（基础兽医学专业论文）应用嗜热脂肪芽胞杆菌检测原料奶中抗生素残留的研究.pdf

河南农业大学学位论文独创性声明、使用授权及知识产权归属承诺书 学位论 文题目 应用嗜热脂肪芽胞杆菌检测原料奶中抗 生素残留的研究 学位 级别 导师 姓名 硕士 学生 姓名 学位论文 是否保密 李梅芝 i 喜翌l 基础兽医学李文献 否 i如需保密，解密时间年月日 独创性声明 本人呈交论文是在导师指导下进行的研究工作及取得研究成果，除了文中 特别加以标注和致谢的地方外，文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成 果，也不包括为获得河南农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材 料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献 均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 特此声明。l 研究生签名：夸袖篁导师签名：芍交蠢火 日期：如。苫年月以日日期：2 矽8 年6 月3 弓 日 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 本人完全了解河南农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按 照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷本 和电子版本，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手 段保存、汇编学位论文。本人同意河南农业大学可以用不同方式在不同媒体上发 表、传播学位论文的全部或部分内容。 本人完全了解河南农业大学知识产权保护办法的有关规定，在毕业离开 河南农业大学后，就在校期间从事的科研工作发表的所有论文，第一署名单位为 河南农业大学，试验材料、原始数据、 所有，否则，承担相应的法律责任。 申报的专利等知识产权均归河南农业大学 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书。 研究生签名：杏嚆蔓导师签名：苏垄人学院领导签名： 日期咖爷6 月哆r 同期：暑年多月2 乡同 同期：砷0 8 年石 致谢 本研究是在导师李文献研究员的悉心指导下完成的。导师在论文 的选题、试验方案、试验设计等过程中，无不倾注了大量的心血和智 慧。三年来，导师在学习、工作和生活上无微不至的关怀，让我终生 难忘；导师渊博的知识，丰富的经历，严谨的治学态度，高屋建瓴的 科学思维和勇于开拓及敬业精神使我受益匪浅。在论文付梓之际，谨 向恩师致以最崇高的敬意和衷心的感谢! 衷心感谢河南三鹿花花牛乳业有限公司研发部王少武经理以第 二导师的身份给与的无微不至的指导和关怀! 衷心感谢河南三鹿花花牛乳业有限公司研发部杨起恒副经理、李 红工程师在论文进程过程中给与的帮助与指导! 衷心感谢河南三鹿花花牛乳业有限公司研发部的李永军、周霞、 马伟华提出宝贵的建议。 非常感谢河南农业大学王星所教授对试验的支持和帮助。 非常感谢河南农业大学梁鸿德教授、河南轻工业学院张中义教 授、郑州牧业工程高等专科学校刘太宇教授对论文的审阅、批评指正! 特别感谢师妹刘燕的热情帮助，感谢同级研究生刘大波、师妹武 波波等的帮助，使我的试验得以；l l 顷n 完成。 另外研究生处及牧医工程学院的各位领导、老师三年来对我学习 和生活给予的关怀，在此一同深表谢意! 最后，特别感谢我的家人的理解和支持，他们的支持和鼓励，使 我得以专心地学习，也是我成长和进步的动力! 谨以此文献给所有关心和爱护我的老师、同学、朋友和家人! 河南农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 摘要 摘要 本文主要应用包埋的嗜热脂肪芽胞杆菌芽胞检测牛奶中的抗生素残留，对营养物质、指 示剂添加量、包埋条件以及检测条件等指标进行了研究，以提高此方法的灵敏度与稳定性。 然后通过与小样发酵法、国标t ic 法、试剂盒( e c l i p s e 5 0 ) 法、试纸条法四种方法作对 照，统计阳性率，进一步确认本研究方法的可行性与灵敏度。 本试验研究主要包括以下几个方面的内容： ( 一) 首先将从普通微生物菌种保藏中心购买的试验菌( a t c c l 2 9 8 0 = n c t c l 0 3 3 9 ) 进行复 壮、优化，在胰蛋白胨大豆琼脂培养基上培养，让其在6 5 、p r i 值7 2 条件下生长，挑选 生长比较快速的菌落。但嗜热脂肪芽胞杆菌只形成针头大小的菌落，为革兰氏阳性菌。 ( 二) 嗜热脂肪芽胞杆菌芽胞的制备。本试验，芽胞悬浮液中的营养菌体可选择两种方 法除去，一是用溶菌酶法，二是加热离心法。通过两种方法的对比，并且考虑到成本因素， 本文选择加热离心法。斜面菌种培养后，用生理盐水洗下菌苔，振荡，过滤，制成一定浓度 的悬浮液进行加热离心制备芽胞。悬浮液7 0 加热1 0m i n 在有效除去营养菌体碎片的情况 下比更高温度、加热更长时间下存活的芽胞数量多，效果最好。 ( 三) 嗜热脂肪芽胞杆菌芽胞包埋：通过对比卡拉胶、结冷胶、瓜尔胶和海藻酸钙四种 包埋剂的凝胶强度、扩散性以及操作的简易程度，选择海藻酸钙作为嗜热脂肪芽胞杆菌芽胞 的包埋剂。 ( 四) 营养要求的研究，利用正交试验选择的最优营养液配方是：葡萄糖的添加量为l ， 蛋白胨为1 。营养液的p h 值控制在7 2 左右，1 6 的指示剂的添加量为每1 0 0 n l l 营养液加入 o 0 6 m l ( 五) 确定检测条件：处理好的牛奶样品检测时，每个检测小管内添加0 2m l 紫色营养液， 再加入牛奶样品0 1m _ l 。在6 5 水浴培养1 5 0r a i n 。取检样2 0 0 份，检测时间为1 3 5m i n ，其中 1 7 3 份为阴性，2 7 份为阳性，没有可疑样品，阳性率为1 3 5 ，本研究方法具有可行性。 ( 六) 稳定性试验：将制备好的检测小管在4 c 保存l 周、2 周、3 周以及4 周，记录其阴性 检测时间分别为前三周都是1 3 5m i n ，第四周检测时间开始增加为1 5 0r a i n ，但也在检测时间 范围内，所以本方法的检测稳定性为一个月。 ( 七) 与小样发酵法、国标( 1 陀) 法、试剂盒法及试纸条法对照试验：制备相同检样 各4 0 份，分别采取小样发酵法、1 t c 法( 国标g b 5 4 0 9 8 5 ) 、试剂盒法( e c l i p s e 5 0 ) 和 试纸条法( 青霉素类) 与本方法进行对照检测其灵敏度。阳性率分别为小样发酵法2 2 5 ， t y c 法2 5 ，本方法2 3 7 5 ，试剂盒法2 6 2 5 ，试纸条法3 2 5 本研究方法的灵敏度介于小样发酵与试剂盒法之间，灵敏度具有可靠性。小样发酵法的 灵敏度较低，国标t r c 法可疑样品份数较多且操作比较复杂，菌液浓度难以控制。试剂盒法 和试纸条法操作都比较简单，其中试纸条法时间比较短，但它们经过商品化，成本较高，适 河南农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文摘要 合予研究试验室应用，不便于在一般的养殖场和收奶站中推广使用。 本课题目的在于根据现有的检测方法对嗜热脂肪芽胞杆菌检测牛奶中抗生素残留的方 法加以改进及创新，建立一种简单、快速、灵敏度高、能够普遍推广应用的抗生素残留检测 方法。该检测方法通过与其他方法作对照，在检测时问和灵敏度方面都能达到要求，而且成 本大大降低，所以本研究方法具有可行性。 关键词：嗜热脂肪芽胞杆菌芽胞抗生素原料奶包埋微胶囊 2 河南农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 文献综述 1文献综述 1 1 原料奶中抗生素残留的种类及体内代谢途径 1 1 1 原料奶中抗生素残留的种类 抗生素是一类由微生物和其他的生物在生命活动过程中合成的代谢产物或其衍生物，其 在很低的浓度时就能够抑制或干扰病原菌、病毒等的生命活动。抗生素是一个传统的定义， 现在临床应用的抗菌药物还包括呋喃类、磺胺类等几类合成药物，鉴于其种类少，用量也不 及抗生素多，现仍沿用这一名剖。抗生素的种类很多，抑菌谱和作用机制也有很大的差异。 现在应用于国内医学临床上的约有6 0 余种，其中常用的约3 0 余种。在国内兽医临床上应用 的相对少些，但相当一部分的抗生素，如b 内酰胺类( 包括青霉素类和头孢菌素类等) 作 为饲料药物添加剂使用。除呋喃类外还有以下几类抗生素。 1 i 1 1 青霉素类( 包括天然青霉素和半合成青霉素) 天然青霉素主要有青霉素g 和青霉素的钾盐、钠盐、普鲁卡因及苄氨青霉素等。其主 要通过抑制细菌细胞壁的合成而达到抗菌目的。 i i 1 2 头孢菌素类 头孢菌素类抗生素为一类半合成广谱抗生素，包括头孢噻吩钠( 先锋i ) 、头孢氨苄( 先 锋) 等。临床上多数来治疗泌尿道、呼吸道等感染。 i 1 1 3 氨基糖苷类( 包括链霉素、庆大霉素、l 4 j i i 霉素、新霉素等) 氨基糖苷类药物主要抑制细菌蛋白质的合成，对葡萄球菌需氧革兰氏阴性杆菌及结核杆 菌均有抗菌活性，动物肌注后大部分以原形经肾脏排出。链霉素与青霉素配合使用，可用于 治疗乳牛呼吸道系统疾病、腹膜炎以及结核病等，也有用来治疗乳房炎。 1 1 1 4 四环素类 四环素类是一类碱性广谱抗生素，包括四环素、土霉素、金霉素、强力霉素等，被广泛 用作饲料添加剂来防治动物疾病和提高饲料利用率。 i 1 1 5 氯霉素类 乳牛注射氯霉素后，虽然吸收很快，但其可广泛地分布于细胞内外液中，因此乳汁中也 有。由于氯霉素具有导致人再生障碍性贫血的副作用，我国农业部已禁止使用该药，但现在 还不能排除残留的可能性。 1 1 i 6 大环内酯类 大环内酯类是一类弱碱性抗生素，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、支原体、衣原体有 很好的抑制作用，包括红霉素、替米考星等。 1 1 1 7 磺胺类 磺胺类药物是一类化学合成抗菌药，具有抗菌谱广、疗效确实、价格低廉等优点，是治 疗乳牛疾病和作饲料添加剂的常用药物之一，包括磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶和磺胺甲基异恶 唑等。 3 河南农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文文献综述 1 1 2 青霉素类抗生素体内代谢途径 青霉素类抗生素在兽医临床上常用来抑制引发乳房炎的病原体。青霉素g 的吸收、消 除速度受青霉素剂型的影响。