（果树学专业论文）酪氨酸可逆蛋白磷酸化在植物细胞逆境信息传递中的作用.pdf

摘要 植物在其生长和发育过程中不可避免地要遭受各种环境胁迫的影响或伤害，长期地进化使 植物演化出适应或对付各种胁迫的机制或策略细胞信息传递是植物实现抗逆的根本基础。植 物的细胞逆境信息传递是非常复杂的，其中植物激素脱落酸( a b s c i s i ea c i d ，a b a ) 被认为是最 为关健的信号组分之一，而a b a 信号的起源机制是最为重要的细胞逆境信息传递过程本研究 围绕d , a b a 生物合成关键酶基因n c e d 3 和朋仍的调控机制开展探讨，发现蛋白酪氮酸可逆磷酸 化酶参与了a b a 信号起源的调节 本研究发现，a b a 合成的关键酶基因i ! 聊和鲥都在拟南芥维管束组织中特异表达 n c e d 3 蛋白定位于在叶绿体，而a a 0 3 蛋白则定位在细胞质，这一结果表明a b a 的信号起源可 能受到其前体物质的跨膜运输操纵干旱胁迫可诱导n c e d 3 租a 月0 3 的高效表达采用诱导表 达的拟南芥转基因体系证明，n c e d 3 的表达可导虱j , a a 0 3 的表达，说明干旱胁迫下朋0 3 的表达 是劂正反馈调节的结果通过大量的突变体筛选发现，一个m a p k k k 家族的双功能激酶， 命名为m a p k k k 6 ( 4 2 ) ，的突变抑制干旱诱导瓶4 a 0 3 的表达进一步研究表明，m a p k k k 6 ( 4 2 ) 定位于细胞质膜采用诱导表达体系证明，m a p k k k 6 ( 4 2 ) 诱导的高表达可导致a a 0 3 的表达， 说n 月m a p k k k 6 ( 4 2 ) 可能是操g a a b a 信号起源的信号组分 本实验室药理学实验证明，玉米植物中酪氨酸磷酸酶专一抑制剂可有效阻 新a b a 积累，意 味着蛋白酪氨酸磷酸酶可能与a b a 信号起源有关将本实验室首次克隆的酪氨酸磷酸酶诱导表 达后发现，随着z m r i d p i 转录水平提升，a a 0 3 的转录水平也随之提高，实验说明植物体内蛋白 酪氨酸磷酸酶可能参与a b a 信号积累的调节进一步研究还发现，拟南芥的一个蛋白酪氨酸磷 酸酶，命名为p t p l 3 ，的突变可导致干旱应答基因l t l 3 0 的表达下降尸开j ”的超表达可促进 t u b i 表达，同时抑制了c o ，t ，c h s ，r e d l ，p i p 4 ，g i h r b i ，p 1 p 3 ，c r 8 8 及e l f 3 的表 达，但对r b c $ - i a ，口玎及c c a i 转录水平没有明显影响本实验揭示蛋白酪氨酸磷酸酶不仅参 与了细胞逆境信息传递过程，还与植物生长发育有着密切的关系 关键词：a b a ，蛋白酪氨酸激酶。蛋白酪氨酸磷酸酶，细胞逆境信息传递 n a b s t r a c t p l a n tg r o w t ha n dd e v e l o p m e n ta r ci n f l u e n c e do rd i s r u p t e di n e v i t a b l yb ye n v i r o n m e n t a ls t r e s s e s ， p l a n t sh a v eo b t a i n e dt h em e c h a n i s ma n ds t r a t e g i e st oa d a p to rr e s i s t a n ta g a i n s te x t e r n a le n v i r o n m e n t a l c o n d i t i o n sd u r i n gl o n gt i m ee v o l u t i o n c e l ls i g n a l i n gt r a n s d u c t i o ni sc r i t i c a lf o rs r e s s _ r e s i s t a n c ci n p l a n t s , a n ds t r e s ss i g n a l i n gt r a n s d u c t i o np a t h w a yi sv e r yc o m p l e x t h ea b s c i s i ca c i d ( a b a ) ak e y s i g n a l i n ge o m p o n e n t ，r e g u l a t i o no ft h eo r i g i no fa b as i g n a l i n gp l a yi m p o r t a n tr o l ei ns t r e s ss i g n a l i n g p a t h w a y s t h i sr e s e a r c ho l lt h er e g u l a t i o nm e c h a n i s mo f n c e d 3a n da d 0 3i na b ab i o s y n t h e s i s i n d i c a t