（分析化学专业论文）新型生物分子固定技术用于构建生物传感器的研究.pdf

新型生物分子固定技术用于构建生物传感器的研究 分析化学专业硕士研究生黎雪莲 指导教师袁若、柴雅琴教授 摘要 长期以来，由于电化学生物传感器具有设计制造简单、灵敏度高、价格低廉、选择性 好、所需仪器设备相对简单等优点，己被广泛研究并逐渐应用于食品工业、环境检测和临床 医学等领域。然而，如何将生物活性组分有效地固定在电极表面上的固定化方法、降低甚至 消除蛋白质在传感器上的非特异性吸附等方面存在的问题阻碍了电化学生物传感器的发展 和应用。本论文正是基于以上考虑，设计了一系列新型生物分子固定技术，结合各种电化学 方法研究了蛋白质的电化学性质并制备了相应的生物传感器。 本文第一部分研究了基于电子媒介体的酶生物传感器。 l利用能保持生物分子活性、增大电极比表面积进而增大生物分子负载量的纳米金溶胶作 为固酶基质，以溶胶一凝胶法固定辣根过氧物酶于电聚合普鲁士蓝膜修饰铂盘电极表面， 制各基于电子媒介体的第二代酶生物传感器。功能化溶胶凝胶的引入，不仅能增大纳米 金及酶分子的固定量，而且能有效地防止易溶性小分子媒介体的渗漏。最优实验条件下， 该传感器在h 2 0 2 浓度为7 0 1 0 4 66 x 1 0 一m o l - l 。范围山有线性响应，检出限为30 x 1 0 4 m o i l 1 。 2 首次电聚合邻氨基苯甲酸于玻碳电极表面，使其形成带负电的界面，通过静电作用自组 装一层带正电荷的电子媒介体甲苯胺蓝，利用媒介体的氨基吸附纳米金，最后静电吸附 固定辣根过氧化物酶制备过氧化氢传感器。探讨了膜聚合时间、媒介体组装时间、p h 、 温度、工作电位等对电极响应的影响。在优化的实验条件下，该传感器对h 2 0 2 电流响 应与其浓度在1 5 x 1 0 1 3 x 1 0 m o l l 。范围内呈线性关系，检出限为5 6 1 0 1 。m o l l 一。 该法制备的传感器具有较低的工作电位能有效地消除抗坏血酸等的干扰。 本文第二部分研究了蛋白质直接电化学的第三代生物传感器。 通过静电吸附作用将多层细胞色素c 和纳米金固定在聚邻氨基苯甲酸膜表面，制成 稳定的多层蛋白膜修饰电极，研究了细胞色素c 在该电极上的直接电化学行为。固载细 胞色素c 的修饰电极在p h6 5 的磷酸盐缓冲液中有一对相当可逆的循环伏安氧化还原 峰。应用于过氧化氢的电催化还原，固定在电极上的多层细胞色素c 表现出稳定且较高 的催化活性。实验发现，通过改变组装层数控制固定在电极上细胞色素c 的量可提高 该传感器的灵敏度和检测范围。在最优实验条件下，i 2 0 2 浓度在9 8 x 1 0 一1 3 x 1 0 。 t o o l l “范围内与其还原峰电流呈线性关系，检出限为6 6 x 1 0 4 m 0 1 l 。 本文第三部分研究了新型酶放大电流响应信号的免疫传感器。 l t 利用静电吸附固定在聚对氨基苯磺酸膜中的甲苯胺蓝媒介体结合纳米金，再固定癌胚抗 体后，利用分子量相近的辣根过氧化物酶代替牛血清白蛋白封闭非特异性结合位点，制 得性能优良的新型免疫传感器。探讨了过氧化物酶取代牛血清白蛋白作为封闭剂的可行 性、过氧化物酶的电流放大效应、阴离子前驱体的选择、甲苯胺蓝吸附时间、h 2 0 2 浓度、 溶液p h 等对此免疫传感器的影响。实验表明：由本法制备的新型免疫传感器无需酶标 抗原或抗体；过氧化物酶在封闭非特异性结合位点的同时就能扩大电极的电流响应信 号，从而使免疫传感器获得比同类文献更高的检测灵敏度。虽优实验条件下，_ e | 循环伏 安法测得癌胚抗原的线性范围为0 5 5 和5 1 2 0n g m l ，检出限为o2n g - m l 。 2 采用自组装技术和静电吸附作用，将甲胎蛋白抗体固定在多层辣根过氧化物酶纳米金及 l 半胱胺酸修饰的金电极表面，制得无试剂型免疫传感器。考察了电极的电化学特性 并对该免疫传感器的作用机理及性能进行了详细研究。该法无需对抗原( 或抗体) 进行标 记，简化了免疫传感器的制备过程；采用纳米金和辣根过氧化物酶层层自组装方法，除 扩大抗体的结合量外，尚利用酶的放大效应显著提高了抗原测定的灵敏度。用计时电 流法测得甲胎蛋白的线性范围为1 0 1 0 0 羊u1 0 0 2 0 0n g m l ，检出限为o5n g m l 。 结果表明，该传感器响应迅速、选择性好，血清中常见抗原不干扰测定。将其用于i 临床 血清检验，与放射免疫测定法的符合率为8 6 ，7 。 