青霉素g 和不同的无机离子和有机离子形成不同青霉素g 盐 类，无机离子包括钠离子、钾离子、和钙离子，有机离子包括普鲁卡因和苄氨基。这些盐具 有不同的溶解性，因此它们的持续作用时间也不同。青霉素g 的吸收、消除速度更多地和 给药途径有关，当肌内和皮下注射时，药物缓慢地进入到血液中，但维持血液浓度的时间比 静脉注射的时间长。使用不溶性的普鲁卡因盐可以进一步放慢青霉素g 从注射部分的吸收。 当等量的青霉素g 和普鲁卡因青霉素g 分别注射用药后，青霉素g 在2h 后达到药峰浓度， 8h 后从血液中消除。而普鲁卡因青霉素g 在注射后5h 达到药峰浓度2 4h 才从血液中消 除。青霉素g 快速被吸收到血液后，部分和血液蛋白结合。青霉素0 注射用药后的最初时 间内，除了肝脏和肾脏外，血药浓度比组织和牛奶中的浓度高，随后快速地从血液中消除， 组织和牛奶中的浓度变高。青霉g 通过肾脏快速地从血液中消除，依据的是母体的结构特 征，最后青霉g 几乎会全部排泄到尿液中【2 】。 1 2 原料奶中抗生素残留的来源及其危害 1 2 1 原料奶中抗生素残留的来源 自1 9 3 5 年d o m a g k 发明磺胺类药物、c l i a i n ( 1 9 4 0 年) 等证实青霉素可以作为一种有效的 化学治疗剂以来，抗菌药物的研究与应用发展迅速，随后进入“抗生素时代”。抗生素在兽 医临床上治疗呼吸系统、消化系统、生殖系统等感染，大部分可用作饲料药物添加剂。抗微 生物药物被用于防止细菌的感染或用于预防疾病的传播，对饲料工业和畜牧业的发展做出了 不可磨灭的贡献。但随着饲用抗生素的普及，其副作用也逐渐突出。 由于我国乳品工业尚处于初级阶段，以及一些人为因素，导致乳中抗生素残留较严重。 而造成牛奶中抗生素残留严重超标的原因主要有以下几个方面： 1 2 1 1 防治乳牛疾病使用的内服或外用抗生素类药在牛体内的残留 当今，世界上治疗乳牛乳腺炎、子宫内膜炎、呼吸道系统等疾病均使用抗生素。另外， 治疗乳牛腹膜炎、创伤性网胃炎、感冒、慢性和继发性胸膜炎，以及产后疾病和腐蹄病等也 常用到抗生素。在治疗时往往使用乳房灌注、肌注、静脉注射等给药方式，剂量也很高。药 物经体内代谢，多数抗生素可经乳汁排泄，这样就增加了乳中抗生素残留的可能性。乳房炎 是奶牛的常见病，治疗乳牛乳房炎是造成原料乳中抗生素残留甚至超标的主要原因。乳房炎 是危害乳牛的最主要的疾病之一，轻者，使产乳量下降；重者，使乳腺失去泌乳能力，被淘 汰或引起死亡，其发生常与微生物感染有密切的关系。目前报道过的病原菌多达8 0 余种，主 要是细菌感染。据报道，在美国，1 1 0 0 万头泌乳乳牛中约有5 0 患有乳房炎【3 j ，日本平均乳 房炎患病率为4 5 1 ，我国乳牛乳房炎患病率还要高一些。因此，抗生素作为治疗药物在乳 牛乳房炎的控制中起了重要作用，但同时也大大增加了原料乳中抗生素残留的机会。在我国 治疗此病的常规方法是采用抗生素直接注入患病乳牛乳房的方法，从而造成抗生素在牛原料 4 河南农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文文献综述 乳中残留。由于长期大量使用抗生素，使耐药菌株增加，一些乳房炎病例变得难以用常规方 法治愈，这又促使临诊兽医在治疗过程中加大抗生素的用量。按照国家有关规定，这样的奶 牛一般应该在停药5d 后，才能将它的牛奶加工成乳制品。但有些人为了经济利益，把有抗 生素残留的牛奶卖给了加工企业【4 】。 1 2 1 2 不按卫生规范和程序操作引起抗生素残留 乳牛的排泄物中若含有抗生素，就难免污染乳房，牛奶在加工过程中，不按卫生规范和 程序操作、生产企业滥用某些药物添加剂、不按操作规范和程序饲喂和挤奶或挤乳时不及时 清洗，就易污染正常乳。调查表明，用经抗生素治疗的乳牛用过的挤乳机器给正常乳牛挤乳， 可使正常牛的乳中残留抗生素。可见，挤乳是原料乳中抗生素残留的又一来源。 1 2 i 3 饲料添加剂造成的残留 大部分的抗生素能作为饲用添加剂应用于动物饲料中，迄今已有5 0 多年的历史。人们一 直以低于治疗量的抗生素来促进动物生长、预防疾病、提高动物生长水平以及提高饲料转化 率。应该说这些抗生素的使用在一定时期对饲料工业及畜牧业做出了巨大贡献。随着科学技 术的发展和生活水平的提高，人们逐渐认识到抗生素会在畜产品中残留以及产生抗药性等负 面作用，从而对饲用抗生素添加剂的安全提出了质疑。个别养殖户甚至饲料生产商家为了经 济利益滥用国家禁止使用的药物等。这样乳中抗生素残留量偏高便成了必然。 1 2 1 4 人为添加抗生素 某些地区或某些不法交乳户为防止牛乳的酸败而人为添加抗生素等等均能引起抗生素 残留。其中在牛饲料中添加饲料添加剂已十分普遍，添加剂中含有一定比例的抗生素，其主 要作用是预防疾病，这是原料奶抗生素残留的重要原因。这种情况很少，但危害很大。按国 际上最高限量单位换算，一个治疗剂量的抗生素( 青霉素) 足以污染2 0 0t 原料奶。因此， 这一环节也很重要。 美国食品与药物管理局( f d a ) 对兽药残留的调查表明，造成兽药残留原因所占比例为： 未遵守休药期的占7 6 ：饲料加工或运输错误的占1 2 ；盛过药物的贮藏器没有充分清洗 干狰的占6 ；使用未经批准的药物占6 。美国兽药中心( ( = v m ) 的调查结果为：不遵守 休药期的占5 1 ；使用未经批准的药物占1 7 ：未作用药记录的占1 2 。 1 2 1 5 不遵守休药期的规定 休药期是指畜禽停止给药到许可屠宰或它们的产品( 乳、蛋) 许可上市的问隔时间。