感h 5 亚型血凝素单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为2 g 4 和3 d 7 。用秋水仙碱诱导法进行染色体分析，证明2 g 4 和3 d 7 两株杂交瘤细胞染色体数分别为9 6条和9 8 条。琼脂免疫双向般扩散法鉴定表明，2 g 4 和3 d 7 两株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体都为i g g l 亚类。2 g 4 和3 1 ) 7 两株单抗细胞上清h i 价分别为1 ：2 7 和1 ：2 9 ；腹水h i 价分别为1 ：2 “和1 ：2 “。两株杂交瘤细胞均能稳定分泌抗禽流感1 - 1 5 亚型血凝素单克隆抗体而且与n d v 、1 1 7 、h 9 、e d s v 无交叉反应。中和实验表明所获得的两株单抗都具有较好的中和活性。连续传2 5 代，及冻存3 个月复苏，两株细胞均能稳定分泌抗禽流感h 5 亚型血凝素抗体，说明两株杂交瘤细胞均具有良好的稳定性。关键词：i - 5 弧型禽流感病毒，单克隆抗体，血凝抑制试验，杂交瘤细胞a b s t r a c th 5a v i a ni n f l u e n z av i r u sw a sc u l t u r e di nc h i c k e ne m b r y o t h eo b t a i n e dv i r u sw a si n a c t i v a t e dw i t h0 1 f o r m a l d e h y d ea n dt h e np u r i f i e db yt h em e t h o d so fd i f f e r e n t i a lc e n t r i f u g a t i o na n dr u n n i n gs e p h a d e x g2 0 0 b a l b cm i c ew e r ei m m u n e dw i t ht h ep u r i f i e da i va n t i g e n s s p l e n o c y t e so fv a c c i n a t e db a l b cm i c ew e r ef u s e dw i t ht h em o u s es p 2 0m y e l o m ac e l l s t h eh y b r i d r a t ew a s9 9 1 t w oh y b r i d o m a s3 d 7a n d2 g 4s e c r e t i n gm o n o c l o n a la n t i b o d y ( m c a b ) a g a i n s th 5h a e m a g g l u t i n i no fa v a i ni n f l u e n z av i r u sw e r eo b t a i n e da f t e rs c r e e n e db yh a e m a g g l u t i n a t i o ni k i b i t i o nt e s t ( 1 i da n dc l o n e dt h r e et i m e sb yl i m i t i n gd i l u t i o n a n a l y s i sw i t hc o l c h i c i n ei n d i c a t e dt h a tt h eh u m h e ro fc h r o m o s o m ei nt h et w oh y b r i d o m a s3 d 7a n d2 ( 3 4e e l sw e r ea b o u t9 8a n d9 6r e s p e c t i v e l y b o t ht h et w om c a b sw e r ep r o v e dt ob e l o n gt oi m m u n o 羽o b u l i ns u b c l a s sl g g l t h eh it i t e r so fc e l lc u l t u r ef l u i do f2 ( 3 4a n d3 d 7 w e r e1 ：2 7a n d l ：2 9a n dt h o s eo fa s c i t e sw e r e1 ：2 “a n d1 ：2 “r e s p e c t i v e l y 1 3 0 t ho ft h et w om o n o c l o n a la n t i b o d i e sw e r ea b l et os e c r e tm c a bs t a b l ya n dt h e yw e r eo n l yb i n dt oh 5 ，n oc r o s s r e a c t i o nw i t hn d v 、h 7 、h 9a n de d s v b o t ht w om c a b sh a v e9 0 0 dn e u t r a l i z a t i o na c t i v i t y a f t e rt w e n