er e v e r s i b l ep r o t e i nt y r o s i n ep h o s p h o r y l a t i o ni n v o l v e di no r i g i no f a b a s i g n a l i n g o u rr e s e a r c hh a sf o u n dt h a tt h ek e ya b ab i o s y n t h e s i sg e n e sn c e d 3a n d 4 4 0 3e x p r e s s e d s p e c i a l l y i n v a s c u l a r b u n d l e t i s s u e f u r t h e r e x p e r i m e n t o f s u b c e l l u l a r l o c a l i z a t i o n , t h a t n c e d 3 a n d a a 0 3 l o c a l i z e ds p e c i f i c l yi nc h l o r o p l a s ta n dc y t o p l a s mc o r r e s p o n d i n g l y , s h o wt h a tt h et r a n s - m e m b r a n e t r a n s p o r to f p r e c u r s o rm a l g h tm a n i p u l a t et h eo r i g i no f a b as i g n a l i n g a sn c e d 3a n da a 0 3c o u l db e i n d u c e ds i g n i f i c a n t l yb yd r o u g h ts t r e s s ，w i t ht h eh e l po ft r a n s g e n i es y s t e mo ft i g h t l y - c o n t r o l l e da n d h i g i l l y - i n d u c i b l e x v ee x p r e s s i o n s y s t e m ，i n c r e a s i n gn c e d 3e x p r e s s i o nu p - r e g u l a t ea d 0 3 t r a n s c r i p t i o n a ll e v e l ，t h e s eo b s e r v a t i o n ss u g g e s tn c e d 3i si n v o l v e di nap o s i t i v ef e e d b a c kr e g u l a t i o no f a a 0 3 g e n ee x p r e s s i o nu n d e rd r o u g h ts t r e s s w ef m da d u b l ef u n c t i o n a lk i n a s eo fm a p k k kf a m i l y n a m e da sm a p k k k 6 ( 4 2 ) i nl a r g e - s c a l ea r a b i d o p s i sm u t a n ts c r e e n i n g , t h em u t a n to fm a p k k k 6 ( 4 2 ) l e a d st ol o w e rt r a n s c r i p t i o n a ll e v e lo f 4 a 0 3 s t u d i e ss h o wt h a ti tl o c a l i z e ds p e c i f i c l yi nt h em e m b r a n e , c h e m i c a l - i n d u c i b l es y s t e m si d e n t i f i e dt h a ti n c r e a s i n ge x p r e s s i o no fm 4 e g r a c 6 ( 4 2 ) u p r e g n l a t et h e e x p r e s s i o no f a d o jg e n e , t h ef i n d i n g ss u g e s tt h a tm a p k k k 6 ( 4 2 ) m i g h tp l a yi m p o r t a n tr o l e si nt h e r e g u l a t i o no f a b as i g n a l i n ga c c u m u l a t i o n e x p e r i m e n t so fp h a r m a c o l o g yi n d i c a t et h a tp t p a s eh a v ear e l a t i o n s h i pw i t ho r i g