凡 经食品动物应用的药物或其它化学物质，均需规定休药期。休药期的规定不仅可以维护动物 健康，而且能够减少或避免供人食用的动物组织或产品中残留药物超量。许多农户受经济利 益驱使，对泌乳期的奶牛用药，并且不遵守休药期的规定使牛原料奶中青霉素的残留量超过 标准规定。 1 2 2 原料奶中抗生素残留的危害 原料奶抗生素残留可能会导致各种不良的反应，对抗生素类药物的敏感性f 降，增加病 5 河南农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 文献综述 原菌对药物的耐药性，在发酵类乳制品加工中阻止发酵的发生【5 。6 1 等，抗生素残留亦与原料 奶的高体细胞相关p 1 。 乳中抗生素十分稳定，基本不受温度的影响，不能通过常压下的物理方法进行破坏和分 解。目前原料奶及其制品消毒加工处理工艺还不能有效除去残留的抗生素【8 】。因此正常的 加工操作会使抗生素残留于乳制品中。原料奶中若含有抗生素，对长期饮用者来说无疑是等 于长期服用小剂量的抗生素，由于抗生素对人体健康存在潜在的威胁，乳和乳制品中抗生素 残留问题逐渐成为公众关注的焦点。随着经济的发展，生活水平的提高，人们逐渐认识到了 乳中抗生素的潜在危害主要有以下几个方面： 1 2 2 1 产生过敏反应 许多抗生素如青霉素、四环素、磺胺类药物及某些氨基糖苷类抗生素等均具有抗原性， 能使部分易感人群发生过敏反应。轻者表现为荨麻疹、发热、关节肿痛及蜂窝组织炎等，严 重时可出现喉头水肿、呼吸困难、过敏性休克，甚至危及生命。 1 2 2 2 引起细菌耐药性 日本、美国、德国、法国和比利时学者研究证明，在乳、肉和动物脏器中都存在耐药 菌株。耐药基因的转移是在人的体内进行的，并且可在人群中细菌、动物群中细菌和生态系 统中细菌闻互相传递，特别是金黄葡萄球菌和肠杆菌科的细菌极易产生耐药性，当人体发生 疾病时，往往由于耐药性菌株的存在而使治疗失败及因用药无效而使病情恶化，可增加人类 和动物感染性疾病治疗的难度甚至导致治疗失败。至今为止，具有耐药性的微生物通过动物 性食品转移到人体内并对人体健康产生危害的问题尚未得到解决。 1 2 2 3 造成环境平衡紊乱或菌群失调 在正常条件下，健康人与动物的胃肠道内寄生着大量菌群，这些菌群与人体能相互适应， 例如某些菌群能抑制其他菌群的过度繁殖，但抗生素残留会使这种菌群平衡发生紊乱，造成 一些非致病菌死亡，例如一些菌群能合成b 族维生素和维生素k 以供机体使用，但抗生素 能杀死这些非致病菌，这样使菌群的平衡失调。致病菌大量生长繁殖，释放毒素，引起二重 感染或内源性继发感染阴。 1 2 2 4 其它毒害作用 影响奶制品生产；奶酪、酸奶和黄油等都是人们】b 常生活中重要的营养品和保健品，它 们在保持人体肠道有益菌群平衡，保证人体肠胃功能方面起着重要的作用。奶酪、酸奶和黄 油的生产都是以牛奶作为原材料。如果牛奶中含有青霉素、链霉素等抗生素，则乳酸杆菌的 生长、繁殖将会受到抑制，可严重影响奶酪、酸奶、黄油的发酵和后期风味的形成【1 0 , 1 1 l 。 污染环境：抗生素残留对环境的污染程度取决于抗生素对环境的释放量及其在环境中降 解的速率。将含有抗生素残留的废弃物随意放置、丢弃，将对周围环境构成潜在威胁，如破 坏士壤和水中的微生物平衡、造成环境的污染。另外动物用药以后，药物以原形或代谢物的 形式随粪、尿等排泄物排出，残留于环境中。进入环境中的残留兽药，在多种环境因子的作 6 河南农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文文献综述 用下，可在植物中富集，然后进入食物链进而损害人体健康，这是一个非常值得关注的问题。 还有链霉素可引起肾损害和听神经受损：四环素引起肝损害，其与骨骼、牙齿中的钙 质结合，产生骨及牙齿黄染，还可影响儿童的生长发育；氯霉素残留对人会造成致命的后果， 引起再生障碍性贫血、粒状白细胞缺乏症、血小板减少症、肝损伤、视神经炎及幼儿次色综 合症等。 1 3 各个地区政府管理组织 1 3 1 世界卫生组织( w 啪) 及粮农组织( f a 0 ) 联合国粮农组织( f a o ) 及世界卫生健康组织( w h o ) 的食品法对食品中的抗生素最 大残留量都有明确的规定，早在1 9 6 9 年就提出。应对各种动物性食品中的抗生素残留提出允 许标准，并建议在乳牛中接受抗生素治疗停药后至少3d ( 最好5 7d ) 内的乳汁不能作为食 用乳的原料。世界卫生组织推荐的青霉素g 在牛奶中的限量为0 0 0 4g g m l 。 由于不可能保证氯霉素残留对人体的安全性，联合国粮农组织( f ：a o ) 和世界卫生组织 ( w h o ) 食品添加剂委员会( j e c f a ) 第3 8 届会议上，建议禁止使用氯霉素特别是禁止用 在产蛋和产奶动物上，因为在蛋和奶中高含量残留会导致不安全性。 1 3 2 发达国家对兽药使用的立法和组织管理 欧盟( e c ) 及美国食品和药品管理局( f d a ) 等也有更为严格而广泛的具体规定。较 发达国家在乳牛病健分群及抗生素在奶牛中残留时间控制方面能依法规范管理，并且建立了 严格的动物性食品中抗生素残留允许标准【1 2 1 。美国食品和药品管理局( f d a ) 规定每毫升 牛乳中的抗生素含量不得超过0 0 0 6i u m l ，使用抗生素的牛乳在9 6h 内应废弃。还规定氯霉 素在兽医上，仅能用于非食品动物，而不能用于食品动物。 