t y - f i v es e r i a lg e n e r a t i o n so rr e s u s c i t a t e da f t e r 3m o n t h so fd e e p f r e e z e ，t h et w oh y b r i d o m a sw e r es t i l la b l et os e c r e tm o n o c l o n a la n t i b o d y ( m e a b ) a g a i n s th 5h a e m a g g l u t i n i no fa v a i ni n f l u e n z av i r u ss t a b l y ，a si n d i c a t e st h a tt h et w oh y b r i d o m a sh a v eg o o ds t a b i l i t y k e yw o r d s ：h 5s u b t y p eo fa v i a ni n f l u e n z av i r u s ，m o n o c l o n a la n t i b o d y , h a e m a g g l u t i n a t i o ni h i b i t i o nt e s t ，h y b r i d o m al i独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也小包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名金轮毛时间：- 7 , , r o s 年j ( 月阴关于论文使用授权的说明本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名：金踅孑_时间：了呼罗年6 月娟导师签名1 酉奔埸时间：“f 年月c rr1 1 禽流感概述第一章文献综述禽流感是禽流行性感冒的简称，又称真性鸡瘟，是禽类( 家禽和野禽) 的一种急性、烈性传染病。该病被国际兽疫局( o i e ) 规定为a 类传染病，我国也列为一类动物疫病。根据禽流感病毒对禽只致病力的大小分为高致病性禽流感和低致病性禽流感。1 8 7 8 年，p e r r o n e i t o 首次报道在意大利的鸡群中暴发的一种称为鸡瘟的严重疾病，现在已知是由商致病性禽流感病毒引起的。1 9 0 1 年，c e n n t a n n i c 和s a r u n o z z i 证实鸡瘟是由“可滤过的病原”引起的。1 9 5 5 年，证实意大利暴发的鸡瘟实际上是a 裂流感病毒引起的禽流感。1 9 8 1 年，在美国马里兰州b e e t s v i l l e召开的第一界国际禽流感学术研讨会上建议废除“鸡瘟”病名，改称高致病性禽流行性感冒( h p a i ) 。1 2a l v 的病原学禽流感( a v i a ni n f l u e n z a ) 的病原是a 型流感病毒，该病毒是正粘病毒科，流感病毒属的成员。典型的病毒粒子鼍球状，直径8 0 1 2 0 n m ，平均为1 0 0 r i m 。某些毒株，特别是初次分离时，常呈丝状，丝状体长短不一，k 者可达数微米。流感病毒的多形性是比较突出的【4 j 。但是，不论氏丝状或球形病毒粒子，其直径是相似的。病毒粒子有囊膜。流感病毒的基因组由8 个负链的单链r n a 片段组成【1 6 】。流感病毒对热敏感，5 6 d 1 1 热3 0 r a i n 、6 0 c 加热l o m i a 、6 5 7 0 加热数分钟即失活【“。病毒对低温抵抗力较强，有甘油保护时可保持活性一年甚至更久。在实验室条件下，流感病毒可在鸡胚中生长，尿囊液中的蛋白质可以起到稳定的保护作用，病毒可在4 c 保存数周，在7 0 c或冻干状态下长期保持传染性。在紫外线的直接照射下，流感病毒的传染性可被迅速破坏，阳光下4 0 4 8 h 即可灭活。a 型流感病毒对去污剂等脂溶剂的灭活较敏感，常用消毒药容易将其灭活。用2 0 乙醚在4 c 处理2 h 可使病毒裂解，而血凝滴度升高。某些蛋白酶对流感病毒的感染性有很大影响，病毒经菠萝蛋白酶和胰凝乳蛋白酶处理后，其感染性和血凝活性全部丧失，而经胰蛋白酶处理，其感染性不受影响，有时反而增强。流感病毒的神经氨酸酶活性受钙离子、温度及d h 的影响较大【4 j 。根据核蛋白( n p ) 与基质蛋白( m ) 的抗原性质，将流感病毒分为三个不同的血清型，即a 、b 、c 三型。其中b 、c 两型只见于人，a 型可见于人、猪、马、水貂、海豹、鲸等哺乳动物及禽类【“i 。病毒囊膜表面有血凝素蛋白( h a ) 和神经氨酸酶蛋白( n a ) 两种糖蛋白。h a 是棒状的三聚体；n a 是蘑菇状的四聚体。囊膜内为螺旋形的核衣壳。依据h a 和n a 的抗原性可将a型流感病毒分成若干距型1 1 。目前已发现1 5 种h a 和9 种n a ，不同的h 抗原或n 抗原之间无交叉反应理论上有1 3 5 种a 型流感病毒的型。所有禽流感病毒毒株都易在9 1 1 日龄的鸡胚中生长，据估计，每个鸡胚绒毛尿囊膜细胞约有1 0 0 0 2 0 0 0 个受体部位 4 1 。