i no fa b a s i g n a l i n g , a ss p i n c a l | yi n h i b i t o ro fp t p a s cc a ne f f i c i e n t l yi n h i b i t e da b aa c c u m u l a t i o n z m r i d p i am e m b e ro f r r p 目k q ef a m i l y , w a sf i r s tc l o n e da n dp u t t i e df r o mm a i z eb o u rl a b ，t h ee x p r e s s i o no f z m r i d p iu p r e g u l a t co b v i o u s l yt h ep r o d u c t i o no f a a 0 3m m a , t h er e s u l tm e a n sp 1 m a i n v o l v e di nt h e a b as i g n a la c c u m u l a t i o n a n t o t h e rp t p a s ew a sf o u n di na r a b i d o p s i s , n a m e da sp t p l 3 5 t h em n t u a n t 醴p t p l 3 5l e a d st ol o w e rt r a n s c r i p t i o n al e v e lo fd r o u g h t - i n d u c i b l eg e n el t l 3 0 t h eg a n ee x p r e s s i o n a n a l y s i ss h o w e dt h a ti no v e r - e x p r e s s i o np t p l 3 5p l a n t s ，u p r e g n l a t et h ee x p r e s s i o no ft u b lm r n a ， d o w n r e g u l a t et h ee x p r e s s i o no fc o , f t , c h s , r e d l 。p i p 4 。g i 。h r b i , p i p 3 c r 8 8 , e l f 3 ，h a v el i t t l e i n f l u e n c e r b c $ - m ，工观c c a i w ei d e n t i f i e dt h a tp 1 p a n o to n l yt a k ep a r ti nt h es t r e s s e s m e s s e n g e rt r a n s p o r t , b u ta l s oi n v o l v e di np l a n t sg r o w t ha n dd e v e l o p m e n t k e yw o r d s ：a l i a ，p r r l ( ，p r es t r e s ss i g n a l i n gt r a n s d u e t i o a 缩略词 英文缩写英文名称 p t pp r o t e i nt y r o s i n ep h o s p h a t a s e l q kp r o t e i nt y r o s i n ek i n a s e m a p k m i t o g e n - a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e z m r i d p i r e d u c t a n t - l n h i b i t e dd u a lp t p l s e1 d s p t p d u a ls p e c i f i cp r o t e i np h o s p h a t a s e r p k r e c e p t o rp r o t e i nk i n a s e g u s b - g l u c u r o n i d a s e a b a a b s c i s i ca c i d z e pz e a x a n t h i ne p o x i d a s e n c e d 9 - c i s e p o x y c a r o t e n o i dd i o x y g e n a r - s d r s h o r t - c h a i nd e h y d r o g e n a s e r e d u c t a s e a a oa b aa l d e h y d eo x i d a s e c t a b h e x a d e c y l t r i m e t h y l a m m o n i u mb r o m i d e d e p cd i e t l dp y r o c a r b o n a t e e d t a e t h