1 3 3 我国的管理现状 我国还未将牛原料奶及其制品中抗生素残留纳入常规检测，作为必检项目。为了保障人 民身体健康，增强国内乳制品业的国际竞争力，必须将抗生素的检测纳入议事日程。同时要 进行抗生素检测方法的筛选工作，要研究发展一些简单、快速、经济、基层易推广的检测多 种抗生素残留的分析技术。过去，我国对牛奶中抗生素残留卫生指标一直没有明文规定， 1 9 9 0 年1 1 月颁布的乳与乳制品管理办法第4 条明确规定，乳牛在应用抗生素期间和停药后5d 内的乳汁不得供食用。2 0 0 1 年1 0 月，农业部发布实施了无公害食品生鲜牛乳行业标准，对 新鲜牛乳的卫生指标明确了“抗生素不得检出”。但对这一行业标准，我国目前并未能严格 执行，致使我国牛原料奶及奶制品中抗生素残留问题一直未能得到解决，以至引起了人们对 牛奶安全问题的担忧，并成为越来越受关注的热点。 1 4 原料奶中抗生素残留的现状 食品安全问题也随着食品工业化的发展变得越来越严峻，引起了世界各国政府、国际 组织、食品企业和消费者的广泛关注，也将成为液态奶生产、销售的重要影响因素之一。产 品安全质量问题也已成为一个企业能否健康、持续发展的关键影响冈素之一，它最终也将成 7 河南农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文文献综述 为影响乳业这个产业健康发展的重要因素之一。 我国的原料奶及奶制品中抗生素残留问题也一直未得到解决，以至引起了人们对牛奶安 全问题的担忧。1 9 8 8 年周树副”l 采用1 】魁去调查了江苏省8 个市1 0 个牧场生奶、消毒牛奶和 奶粉中抗生素残留情况，生奶阳性率3 。6 ，消毒牛奶1 1 。4 ，奶粉3 9 5 8 。1 9 9 1 年，李权超 【1 4 】用”r c 法测长春市鲜牛奶中抗生素残留情况，结果阳性率3 3 ，可疑率1 8 3 。此外，王 春奕等1 1 5 谰圆盘法对西宁市消毒鲜牛奶中抗生素残留调查。试验结果表明检测的5 批2 5 份市 售消毒鲜牛奶中抗生素残留质量分数在1 5 1 0 9 以上。1 9 9 9 年，胡松华f 1 6 】等在杭州市某一牛 奶收购站随机取1 2 个奶牛场的桶奶奶样进行分析，l 份奶样残留抗生素，阳性率8 3 3 。许明 贞【8 l 等监测市内7 个乳牛场及1 个收奶站的4 0 份生牛奶，阳性2 4 份，阳性率6 0 。监测市售奶 粉4 l 份，其中一般奶粉1 8 份。婴幼儿奶粉2 3 份，阳性份数分别为7 与l o ，阳性率分别为3 9 和 4 3 ：监测消毒牛奶5 3 份，阳性1 1 份，阳性率为2 1 。 丁洁等在2 0 0 3 年对南京市牛奶中抗生素残留进行了调查，发现消毒牛奶、奶粉、婴幼儿 奶粉和生牛奶的阳性率分别1 3 3 、3 7 8 、3 4 4 、3 2 ；广州市卫生防疫站对广州市牛 奶中抗生素残留进行监测，结果如下：消毒牛奶、奶粉、婴幼儿奶粉和生牛奶的阳性率分别 为2 1 、3 9 、4 4 、6 0 。另外，不久前我国卫生部门曾对市场上1 3 5 份鲜奶和6 吩奶粉 进行检测，其结果是：1 3 5 份鲜奶中有3 0 份含残留抗生素，阳性率达2 2 ；6 吩奶粉中2 份有 抗生素残留，检出率为3 3 从以上情况可以看出，我国牛奶中抗生素残留现状并不令人乐观，应加强对牛奶生产的 管理，并对牛奶中的抗生素等药物残留进行有效检测和监控，以保证人们饮用牛奶的卫生和 安全。 1 5 原料奶中的抗生素残留检测方法 抗生素检测技术成为制约我国乳和乳制品行业发展壮大和出口创汇的“瓶颈”。所以尽 快开发或引进先进的抗生素检测技术以解决我国当前乳和乳制品行业面临的难题已成为当 务之急。5 0 年代中期n e a l 和c a l b e r t 1 7 , 1 s 】首次报道抗生素检测方法。1 9 5 5 年提出氯化三苯 四氮唑法，是日本1 9 5 0 年检测牛乳中青霉素残留的法定方法，我国1 9 5 5 年4 月1 日生效为 法定标准，目前我国的食品标准g b t 4 7 8 9 2 7 2 0 0 3 中还规定采用该法。1 9 6 6 年，h a m b u r g e r 【1 9 】 首次制备发现抗氯霉素抗体。1 9 8 4 年，a r n o l d 等脚】建立了氯霉素的放射免疫测定法( r i a ) ， 并与g c e c d 进行了比较，检测限为0 2 。u g k g 。h u t h 2 1 1 用荧光免疫法测定牛奶中的6 种b - 内酰胺类抗生素，结果为：青霉素g 3 2 , u g k g 、氨苄青霉素2 9 p g k g 、羟氨苄青霉素3 6 9 9 k g 、 邻氯青霉素7 4 比g k g 、头孢匹林1 6 3 u g k g 、头孢噻呋3 3 7u g k g 。 目前国内主要依据国家标准g b 4 7 8 9 2 7 9 4 鲜乳中抗生素残留量检测方法进行，此方法 操作简便，比较适合基层单位使用，但其灵敏度低，对乳中青霉素的检测限仅为o 0 4i u m l ，已不适应国际需要【勿。国外对乳中青霉素的检测多数仍用微生物学的方法，该方法灵 敏度高、价格低廉。到目前为1 ：还没有令入满意的化学仪器分析方法。生鲜牛乳中抗生素残 8 河南农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文文献综述 留检测方法( w 【方法) 与我国多年以来形成的兽药市场抗生素种类繁多、奶农或兽医人员 滥用抗生素不相称，要控制生鲜牛奶的抗生素残留问题，避免因为抗生素含量超标而导致被 拒收处理的风险，乳品企业和奶农等相关部门，积极寻找和探索新的高效和有效的抗生素残 留检测方法势在必行。 