鸡胚成纤维细胞( c e f ) 是应用最为广泛的原代细胞培养宿主，中国农业大学硕士学位论文第一章文献综述犬肾细胞( m d c k ) 是最常用的传代细胞系。由丁鸡、火鸡和鸭在自然条件下最易感染，因此它们是研究中应用最j h 泛的实验动物。禽流感病毒也可以在一些人工接种的实验哺乳动物如小鼠、猴、水貂和猪体内增殖【1 6 i 。1 3 流行病学禽流感病毒能感染许多种类的家禽、野禽、特禽、观赏鸟以及哺乳动物，引起或不引起疾病。家禽中火鸡、鸡、鸭、鹅是自然条件下最常感染的禽种。野禽包括天鹅、燕鸥、野鸭、海岸鸟和海鸟等；特禽包括珍珠鸡、鹌鹑、雉鸡、番鸭、鹧鸪等；观赏鸟包括鹦鹉、虎皮鹦鹉、燕八哥等都可感染禽流感病毒。除以上禽类外，还从多种鸟中分离到流感病毒，如石鸡、麻雀、乌鸦、寒鸦、栅鸟、岩鹧鸪、燕子、苍鹭、加拿大鹅等。国外报道已发现带毒的鸟类达8 8 种，我国在1 7 种野鸟中发现禽流感病毒。哺乳动物中的猪、马、海豹以及鲸也是禽流感病毒重要的储存宿主【4 1 。禽流感的传染来源较多，可来自感染或发病的家禽、野生鸟类、迁徙的水禽及哺乳动物。一般认为禽流感的传播途径主要是通过水平传播。病毒可通过病禽的分泌物、排泄物( 特别是粪便) 和尸体等污染饲料、饮水及其他物体，通过直接接触或间接接触发生感染，禽流感的感染途径主要是呼吸道和消化道。人工感染途径包括鼻内、气管、结膜、皮f 、肌肉、静脉内、口腔、腹腔、气囊、泄殖腔、颅内及气溶胶等1 4 j 。禽流感的发病率和死亡率受多种冈素的影响，既与禽的种类和易感性有关又与病毒株的毒力相关，还与禽的日龄、性别、应激、环境因素、饲养条件以及疾病并发情况有关【4 l 。1 4 临床症状和病理变化禽流感的症状极为复杂，本病的潜伏期长短不一，有几小时，也有2 3 d 。根据禽的种类、周龄、性别、以及感染病毒的亚型类别，毒株的强、弱，抵抗力不同，临床症状各种各样，可分为三类【3 ，1 8 】：( i ) 隐性感染只能通过抗体检查或病毒分离才能确诊的“假定健康群”。( 2 ) 吸呼型致死率比较低，出现呼吸道症状咳嗽、打喷嚏、气管出现罗音、流泪、副鼻肿大等。( 3 ) 急性型致死率高，多为急性，病程1 2 d ，突然发病，无任何临床症状，病程长的体温升高4 3 3 4 4 4 c ，拒食精神高度沉郁、很快处于昏睡状态。眼脸、头部浮肿。无毛处皮肤出血、发绀、坏死，尤其是冠、肉垂更明显。脚鳞出现紫色出血斑。产蛋下降。有的出现颈部向后扭转的神经症状，下痢。病理变化因感染病毒株和禽的种类不同而异。死于禽流感的鸡表现不同程度的充血、出血、渗出、坏死等变化，内脏器官常见灰黄色坏死灶，气囊腹膜和输卵管表面有灰黄色渗出物，有时可见纤维素性心包炎。产蛋鸡多见卵黄性腹膜炎。幼禽感染后，很少迅速死亡，但肉眼病变明显。21 5 诊断当末出现大范围流行时，即使出现典型的流感症状，其散发病例很难通过临床症状来确诊。如果在短时间内出现较多数量的相似病例，可根据临床症状观察。临床表现为呼吸道症状、高烧或全身症状，临床变化检查再结合发病季节等流行病学调查，可初步判定为疑似禽流感。但人多数情况下，禽流感病例并不表现典型症状，因此要进一步做病原学与血清学的检查。禽类发生疑似高致病性禽流感后，要将病料送往禽流感国家参考实验室进行病毒分离、诊断及病毒弧型的鉴定。目前国家实验室诊断禽流感的方法主要是进行病毒分离培养、接种鸡胚、病毒血凝实验和病毒血凝抑制实验，确定是否为禽流感病毒。用血凝抑制实验和神经氨酸酶抑制实验对病毒亚型进行鉴定，要用抗不同血凝素( h a ) 抗血清，以h l 试验来确定h a 亚型，蚪j 抗不同神经氨酸酶( n a ) 的抗血清，以微量神经氨酸酶抑制实验( n 1 ) 鉴定n a 亚型瞄”。基层常采用琼脂扩散实验 ：z ：j jor t - p c r 是一种有效的分子生物学诊断方法，可以应用该法对禽流感做出快速诊断“。临床也可在流行中采集双份血清，根据抗体变化进一步确诊，采用补体结合实验及酶联免疫吸附实验等检测技术进行诊断 2 7 j 。1 6 预防全面的综合防疫措施与疫苗预防相结合是我国禽流感防制的发展方向。根据世界各国对禽流感的防治经验，由于病毒抗原的多变性，因此目前用疫苗进行预防其免疫效果尚存在一定问题。禽流感灭活苗的使用，在控制疫情的同时，也一定程度上增加了疫病监测中区分疫苗免疫与自然感染的难度。采用h 5 亚型血凝素( h a ) 和神经氨酸酶( n a ) 基因，经杆状病毒表达，构建了h 5 亚型基因重组杆状病毒昆虫细胞表达亚单位疫苗，初步动物试验结果己显示出良好的免疫原性；以脂质体转染技术构建了h 7 哑型禽流感病毒血凝性基因重组鸡痘病毒 4 6 1 ，并对其进行了免疫保护性研究结果表明，h 7 哑型a i v h a 基因的重组禽痘病毒可诱导鸡产生有效的免疫保护反应，肠道排毒显著减少m 】；h 5 驱型a i v 具有良好的免疫原性，肌肉注射途径即可达到对同源强毒攻击的免疫保护反应，肠道排毒显著减少；近期h 5 亚型a i v h a 基因重组禽痘病毒在动物试验中也显示出良好的免疫保护反应心”j ；d n a 疫苗作为9 0 年代兴起的新型疫苗策略已在禽流感防制上显示出极为光明的前景，h 7 亚型血凝素基因d n a 疫苗在极小的使用剂量下即可成功诱导免疫保护反应，并有效阻断同源低致病力禽流感病毒在机体内的感染和排毒；1 - 1 5 贬型血凝素基因d n a 疫苗，具有良好的免疫原性，肌肉注射途径即可达到对同源强毒攻击的免疫保护，并能有效阻断免疫保护存活鸡机体的排毒h w j 。