（微生物与生化药学专业论文）硫酸庆大霉素c组分hplc测定方法研究.pdf

北京协和医学院中国医学科学院医药生物技术研究所硕士论文 目录 中文摘要l 英文摘要2 弓l言3 第一章硫酸庆大霉素c 组分现行药典测定方法原理概述7 第一节衍生化方法概述7 第二节蒸发光散射检测器技术概述1 0 第三节电化学检测器概述2 3 第二章h p l c u v 柱前衍生化方法分析硫酸庆大霉素组分3 6 第三章h p l c e l s d 法测定硫酸庆大霉素c 组分4 0 第四章反相液相色谱一积分脉冲安培检测器分析硫酸庆大霉素组分和 有关物质方法的建立4 9 第一节欧洲药典方法考察4 9 第二节反相液相色谱一积分脉冲安培检测器分析硫酸庆大霉素 组分及有关物质方法的建立5 4 第五章n q a d 分析庆大霉素c 组分6 2 第一节n q a d 的工作原理6 2 第二节h p l c - n q a d 分析硫酸庆大霉素组分6 4 第六章各检测方法的讨论与分析6 7 参考文献7 0 致谢7 2 北京协和医学院中国医学科学院医药生物技术研究所硕士论文 中文摘要 本文对现行美国药典、英国药典欧洲药典和中国药典中收载的硫酸庆大霉 素组分和杂质分析方法进行了研究和比较，分析和讨论了以上药典收载方法在实 际检测过程中存在的问题和不足之处；改进了国外使用的了采用常规反相液相色 谱积分脉冲安培检测器法分析硫酸庆大霉素组分和有关物质的方法；首次采用 了一种新型的基于电雾原理的通用型检测器一水凝聚核粒子计数检测器( n a n o q u a n t i t ) ，a n a l y t ed e t e c t o r n q a d ) 来成功进行了庆大霉素的组分分析，为硫酸 庆大霉素组分分析提供了一个新的途径。 本文改进的c 1 8 色谱柱结合积分脉冲安培检测器建立的硫酸庆大霉素组分 分析和有关物质检测方法具有灵敏度高、专属性强、重复性和耐用性好的特点， c l 。的最低检测限达到5 2 n g ，专属性强，可作为现行欧洲药典和英国药典的替代 方法用于硫酸庆大霉素c 组分的检测和分析。 本文中使用的n q a d 检测器，雾化和蒸发阶段的原理与e l s d 相似，但检 测部分不一样，用于硫酸庆大霉素c 组分的测定和分析灵敏度比e l s d 高出2 个数量级且呈线性响应。 本论文通过采用积分脉冲安培检测及水凝聚核粒子计数检测技术，解决了 硫酸庆大霉素质量分析中的难题，为全面了解和分析氨基糖苷类抗生素的质量开 创了新的思路和手段，其中，采用n q a d 检测器分析硫酸庆大霉素组分的方法 具有操作简单、影响因素少、灵敏度高的特点，在国际上是首次报道。 关键词：硫酸庆大霉素；组分分析：药典分析方法 北京协和医学院中国医学科学院医药生物技术研究所硕士论文 a b s t r a c t i n t h i sp a p e r ，c u n e n tc o m p e n d i a lm e t h o d s ( u s p ；b 只a n de p ) f o rd e t e n n i n a t i o no f g e n t a m i c ncc o m p o n e n t sw e r ef u l l y s t u d i e d a l lo ft h e s eo 币c i a lm e t h o d sa r e p r o b i e m a t i cf o rs e p a r a t i n g o rt e s t i n gt h eg e n t a m i c i ncc o m p o n e n t sa n dr e l a t e d i m p u r i t i e s a n dc o n s e q u e n t i y ，t h er o o tc a u s e sw e r e i n v e s t i g a t e d f o l l o w i n ga c o m p a r a t i v es t u d y 锄i m p r o v e dl i q u i dc h r o m a 幻g r a p h i cm e t h o dw i t hi n t e g r a t e d p u l s e da m p e r o m e t r i c d e t e c t i o nf o rt h ea n a l y s i so fg e n t a m i c i nc o m p o n e n t sw a s e s t a b l i s h e da n dv a l i d a t e du s i n gar c v e r s e dp h a s ec 1 8c o l u m n i na d d i t i o nt ot h e h p l c - i p a dm e t h o d ，an e wa e r o s o lb a s e dd e t e c t o r n a n oq u a n t i t ya n a l y t ed e t e c t o r ， a l s ob