原料奶中抗生素残留检测方法大致可分为三大类：微生物检测方法、仪器分析方法、免 疫学分析方法。微生物检测方法包括有b s d a 法( b s t e a m t h e r m o p h i l i st a b l e td i s ca a s s a g ) 、 纸片法，即p d 法( p a p e rd i s c ) 以及在美国和加拿大使用的试纸法和磺胺试验法c a l fa n t i b i o t i c a n ds u l f o n a m i d et e s t ( 湖法) 、c r r e p r o b e ( 8 1 a c t a m ) 、d e l v o t e s t - p ( d s m 公司) 、 c h a r mf a r m 、l a ct e l 固d 等，还有美国近年来补充的一个新的试验方法一快速抗生素筛选 法f a s ta n t i m i c r o b i a ls c r e e nt e s t ( f a s t ) ，以及国标t i c 法、s n a p 法以及e l i s a 法；仪器分 析方法有气相色谱、液相色谱气质联用或液质联用；免疫学分析方法是依据抗原抗体特异性 反应而设计的一种方法，是当今发展比较迅速的一类检测技术。下面简单介绍几种常用的检 测方法； 1 5 1t t c 法 唧c 法即是氯化三苯基四氮唑法( t r i p h e y et e t r a z o l i u mc h l o r i d e ) 是我国鲜牛乳中抗生素 残留检测的标准方法( g b 4 7 8 9 2 7 1 9 9 4 ) ，此方法的特点是设备简单、费用低，但灵敏度 低、易假阳性，在检测青霉素和氯霉素上敏感度与枯草杆菌纸片法大致相等，但对链霉素不 太敏感，对新霉素根本不敏感，消毒剂可干扰试验。我国目前广泛使用此方法。它用嗜热乳 酸链球菌作为指示菌，各种抗生素的检测灵敏度( 最低检出量) 为：青霉素0 0 0 4i u m l ， 链霉素0 5i u m l ，庆大霉素0 4i u m l ，卡那霉素5n j m l 。 1 5 2b s d a 法 b s d a ( b a c i l l u s s t e a r o t h e r m o p h i l i st a b l e td i s c a s s a y ，嗜热脂肪芽胞杆菌圆盘检验) 法采 用嗜热脂肪芽胞杆菌对抗生素的耐受程度作为检测指标，采用抑菌圈法，用青霉素酶和头孢 菌素酶做确证试验。对照组加磷酸盐缓冲液1 2 3 。k a n g - k i - 1 分别采用嗜热脂肪芽胞杆菌、藤 黄链球菌( m i c r o c o c c u sl u t e u s ) 、嗜热链球菌( s t r e p t o c o c c u st h e r m o p h i l u s ) 等3 种细菌检测 抗生素，它们对青霉素的检测限分别为0 0 0 2 5r u r n l 、0 0 1 i u m l 和0 0 3 啪。r b 等用大 肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l i ) 、藤黄八叠球菌( s a r c i n ai u t e a ) 、枯草芽胞杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i s ) 、 腊样芽胞杆菌( b a c i l l u sc e r e u s ) 、巨大芽胞杆菌( b a c i l l u sm e g a t e r i u m ) 这五种菌对八种磺 胺类药物和9 种抗生索进行抑菌圈法敏感试验，发现能产生孢子的巨大芽胞杆菌在3 7 。c 培 养对药物的检测限比较低，巨大芽胞杆菌的孢子含量达到5 1 0 4 个，m l 【矧。 1 5 ，3d e i v o t e s t p 法( 戴尔沃检测法) d e l v o t e s t p 试剂盒是依据嗜热脂肪芽胞杆菌的生长对培养基颜色的改变为测试指标， 黄色为阴性，紫色为阳性( 青霉素检出限度为0 0 0 3i u m l ) 。该法最早从香港传到广东的， 其使用是基- 丁2 0 世纪8 0 年代初香港要求广东出口的生奶必须“无抗”且要求采用d e l v o t e s t 9 河南农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 文献综述 法检测。该方法也是微生物测定法，其试剂是由荷兰d s m 公司生产并由a o a c 认证。其原 理是利用微生物嗜热芽胞杆菌在6 4 条件下培养2 5 3h 后会产酸，酸引起指示剂b c p ( 溴甲酚紫) 变为黄色；若原料奶样品中不含抗生素，培养后样品呈黄色，如样品中含有抗 生素，嗜热芽胞菌生长受到抑制而无法产酸，指示剂将不变色陋2 6 1 。此法可检测多种抗生素 如磺胺类、四环素类、大环内酯类、氨基糖苷类、氯霉素等，其中对青霉素和磺胺类抗生素 特别灵敏。其灵敏度为：青霉素：3p p b ；链霉素：3 0 0p p b ：庆大霉素：4 0 0p p b ；卡那霉素： 2 5 p p b 1 5 4 纸片法 纸片法 z t , 2 s ，即p d 法( p a p e rd i s km e t h o d ) 。