我国开展了对上述基因工程疫苗防制禽流感的基础性研究，为我国禽流感基因工程疫苗的开发与应用奠定了技术储备。使我国应用禽流感基冈工程疫苗，清除鸡群中流行的具有潜在高致病突变可能的h 5 ，h 7 低致病力禽流感病毒及目前流行广泛、危害严重的中、低致病力h 9 型禽流感病毒的防制策略成为可能口4 j 。1 7 血凝素蛋白( h a )a 基因组由8 个分段的r n a 片段组成，其中第4 个片段全长为1 7k b ，只含有1 个开放阅读框编码病毒的表面结构蛋白h a 。h a 是典型的i 型糖蛋白，含有4 个结构域：信号肽( 前3中国农业大学硕士学位论文第一章文献综述导序列) 、胞浆域、跨膜域和胞外域阳”。免疫学和生物学方法研究表明，h a 在细胞内质网合成，合成后由内质网运送到高尔基复合体，最后到达细胞膜，嵌入细胞膜的脂质双层，在病毒出芽释放时被带到病毒囊膜上。h a 在运送过程中经过不断的修饰，修饰的位置随毒株不同而有区别。形成的单体h a 分布在内质网膜上，在向高尔基体运送过程中，由二硫键连接并折叠成一定的形状，随后形成三聚体，由高尔基体运送到细胞膜。h a 产生后到发挥作用时，还要经过几个切割加工过程包括n 端信号肽的切除以及h a l和h a 2 的产生。n 端的信号肽约由1 6 个氨基酸残基组成其作用是识别内质网膜。h a 合成后由信号肽酶将这一短肽切除，因此成熟的h a 不含信号肽。另一个加工过程是将h a 切割成两条多肽链，产生h a l 和h a 2 ，切割时去掉一个或多个氨基酸残基。h a l 和h a 2 的分子量分别为3 6 k d 和2 7 k d ，两条肽链被二硫键连在一起，再加上分子内的一些二硫键及其他非共价键的相互作用，使h a 形成一定的立体结构。大量的研究表明h a 裂解位点的氨基酸序列特点直接决定着a i v 的组织嗜性与致病力 4 0 l 。h a 可在宿主蛋白酶的作用下水解成h a l 和h a 2 ，这种裂解是病毒获得感染性的先决条件，因为这一步可以暴露出h a l 上的细胞膜结合位点和h a 2 上的细胞膜融合位点m j 。h a 在病毒入侵细胞的过程中起着极为重要的作用，借助对细胞受体的作用，使病毒吸附于细胞，在穿膜过程中起重要作用1 3 1 , s l 。有研究表明，h a 在n a 的合作下才能获得较强的感染性，因为n a 可以使结合在细胞膜上的病毒粒子解离下来，从而为病毒穿膜和增殖打_ f 基础p “。h a 是a i v 的主要保护性抗原【“，具有诱生中利抗体的能力，产生免疫保护作用【1 9 】。h a的变异性很强，是病毒发生抗原变异的主要原因i l 。h a 能凝集多种动物的红细胞，被特异的抗血清所抑制。h a 可以直接通过血凝反应检测，其相应抗体可用血凝抑制、中和试验、补体结合反应和e l i s a 方法来检测。1 8 单克隆抗体研究进展单克隆抗体技术是在细胞融合技术的基础上发展起来的。最初的单克隆抗体技术以小鼠一小鼠杂交瘤技术作为研究中心。1 9 6 2 年，日本学者o k a d a 首次在体外利用仙台病毒诱导细胞融合成功i ，j 。八十年代后，小鼠一大鼠、大鼠一大鼠、小鼠一人以及人一人杂交瘤技术也被尝试并取得了不同程度的成功，这有力地推动了单克隆抗体技术的发展和生物医学研究的深入 4 1 , 3 3 , 3 0 , 3 9 1 。1 9 7 5 年，g e o r g ek o h l e r 和c e s a rm i l s t e i n 首次报道用细胞融合技术，将经过绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，建立了能够产生抗绵羊红细胞单克隆抗体的杂交瘤，井可以在体外大规模培养增殖以获取特异的抗体【2 6 】。这是人类首次能够按照自己的意愿在体外生产针对某一抗原决定簇的特定抗体技术，给免疫学乃至整个生物医学领域带来了一次巨大革命。单克隆抗体技术诞生后，立即引起了许多研究者的注意。人们纷纷投入这一崭新领域的研究。到二十世纪八十年代中期，单克隆抗体技术已处于完善阶段，单克隆抗体也开始广泛应用于生物医学研究、生物技术以及临床诊断和治疗的许多领域【9 】。在八十年代中期到九十年代末期的短短十多年中，双特异性抗体技术【4 4 “j 、人一鼠嵌合抗d中国农业人学硕士学位论文第一章文献综述体技术、人源化抗体技术、小分子抗体技术、植物基因工程抗体技术p ”、抗体酶技术p ”、抗体库( 噬菌体显示) 技术【刈及外因鼠( x e n o m o u s ) 技术 3 4 1 等基因上程抗体技术在经典单克隆抗体技术的基础上也被创立并得到了突飞猛进的发展。近十多年来，基因工程抗体技术发展很快，其中一些基因丁程抗体是以淋巴细胞杂交瘤产生为基础的，它们的出现更丰富了单克隆抗体的内容。随着2 1 世纪功能基因组计划的全面实施，单克隆抗体在蛋白质芯片等诸多方面的应用，将成为研究新蛋白质分子结构和功能必不可少的工具。单克隆抗体的实验成功，不仅在生物学基础理论的研究中具有重要意义，而且在实践上也有很高的实用价值。