ee x p l o r e df o rt h ef i r s tt i m et 0d e t e c tt h ec c o m p o n e n t so fg e n t a m i c i n ，w h i c h p r o v e dt ob ean e w 印p r o a c h t or e s o l v et h eg r e a tc h a ll e n g ew ef a c e di nt h ea n a l y s i so f a m i n og l y c o s i d ea n t i b i o t i c s t h i sm e t h o d ，w h i c hu t i l i z e sas i l i c ab a s e dc 1 8c o l u m nw i t hp u l s e da m p e r o m e t r i c d e t e c t i o ni ss e l e c t i v e ，l i n e a r ，s e n s i t i v ea n dr o b u s t ，a n dc o u l ds e p a r a t ea n dd e t e c tm o r e t h a nt e ni m p u r i t i e so fg e n t a m i c i na p a r r tf o r n lt h e6 v em 旬o rc o m p o n e n t s i ti sa s u i t a b l ea l t e m a t i v et 0t h eo m c i a lm e t h o df o rt h ea n a l y s i sc c o m p o n e n t so fg e n t a m i c i n a n dr e l a t e di m p u r i t i e sa sw e l l n q a ds h a r e st h es a m em e c h a n i s mo fn e b u l i z a t i o na n de v a p o r a t i o nw i t he l s d ， h o w e v e r ，i th a sd i h e r e n td e t e c t i n gw a y r e s u l ti nal i n e a rd e t e c t i o nc u r v ea n dt 、v oo r d e r o fm a g n i t u d em o r es e n s i t i v et h a ne l s d b ye m p l o y i n gt h ei p a da n dn q a dd e t e c t i n gt e c h n o l o g i e s ，s o m ep r o b l e m se x i s t i n g i nt h e 彻a l y s i so fg e n t a m i c i n 、v e r ee a e c t i v e l ys o l v e d ，a n dan e wp e r s p e c t i v ef o rt h e q u a l i t yc o n t r o lo fa m i n o g l y c o s i d ea n t i b i o t i c s 、a sp r o v i d e d k e yw o r d s ：g e n t a m i c i n ，c o m p o n e n t sa n a l y s i s ，c o m p e n d i a lm e t h o d s 2 北京协和医学院中国医学科学院医药生物技术研究所硕士论文 引言 1 课题目的和意义 氨基糖苷类抗生素( a m i n o g i y c o s i d e s ) 属于广谱抗菌素，对革兰氏阳性和阴 性菌都有效，是临床上最常用的抗感染药物之一。庆大霉素( g e n t a m i c i n ) 是由 小单孢菌属( m i c r o m o n o s p o r ap u r p u r e a ) 发酵产生的一组结构相近的多组分氨基糖 苷类抗生素。庆大霉素的主要活性成分是c 组分，c 组分具有较强的广谱抗菌作 用，目前临床中广泛使用。根据分子结构的差异其c 组分包括c l 。，c 2 ，c 2 。， c l 和c 2 b 共5 个组分，这些组分在结构和理化性质上都很相似( 见图1 ) 。 h 荆 g e n t a m i c l nc h 2 n - 垂i - 2 0 8 g e n 协m i c i n r r 2r o c ， c h 3 h c 嚆 c 1 。 hhh c 2 hh c 心 c 轴 h c h 3 h _ *一 c 知c h 3 hh 2 d e o x y s t r e p t a m i n e 图1 ：庆大霉素及相关组分分子结构 对于庆大霉素组分的分析检测一直是药品检验人员和科研人员努力想解决 的难题之一，主要有以下两点原因：一是庆大霉素是强极性、难挥发性的化合物， 北京协和医学院中国医学科学院医药生物技术研究所硕士论文 在反相色谱中难以保留和分离；二是分子中缺少发色基团或荧光物质，因而难以 采用常规的u v 检测器来对其进行检测。