常用的纸片法有枯草杆菌纸片法和嗜热脂 肪杆菌纸片检测法。这两种方法主要用来检测牛奶中b - 内酰胺类抗生素，其操作过程基本 相同，而选用的菌种不同，枯草杆菌纸片法检测的结果易出现假阳性，为了确定阳性物质是 否为青霉素( 或8 内酰胺类) ，对加热后的乳样用青霉素酶处理。以灭活乳样中的青霉素， 然后再行检测，检测限可达o 0 1i u m l ，而嗜热脂肪杆菌纸片检测法不仅用于检测奶样中b - 内酰胺类，并能暗示是否还存在其他抑菌物质，检测限可达0 0 0 8i u m l 以下。该法在4h 内即可获得结果，1 9 8 1 年由f d a 认可，1 9 8 2 年1 月1 日生效为法定方法。 1 5 5 阻抗分析法 b a c t o m a t e r 系统是利用阻抗变化来测定微生物的活动，当培养基中因微生物的代谢活动 而发生化学改变时，阻抗也发生改变。在微生物生长过程中，大分子营养物质经代谢转变为 较小但更为活跃的分子，当细菌产生的离子浓度达到比培养基初始离子浓度稍低的含量时， 电导改变即可检出，这一时间称作检出时间( d t ) 。在预先加入含有嗜热脂肪芽胞杆菌的 m p 琼脂培养基的检测池内加人需检测的牛奶。当原料奶中有抗生素存在时，m p 琼脂培养基 内的嗜热脂肪芽胞杆菌的繁殖( 代谢活动) 就会受到抑制，因此阻抗发生改变的时间或延长 或不产生，则该样品的d t 时间值将比无抗生素牛奶的d t 值大或为o ； 而样品如为阴性时， 则d t 值很快就会出现【2 9 】。抗生素残留监测中的免疫测定法只能作为筛选方法，其定量效果 还有待进一步研究。如w a t a n a b e 等俐制备了卡那霉索结合抗原，并筛选单克隆抗体，用直 接竞争e l i s a 法测定牛奶样品，检测限为4n g m l 。 1 5 6 理化检测法 理化检测法是利用抗生素分子中的基团所具有的特殊反应或性质来测定其含量，如高效 液相色谱法( h p l c ) 、气相色谱法( g c ) 、质谱法、联用技术等等，能进行定性、定量和 药物鉴定，敏感性较高，在牛奶中抗生素残留检测方面，最常用的理化检测方法是高效液相 色谱和联用技术。牛奶中抗生素残留检测方法还有高效薄层色谱( h l m c ) 、超临界流体 色谱( s f c ) 和毛细管区域电泳法( c z e ) 等，这些方法尽管在残留检测中不常用，但冈 其各自特有的性能，能弥补常用方法中不足之处。 1 5 7 生物传感器法 1 0 河南农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 文献综述 g a u d i n 3 1 1 采用b l a c o r e 检测磺胺二甲基嘧啶( s m z ) 。即将s p r 上的改性羧甲基葡 聚糖金属结合传感器为检测因子，检测s m z 。s m z 在0 - 2 0 0 | lg k g 之间，两者存在线性关 系，检测时间为8 码om i n ，检测底限达到1 7ug k g 。并行多孔检测，可同时检测青霉素、 四环素、氯霉素和氨基糖苷类抗生素。s e f f o r d l 3 2 将能特异吸附青霉g 的蛋白质固定在基质 上，青霉g 同蛋白质结合，引起电流的变化，从而推算其浓度。本方法时间短，灵敏、试 剂少。很适合野外操作。g u s t a v s s o n 3 3 】用s p r 上具羧肽酶活性的蛋白质为检测因子，b 一内酰 胺抗生素的含量同它的活性之间存在线性关系。本方法可解决e l i s a 流量小，微生物法只 测活性成分的缺点，并能实现自动检测。对青霉g 的最小检测限为2 6pg k g ，3 日检测变 动率间于7 3 一1 6 。武海 3 4 1 以新亚甲蓝为介体。利用电聚合法和共价键合法制备成电流型 青霉素免疫传感器，并就传感器的检测原理、电化学行为、检测条件的优化、影响因素以及 在牛奶中的实际检测等问题作了详细地研究。 1 5 8s p 法 该方法是酶联免疫法，由美国i d e x x 公司生产其检测分析仪及其试剂盒，均获得a o a c 认证。它利用了竞争酶联免疫技术。其基本原理是用特异性抗体将固相载体激活，加入含待 测抗原的溶液和一定量的酶标记抗原在4 5 5 共同保温，使样品内的抗生素与内置抗生素 标志物竞争与固定的抗体结合，然后进行洗涤和显色，内置抗生素标志物与固定的抗体结合 形成的复合体，通过酶的作用分解可形成有色物质，通过测定色度并与参照物对照，就可以 确定结果是阳性或阴性。 1 6 减少和避免抗生素残留的措施 减少和避免抗生素残留可以采取以下对策和措施：进一步完善抗生素残留监控体系；完 善动物性食品中抗生素残留检测方法；完善抗生素休药期规定；建立兽药安全监测信息网； 抗生素替代品的研制：提高兽医临床用药水平，增强法制观念。 1 7 微胶囊技术的研究进展 自从1 9 5 3 年b i cg r e e n 发明了凝聚微胶囊化方法【3 5 】，成功地研制了无碳复写纸以后，微 胶囊技术才正式问世。所谓微胶囊化就是将固、液、气态物质包埋到微小、封闭的胶囊内， 使其内容物在特定的条件下以可控的速率释放的技术，这一微小封闭的胶囊既是微胶囊，其 大小通常在1 。1 0 0 0 p m 之间。