单克隆抗体在疾病的诊断、治疗和预防方面，与常规抗体相比，特异性强，灵敏度高，优越性非常明显。1 9 本实验的研究目的与意义禽流感自1 8 7 8 年流行以来，已造成世界养禽业巨大的经济损失，特别是自1 9 9 7 年以来，高致病性禽流感在亚太地区呈现扩大传播之势，且已成为人禽共患的严重疾病，对人类的健康和生命造成严重威胁。2 0 0 3 年1 2 月以来，亚洲有1 0 个国家和地区接连发生禽流感，上千万只鸡病死或被宰杀，越南和泰国还出现了人因感染禽流感而死亡的病例。在这样的情况下，建立快速诊断技术、加大禽流感防制力度成为当今养禽业的重要任务。本实验旨在通过细胞融合和h l 筛选，获得抗禽流感病毒h 5 弧型血凝索的特异性单克隆抗体，为禽流感的快速诊断和防治打下基础。5! ：旦查些查兰堡主兰垡丝兰第二章实验材料与方法第二章材料与方法2 1 实验材料2 1 1 病毒禽流感h 5 病毒本实验室保存2 1 2 鸡胚、小鼠及细胞s p f 鸡胚b a l b c 小鼠和i c r 鼠s p 加细胞2 1 3 主要试剂h t 选择培养基h a t 选择培养基d m e m 高糖培养基胎牛血清细胞融合剂青霉素钠硫酸链霉素二甲基砜( d m s o )十，二烷基磺酸钠( s d s )巯基乙醇秋水仙碱正辛酸h r p 标记的羊抗鼠i g g羊抗鼠l g g 亚类低分子量标准蛋白质2 1 4 试剂配制1 ) 平衡液洗脱液( 0 0 1 mp h 7 4p b s 溶液)n a c 8 0 9k c l0 2 9n a 2 h p 0 41 1 4 9k h 2 p 0 40 2 4 9购自梅里亚动物保健品有限公司购自北京市实验动物研究所本实验室保存s i g m a 公司s i g m a 公司g i b c o b r l 公司h y c l o n e 公司s i g m a 公司华北制药华北制药北京旭东化工厂s i g m a 进口分装s w i t z e r l a n d邦定生物公司军事医学科学院鼎国公司s i g m a 公司中科院上海生化研究所6加去离子水溶解并定容至1 l o2 ) h t 脚母液将h t 和h a t 粉剂分别溶于1 0 m l 灭菌三蒸水，混匀分装后一2 0 保存备用。3 ) h a l 选择培养基d m e m 基础培养基7 6 m l胎牛血清2 0 m ll 谷氨酰胺( 3 )1 m l双抗( 1 0 0 0 单位n i l )1m lh a t2 m l4 ) h t 选择培养基d m e m 基础培养基7 6 m l胎牛血清2 0 m ll 广谷氨酰胺( 3 ) l m l敢抗( 1 0 0 0 单位n i l ) l m lh t2 m l5 ) d m e m 生长液d m e m 基础培养基7 8 m l胎牛血清2 0 m ll 谷氨酰胺( 3 ) l m l烈抗( 1 0 0 0 单位m 1 ) l m l6 ) 冻存液d m e m 基础培养基6 6 m l胎牛血清2 0 m ll 谷氨酰胺( 3 ) l m l双抗( 1 0 0 0 单位m 1 ) l m ld m s 0l o m lm2 m l7 ) 细胞维持液d m e m 基础培养基9 7 m l胎牛血清1m ll 谷氨酰胺( 3 )1 m l双抗( 1 0 0 0 单位m 1 )1 m l8 ) 0 0 7 5 mk c lk c l0 5 6 9用蒸馏水定容至1 0 0 m l 。9 ) 甲醇固定液甲醇3 份冰醋酸1 份7临用新鲜配制1 0 ) g i e m s a 染色原液g i e m s a 粉0 5 9甘油3 3 m l在研钵中研磨至无颗粒，1 1 ) 1 0 g i e m s a 染色液g i e m s a 染色原液1 1 5 m ( p n 6 8 ) p b s临用新鲜配制1 2 ) 秋水仙素溶液5 0 - - 6 0 c 保温2 h 后加入3 3 m l 甲醇混匀，保存丁棕色瓶内1 份9 份秋水仙素1 0 r a g生理盐水1 0 0 m l用0 2 2 i t m 滤膜除菌后，分装加保存备用1 3 ) 0 0 5 氨基黑染色液氨基黑0 0 5 95 醋酸1 0 0 m l1 4 ) 3 0 丙烯酰胺丙烯酰胺3 0 9二甲基双丙烯酰胺0 8 9用蒸馏水定容至l o o m l ，于棕色玻璃瓶中4 c 贮存1 5 ) 分离胶缓冲液( 1 5 mp h 8 8t f i s - h c l )t r i s1 8 1 7 9溶于8 0 m 堞馏水中，用浓盐酸调p h 至8 8 再以蒸馏水定容i i 5 1 0 0 m l ，40 c 贮存1 6 ) 浓缩胶缓冲液( 0 5 mp h 6 8t d s - h c l )t r i s6 o g溶于8 0 m l 去离水中，用浓盐酸调p h i 6 8 ，再以蒸馏水定容至l o o m l 。