目前各国药典虽然都对各c 组分的含量 进行严格的控制( 见表1 ) ，但是这些药典收载方法都不能够对c 组分进行灵敏 准确的检测和控制。 表1 ：现行药典对硫酸庆大霉素c 组分的限度控制要求 目前美国药典是采用邻苯二甲醛( 0 p a ) 柱前衍生化方法来对硫酸庆大霉素 组分进行控制，衍生化方法存在的最大问题是c 1 峰的选择性不好，c l 峰与前后 的多个小杂质峰之间得不到有效的分离，导致了不能够对c l 峰面积进行准确的 积分，造成c l 测定的准确性和重现性不好。为了克服选择性差这个缺点，欧洲 药典和英国药典采取相对峰高法来对c 组分进行定量，相对峰高法虽然能够部 分消除融合在c l 主峰中的小组分对c l 定量的影响，但是由于c l 主峰与其前后 的小组分峰之间没到达到基线分离，也在一定程度上影响了c i 峰高的准确判断， 因此不论采用哪种定量计算方法( 峰面积法和相对峰高法) 都不能够从根本上解 决c 。组分定量不准确和测定结果重现性差的问题。另外，由于衍生化反应其实 是专门的有机合成反应，供试品溶液的制备过程比较复杂，操作相对比较繁琐费 时，对操作者的要求比较高，只有有经验的操作者才能够取得重现性比较好的结 果，这也是衍生化反应的另外一个缺点。中国药典从2 0 0 5 年版开始采用e l s d 法对庆大霉素组分进行分析和控制，该方法简单易于操作，不需要衍生化，且各 组分之间在e l s d 的响应值一致。但是该方法最关键的一个不足之处是其检测灵 敏度低，不能够满足杂质分析的要求，而且经常有药检所反映该方法重现性不太 理想；另外，被分析物的峰面积和浓度在e l s d 上是呈对数关系而不是线性关系， 这对定量计算带来了一定的繁琐性，也是其一个小缺点。 欧洲药典第5 版和英国药典2 0 0 5 年版开始收载采用离子交换色谱( 聚合物 柱) 一脉冲安培检测器通过柱后加碱液来改善检测的方法来对硫酸庆大霉素组分 4 北京协和医学院中国医学科学院医药生物技术研究所硕士论文 和有关物质进行控制。欧洲药典收载此方法后，陆续有许多发表的研究结果表明 该方法在实际检测过程中具有很多问题，许多质控实验室也报道该方法在日常质 控试验过程中对硫酸庆大霉素组分和杂质的不可控性，具体体现在以下几点： ( 1 ) 流动相中含有四氢呋喃，造成背景噪音高，基线特别不稳定； ( 2 ) 聚合物柱选择性差，c 2 b 和c 2 之间、c 2 和c 2 。之间达不到基线分离； ( 3 ) 检测器电位设定中没有规定具体时间参数，采用该方法规定的三段式电位波 形进行检测造成电极污染严重，很快就不能使用( 电极失效) ； ( 4 ) 重现性差。 。造成欧洲药典方法不具有可操作性的最主要的原因有两个：一个是基线特别 不稳定；另外一个是电极污染老化严重，很快就不能使用。研究结果显示，由于 四氢呋喃本身不稳定易氧化而显著性的影响基线的稳定性；流动相中高盐浓度也 会容易污染电极表面而影响基线的平稳性；另外一个关键的因素是欧洲药典方法 中检测器电位波形设定不合理，只简单的规定了氧化电位和还原电位而对关键的 时间参数没有具体规定，导致在具体的试验过程中由于电位波形图设定不合理而 影响了工作电极表面的充分还原，因此影响了电极表面清洁和电极的使用寿命， 造成在实际过程中的不可操作性。 鉴于以上所述的u s p 、中国药典和欧洲药典收载方法的局限性，本文的主要 目的之一就是要建立一个操作简单，质量可控的硫酸庆大霉素组分测定方法。 2 本论文的主要内容 本论文采用4 批硫酸庆大霉素原料作为被测物，首先对美国药典、中国药 典和欧洲药典收载方法进行了考察和有针对性的方法学验证；在此基础之上，改 进了国外采用常规反相液相色谱结合积分脉冲安培检测器并柱后加碱溶液的用 于硫酸庆大霉素组分分析和有关物质检查的方法，本文采用c 1 8 色谱柱结合积分 脉冲安培检测器建立的方法具有灵敏度高、专属性强、重复性和耐用性好的特点， c l 。的最低检测限达到5 2 n g ，专属性强，除了庆大霉素的5 个主要组分之外，还 可以检测出1 0 个以上的杂质。方法学验证结果表明，该方法可替代现行欧洲药 典和英国药典收载方法，用于硫酸庆大霉素组分测定和分析。 最后，本论文还首次采用了一种新型的基于电雾原理的通用型检测器一水 北京协和医学院中国医学科学院医药生物技术研究所硕士论文 凝聚核粒子计数检测器( n a n oq u a n t i t ) ra i l a l y t ed e t e c t o r ，n q a d ) 来成功进行了 庆大霉素的组分分析，为硫酸庆大霉素组分分析提供了一个新的途径。本文中使 用的n q a d 检测器，雾化和蒸发阶段的原理与e l s d 相似，但检测部分不一样， 灵敏度比e l s d 高出2 个数量级且呈线性响应。相对于电化学检测器来说，n q a d 具有操作简单、影响因素少、对仪器设备要求低等显著特点，是一个很有前途的 用于硫酸庆大霉素c 组分测定的新检测器。 