微胶囊的形状以球状为主，也有米粒状、块状、针状或不规则 状，其结构可分为心材和壁材，心材是指被包埋的物质，也称核、芯或内包物；壁材是指用 于包埋的物质，也称为被膜、壁膜、壳或保护膜。目前微胶囊化的方法己发展到几十种之多 p 3 7 ，在食品工业中应用最多的方法主要有喷雾干燥，气体悬浮包衣法，挤压法、凝聚法、 包接络合法等。陈少欣等】利用海藻酸钙、明胶和壳聚糖为固定化载体包埋嗜热脂肪芽胞 杆菌细胞合成低聚半乳糖( c o s ) ，这些载体无毒性，可用于食品生产。胡立勇等【3 9 】采用 卡拉胶包埋嗜热脂肪芽胞杆菌，制成块状固定化细胞。赵美云等【删对海藻酸钠一氯化钙法 包埋某高效微生物菌种用于强化聚酯废水的生物处理进行了试验研究。陈健凯等1 4 l l 研究利 河南农业大学2 8 届硕士学位论文文献综述 用双层包埋剂包埋乳酸菌。近年来酶固定化技术也取得了很大进展，并且在工业上，特别 是医药工业中取得巨大成功，海藻酸钙固定化是常用的酶固定化方法 4 2 1 。 微胶囊化常用的方法有：( 1 ) 喷雾干燥法：这是最常用的微胶囊化方法。工艺经济且适 用性强，还可得现成的设备，并且品质良好。其工艺是将心材分散于壁材物质中进行乳化， 然后将乳化液送入干燥室雾化，在加热空气中干燥固化后形成微胶囊。在固化过程中，虽然 热空气的温度很高但由于水从壁材中快速蒸发从而保证了心材的温度低于1 0 0 。因此，该 方法对热敏感物质的处理是比较有效的。( 2 ) 气体悬浮包衣法：又称w u r s t e r 法、流化床法或 喷雾包衣法。该法利用流化床将心材颗粒悬浮于上升的空气流中，然后喷上溶解的或熔融的 壁材溶液，在心材表面形成一层薄膜。选用的壁材有纤维素衍生物、蛋白质、淀粉衍生物、 蜡类等。( 3 ) 挤压法：是将心材分散到熔融的壁材中，经挤压后进入脱水剂中，使其脱水硬 化后干燥而得，用此法包埋率高，损失小，但设备较昂贵。( 4 ) 凝聚法：又称相分离法，根 据心材和壁材极性不同，及溶解度受温度变化不同，改变温度、p h 值、组成等因素，使其 壁材凝固形成壁膜，通常在壁膜形成以后，经热、交联或去除溶剂等方法使其进一步固化， 收集胶囊的方法有过滤、离心等。( 5 ) 包结络合法：是利用b 环糊精作载体，在分子水平上 进行包结。b 环糊精分子是由7 分子葡萄糖以a 1 ，4 糖苷键连成环状，分子外形呈圆台，表面 是亲水区，内有一中空的近似圆柱形的疏水区，此反应只发生在有水的条件下水分子占据了 环糊精分子的疏水区，易为低极性客体分子所替换，从而进行包埋。包结物在干燥条件下很 稳定，要在2 0 0 c 才分解，但在口腔的温度和湿度下，心材可被释放。( 6 ) 乳化缩聚法：是 由单体或高分子材料经化学交联反应产生囊膜而制备微胶囊的一种方法。常用的可生物降解 的材料有明胶、淀粉、白蛋白、聚乳酸等。 1 8 本课题的目的、意义及研究内容 尽管人们对奶牛乳房炎的研究不断深入，但奶牛乳房炎发病率在全世界范围内居高不 下，已成为制约奶业发展的一大难题。我国饲养业的饲养者只考虑经济效益，大量使用兽药 和饲料添加剂，使奶牛乳房炎的治疗药物使用情况非常复杂，存在大量不合理用药、用药剂 量严重超标等现象。目前治疗奶牛乳房炎的药物品种多达几十种，由于长期使用一种或两种 抗菌素使细菌耐药性情况非常严重，如金黄色葡萄球菌等很多菌株己经对青霉素产生了严重 的耐药性。某些药物的使用，由于其药物残留期过长，废弃奶增多造成较大经济损失。 抗生素残留问题是液态奶安全质量问题的重中之重，因此我们把快速检测抗生素残留 作为“液态奶安全质量控制体系应用研究”中的子项目进行研究。为人们的安全饮用提供有 力的保障。商品化的试剂盒试纸条以及各种理化检测方法检测成本较高，广泛应用性受到限 制，国标t i c 法费用低但存在的问题也很多【4 3 7 1 ，如灵敏度较低，操作繁琐，试验菌的制 备和使用还没有统一的规定，不同菌株耐药性不同、灵敏度也不同等等。因此，摸索一种操 作方便、费用低、可靠、可用于大量检测样品中抗生素的检测方法是很有指导意义的。国际 乳品联合会推荐的微生物检测抗生素残留菌种为嗜热脂肪芽胞杆菌，它对抑制物质的敏感性 1 2 河南农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 文献综述 较高，生长较为快速。目前用于治疗奶牛疾病的抗生素多为青霉素类即具有b - 内酰胺环的 抗生素。本研究就是根据这两点设计的，以快速准确的检测出原料乳中青霉素类抗生素的残 留。鉴于上述原因，开展该项目研究有着重要现实意义，本项目根据现有的检测方法对嗜热 脂肪芽胞杆菌检测牛奶中抗生素残留的方法加以改进及创新，建立适合国内奶牛场、乳品企 业检测乳中抗生素残留的方法。 1 3 河南农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文引言 2 引言 自1 9 3 5 年d o m a g k 发明磺胺类药物、c l i a i n ( 1 9 4 0 年) 等证实青霉素可以作为一种有效的化 学治疗剂以来，抗菌药物的研究与应用发展迅速，随后进入“抗生素时代”。抗生素在兽医 临床上治疗呼吸系统、消化系统、生殖系统等感染，大部分可用作饲料药物添加剂。但随着 饲用抗生素的普及。其副作用也逐渐突出。由于我国乳品工业尚处于初级阶段，以及一些人 为因素，导致乳中抗生素残留较严重。如抗生素作为治疗药物在乳牛乳房炎的控制中起了重 要作用，另外其作为饲料添加剂以及不遵守操作规程等都能引起抗生素在牛奶重的残留。牛 奶中若含有抗生素，对长期饮用者