4 c 贮存1 7 ) 1 0 ( w v ) s d s十二烷基硫酸钠( s d s ) l o g加9 0 m l 蒸馏水，加热至6 8 c 助溶，然后再以蒸馏水定容至1 0 0 m l1 8 ) 1 0 ( w v ) 过硫酸铵( a p )过硫酸胺0 1 9蒸馏水l m l临用新鲜配制1 9 ) t e m e d原液2 0 ) 1 0 x 电极缓冲液( p h 8 3 ) i r i s3 0 3 98中国农业大学硕士学位论文第二章实验材料与方法甘氨酸1 4 4 2 9s d s1 0 9溶予蒸馏水并定容至1l ，使用时1 0 倍稀释2 1 ) 2 x s d s 样品缓冲液s d s5 0 0 m g巯基乙醇1 0 m l甘油3 m l溴酚蓝4mg1 m i r i s c l ( p h 6 8 )2 m l用蒸馏水定容到1 0 m l ，小份分装，一加保存2 2 ) 染色液( 0 2 5 考马斯亮蓝r - 2 5 0 酸甲醇水染液)马斯亮蓝r - 2 5 01 2 5 9甲醇2 2 7 m l冰醋酸46ml蒸馏水2 2 7 m l2 3 ) 脱色液( 酸甲醇水脱色液)甲醇5 0 m l冰乙酸7 5 删蒸馏水8 7 5 m l2 4 ) 0 0 1 mp h 7 4 p b s t在0 0 1 mp h 7 4p b s 中按0 5 加入吐温2 0 ，混匀。2 5 ) 包被液n a h c 0 32 9 3 9n a 2 c 0 31 5 9 9m g c l 20 2 0 3 9加d d h 2 0 至1 0 0 0 m l ，调p h = 9 62 6 ) 封闭液脱脂奶粉2 5 9t w e e n - 2 0l m ln a n 3o 0 2 ( 终浓度)用p h 7 40 0 1 m 的p b s 溶解，定容至5 0 0 m l2 7 ) 洗涤液p b s t2 8 ) 0 5 mp h = 5 柠檬酸盐缓冲液柠檬酸( 含h 2 0 )1 3 4 9柠檬酸三钠( 含h 2 0 )6 2 4 9n a c i ( 0 1 5 m o l 1 )4 3 8 5 9加入去离子水溶解、定容5 0 0 m l ，高压灭菌。4 c 保存被用。92 9 ) 底物稀释液灭菌柠檬酸盐缓冲液2 5 m l3 0 h 2 0 21 0 山混合均匀，按照总体积的0 1 加入t w e e n 2 0 ，4 c 保存备用。3 0 ) 底物浓缩液t m b ( 2 h c i ) 4 0 m gd m s o1 0 m l甘油1 0 m l柠檬酸盐缓冲液1 0 m l3 1 ) 底物下作液将底物稀释液和底物浓缩液等体积混匀，临用新鲜配制。3 2 ) 终止液2 1 5 耗材及主要仪器自动双重纯水蒸馏器超净工作台二氧化碳培养箱倒置显微镜高速离心机超速离心机酶联检测仪酶联洗板机台式电子天平水浴箱微孔细胞培养板进口可拆酶标板电泳成套设备成像仪2 2 实验方法上海亚荣生化器厂s z - 9 3s p e g a i r t e c hf o i i l l as c i e n t i f i c日本n i k o n日立1 8 p r 唧5 2 型日本b e c k m a nl e 8 0 kb i o - r a d 公司m o d e l 5 5 0b i o r a d 公司m o d e l1 5 7 5s a r t o r i u s1 6 0 2 m p 8 1星球电子恒温水浴锅c o s t a r 公司c o s t a r 公司b l o r a d 公司a l p h a l m a g e r 2 0 0 0 ，a l p h ai n n o t e a c hc o r p o r a t i o n2 2 1 病毒的繁殖、纯化及浓缩2 2 1 1 病毒的繁殖取a i v h 5 种毒，作1 0 0 0 0 倍稀释，尿囊腔接种1 0 日龄s p f 鸡胚，0 2 m l 枚，3 7 c 培养，每日照蛋3 次，淘汰2 4 小时内的死胚，收集2 4 9 6 小时仍未死亡的鸡胚，放4 c 冷却，无菌收获尿囊液。2 2 1 2 病毒的灭活及纯化( 1 ) 灭活1 0中国农业大学硕士学位论文第二章实验材料与方法在收获的尿囊液中加入甲醛使其终浓度为0 1 ，置于3 7 。c 生化培养箱中灭活2 4 小时。( 2 ) 差速离心4 0 0 0 r p m ，4 c 离一e l , 4 5 分钟，弃去沉淀。上清液于1 0 0 ，0 0 0 x g ，4 。c 超速离心2 小时，收集沉淀，以原尿囊液1 2 0 体积的p b s ( ph7 4 ) 重悬病毒，- 8 0 ( 2 保存。( 3 ) 凝胶过滤【”l取l gs e p h a d e xg - 2 0 0 ，以蒸馏水煮沸3 0 m i n ，充分溶胀后装柱，用平衡液充分平衡柱床。将粗提病毒加入柱内，待病毒液全部进入层析柱后，关闭下口完成上样，然后加入洗脱液进行洗脱，控制流速0 3 m l m i n ，1 0 m l 管，分别测定各管的o d 2 8 0 值和h a 价，绘制曲线，收集符合要求的各管洗脱液。( 4 ) 洗脱液的浓缩将收集的洗脱液装入透析袋，用固体聚己二醇( p g e 分子量6 0 0 0 ) 包埋1 0 h 进行浓缩【1 2 1 。取出病毒浓缩液，用紫外分光光度计测定其o d 2 6 0 和o d 2 ，根据公式：蛋白质浓度( m g m 1 )= 1 4 5 0 d 2 一0 7 4 0 d 2 【2 8 i 计算病毒蛋白浓度，并测定浓缩病毒液的h a 价。2 2 2 小鼠免疫程序用纯化浓缩的病毒作为免疫抗原免疫8 周龄b a l b c 小鼠。