6 北京协和医学院中国医学科学院医药生物技术研究所硕士论文 第一章硫酸庆大霉素c 组分现行药典测定方法原理概述 在过去的2 0 年中，美国药典( u s p ) ，英国药典( b p ) 欧洲药典( e p ) 和 中国药典所收载的硫酸庆大霉素c 组分测定方法主要是o p a 柱前衍生化法、电 化学检测器法( p a d ) 和蒸发光散射检测器法( e l s d ) 。其中美国药典从2 2 版 ( 19 9 0 年) 【l 】开始采用h p l c 柱前o p a 衍生化法结合紫外检测器在3 3 0 n m 的波 长下检测硫酸庆大霉素c 组分，一直到今天( u s p3 2 版，2 0 0 9 年) 【2 j 仍然是这 个方法。英国药典1 9 9 3 【3 】年开始收载柱前衍生化法检测硫酸庆大霉素c 组分， 2 0 0 5 年改为采用h p l c p a d 法测刊4 1 ，一直延续到现在( b p2 0 0 9 ) 【5 1 。中国药 典1 9 9 5 年版【6 】开始采用欧洲药典的衍生化方法，2 0 0 5 年版【7 1 开始采用蒸发光散 射检测器法( e l s d ) 对硫酸庆大霉素c 组分进行控制。本章对硫酸庆大霉素c 组分测定最常用的三种药典方法( 衍生化法、p a d 法和e l s d 法) 的原理和应 用进行了概述和介绍。 第一节衍生化方法概述 对于没有紫外吸收的化合物的检测来说，衍生化方法过去一直是一个经典 常用的方法，美国药典从2 2 版( 1 9 9 0 年版) 就开始收载采用邻苯二甲醛( o p a ) 柱前衍生化h p l c u v ( 3 3 0 n m 波长下检测) 的方法来测定硫酸庆大霉素的组分， 一直到现在的u s p3 2 版( 2 0 0 9 年版) 都是这个方法，2 0 年来没有任何变化。柱 前衍生化的方法在英国药典和欧洲药典中使用了1 2 年，在中国药典中使用了1 0 年。由此我们不难看出柱前衍生化测定硫酸庆大霉素c 组分在历史上有重要的 地位，为了能够更好的比较硫酸庆大霉素组分不同分析方法之间的优缺点，本论 文首先采用现行美国药典中的0 p a 衍生化方法对u s p 硫酸庆大霉素标准品进行 了组分分析，并针对衍生化方法的重点问题进行了方法学考察。 一衍生化方法的基本原理和特点 色谱技术中的化学衍生化法系指在色谱过程中使用特殊的化学试剂( 称为 衍生化试剂) ，衍生化试剂借助化学反应给样品化合物结构上接上某个特殊基团， 使其转变为相应的衍生物之后进行分离检测或直接进行检测的方法。近些年来， 化学衍生法在高效液相色谱法中的应用受到重视，发展较快，新的衍生化试剂层 7 北京协和医学院中国医学科学院医药生物技术研究所硕士论文 出不穷。 利用化学衍生化反应达到改变化合物特性，使其更适合于特定的分析过程 的方法，在其它仪器分析方法中都有应用，如质谱、核磁共振、紫外可见吸收、 荧光和电化学等。在气相色谱中应用化学衍生化反应是为了增加样品的挥发性或 提高检测灵敏度。液相色谱中的化学衍生化法一般来说主要有以下几个目的： ( 1 ) 提高对样品的检测灵敏度； ( 2 ) 改善样品混合成分之间的分离度； ( 3 ) 适合于进一步做结构鉴定，如质谱、红外、核磁共振等。 一般来说，进行化学衍生化反应应该满足如下要求： ( 1 ) 对反应条件要求不苛刻，且能迅速定量的进行； ( 2 ) 对某个样品只生成一种衍生物，反应副产物( 包括过量的衍生试剂) 不应 干扰被测样品的分离和检测； ( 3 ) 化学衍生试剂方便易得，通用性好。 以是否与h p l c 系统联机来划分，目前化学衍生化方法可分为在线衍生和离 线衍生两种。以发生衍生化反应的前后来区分，又可分为柱前衍生化法与柱后衍 生化法两种。目前，在h p l c 中，以离线的柱前衍生化法( 简称柱前衍生法) 与 在线的柱后衍生法( 简称柱后衍生法) 使用居多。柱前衍生法是在色谱分离前， 预先将样品制成适当的衍生物，然后进样分离和检测，柱前衍生的优点是衍生试 剂、反应条件和反应时间的选择不受色谱系统的限制，衍生产物易进一步纯化， 不需要附加的仪器部件。缺点是操作繁琐，容易影响定量的准确性。柱后衍生则 是在色谱分离后，向色谱系统中加入衍生试剂及辅助反应液，与色谱流出组分直 接在系统中进行反应，然后检测衍生反应的产物。柱后衍生的优点是操作简便， 可连续反应以实现自动化分析。缺点是由于在色谱系统中反应，对衍生试剂、反 应时间和反应条件均有很多限制，而且还需要附加的仪器部件，如输液泵、混合 室和加热器等，还会导致色谱峰展宽。柱前衍生和柱后衍生两者的主要差别在于 前者是根据衍生物的性质不同而进行色谱分离的，后者则是先分离样品混合物， 然后再衍生。究竟选用那种方式，需视不同情况而定。为保持较高的反应产率和 重现性结果，一般要求向反应体系中加入过量的衍生化试剂，这就导致了向液相 系统中引入了过量的没有参加反应的衍生化试剂，可能会对色谱分离和测定带来 8 北京协和医学院中国医学科学院医药生物技术研究所硕士论文 一定的干扰，这也是衍生化反应的最主要缺点之一。 