关键词：生物传感器生物分子固定技术纳米金蛋白质 2 s t u d i e so fn o v e lt e c h n i q u e sf o ri m m o b i l i z a t i o no fb i o m o l e e u l e s a n dt h e i ra p p l i c a t i o n si nd e v e l o p i n gb i o s e n s o r s a n a l y t i c a lc h e m i s t r ym a s t e rp o s t g r a d u a t e ：x u e l i a nl i s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o rr u oy u a n 、y a q i nc h a i a b s t r a c t e l e c t r o c h e m i c a lb i o s e n s o r sa r ew i d e l yu s e df o rt h ea s s a yo fb i o l o g i c a la n a l y t e s t h e a d v a n t a g e so ft h i sa p p r o a c hi n c l u d i n gt h e i rs i m p l e d e s i g n ，h i g h - s e n s i t i v i t y , l o w c o s t ，s e n s i t i v i t y a n di n e x p e n s i v ei n s t r u m e n t a t i o na t t r a c ts u b s t a n t i a lr e s e a r c he f f o r t sd i r e c t e dt ot h ed e v e l o p m e n t so f s o m en e we l e c t r o c h e m i c a lb i o s e n s o r s h o w e v e r , t h em e t h o do fi m m o b i l i z a t i o n ，t h ep r e v e n t i o no r e l i m i n a t i o no fn o n s p e c i f i ci n t e r a c t i o n ss t i l lr e m a i n st ob et h ek e ys t e p s i nt h i s t h e s i s ，t h e e l e e t r o c h e m i c a ib i o s e n s o r sb a s e do hd i f f e r e n ti m m o b i l i z a t i o nm e t h o d sa n dd i f i e r e n tt r a n s d u c e r s h a v eb e e nd e v e l o p e df o rp r o t e i nd e t e r m i n a t i o n t h em a i nw o r k sa n dc o n c l u s i o n sa r ei n c l u d e da s f o i l o w s ： p a r tii n v e s t i g a t e dt h eh y d r o g e np e r o x i d eb i o s e n s o rb a s e do nd i f f e r e n tm e d i a t o r 1 ah y d r o g e np e r o x i d eb i o s e n s o rw a sc o n s t r u c t e db yi m m o b i l i z i n go fh o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ( h r p ) w i t hg o l dn a n o p a r t i c l e s ( n a n oa u ) ，w h i c hc h e m i s o r b e do n t ot h et h i o lg r o u p sb o t h i n s i d e t h en e t w o r k a n do nt h es u r f a c eo ft h r e e d i m e n s i o n a l s o l g e l o nap r u s s i a n b l u e - m o d i f i e dp l a t i n i u me l e c t r o d e t h ei n t r o d u c t i o no fs i l i c as o l - g e lm a t r i xc o u l di n c r e a s et h e a s s e m b l e dn a n o p a r t i c l e sa n dp r o t e i n s ，b u ta l s oa v o i dt h el e a c h i n go fm e d i a t o rf r o mt h e e l e c t r o d e u n d e rt h eo p t i m i z e dc o n d i t i o n s ，t h el i n e a rc a l i b r a t i o nf o rh 2 0 2w a so b t a i n e di nt h e r a n g e7 , 0 x 1 0 。t o6 6 1 0 一m o l l 。