y l e n e d i a a m i n e t e t r a - a c e t i ca c i d i f r g i s o p r o p h y t h i o - 争d - g l u c u r o n i d a s e a m pa m p i c i l l i ns o d i u ms a l t k a a k a n a m y c i ns u l f a t e h y g b h y g r o m y c i nb m s m u r a s h i g e s a l tm i x t u r e p a o p h e n y l a r s i n eo x i d e p c r p o l y m c r a s ec h a i nr e a c t i o n p h y bp h y t o c h r o m eb s d s s o d i u md o d e c y ls u l f a t e t r b a - a m i n o - 2 ( h y d r o x y m e t h y l ) i ，3 - p r o p a n e d i o l x g a l 5 - b r o m o - l - c h l o r o - 3 一i n d o l y l p d - g a l a c t o s i d e 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 翘开发时间：砌萨月夕日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：= 瑰开发 摊名：霞父欲导师签名：_ 定父勿吵、， 9 哆 月 月 彳 移 弧 滁 节 7 问 问 时 时 中国农业大学博卜学位论丈 文献综述 第一章文献综述 植物在长期进化过程程中，在各类环境胁迫下形成了一套抗逆性机制，植物细胞可通过一系 列生理生化过程的调节使植物产生各种抗逆反应以求得物种的生存和繁衍植物抗逆的生理生化 反应是非常复杂的，其中包括了众多的物质代谢和运转的变化，如渗透物质及抗逆蛋白的积累， 自由基的清除及离子的运转或区隔等等许多环境胁迫都可导致a b a 的大量积累，但是与渗透 调节等过程相关的物质积累不同的是，a b a 不是作为一种功能物质直接参与植物的抗逆性，而 是作为重要的细胞信号物质介导一系列的抗逆反应a b a 之所以被认为是信号，原因在于a b a 不仅可以作为胞内信号介导一系列逆境应答基因的表达，也可以作为长距离信号，介导植物以整 体形式对逆境协追作出适应性调整z e p n c e d 及a a 0 3 被认为是a b a 生物合成过程中的关健 酶，凡是能正向调控上述酶活性的因子就能上调植物体细胞内源a b a 的水平，利于植物抗逆性 的提高，这些调节机制的发现将对阐明植物细胞逆境信号传递途径和开展植抗逆基因工程的研究 提供新的依据 1 蛋白激酶与蛋白磷酸酶 蛋白磷酸酶和蛋白激酶共同动态调节的可逆蛋白磷酸化在调节细胞生长、分化、细胞周期、 基因转录、离子通道的活性、免疫应答及细胞内生物信息传递中起极其重要的作用。可逆磷酸化 通过变构效应和共价修饰机制使非活性蛋白和活性蛋白构象之间发生转化从而实现活性变化，如 有些酶磷酸化后，构象发生变化，阻断了底物接近酶活性位点的机会，实现对酶活性的调节 1 1 蛋白激酶 植物中存在着许多种蛋白激酶，它们和动物蛋白激酶类似，植物中的蛋白激酶也可以根据被 磷酸化的氨基酸的种类分为s e t t h r t y r 型现在已从拟南芥中克隆了一些同时受干旱、高盐 及低温诱导的蛋白激酶编码基因，分别编码受体蛋白激酶，促分裂原活化蛋白激酶、核糖体蛋白 激酶以及转录调控蛋白激酶四类 1 1 1 受体蛋白激酶 类受体蛋白激酶( r e c e p t o r p r o t e i nk i r m e ) 最早发现在动物中，位于细胞膜上，能够感受外界刺 激。并参与胞内信号转导过程它由胞外配体结合区( e x t r a e ：e l l u l a rl i g a n d - b i n d i n gd o m a i n ) 、跨膜 区( i r a n s m e m b r a n ed o m a i n ) 和胞质激酶区( c y t o s o l i ck i n a s ed o m a i n ) 3 个结构域组成胞外配体结合 区的功能是识别配体感受外界信号，跨膜区则将被胞外配体识别的信号传递给胞质激酶区，而胞 质激酶区能够通过磷酸化作用将信号传递给下一级信号传递体目前已在多种高等植物中分离出 一系列受体蛋白激酶基因，如从拟南芥植株分离到一种类似受体的蛋白激酶基因r p k l ，该基因 编码的氨基酸序列包含蛋白激酶中的1 1 个保守亚区，属丝氨酸，苏氨酸蛋白激酶类型，具备胞 外配体结合区、跨膜区和胞质激酶区等全部受体蛋白激酶的特征区此外r p k i 激酶的胞外部分 中圃农业大学博士学位论文文献综述 台有富亮氨酸重复序列( l r rl c u c i n e r i c hr e p e a ts e