衍生化反应的类型主要分为：紫外衍生反应、荧光衍生反应、电化学衍生 反应和手性衍生反应。紫外衍生反应是最常用、使用最为广泛的衍生反应，大多 数的紫外衍生试剂已用于经典的光度法和定量有机分析法。新的紫外衍生反应和 试剂也在不断的出现。许多荧光试剂在紫外区都有强吸收，故也可用作紫外衍生 试剂。实质上，衍生反应是专门的有机合成反应，要求操作者对反应过程有较深 入的了解，首先要保证得到较高的反应产率，其次要求重复性好。另外，反应量 仅在m g 级甚至更低的情况，还需要加入大量的试剂，而过量的试剂和试剂中的 杂质势必又会对h p l c 的分离和测定带来干扰，因此衍生化操作过程中衍生化试 剂的纯度是一个十分关键的因素，应该尽可能的保证使用高纯度的衍生化试剂。 由于不同的试剂公司生产的衍生化试剂的纯度和杂质情况不同，甚至同一生产厂 家生产的不同批次的试剂之间的纯度和杂质状况也存在微小的差异，这也是导致 衍生化反应测定结果重现性差的一个主要因素。 现行美国药典中收载的衍生化法测定硫酸庆大霉素组分的方法就是典型的 紫外衍生化法，利用氨基糖苷类抗生素结构中的活泼基团( 如氨基、羰基) 与衍 生化试剂( 邻苯二甲醛) 发生反应，形成具有紫外吸收的反应产物，在3 3 0 n m 的 波长下采用紫外检测器进行检测。该方法为柱前衍生化方法，不需要特殊的仪器 部件，2 0 年来一直作为u s p 中硫酸庆大霉素组分测定方法。o p a 衍生化原理见图 1 。 + r n h 2 二_ r 一s h 图1 ：o p a 衍生化示意图 9 r l r 北京协和医学院中国医学科学院医药生物技术研究所硕士论文 第二节蒸发光散射检测器技术概述 一蒸发光散射检测器的工作原理和仪器结构 蒸发光散射检测器的基本原理是：经色谱柱分离的组分随流动相进入检测 器，经过雾化及溶剂蒸发过程使溶质以气溶胶雾状颗粒的形式进入光散射池。在 光散射池中溶质被光源照射而产生光散射，根据光散射强度正比于溶质粒子的数 目及粒子的大小，进而确定组分的含量。蒸发光散射检测器的基本工作原理如图 2 所示： m o b i e p h a p n。bu-注at；。f_ r o e t e d i o n i d i b 他岫q 凹 图2 ：蒸发光散射检测器的工作原理图 蒸发光散射检测器的运行分为三个过程： ( 1 ) 雾化过程经色谱柱分离的组分随流动相进入与色谱柱出口直接相连的雾化 器针管中，在雾化器的末端色谱流出物与充入的高速气流( 氮气、氦气和空 气) 混合形成均匀的气溶胶雾状颗粒。 ( 2 ) 蒸发过程这些气溶胶雾状颗粒进入可以控制温度的蒸发漂移管中，使流动 相汽化蒸发，只剩下挥发性较小的被测物质的雾状颗粒，他们高速通过蒸发 漂移管进入光散射池。 ( 3 ) 检测过程在光散射池中，光源光线通过光散射池中的被测组分的雾状颗粒， 然后被光阱捕集，以防止反射。样品颗粒散射光源发出的光被光电检测器接 1 0 r；。l 北京协和医学院中国医学科学院医药生物技术研究所硕士论文 收，转换成电信号。蒸气状态的溶剂通过光路时，光线反射到检测器上成为 无漂移的稳定信号被检测作为基线记录。测量得到的光与在光散射池中样品 量成正比。 溶质粒子在蒸发光散射检测器中的散射过程取决于三种机理：瑞利散射 ( r a y l e i 曲s c a n e r i n g ) ，米氏散射( m i es c a r i n g ) 和反射一折射 ( r e f i e c t i o n r e f r a c t i o n ) 【引。究竟哪一种过程起主要作用，取决于溶质粒子颗粒的 半径( 力及入射光的波长( ) 。如果溶质的粒子较小即：，i r 2 0 ) ，米氏散射起主要作用。当溶质 粒子的半径比入射光的波长还要大时( ， ) ，则产生反射和折射。可见，在蒸 发光散射检测器中，散射光的强度与复杂的散射机制有关系。 通常情况下，当被分析物颗粒的大小处在米氏散射区域时，根据米氏理论， 散射光强度，可表示为： ，：删z 闰y l z j 式中，k 为常数，n 是散射区域中颗粒的数目，a 为入射光的波长；d 为颗 粒的直径，y 值则根据颗粒的大小从4 o 减小到2 2 【9 ，1 0 1 。 由于散射区域中颗粒数目正比于待测组分的含量，因此通过测量散射光强度 ，即可对组分进行定量分析。 当被分析物颗粒较小时即：a 2 0 ，此时在汽溶胶中散射光的强度符合 r a y l e i 曲公式： 驴等= 警( 袈) 2 ( 1 + c o s 坳 式中，r 。称为汽溶胶口散射角处的瑞利比；r 是观察者到散射源的距离( 散 射距离) ；i 。是散射角为口、散射距离为r 时的散射光强度；i o 是入射光强度； n 0 是单位体积中散射点数；v 是质点的体积，n 为散射物质的折射率，a 是入射 光的波长。由上式得： 厶= 等c o s 2 印等( 舞卜 北京协和医学院中国医学科学院医药生物技术研究所硕士论文 若令： 尼= 等( s 2 印 赚 铲后等( 矧2 厶 以t ，z 十么， 由上式可以看出，k 是与散射角及散射距离有关的常数。 从瑞利公式可以得到如下几点结论： ( a ) 散射光强度与入射光波长的4 次方成反比，即入射光波长越短，散射越强 烈。 ( b ) 散射物质的折射率越大，散射越显著。 ( c ) 散射光强度与散射粒子体积的平方成正比，散射粒子越大，测得的散射光 强度越强。 ( d ) 散射光强度与散射粒子的数目成正比。因此测定散射光的强度，就可测定 被测组分的含量。 虽然e l s d 响应与复杂的散射机制由关，但仍有些学者认为，在相当宽的范围内， 峰面积( a ) 与样品量( m ) 成下列关系： a = a m b 式中，a 、b 是与溶质特性、蒸发温度、流速等多种因素相关的系数。由上式我 们可以得到a 与m 的双对数线性关系。在进行定量分析时，需用对照品做出校 正曲线( a 与m 的对数回归) ，应用对数关系进行计算。为了得到准确的数据， 要注意保持试验条件的一致。 e l s d 通常由三部分组成，即雾化器、蒸发漂移管和光散射池。雾化器与分 析柱出口直接相连，柱洗脱液进入雾化器，并与充入的气体混合形成均匀的微小 液滴，可通过调节气体和流动相的流速来调节雾化器产生的液滴的大小。漂移管 的作用在于使气溶胶中的易挥发组分挥发，流动相中的不挥发成分经过漂移管进 入光散射池。在光散射池中，样品颗粒散射光源发出的光经检测器检测产生信号。 蒸发光散射检测器的主要构造如图3 1 所示。 北京协和医学院中国医学科学院医药生物技术研究所硕士论文 n 圆 r 一l l 讲 图3 ：a l l t e c h 蒸发光散射检测器的主要构造示意刚1 1 】 i ：雾化过程；i i ：蒸发过程；：检测过程 l 一柱洗脱液：2 一喷雾气；3 一雾化器；4 一蒸发漂移管； 5 一样品气溶胶；6 一光检测器；7 一放大器：8 一激光光源 目前，已有多种商品化的蒸发光散射检测器，如：s e d e i 也公司的s e d e x 7 5 8 0 ，a l l t e c ha s s o c i a t e s 公司的a l l t e c h2 0 0 0 3 0 0 0 ，p o l y m e rl a b o r a t o r i e s 公司的 p l e l s1 0 0 0 和w a t e r s 公司的w 乱e r s2 4 2 0 等。国内首台e l s d 检测器( u m3 0 0 0 ) 由通微( 上海) 分析技术有限公司由2 0 0 7 年研发成功并推向市场。虽然各个厂 家的设计均有自己的特点，但是他们的基本结构都大致相同，即主要由雾化器、 蒸发漂移管和光散射池三部分组成。这些商品化仪器的主要区别在于以下几点： ( a ) 光源的设计可采用光二极管也可以采用卤素灯，后者的波长范围宽但寿命 短。使用激光二极管光源的蒸发光散射检测器称为蒸发激光光散射检测器。 目前，除a l l e t c h2 0 0 0 3 0 0 0 使用6 7 0 n m 激光二极管外，其余的多使用卤素灯。 ( b ) 雾化器的设计是提高灵敏度的重要因素。雾化效率随雾化器的结构不同而 有很大的差异。一个好的雾化器应具有较高的雾化效率和产生较小的雾滴。 当雾滴进入漂移管后，则能更快的将流动相蒸发，获得更强的光散射信号。 ( c ) 检测器原件可采用光电倍增管或硅晶体光电二极管。后者的价格便宜但灵 敏度较低。若能采用雪崩式光电二极管则灵敏度与光电倍增管相当。 1 3 北京协和医学院中国医学科学院医药生物技术研究所硕士论文 蒸发光散射检测器的蒸发模式主要有两种：一种是让全部柱流出物都进入直 线型的漂移管，让流动相在其中蒸发( 图3 的蒸发模式) ，这种模式有时候 又称为无分流模式；另一种模式是让柱流出物通过一个弯管，在此管中大的 颗粒沉积下来流入废气管，其余的小颗粒进入螺旋状的蒸发管，此种模式又 称为分流模式( 图4 中的蒸发模式 jo 】) 。前一种的e l s d 把所有的气溶胶都 转移到漂移管中，为了有利于蒸发，漂移管常常需要较高的操作温度，因此 它适合于检测不易挥发的样品，可使用流速为1 0 m l m i n 或更低流速的挥发 性流动相进行分析。后一种类型的e l s d 将大颗粒气溶胶撞在弯曲管壁上除 去，使气溶胶粒度分布变窄，在较低的温度下易于蒸发，适合于检测半挥发 性样品，以流速为1 5 m l m i n ( 或更高流速) 的高含水流动相进行分析。 疆l 图4 ：采用螺旋盘管的蒸发光散射检测器的主要构造示意图f l o 】 i ：雾化过程；i i ：蒸发过程；：检测过程 l 一柱洗脱液；2 一喷雾气；3 一雾化气；4 一蒸发漂移管；5 一样品气溶胶； 6 一光检测器；7 一放大器；8 一激光光源；9 一雾化管；1 0 一废气排出 蒸发光散射检测器自问世以来深受重视，技术上不断改进。有的商品化检测 器的设计是流动相雾化后，先进入雾化室分流，以减少进入蒸发管的流动相的量 ( 如s e d e x 的产品) 。有的检测器是采用雾化室后接撞击器，利用撞击器的开 与关来控制流动相的分流与不分流模式( 如a l l t e c h 的产品) 。而另一些厂家采用 的是雾化室自然冷凝方式来进行流动相的分流( 如w 乱e r s 的产品) 。采用流动相 1 4 北京协和医学院中国医学科学院医药生物技术研究所硕士论文 的分流技术可以除去大部分高含水量流动相，以降低基线噪音，并能检测半挥发 性化合物。