w i t had e t e c t i o no f3 0 x 1 0 t o o ll _ la tas i g n a l - t o n o i s e r a t i oo f 3 t h es t u d i e db i o s e n s o re x h i b i t e dh i g hs e n s i t i v i t y , s e l e c t i v i t ya n ds t a b i l i t y 2 an o v e la p p r o a c hb ym e a n so fs e l f - a s s e m b l e dt e c h n i q u ea n do p p o s i t e c h a r g e da d s o r p t i o nt o i m m o b i l i z eh o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ( h r p ) o ng o l dn a n o p a r t i c l e s ，w h i c hw e r ei m m o b i l i z e do n g l a s s yc a r b o ne l e c t r o d em o d i f i e dw i t hp o l y 一2 a m i n o b e n z o i ca c i d ( p a b a ) a n dt o l u i d i n eb l u e ( t b ) a m i n o b e n z o i ca c i dw a se l e c t r o p o l y m e r i z e dt og l a s s yc a r b o ne l e c t r o d es u r f a c ef o rt h e f i r s tt i m e ，w h i c hu s e dt oe l e c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o nw i t ht h ep o s i t i v e l yc h a r g e dt bt h ee f f e c t s o f e x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n ss u c ha s t h ep o l y m e r i z a t i o n t i m eo f p o l y a b a a s s e m b l i n g - t i m e f o r m e d i a t o r ，p h ，t e m p e r a t u r ea n da p p l i e dp o t e n t i a l o nt h ee l e c t r o d ep e r f o r m a n c eh a v eb e e n i n v e s t i g a t e d u n d e ro p t i m a lc o n d i t i o n s ，t h el i n e a rr e s p o n s eo ft h es e n s o rt oh 2 0 2i s i nt h e 3 r a n g eo f1 5 x l o 1 3 x l o m o l l 1w i t had e t e c t i o nl i m i to f5 6 x i 0 4m 0 1 l 1 t h ec u r r e n t r e s p o n s et i m ei s 1 0s t h eb i o s e n s o rr e t a i n e d8 3 6 o fi t so r i g i n a la c t i v i t ya 髓rt h r e ew e e k s o fu s e m o r e o v e r , t h es t u d i e db i o s e n s o re x h i b i t e dg o o dr e p r o d u c i b i l i t y ，s e l e c t i v i t ya n dh i g h s e n s i t i v i t y p a r ti is t u d i e dt h ed i r e c te l e c t r o c h e m i s t r ya n de l e c t r o c a t a l y t i co ft h et h i r d - g e n e r a t i o n b i o s e n s o r t h ed i r e c te l e c t r o c h e m i c a l b e h a v i o r so fc y t o c h r o m ec ( c y tc ) ，w h i c hl a y e r - b y l a y e r e l e c t r o s t a t i ca d s o r b e dw i t h g o l dn a r l o p a r t i c l e s o n g l a s s yc