共免疫四次，第一次免疫用等量弗氏完全佐剂充份乳化，第二次和第三次免疫加等量弗氏不完全佐剂，第四次免疫不加佐剂。每次免疫间隔2 周，每次免疫的病毒剂量为每刚、鼠1 5 0 h 昏免疫途径为颈背部皮下多点注射。第四次免疫2 周后尾部采血测定血清的h 1 价，若血清效价合格，融合前三天进行一次加强免疫，用不加佐剂的病毒抗原经腹腔注射。2 2 3 杂交瘤细胞株的建立2 2 3 1s p 2 0 细胞的准备融合前2 4 4 8 h 将s p 2 0 细胞分瓶扩大培养，融合前6 h ，弃去瓶中培养液，换上新液。融合时，选择形态良好、呈对数生长的s p 2 0 细胞，将其从瓶壁上轻轻吹下，收集丁5 0 m l 离心管内，1 5 0 0 r p m 离& , 3 r a i n ，用5 m ld m e m 基础培养液悬浮沉淀，再离心一次，然后用d m e m 重新悬浮后计数备用。2 2 3 2 饲养细胞的制备( 1 ) 将未经免疫的i c r d x 鼠眼球放血处死。( 2 ) 将处死的小鼠置7 5 酒精中浸泡5 m i n ，转入超净台，置于无菌腰盘中。( 3 ) 剥离小鼠皮肤，无菌取出脾脏，放入盛有1 0 m ld m e m 基础培养液的平皿中，剔去结缔组织，并轻轻漂洗。( 4 ) 将脾脏移入另一盛有1 0 m l d m e m 基础培养液的平皿中，片j 灭菌的钝头镊子反复夹取挤压脾脏，充分释放其中的脾细胞。( 5 ) 将含有脾细胞的d m e m 移入离心管内，1 5 0 0 r p m 离，1 二, 3 m i n ，弃上清。( 6 ) 用1 0 m ld m e m 基础培养液重悬沉淀，吹吸均匀，1 5 0 0 r p m 离一t = i , 3 m i n ，弃上清。此步骤重复2 3 次。1 1中国农业大学硕士学位论文第二二章实验材料与方法( 7 ) 沉淀用1 0 m lh a t 选择培养基悬浮备用。2 _ 2 3 - 3 免疫脾细胞的制备( 1 ) 在强化免疫7 2 h 后将免疫小鼠摘除眼球放血并分离血清作为抗体阳性对照。( 2 ) 免疫脾细胞的制备同上述饲养细胞的制备过程( 2 ) ( 6 ) 。( 3 ) 最后，沉淀用d m e m 基础培养液悬浮计数备用。2 2 3 4 融合方法( 1 ) 分别吸取2 4 1 0 8 个脾细胞和含有6 o 1 0 7 个s p 2 0 细胞的悬液量，加入到一只5 0 m l 离心管内，轻轻混匀。( 2 ) 1 5 0 0 r p m 离, t = i , 3 m i n ，将上清尽量弃去。( 3 ) 用手掌轻轻震动管底，使沉淀细胞松散均匀成糊状。( 4 ) 用移液管吸取l m l 细胞融合剂，使移液管尖部接触细胞，缓缓加入融合剂，使细胞与融合剂充分接触控制在6 0 s 加完。( 5 ) 加入2 5 m l d m e m 液终止细胞融合剂的作用，方法如下：第1 分钟缓缓加入l m ld m e m液，第2 分钟加入4 m ld m e m 液，然后在3 分钟内加入2 0 m ld m e m 液。( 6 ) 将离心管置3 t cc 0 2 培养箱中静置5 m i n 。( 7 ) 1 5 0 0 r p m m i n 离- t j , 3 m i n ，弃上清，用1 0 5 r a lh a t 选择培养基悬浮融合细胞，将制备好的1 0 m l饲养细胞悬浮液全部加入，轻轻将细胞混合均匀。( 8 ) 将悬浮细胞液滴入到6 块9 6 孔板中，每孔2 0 0 山，置3 7 ( 7c 0 2 培养箱中培养。( 9 ) 融合第二天，用i - i a t 选择培养基、f 量换液，融合后第四天，再用h a t 选择培养基半量换液一次第八天改用h 瓞择培养基半量换液。每天记录细胞生长情况。2 2 3 5 阳性杂交瘤细胞的筛选( 1 ) 检测方法用血凝抑制试验( 砌) 进行检测。先用4 单位a i v h 5 亚型血凝抗原检测，对于阳性孔。再用8单位血凝抗原检测一次，筛选强阳性孔。所用的血球为0 5 ( v n ) 浓度的鸡红血球，直接对上清原液进行检测。瑚试验操作过程：a 加2 5 m 杂交瘤细胞上清。b 加2 5 m 4 单位或8 单位的血凝抗原轻轻震荡混匀，3 t c 静置2 0 m i n 。c 加5 0 m 0 5 鸡红血球，混匀。d 、3 7 静置3 0 r a i n 后观察结果。( 2 ) 筛选待融合后的细胞克隆生长到覆盖细胞孔底部面积的1 1 0 时，用确立好的m 方法对其培养上清进行检测。对丁用8 单位血凝抗原检测呈阳性的细胞孔，及时进行克隆；4 单位血凝抗原检测呈阳性，而8 单位抗原检测呈阴性的细胞，换上细胞冻存液，放入- 8 0 c 冰箱保存。2 2 3 6 阳性杂交瘤细胞的克隆采用有限稀释, 法1 1 a , 2 2 1 。( 1 ) 克隆的当天制备饲养细胞，制备过程如前所述，将制备好的饲养细胞悬液加入9 6 孔培养板中，1 0 0 u l 孑l 。1 2中国农业大学硕士学位论文第二二章实验材料与方法( 2 ) 将检测为强阳性的细胞孔用吸管轻轻吹吸使细胞分散均匀，吸至l m l 含2 0 胎牛血清的d m e m 液中，取少量悬液进行细胞计数。( 3 ) 用h t 选择培养液稀释阳性杂交瘤至2 0 个m l 、1 0 个n i l 、5 个，m l 。