q u e n c e ) ，该序列参与蛋由质蛋白质问的相互作 用，与感受发育和环境胁迫信号有关低温及脱落酸处理能快速诱导蛋白激酶基因尉璩1 的表达 除了上述两类蛋白激酶外，最近又从拟南芥中分离剑一类蛋白激酶基因，a t p k 6 和a t p k | 9 ， 它们编码的氨基酸序列分别与动物棱搪体蛋白s 6 激酶p 7 0 眦和p p 9 矿增很高的同源性，因而命名 为核耱体蛋白激酶关于他们的功能可能与植物感受环境胁迫有关，有报道一嬲和4 例n 9 均 能被低温、高盐和干早诱导表达 1 1 2 促分裂原活化蛋白激酶 促分裂原活化蛋白澈酶家族的成员在多种信号传递系统中起着重要作用，它们均为保守的丝 氮酸虏氮酸类蛋白激酶，分子量约为3 5 5 5l 【i i ，都具有1 1 个保守的蛋自激酶亚区这类蛋白激 酶包括促分裂原活化蛋白激酶( m i t o g e n - a c t l v a 把dp r o t e i nk i n a ，m a p k ) ，促分裂原活化蛋白激酶 澈酶( m i t o g e a - a e t i v a t e dp r o t c 4 nk i n a k i n a s e ，m a p k k ) 促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶 ( m i t o g e n - a c t i v a t e dp r o t * i nk i t m s ek i n a r k i n a ，m a p k k k ) 3 种类型在真核细胞内这3 种类型的 蛋白激酶组成m a p 激酶级联途径( m a p k i n a c a s e , a d e ) ，通过m a p k k k 、m a p k k ，m a p k 逐级 磷酸化，级联反应地将信号不断放大并传递下去已知m p 激酶级联信号传导途径在介导生长 因子、激素反应、细胞增殖和分化畎及在介导胞外环境胁追信号和调节胞内胁迫反应中起重要作 用近年来，人们已相继从拟南芥、苜蓿( m e d i c a g o 姒i v a ) 、烟草( n i e o t i n at a b 越u m ) 等高等植物中 分离出一系列健分裂原活化蛋白撇酶家族的成员，它们分别在植物信号传递的不同过程中起作 用目前已经发现，m a p 激酶级联途径与植物对干旱、高盐、低温、激素( 乙烯、脱落酸、赤霉 素、生长素) ，刨伤、病原反应以及细胞周期调节等多种反应的信号传递有关 从拟南芥中分离到的被干旱、高盐及低温胁迫诱导的m a p 蛋白激酶基因有a t i v l p y jf 编码 m a p k 澈酶) 和a t m e k k i ( f f l 码m a p k k k 激酶) 两种。对它们的研究表明，m a p 激酶级联系统 不仅在蛋白质水平上受到磷酸化和去磷酸化的调控，在转录水平也受环境胁追信号的诱导调控 1 1 j 转录调控蛋白激蘼 转录调控蛋白擞酶基因是最近从拟南芥果实中分离鉴定出的一种新的蛋白激酶基困，序列分 析表明，它编码的氨基醴序列与酵母( s c h 缸o 嗍e e r e v i s i a e ) d b f 2 基因编码的氨基酸序列具有很 高的同振性，且该基因能补偿酵母d b f 2 突变体的功能缺陷，故定名为a t - d b f 2 拟南芥a t - d b f 2 激酶亦属丝氮酸，苏氨酸蛋自激酶类，同样包含有1 1 个蛋白澈酶的保守亚区高盐、低温及脱水 均能很快诱导a t - d b f 2 基因的表达 1 j 。4 棱糖体蛋白激酶 a t p k 6 和a t p k l 9 是从拟南芥中分离的另一类蛋白激酶基因，两者的核苷酸序列有8 2 o 的 同源性基因表达特性研究表明它们均被千旱、高盐及低温诱导，仅在诱导的表达时问上略有 差异 a t p k 6 j 4 l a t p k l 9 所编码的氨基酸序列与动物核糖件蛋白s 6 激酶p 7 0 娥和p 彬的同源性 很高目前尚未发现p 7 0 s 罐的直接上游灌活物质，但p 7 俨在动物中能遥过磷酸化4 0 s 核糖体 2 中国农业大学博士学位论文文献综述 b i l l 蛋白s 6 而激活蛋白质的合成，为此a t p k 6 和a t p k l 9 可能通过增加某些特定蛋白的合成使植物 对外界胁迫作出反应研究表明，m a p 激酶所催化的磷酸化能够激活p p 9 0 “，且a t p k l 9 的表 达方式与编码m a p 激酶的a t m p k 3 和a t m e k k i 存在相似之处 1 2 蛋白磷酸酶 蛋白磷酸酶( p r o t e i np h o s p h o t a s e ，p p ) 与蛋白激酶在细胞信号转导中的作用相反，主要功能是 使磷酸化的蛋白质去磷酸化。