a r b o n e l e c t r o d em o d i f i e dw i t h p o l y - 2 a m i n o b e n z o i ca c i dw e r ei n v e s t i g a t e d t h em o d i f i e de l e c t r o d es h o w e dap a i ro f w e l l - d e f i n e da n dn e a r l yr e v e r s i b l ec y c l i cv o l t a m m e t r i cp e a k sf o rh e m ef e ( 1 1 1 ) f e ( i i ) r e d o x c o u p l ei np h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n es o l u t i o n ( p h6 5 ) t h em o d i f i e de l e c t r o d es h o w e das t a b l e a n ds i g n i f i c a n tc a t a l y t i ca c t i v i t yf o rt h ee l e c t r o c h e m i c a lr e d u c t i o no fh y d r o g e np e r o x i d e b y v a r y i n gt h en u m b e ro ft h el a y e r s ，w ec a nc o n t r o lt h ei m m o b i l i z e dc y t o c h r o m eca m o u n tt h u s e n h a n c et h el i n e a rr a n g ea n ds e n s i t i v i t yo ft h es e n s o r s u n d e rt h eo p t i m i z e dc o n d i t i o n s ，t h e l i n e a rr e s p o n s eo f d e t e c t i o n t o h 2 0 2 i s i n t h ec o n c e n t r a t i o nr a n g eo f 9 8 1 0 8 t o1 3 1 0 。m o l l 。 w i t ha d e t e c t i o n l i m i t o f 6 6 x 1 0 m 0 1 l p a r ti i ii n v e s t i g a t e dt h en o v e li m m u n o s e n s o rb a s e do nh r pi n s t e a do fb s aa s b l o c k i n ga g e n t 1 an e wc u r r e n t a m p l i f i e d i m m u n o s e n s o rf o r c a r c i n o e m b r y o n i ca n t i g e n ( c e a ) w a s d e m o n s t r a t e d t h ee l e c t r o d ew a sf a b r i c a t e db yp o s i t i v e l yc h a r g e dt o l u i d i n eb l u ec o a t e do n n e g a t i v e l yc h a r g e dp o l y s u l f a n i l i ca c i d ( p s a a ) m o d i f i e dg e et h r o u g h e l e c t r o s t a t i c i n t e r a c t i o n st oa s s e m b l eg o l dn a n o p a n i c l e sf o ri m m o b i l i z a t i o no fa n t i c e aa n dh o r s e r a d i s h p e r o x i d a s ei n s t e a do f b o v i n es e r u ma l b u m i n ( b s a ) t ob l o c ks i t e sa g a i n s tn o n s p e c i f i cb i n d i n g t h ep a r a m e t e r s ，w h i c hi n f l u e n c et h ea m p e r o m e t r i cd e t e c t i o no fi m m u n o a s s a y ，i n c l u d e du s i n g h r pi n s t e a do fb s aa sb l o c k i n ga g e n ta n da m p l i f yt h ec u r r e n tr e s p o n s e ；t h ec h o i c eo fp s a a a n i o n i cp r e c u r s o r ；t h ee l e c t r o s t a t i ca d s o r p t i o nt i m eo ft bm e d i a t o r ；t h ep h ；t h ec o n c e n t r a t i o n o fh 2 0 2 ；t h ei m m u n o c h e m i c a li n c u b a t i o nt e m p e r a t u r ea n dt i m ew e r ei n v e s t i g a t e d t h ec v s r e d u c t i o nc u r r e n to ft h ei m m u n o s e n s o rc h a n g e dl i n e a r l yi nt w oc o n c e n t r a t i o nr a n g e so fc e a f r o m0 5t o5 0a n d5 0t o1 2 0 0n g m l i np r e s e n c eo f 0 3m m o l l 1h 2 0 2i na n a l y t es o l u t i o n ， a n dt h ed e t e c t i o nl i m i tw a s0 2n g m l a tt h r e et i m e sb a c k g r o u n dn o i s e t h e p r o p o s e d m e t h o di se c o n o m i c a l ，e f f i c i e n ta n dp o t e n t i a l l ya t t r a c t i v ef o rc l i n i c a li m m u n o a s s a y s 2 an o v e li m m u n o s e n s o rf o rd i r e c ta m p e r o m e t r i cd e t e r m i n a t i o no fa - 1 f e t o p r o t e i n ( a f p 、w a s c o n s t r u c t e db ya n t i a f pi m m o b i l i z e do nm u l t i l a y e r so fh r p n a n oa ut h r o u g he l e c t r o s t a t i c a d s o r p t i o no n t ol - c y s t e i n em o d i f i e dg o l de l e c t r o d es u r f a c e t h ed e s i g no ft h ei m m u n o s e n s o r 4 s i g n i f i c a n t l ys i m p l i f i e dt h ei m m u n o a s s a yp r o c e d u r ea n da m p l i f i e dt h ea m p e r o m e t r i cr e d u c t i o n c u r l n tt h r o u g hm u l t i l a y e r so fh r p n a n oa u ，t h ea s s a yf o r m a ta v o i d e dt h ei n t r o d u c e ro fa n e l e c t r o nt r a n s f e rm e d i a t o r , a n dn a n oa ne f f i c i e n t l yr e t a i n e dt h eb i o l o g i c a la c t i v i t yo fp r o t e i n u n d e ro p t i m a lc o n d i t i o n s ，t h ei m m u n o s e n s o rw a sh i g h l ys e n s i t i v et oa f pw i t had e t e c t i o no f 0 5n g - m u la n dt h el i n e a rr a n g ew a sa tt w oc o n c e n t r a t i o n sf r o m1t o1 0a n df r o m10t o2 0 0 n g m l 。