( 4 ) 将稀释好的细胞悬液加到有饲养细胞的9 6 孔培养板中，1 0 0m 孔，每一种稀释度$ f l a 2 i k 。( 5 ) 每天观察细胞生长情况。第四天用h t 选择培养液半量换液。( 6 ) 待孔中细胞液变黄进行检测。( 7 ) 选择仅有一个克隆生长的阳性孔再次进行克隆化，直至阳性克隆达n a 0 0 。( 8 ) 获得稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株后，及时扩大培养并冻存。22 4 细胞的冻存与复苏2 2 4 1 细胞的冻存( 1 ) 选择处于对数生长期的细胞，轻轻将细胞从瓶壁上吹下。( 2 ) 1 5 0 0 r p m 离一t ) 3 m i n ，弃上清。( 3 ) 用冻存液将细胞沉淀悬浮，分装于细胞冻存管中，1 5 m l 管，加盖封严，注明细胞代号、冻存日期。( 4 ) 将冻存管置于盛有无水乙醇的小烧杯内，于4 冰箱静置2 h 后转入。8 0 c 冰箱过夜，再将之移入液氪罐内长期保存。2 2 4 2 细胞的复苏( 1 ) 从液氮罐中取出冻存管，迅速放3 k 3 7 c 水浴中，轻轻晃动使其尽快融化。( 2 ) 1 5 0 0 r p m 离- t = l , 3 m i n ，弃上清。( 3 ) 用含2 0 血清的d m e m 液将沉淀悬浮，移入细胞瓶，置c 0 2 培养箱内培养。2 2 5 单克隆抗体的大量制备2 2 5 1 体外培养法将己建立的杂交瘤细胞株扩大培养，并持续培养直至细胞全部死亡。收集细胞培养上清1 5 0 0 r p m 离t ) 3 m i n ，上清液- 2 0 ( 2 保存备用。2 2 5 2 体内诱生腹水法( 1 ) 挑选经产b a l b c 小鼠，腹腔注射灭菌石蜡油0 5 m l 只。( 2 ) 1 0 1 4 天后，将杂交瘤细胞吹打r 来，1 5 0 0 r p m 离- l , 3 m i n ，弃上清，用5 m ld m e m 重新悬浮，计数备用。( 3 ) 每只小鼠腹腔接种杂交瘤细胞1 0 6 个。( 4 ) 7 - 1 0 天后，可见小鼠腹部明显增大，采集腹水。( 5 ) 将腹水3 0 0 0 r p m 离一l , 1 0 m i n ，收集上清，一2 0 保存备用。2 2 6 单克隆抗体的浓缩及纯化2 2 6 1 杂交瘤细胞上清的浓缩及纯化中国农业大学硕士学位论文第二二章实验材料与方法采用饱和硫酸铵沉淀法。( 1 ) 将生长状态良好的杂交瘤细胞培养至细胞全部死亡，收集细胞上清，约1 0 m l ，1 0 0 0 r p m离, t j q o m i n ，弃沉淀。( 2 ) 上清置小烧杯中，逐渐加入等体积的饱和硫酸铵，边加边搅拌。( 3 ) 室温搅拌3 0m i n 后，3 0 0 0 r p m 离- l = i , 2 0 m i n ，弃上清，用5 5 m l0 0 1 m o l l p h7 4p b s 悬浮沉淀。( 4 ) 将悬液置小烧杯中，逐滴加入4 5 m l 饱和硫酸铵，边加边搅拌。( 5 ) 室温搅拌3 0m i n 后3 0 0 0 r p m 离一1 ：, 2 0 m i n ，弃上清，用少量0 0 1 m o l l p h7 4p b s 悬浮沉淀。( 6 ) 将沉淀悬液透析除盐，透析后取出置2 0 保存备用。( 7 ) 用紫外分光光度计测定抗体含量。2 2 6 2 腹水的纯化( 采用辛酸一饱和硫酸铵法)( 1 ) 取腹水1 0 m l ，加入0 0 6 m 醋酸钠一醋酸缓冲液( p h 4 0 ) 2 0 m l ( 边加边搅拌) 。( 2 ) 用1 m 氢氧化钠将腹水p h 调至4 8 后，边搅边加入正辛酸o 3 3 m l ，室温搅拌3 0 r a i n 。( 3 ) 腹水经6 0 0 0 r p m m i n 离心3 0 m i n ，弃沉淀，上清用i m 氢氧化钠将p h 调至7 2 ，边加搅拌，缓慢加入等体积饱和硫酸铵，搅拌3 0 m i n 后，经6 0 0 0 r p m m i n 离心3 0 m i n ，弃去上清，沉淀溶于6 m l p b s 中。( 4 ) 缓慢加入4 m l 饱和硫酸铵，并不断搅拌，3 0 m i n 后，6 0 0 0 1 p m m i n 离心3 0 m i n ，将沉淀溶于适量p b s 中，移至透析袋中进行透析。2 2 7 单克隆抗体的鉴定方法2 2 7 1h i 价测定( 1 ) 杂交瘤细胞上清的测定培养至细胞瓶中的细胞全部死亡，收集细胞培养上清，1 5 0 0 r p m 离- t = i , 3 m i n ，除去细胞碎片。测定h i 价，用4 单位血凝抗原，测定按微量法常规程序进行。( 2 ) 腹水的测定将收集的腹水3 0 0 0 r p m ，1 0 m i n 离心处理，弃掉杂质，测定h i 价。2 2 7 2 单克隆抗体类型的鉴定( 1 ) 琼脂免疫双向双扩散a 将铺好的1 琼脂板取出，打梅花型孔，过酒精灯封底。b 浓缩杂交瘤细胞上清2 倍倍比稀释于周围孔，羊抗鼠i g g 亚类加于中间孔。c 置3 7 。c 恒温箱中保湿过夜，2 4 h 亓观察结果。( 2 ) 琼扩反应结果的保存a 反应后的琼脂板用生理盐水浸泡漂洗2 4 h ( 中间换液几次) 。b 洗干孔内