如在接收上游传递来的信号时通过蛋白激酶适时激活，一旦完成信号 接收或传递后及时失活，蛋白磷酸酶去磷酸化使信号传递通路关闭，不至于造成生物体内出现持续 性激活或失活的现象 相对于蛋白激酶，蛋白磷酸酶的研究较晚越来越多的证据表明蛋白质的磷酸化几乎存在于所 有的信号转导途径拟南芥中目前估算约有1 0 0 0 个基因编码激酶，3 0 0 个基因编码蛋白磷酸酶，约 占其基因组的5 已有初步工作表明蛋白磷酸酶参与了a b a 、病原、胁迫及发育信号转导途径 2 蛋白酪氨酸磷酸酶 蛋白酪氨酸磷酸酶( p r o t e i n t y r o s i n e p h o s p h t a s e ，p t p a s e ) 和蛋白酪氨酸激酶( t y r o x i n e p r o t e i n k i n a s e 。t p k a s e ) 催化的磷酸酪氨酸可逆蛋白磷酸化在动物及低等真核生物的信号传递中起着 非常重要的作用，如m a p k 途径，激素的感知和信号转导，细胞问相互作用和细胞周期控制等 2 1 蛋白酪氨酸磷酸酶分类及特性 1 9 9 1 年，f i s c h e r ”实验室从人的胎盘细胞中分离纯化了第一个蛋白酪氨酸磷酸酶p t p i b ， 发现p 1 1 p 鹬e 通过去磷酸化参与信号传递和细胞周期调控。尽管之后许多p t p a s c 相继被纯化，但 在植物细胞中直到最近才发现p r i p a s e 家族的存在，它们的功能也不甚清楚随着拟南芥基因组 测序完成，2 0 多个基因被鉴定编码p t p a s d $ ，其中包括1 7 个d s f t p 及类化) , d s p t p ，一个f r p ，一 个低分子量e t p l 2 1 根据磷酸氨基酸的特异性，p t p a s c 可以分为酪氨酸特异性( p t p ) 和双重特异性 ( d s f i p ) 两大类，前者脱磷酸酪氨酸的磷酸基，后者既脱磷酸酪氨酸的磷酸基，也脱磷酸化磷酸 丝氨酸，苏氨酸残基。根据酪氨酸特异性p 1 p 的亚细胞定位，将其分为两组，即受体类型p t p 胞内 p t p i ” p t p a s c s 能够水解对硝基苯磷酸( p - - n i v o p h e n y lp h o s p h a t e p n p p ) ，专一性抑制剂为氧化苯肿 ( p a o ) ，p t p a s e s x 口钒酸钠十分敏感，对冈田酸( o k a d a i c i ，o a l 不敏感h 。 2 2 蛋白酪氨酸磷酸酶活性调节 尽管p t p d s p t p 之间同源性很低。但所有p t l a s e s 催化机制基本相同，即催化核心都包含一个 特征序列( w i ) h c x a g x g r ( s m g ，这一序列中有一个关键的半胱氨酸残基，半胱氮酸处于还原 态时磷酸酶才有活性。用它作为亲核物质，形成硫代磷酸共价酶中问产物。在氧化胁迫条件下， 半胱氨酸的氧化作用可使p r i p a s 发生可逆失活”，h 2 0 2 导致一个类似受体p 1 既活性中心半光氨 酸依赖的构象快速可逆变化在拟南芥中，用h 2 0 2 处理，4 ，p z p 垢发现a t p t p 活性散失。还原剂处 3 中囝农业大学博士学位论文 文献综述 理后，活性即得到恢复在实验中还发现m s 除了受h 2 0 2 抑制d t t 激活外还能受d 订抑制，这说 明p t p s 的氧化还原调控具有多样性 不同类型的p t p 的表达有细胞组织特异性，如在哺乳动物淋巴细胞中表达的c d 4 5 ，参与t 细 胞和b 细胞的信号转导# 选择性地在神经组织中表达的受体类型的p t p 与神经细胞粘连有关l 再造血细胞中s h p i 表达水平高，在淋巴细胞分化过程中发挥作用 在动物中，氧化胁迫使p r p s s e s 失去活性在拟南芥中有些d s p t p 的表达可被有丝分裂和胁迫 信号所诱导如a t p r p l 2 3 蛋白酪氨酸磷酸酶的功能 2 3 1p t p s 对m a p k 信号系统的调节 m a p k 途径存在于高等植物体内，在激素、环境胁迫等信号转导途径中涉及到姒p k s 的活化 作用嘲在哺乳动物细胞中促分裂素和环境刺激能够激活m a p k s 的活性1 7 】，m a p k 家族是一类丝 氨酸苏氨酸( s e r m h r ) 蛋白激酶，包括m a p k s ，m a p k k s ，m a p k k k s3 种类型，其家族成员是 激素、细胞分化以及基因表达等信号传递途径中的主要成分，它们通过1 1 l r 和1 耵残基的磷酸化和 脱磷酸化作用实现活性调节当接受信号时，b a p k 信号途径被激活，m a p k 迅速发生自体磷酸 化或由m a p k i | ( s 使之磷酸化，传递信息，引起各种生理生化反应，之后，p t p a s 使之脱磷酸 而失活，回到原来状态，使信号灯熄灭m a p k 级联系统持续活化或延长时，会对细胞造成伤害， 比如哺乳动物细胞中m p k 持续活化时会形成肿瘤嗍这样的瞬时开关过程对于m a p k a 调节的生 理过程非常重要，蛋白磷酸酶，尤其p t p s 和d s p t p ，是精确维持m a p k s 活化和失活的关键调节因 子 在拟南芥基因组中鉴定到2 0 个左右编码m a p k s 基因，l o 个m a p k k s ( m a p kk i n a s e s ) 基因，约6 0 + m a p k k k s ( m a p k k 妇岱) 基因唧尽管不同的m a p k s 有不同的功能，但在一些情况下，不同的 信号好像汇聚在相同的m a p k 上，例如不同的病源菌刺激和非生物逆境信号激活烟草的水杨酸诱 导的蛋白激酶( s 口k ) 或拟南芥中的促分裂原活化蛋白激酶6 i l 川这些研究说明m a p k s 的活化是逆 境、激素和发育信号反应的早期事件 g u p t a 等i “1 从拟南芥中分离到一种双特异性蛋白磷酸酶基因，d 妒刀它可使底物蛋白磷酸 化的s 凹1 1 l r 及酪氨酸残基脱磷酸化和a t m p k 4 脱磷酸化而失活a t m p k 4 是拟南芥中的一种 m a p k ，生化分析表明a t m p k 4 上的酪氨酸残基的磷酸化作用对它的活化是必需的u l m i i ”发现一 个类 d t o s p i p c a t m k p o 的基因，在辐射条件下，这个突变体表现出高的m a p k 活性，说明a t m k p i 是m a p k s 的一个负调节因子x u 等l t 3 l 报道，拟南芥对逆境反应敏感的基因护z 科是一个典型的 酪氨酸磷酸酶基因，乱f t p t p l 缺失突变体中，m a p k s 明显比野生型的活性高，但在转基因植物 中，a t p t p i 过量表达则会延迟m a p k 的活化 最近研究表明，p t p a s 嚣在a b a 介导的种子后熟发育中对m a p k 信号途径有负调控作用j 2 3 2p t p s 对a b a 信号途径的调节 水兮亏缺诱导的a b a 积累可被p 1 p a 专一抑制剂p a o 抑制，并且水分亏缺可大大激活蛋白磷 4 中国农业大学博t 学位论文 文献综述 酸酶活性，且f r p a 的激活和a b a 积累在时问动力学曲线上一致脱水玉米胚芽鞘中至 少含有4 种以上的蛋白磷酸酶组分，其中仅有1 个组分对n a v 0 3 敏感，p t p a s c s 的专一性抑制剂p a o 和钒酸钠可以抑制水分亏缺时玉米胚芽鞘中a b a 的积累l i ”实验表明p t p a s e s 活性变化与a b a 消 长间存在重要关联，但p t p a 如何调控水分胁迫时的a b a 积累尚无充足证据 m a c r o b b i e ”1 研究p a o 幕 鸭趾草气孔运动的影响时发现，p a o 可以阻止外源a b a 诱导的气孔 关闭，在关闭的气孔中加入p a o 气孔也可以重新张开如前面所述，植物中p t p a s c s 作用的主要 靶位是参与诸多信号过程的m a p k s ，而m a p k 在a b a 诱导产生和气孔关闭过程中，对氧化信号的 产生、放大及其信号途径中刺激和反应的特异性有调节作用。 此外，蛋白酪氨酸磷酸酶对保卫细胞中a b a 诱导产t t i - i z 0 2 的信号有调节作用” 2 3 3p t p s 调节植物的生长发育 m a c r o b b i e 使用p t p 特异抑制剂发现，p t p 在a b a ，外部c a 2 + ，黑暗，h 2 0 2 四种因子诱 导的气孔关闭过程中是必须的。h 2 0 2 和m a p l e s 是保卫细胞a b a 信号途径中的重要组分，如前所 述p t p 是m a p k s 的重要调节剂，p t p a s e 能被p a o 和h 2 0 2 有效抵制，p a o 能阻止a b a 或h 2 0 2 诱导 的气孔关闭并能抑制保卫细胞中a b a 信号下游组分h 2 0 z 的产生。因此研究者认为p t p 介导了保 卫细胞中h 2 0 2 的产生在保卫细胞中p t p 抑制剂影响了液泡膜k + 的外流，但对穿越质膜的离子 流无影响，说明一种与液泡膜k + 离子通道有关的蛋白受到可逆磷酸化的调节 c d c 2 5 磷酸酶是d s p t p 的一类，在酵母与动物中发现在细胞分裂周期过程中起作用c d c 2 蛋白激酶上的酪氨酸残基磷酸化后而失活，c d c 2 5 磷酸酶可促使c d c 2 磷酸化酪氨酸残基脱磷酸 化而激活l l 习虽然酵母中的c d c 2 5 磷酸酶也激活植物的细胞分裂，但在植物中还没有鉴定到与 c d c 2 5 磷酸酶类似的同源物植物可能还有其它d s p t p s 代替了c d c 2 5 磷酸酶调节植物c d c 2 激酶的 功能 肿瘤限制因子p t e n 是一类d s p t p 酶，它们催化核心序列与p t p a $ - - 致，其结构域与细胞骨 架蛋白张力蛋白( t m s m ) 也有高度的相似性【1 9 1 从拟南芥中鉴定出一些基因，它们编码的蛋白与 p t e n 有高度同源性拟南芥中类似p n 烈的基因如a t p t e n i ，重组的a t p t e n i 是一个有活性的磷 酸酶，能水解多肽上的磷酸化的酪氨基酸残基a t p t e n im r n a 在拟南芥的叶、茎或根没有表 达，而花粉籽中专一高表达，而且仅在花粉发育的后期才检测到a t p t e n i 的表达；用r n a 干扰技 术使a t p ! n 1 