各商品化检测器均采用与液相色谱一质谱、原子吸收和等离子体发射 光谱相同的分流喷雾口设计，无样品歧视，且雾滴颗粒均匀，可以同时提高检测 灵敏度和降低操作温度( 水相流动相一般设定蒸发温度为4 0 ，油相为3 5 ) 。 在各种流动相条件下，对半挥发性化合物和不挥发性化合物均能得到良好结果， 表l 及表2 【1 1 】给出了本论文实验中采用的两种e l s d ( s e d e x7 5 和a l l t e c h 3 0 0 0 ) 的特性参数。 北京协和医学院中国医学科学院医药生物技术研究所硕士论文 表1 ：s e d e x7 5 型蒸发光散射检测器的物理特性参数【1 2 j s e d e x7 5 检测元件高灵敏度光电倍增管 光源高能量全波长卤素灯 检测限 l0 0 p g ( e t h o x y l a t e da l c o h o ic 1 2 e 0 8 ，m i c r o - h p l c ) 曲型定量检测量 o 5 5 烬 灵敏度1 1 2 档增益设定，在相同的增益时，s e d e x7 5 的灵敏度两倍于s e d e x 5 5 蒸发温度室温8 0 ，调节精度为l 流动相流量 o 1 m l m i l l 5 m l m i n ( 标准h p l c ) ，1 0 1 5 皿m i l l ( 快速h p l c ) 气体要求大于5 l m h l 的氮气或空气，2 4 5 b a r 气体消耗量 3 l m i n 基线噪音 水相低于1 m v h ，非水相低于3 m v h ( g a i n 值设定为8 时) s f c 接口可选 信号输出 0 1 0 m v ，0 l v 时间常数功能标准配置 通讯接口 r s 2 3 2 软件控制可选 零点控制手动和自动 操作参数显示内置微处理器，可通过面板控制，l c d 显示 安全保护全内置，无需额外辅助保护 检测样品范围同时检测半挥发性和不挥发性化合物 易用性参数少，简单 载气流速调节无需调节，以最优设计 蒸发温度设定两种基本设定，可满足绝大多数要求 维护 自动清洗功能，无需手动拆卸清洗，外置透明，方便操作 1 6 北京协和医学院中国医学科学院医药生物技术研究所硕士论文 表2 ：a l l t e c h3 0 0 0 型蒸发光散射检测器的物理特性参数【l l 】 a l l t e c h3 0 0 0 操作模式分流或不分流双模式，根据使用时不同需要自由选择；对于相对低沸点 物质选择分流模式，可降低漂移管温度，减少样品挥发，进而提高灵敏 度。对于相对高沸点物质选择不分流模式，使得样品经过色谱柱后，完 全进入检测元件中，进而达到最高灵敏度 光源激光二极管，带有光校正系统 检测限 使用标准柱，信噪比为5 时，以苯甲酸计1 0 n g 使用窄径柱，信噪比为5 时，比苯甲酸计o 5 n g 使用微径柱，信噪比为5 时，比苯甲酸计o 1 n g 温度范围雾化器、漂移管、检测池及排出口四区域分别独立控温，保持了喷雾口 与排出口的温差恒定，漂移管温度范围为室温1 2 0 ，内置温度补偿 系统使温度控制更精确 雾化气体 0 5 l m i i l ，可调节，内置式数字型流量计控制，不受压力变化影响 喷雾压力 0 8 0 p s i ，可调节 s f c 接口有 自动调零 有 气体开关控制自动 出错修正系统p c 机智能控制并修正气体流量、气体压力、溶剂压力及温度 安全功能自动报警 雾化温度控制分流或不分流全程恒温控制 漂移管构造全部优质不锈钢结构( 不含易碎玻璃及易腐蚀元件) 操作参数的选择仪器自身可储存1 0 种方法，仪器初始化迅速可靠。l c d 显示，通过面 与显示板控制 模拟输出0 l v 或0 1 0 m v 双选择，5 档衰减，可调 检测样品范围可检测半挥发性和不挥发性化合物 电源两种基本设定，可满足绝大多数要求 维护漂移管污染后需要手动拆卸进行清洗 1 7 北京协和医学院中国医学科学院医药生物技术研究所硕士论文 二蒸发光散射检测器的优缺点 蒸发光散射检测器作为新一代质量型通用型检测器，与其他常用检测器相 比具有以下显著优点： ( a ) 通用型强。蒸发光散射检测器解决了h p l c 检测中不具有紫外一可见光吸 收组分的检测问题。这是由于蒸发光散射检测器的检测不依赖于样品的化学 性质，不论化合物是否存在紫外、荧光或电活性基团，任何挥发性低于流动 相的样品在蒸发光散射检测器上都可以产生响应，不受其官能团的影响。这 对于氨基糖苷类抗生素来说，开创了用h p l c e l s d 测定氨基糖苷类抗生 素组分和有关物质( 小组分) 的新局面1 1 引。 ( b ) 灵敏度高于示差折光检测器。由于示差折光检测器更容易受溶剂的影响， 而且容易出现负峰，对于示差折光检测器难以测定的组分，若采用e l s d 来 检测，不仅有足够的灵敏度，而且排除了流动相的干扰。 ( c ) 可进行梯度洗脱。蒸发光散射检测器不仅消除了溶剂峰的干扰，而且可以 进行梯度洗脱。这是因为样品达到光散射池时剩下的仅是组分微小颗粒，流 动相早已在蒸发器中被蒸发汽化了。