w i t ho 7m m o l - l h 2 0 2i na n a l y t es o l u t i o n m o r et h a n8 6 7 o ft h er e s u l t so f t h e h u m a ns e r u ms a m p l e so b t a i n e db yt h i sm e t h o dw e r ei na g r e e m e n tw i t ht h o s eo b t a i n e db y r a d i o i m m u n o a s s a y s oi tw o u l db eap o t e n t i a la p p l i c a t i o no nc l i n i c a ld e t e r m i n a t i o no fa f p i e v e l k e y w o r d s ：b i o s e n s o r ；i m m o b i l i z a t i o no f b i o m o l e c u l e ；g o l dn a n o p a r t i c l e s ；p r o t e i n 5 独创性声明 y 9 。l5 ：l 学位论文题目：堑型生物盆王固定撞盔旦王拉建生塑篮壁墨的叠塞 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西南大学或其他教育机构的 学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己 在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者：韶雪莲 签字日期：2 口口年4 月? d 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权西南大学研究生院可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密， 口保密期限至年月止) 。 学位论文作者簦名：韶需莲 签字日期：御口6 年4 月孑。日 学位论文作者毕业后去向： 工作单 通讯地 导师签名 签字日期 位：盟蛐绿陛! 醯啦 址： 幺月明日 电话：12 邮编： 第一部分综述 生物传感器【1 】是近年来兴起的一种新型传感器，它主要用来检测生物试样的 化学成分。由于它具有选择性好、灵敏度高、分析速度快、操作简易和仪器价格 低廉等特点，可以进行在线甚至活体分析，为生物医学、环境监测、食品医药工 业及军事医学领域直接带来新技术革命。2 0 世纪8 0 年代起国际上对生物传感器 进行了广泛的研究和探索，近些年来已经研制出一系列在环境监测、临床检验和 生化分析等方面有实用价值的生物传感器。 1 生物传感器的基本原理 1 i 生物传感器的概念 生物体的发展与进化是通过与其环境的不断交换和交流来实现的，他们收 集到的信息能够满足其生产与生存的需求。许多微生物具有的独特化学识别能 力，使他们能得到营养物质，远离危险，人类一直梦想用具有同样的工具一生物 识别的传感器来观察和了解其生存环境，首先人们必须模拟自然界，使用自然界 所提供的细胞、组织、蛋白质和酶等，将可观察的事物转变为可测量的物理量， 作为这种生物模拟的结果，这类传感器被称为生物传感器( b i o s e n s o r ) 口】。 随着生产力的发展，在工农业生产、环境保护、临床检验以及食品工业等 领域，每时每刻都有大量的样品需要分析和检验，而且往往要求在很短的时间内 完成样品检测，有的甚至要求在线或活体内直接检测。b i o s e n s o r ，作为生物、化 学、医学、物理、电子技术等多种学科相互渗透形成的研究领域，由于具有灵敏 度高、选择性好、分析速度快、操作简易、样品需要量少、可微型化、仪器价格 低廉、专一的识别功能、可实现生物活体连续在位检测等特点，引起人们的普遍 关注。其应用范围从临床、生化、医疗保健、药物研究、环境监测、食品工业及 食品检验、添加剂、农药、工业过程控制，直至扩展到分子生物器件的研制、神 经网络的模拟、仿生智能器件的出现、生物计算机的基础研究等p j 。国际上从8 0 年代起对生物传感器进行了广泛的研究和探索。近l o 多年来已经研制出一系列 在环境检测、临床检验和生化分析等方面有实用价值的生物传感器，可以测定糖 类、有机酸、氨基酸、蛋白质、抗原、抗体、d n a 、激素、生化需氧量以及某 些致癌物质等1 4 4 j 。 1 2 生物传感器的原理 生物传感器是一种利用生物的因子或生物学原理来检测或计量化合物的装 置。它将分析化学和生物学的技术及方法结合在一起，通常由分子识别部分f 敏 感元件) 和转换部分( 换能器) 组成。敏感元件由对被测定物质具有高选择性分子识 别功能的膜构成；换能器则能把膜上进行的生化反应中消耗或生成的化学物质， 或产生的光、热等转变为电信号，然后把所得的电信号经过电子技术的处理后， 在仪器上显示或记录下来。其基本构成及工作原理如图l 所示。 图i 生物传感嚣的原理示意图 由于使用生物材料( 酶、抗原、抗体、激素、细胞、细胞器、组织等) 作为传 感器的敏感元件酬，所以电化学生物传感器具有高度选择性，是快速、直接获取 复杂体系组成信息的理想分析工具。一些研究成果已在生物技术、食品工业、临 床检测、医药工业、生物医学、环境分析等领域获得实际应用。 1 2 i 生物功能物质和分子识别 在设计生物传感器时，选择适合于测定对象的识别功能物质，是极为重要 的前提。分子识别部分是生物传感器选择性测定的基础。生物体中能够选择性地 分辩特定物质的生物分子有酶、抗原和抗体、结合蛋白质、植物凝血素、激素受 体和微生物等。