发生基因沉默，则花粉发育后期阶段细胞不能正常发育而死亡，但a t p t e n i 如何 影响花粉的发育，尚无证据 p a o 阻断含羞草叶枕细胞中肌动蛋白的酪氨酸脱磷酸化，从而抑制触摸引起的叶柄弯曲运 动，表明含羞草肌动蛋白酪氨酸磷酸化的状态与含羞草叶片运动有关1 2 1 j 3 蛋白酪氨酸可逆磷酸化与a b a 信号起源 植物的生长发育受内部信号必外部环境的调节，a b a 介导了植物生长发育对环境的响应 a b a 在种子发育、休眠、萌发、营养生长及逆境响应等过程中扮演重要角色【恐1 ，a b a 参与这 些复杂调节机制的不同功能涉及a b a 的合成、降解、信号的感知与传导对这些机制的理解有 助于我们通过育种或基因工程方法提高植物对逆境的抗逆性自从六十年代a b a 被分离和鉴定 5 巾旧农业大学博 学伊论文文献综述 以来，人们通过遗传和生化手段，对a b a 生物合成过程中编码合成酶的基因都已清楚”j 。a b a 合成缺陷突变体更易受到环境胁迫的影响，这些突变体通过逆境敏感性实验得到筛选”j 。 尽管越来越多的证据表明a b a 对逆境的响应过程是一个复杂的调节机制，但我们还是想试 图知道这些参与 b 生物合成的基因及作为一个整体的合成途径是如何被调控的。 3 1 a b a 合成部位 尽管植物的老叶、花、果及种子等器官都能合成a b a ，但离体的根系，特别是根尖( 根毛区 至根冠) ，在缓慢脱水时能合成大量a b a ，非离体根在胁迫下也能够合成a b a 并可沿木质部随 蒸腾流运输到叶片而导致气孔关闭的事实引人注目“。在叶片中a b a 主要集中在叶绿体，番茄 幼苗根冠细胞中，a b a 主要分布于质体、细胞质膜囊泡及淀粉粒周围的造粉体等，这些部位很 可能就是合成a b a 的亚细胞位点2 ”。 3 2a b a 生物合成途径 圈l i a b a 生物合成示意图 f i g i 1 t h e p a t h w a y o f a b a b i o s y n t h e s i s ( s t e v e n h s c h w a r t z x i a o q i o n g q i n ，a n dj a n a d 7 2 e v a a r t , 2 0 0 3 ) 6 中日农业大学博+ 学位论文 文献综述 在a b a 合成途径的探讨中，a b a 合成缺陷突变体起了重要作用，通过早萌的种子和萎焉表 现一大批突变体得到筛选，如玉米、烟草、番茄、马铃薯及大麦等结合外用a b a 饲喂突变体 的方法知道a b a 合成途径中间体的存在高等植物可能存在两条a b a 生物合成途径：直接途径， 3 个异戊烯单位聚合成c ”前体法呢基焦磷酸( f p p ) ，由f p p 经环化和氧化直接形成15 碳的 a b a ；间接途径，即先由甲羟戊酸( m v a ) 聚合成c 前体类胡萝h 素，再由类胡萝h 素裂解成 c l ，化合物，如黄质醛( x a n ) ，最后由x a n 转变成a b a ，现在越来越多的证据表明高等植物 主要以间接途径合成a b a l ”2 l ，如下图 到目前为止拟南芥中主要突变体，相应基因及酶都已得到说明刚如图l ，l , a b a 合成途径的 第一步是玉米黄质经过两步环氧化步骤向全反紫黄质( a l l - t r a n s v i o l a x a n t h i n ) 的转化，催化该反 应的酶为玉米黄质环氧酶( z e a x , t h i ne p o x i d a s e ，z e p ) ，这是a b a 合成的第一个特异酶，其分 子证据最先是在烟草中得到 全反紫黄质向a b a 转化的下个步骤是变为9 - 顺紫黄质( 9 - c i s - v i o l a x a n t h i n ) 或9 一顺一新黄质 ( 9 - e i s - n e o x a n t h i n ) ，目前催化该反应的酶还没得以纯化和鉴定9 顺紫黄质或9 一顺一新黄质的氧 化裂解是由9 - 顺环氧类胡萝h 素二氧合酶( 9 - c i s - e p o s y c a r o t e n o i dd i o x y g e n a s e ，n c e d ) 催化的， 得到一个c ”的中间体黄质素【，l j 这一步被认为是a b a 合成途径中第一个限速步聚，编码n c e d 的基因是首次从玉米突变体v p l 4 中克隆的p 2 1 重组蛋白v p l 4 可特异催化9 - 顺一紫黄质或9 顺- 新黄质的氧化裂解，目前n c e d 的c d n a 已在大豆( p h a s e o l u s v u | g a r i s ) 、鄂梨( p e r s e a a m e r i c a n a ) 、 拟南芥( a r a b i d o p s i s t h a l i a n a ) 以及v i g n au n g u i c u l a t a 等植物中克隆出来。在所有这些植物品种中， n c e d 组成了一个小的基因家族 a b a 合成的最后步骤就是9 顺环氧类胡萝p 素的裂解产物黄质醛( x a m h o x i n