所以被测成分在被检测时不会受到溶剂 的干扰。 ( d ) 响应因子具有一致性。蒸发光散射检测器是质量型通用型检测器，被测物 在e l s d 上的响应值仅取决于光束中溶质颗粒的大小和数目，与其化学结构 关系不大，检测器对所有物质几乎具有相同的响应因子。这一特征较经典的 紫外检测有较大的优势，更能真实地反映样品的组成情况。在药品的杂质研 究过程中，由于不同组分和杂质在e l s d 上的响应因子具有一致性，所以 e l s d 在这方面具有独特的优势。用紫外检测器来对药品进行杂质检测时， 需要相应的杂质标准物质，或者至少知道杂质成分相对于主成分的相对响应 因子，在实际测定过程中采用主成分自身对照加响应因子校正的方法来对样 品中的杂质进行定量测定。而蒸发光散射检测器可以对杂质直接进行分析， 色谱图可精确地描绘出各组分的含量。表3 显示了5 种氨基糖苷类抗生素在 蒸发光散射检测器上响应因子的比较1 1 4 】。 1 8 北京协和医学院中国医学科学院医药生物技术研究所硕士论文 表3 ：5 种氨基糖苷类抗生素在e l s d 上的响应因子比较 化合物e l s d 响应因子 阿米卡星( 锄i k a c i n ) 西索米星( s i s o m i c i l l ) 奈替米星( n e t i l m i c i n ) 依替米星( e t i i n i c i l l ) 威替米星( v e n i l i t l i c i l l ) 1 4 6 1 5 l 1 5 2 1 4 6 1 4 6 由表3 可以看出，5 种氨基糖苷类抗生素在蒸发光散射检测器上的响应因子 基本一致，使蒸发光散射检测器成为解决无紫外吸收物质分析难题的强有力途径 之一。 ( e ) 对流动相系统温度变化不敏感。示差折光检测器受温度影响很大，流动相 温度稍有变化，折射率变化很大，会引起基线不稳定。因此在检测的过程种 必须严格控制温度。而蒸发光散射检测器不受流动相温度变化的影响，消除 了流动相温度波动产生的误差。 ( f ) 可消除流动相和杂质的干扰，提高了色谱的分辨率。如紫外检测器，在较 低的紫外吸收波长下检测样品时，可能有溶剂吸收干扰；样品中有的杂质含 量很小，但紫外吸收系数可能很大，而主成分含量虽高但吸收系数小，在这 种情况下，杂质峰的峰面积比主峰还大，甚至干扰组分的检测。相比较来说， 蒸发光散射检测由于流动相及其中的挥发盐已事先除去，故基线平直。 ( g ) 便于应用质谱分析。由于蒸发光散射检测器的色谱条件与质谱条件的要求 是基本一致的，流动相均在样品检测前挥发除去。所以使用h p l c e l s d 可 以为l c m s 摸索色谱条件，节省相对昂贵的l c m s 系统的操作成本，可作 为低成本的质谱检测方法的开发工具。 与其它检测器相比较，蒸发光散射检测也有以下不足之处： ( a ) e l s d 的一个限制因素是受样品组分和流动相的挥发性的影响。样品组分 应是非挥发性或半挥发性的，而流动相应是易挥发的溶剂。若样品组分为挥 发性的，将会与溶剂一同蒸发，导致无法检测或响应极弱。常用的溶剂和有 机改性剂有：反相色谱系统常用的甲醇、乙腈和水；正色谱系统常用的氯仿、 1 9 北京协和医学院中国医学科学院医药生物技术研究所硕士论文 二氯甲烷、乙醚和正己烷等。一些非挥发的缓冲盐的应用受到了限制。而绝 大多数离子型化合物的检测都需要用缓冲盐溶液作为流动相。所以流动相中 如含缓冲盐溶液，该缓冲盐溶液必须具有挥发性。缓冲盐溶液的挥发性、纯 度等将直接影响e l s d 检测器的基线水平和噪声大小，因此缓冲溶液浓度应 尽可能低一些。通常可选用的缓冲盐溶液有：甲酸一甲酸盐、乙酸一乙酸盐、 三氟醋酸、五氟丙酸和磷酸氢二铵等。 ( b ) 与紫外、荧光和电化学检测器相比，蒸发光散射检测器的灵敏度不够理想。 其检测限多在纳克( n g ) 级别( 其检测氨基糖苷类抗生素的检测限在几十到 几百纳克之间) ，不能够很好的解决痕量物质的检测难题，需要进一步改进。 ( c ) 对于某些样品，蒸发光散射检测器线性范围窄，而且样品量与峰面积之间 不成线性关系，为指数关系。对峰面积和浓度需要取对数后转成线性关系才 可进行定量计算，定量分析过程比较复杂。 ( d ) 有些品牌的蒸发光散射检测器的载气流速对峰面积的重现性影响特别大， 测定的时候需要精确控制载气流量，可将峰面积的日内重现性的r s d 控制 在3 以下。 ( e ) 有些品牌的蒸发光散射检测器如果长时间使用较高的蒸发管( 漂移管) 温 度，会使被测成分在蒸发管中吸附和沉积，从而导致基础噪音过高和基线漂 移。此时需要将漂移管从检测器上拆卸下来手动清洗，维护比较费事。 三影响蒸发光散射检测的基本因素 影响蒸发光散射检测器检测性能的基本因素主要包括以下四个方面，即雾 化载气的流速、流动相的流速、漂移管的温度及流动相的组成成分和浓度。 1 雾化载气的流速 雾化载气的流速影响雾化器中液滴的形成，从而影响检测器的响应。一般 来讲，载气流速越小，形成的物质粒子越大，对光的散射能力越强。但是并不是 雾化载气的流速越小越好，因为当载气流速太小时，流动相挥发不完全，背景噪 声也会相应的增加，信噪比会显著的降低。最佳雾化载气流速