这些分子识别功能物质通过识别过程可与被测目标结合成复合 物，例如葡萄糖氧化酶能从多种分子的混合溶液中，高选择性地识别出葡萄糖， 并把它迅速地氧化为葡萄糖酸内脂【7 】。生物功能物质能够识别响应的生物分子， 具有很高的选择性，犹如钥匙和锁的关系一样，一把钥匙只能打开一把锁，因此 所制各的生物传感器同样具有很高的选择性。可从两个主要方面提高生物传感器 的选择性：一是改善生物单元和信号转换器之间的联系以减少干扰；二是选择、 设计新的活性单元以增加其对目标分子的亲和力。如在酶电极中加入介体或对酶 进行化学修饰可提高这类电极的选择性，其中介体或用于修饰的物质大都具有一 定的电子运载能力。 当分子识别物质与信号产生、固定化等技术紧密结合时，就形成了生物传 感器真正需要的敏感元件。如图2 所示，按分子识别元件即敏感元件的不同， 可将生物传感器分为五类：酶传感器( e n z y m e s e n s o r ) 、免疫传感器( i m m u n o s e n s o r ) 、 细胞传感器( o r g a n a l l s e n s o r ) 、组织传感器( t i s s u o s e n s o r ) 、微生物传感器 ( m i c r o b i a l s e n s o r ) 。按生物敏感物质相互作用的不同，可将生物传感器分为催化型 生物传感器( b i o c a t a l y t i cb i o s e n s o r ) 和亲和型生物传感器( a f f i n i t yb i o s e n s o r ) 两类，前 者包括酶传感器、微生物传感器、组织传感器等：后者利用分子问特异的亲和性， 如免疫传感器、受体传感器、d n a 传感器等。 陌甄酮 i 一 杂交 图2 生物传惑器按生物识别元件分类 1 2 2 生物功能物质的固定化 将具有分子识别能力的生物功能物质，如酶、抗原抗体、细胞等，包裹或 吸附于某些高分子材料、生物高分子或无机材料( 如分子筛) 上制备成感应器，这 些称为生物功能物质的固定化。这是制作生物传感器的关键技术。通常的生物组 分固化技术应满足以下条件：固化后的生物组分仍能维持良好的生物活性；生物 膜与转换器需紧密接触，且能适应多种测试环境：固定化层要有良好的稳定性和 耐用性：减少生物膜中生物组分的相互作用以保持其原有的高度选择性。因此， 生物分子识别物质的固定化技术决定着生物传感器的稳定性、灵敏度等主要性 能。为了研制廉价、灵敏度高、选择性好和寿命长的生物传感器，固定化技术已 成为世界各国竞相研究和探索的目标。经过近2 0 年的不断工作，已经建立了对 各种不同的分子功能物质的固定化方法，这些方法大致有以下几种： n ) 直接化学结合法 将电极表面先经过化学处理或修饰，然后将生物功能物质以共价、离子或 配位等方式结合固定于电极表面。例如在用溴化氰处理过的二氧化钛电极表面固 定抗原或抗体，以制备免疫传感器j 。 ( 2 1 架桥化固定法 用多功能的试剂，如戊二醛与蛋白分子相互结合，起着桥梁的作用，从而 使蛋白质固定于电极表面i l2 。这是蛋白分子固定化用得比较多的方法。 f 3 ) 高分子载体包埋法 将生物功能物质与合成高分子【如全氟磺酸离子交换树脂( n a 矗o n ) 】或生物高 分子( 如丝素蛋白) 经溶剂混合而使酶包埋于其中，制备成具有酶活性的感应膜， 再把它覆盖到换能器即电极的表面，构成生物传感器【临7 】。常用的膜材料有聚丙 烯酰胺、淀粉、明胶、聚乙烯醇、硅树脂、纤维素膜、尼龙膜、火棉胶等。 ( 4 ) 高分子膜吸附法 先在电极表面上修饰一层合成高分子或生物高分子，然后将生物功能物质 吸附到高分子膜上，制备成感应膜，再与换能器结合，构成生物传感器。 ( 5 ) 电聚合高分子包埋法 将单体和生物功能物质同时混合于电解液中，通电使单体在电极表面电聚 合成高分子，与此同时可以将蛋白分子包埋于高分子膜内，直接固定于电极表面， 构成生物传感器1 1 8 m 】。用这种方法固定酶或其他生物器件制备生物传感器是一种 非常有效的方法。它具有制作简单、响应快速、抗干扰能力强、适于制作微电极 等优点。此外，不少高分子膜具有选择性透过某些物质的功能，可起到降低干扰， 防止电极被玷污的作用。 ( 6 1 无机材料吸附结合法 利用无机材料如分子筛或氧化铝等强烈的吸附特性，以此作为载体。先将 分子筛用聚乙烯醇调制后固定于电极表面，然后使生物功能物质吸附固定于分子 筛膜内，即可制成生物传感器1 2 3 - 2 4 。 ( 7 ) 分子自组装固定法 在单晶金电极表面，先修饰一层硫醇类化合物( 可以是脂肪酸及其衍生物、 有机硅烷类和烷基硫醇类化合物) ，这是通过分子问的引力进行自组装构成的单 分子层，然后再通过自组装方法将媒介体和蛋白质一层一层地修饰于电极上构 成生物传感器【2 5 _ 28 1 。 ( 8 ) 碳糊固定法 将酶、抗原一抗体、微生物等蛋白分子用石蜡油等溶剂调匀，再加入石墨粉 调制成糊状物，填充于玻璃管内制备碳糊电极，。以构成生物传感器【 2 9 3 舶。 ( 9 ) 溶胶凝胶固定法 溶胶一凝胶应用于生物传感器领域具有如下优点：( 1 ) 基质具有一定的刚性， 提高了生物活性分子的热稳定性；( 2 ) 基质热稳定且呈化学惰性，保持了蛋白分 子的活性；( 3 ) 通过溶胶凝胶制备条件的优化，可控制基质的孔径大小及其分布， 使蛋白分子有足够的自由活动空间而又不至于从基质中流失，从而提高传感器的 使用寿命；( 4 ) 基质在可见光区是透明的，适于光化学生物传感器的制作：( 5 ) 溶胶凝胶材料还具有生物相容性，为微电极植入人体提供了新的可能性：( 6 ) 还 4 可通过对前驱体的功能化赋予溶胶凝胶新的性能：( 7 ) 溶胶凝胶的制备条件十分 温和生物分子可以在不同的制备阶段加入，并且可以制成不同大小和形状的修 饰电极等。溶胶凝胶材料作为固定化载体，开辟了制备生物传感器的新领域 3 3 - 3 8 。 1 2 3 信号转换 根据分子识别功能物质制备的敏感元件所引起的化学变化或物理变化来选 择换能器，是研制高质量生物传感器的另一重要环节。敏感元件中光、热、化学 物质的生成或消耗等会产生相应的变化量。根据这些变化量，可以选择适当的换 能器。根据生物传感器的换能器即信号转换器分类有：生物电极( b i o e l e c t r o d e ) 传 感器、半导体生物传感器( s e m i c o n d u c tb i o s e n s o r ) 、光生物传感器( o p t i c a l b i o s e n s o o 、热生物传感器( c a l o r i m e t r i cb i o s e n s o r ) 、压电晶体生物传感器 ( p i e z o e l e c t r i cb i o s e n s o r ) 等，换能器依次为电化学电极、半导体、光电转换器、热 敏电阻、压电晶体等。其中电化学换能器具有许多优势，如能在混浊的溶液中操 作，具有较高的灵敏度并且容易微型化，所用仪器简单、便宜，电极体系的连续 操作可在线测定物质的变化等【3 ”，常被广泛用于传感器的制备。因此，在本论文 中主要采用电化学换能器。它的换能器主要有电流型和电位型两类。 电化学生物传感器是生物传感器领域中研究最多的一种类型，由于它具有 诸如以下的优点而被广泛研究：结构简单，不需要昂贵的检测仪器设备；灵敏度 高，据报道，电化学免疫传感器对生物样品的检测灵敏度目前已达到飞克( 龟) 水 平，远远高于目前最灵敏的放射免疫测定方法的灵敏度：选择性好，复杂的样品 往往不需要经过分离或掩蔽处理就可以直接测定；方法简单，如测定过程无需对 生物样品做任何分子标记、衍生等：快速实时，如检测一对生物大分子的相互作 用通常用时不到1h ，而且在检测过程中，就可以观察到生物分子间相互作用的 结果；操作简便，换能器将反应能转换成电信号易于检测和转换成数字信号与 计算机联机，实现连续、实时、自动化检测分析：易于小型化、智能化，由于其 具有对样品分离和检测相结合的特点，因此电化学传感器易于小型化、微型化， 更适合临床和现场的检测分析。其中电流型电化学生物传感器的换能器主要有惰 性金属电极、碳电极等。惰性金属电极中，铂电极因其对酶反应产物h 2 0 2 有较 灵敏的响应值应用较多4 0 - 4 2 。金电极则多用于自组装( s a m ) 技术【4 7 1 。碳电极主 要包括玻碳电极、石墨电极、碳糊电极、碳纤维电极和多孔玻碳电极【4 “”j 。碳电 极的主要优点在于良好的化学惰性和较宽的电势窗口。电位型生物传感器换能器 主要有离子选择性电极i s e s ( i r o n s e l e c t i v ee l e c t r o d e s ) 和气敏电极( g a se l e c t r o d e ) 。 将不同的传感器分类方法交叉结合起来，生物传感器的类别就更多了，例 如酶传感器又分为酶电极、酶热敏电阻、酶f e t 等。上面介绍的各种名称都是类 别的名称，每一类又包含许多具体的生物传感器，例如仅酶电极一类，根据所用 酶的不同就有几十种：如葡萄糖电极、尿素电极、尿酸电极、胆固醇电极、乳酸 电极、丙酮酸电极等等；就是葡萄糖电极也并非只有一种，有用p h 电极或碘离 子电极作为换能器的电位型葡萄糖电极，有用氧电极或过氧化氢电极作为换能器 的电流型葡萄糖电极等。 1 3 生物传感器的特点 由于生物传感器是选用选择性良好的生物材料作为分子识别元件，因此， 与传统的分析方法相比，它具有以下优点：( 1 ) 一般不需要对样品进行预处理， 样品中的被测组分的分离和检测同时完成，且测定时也不需另加其它试剂；( 2 ) 结构简单，体积小，使用方便，可以实现连续在线监测，容易实现自动化测量： ( 3 ) 响应快，样品用量少，且由于敏感材料是固定化的，可以反复多次使用；f 4 1 与其它大型分析仪器相比，生物传感器连同测定仪的成本较低，便于推广普及。 2 生物传感器的发展历程 h e y r o v s k y l 5 4 1 1 9 2 1 年创立极谱学，为电分析化学的发展做出了巨大的贡献。 2 l 世纪4 0 年代，酶开始用作分析试剂来检测待定物质( 底物主要是有机物) 。1 9 6 2 年c l a r k l s s l 等人提出把酶与离子敏感氧电极技术结合，创制了测定葡萄糖含量的 酶电极，开创了生物传感器的先河。1 9 6 7 年u p d i k e 和h i c k s 56 】研制出世界上第 一支葡萄糖氧化酶电极，用于定量检测血清中葡萄糖含量，这是生物传感