（分析化学专业论文）新型复合生物传感器平台的构建及应用.pdf

摘要 生物传感器是指利用生物化学和电化学反应原理，用固定化的生物材料( 酶、 抗原、抗体、激素、d n a 、r n a ) 或生物体本身( 细胞、细胞器、组织) 作为敏感 元件，将生化反应信号转化为电信号，通过对电信号进行放大和模数转换，测量出 被测物质及其浓度的装置。如何改进其性能是研究工作者们近年来努力的方向，基 于此，本论文主要研究了新型复合生物传感器平台的构建及应用，制备出了性能更 加优良的生物传感器。主要包括两部分内容：基于麦尔多拉蓝介孔碳复合材料的乙 醇生物传感器；基于介孔碳负载纳米铂的葡萄糖生物传感器。 利用介孔碳和电子媒介体之间快速的电子转移速率制备出新型的乙醇生物传 感器，首先将麦尔多拉蓝吸附到覆盖了介孔碳的电极表面，再将乙醇脱氢酶通过戊 二醛交联的方法固定到电极表面。在0 1v 的电位条件下，不受常见的活性物质及 低分子量醇的干扰，对乙醇的检测线性范围可达1 0m m ，并有很低的检出限( 1 9 1 1 t m ) 和较高的灵敏度( 3 4 5 8n a m m ) ，最重要的是，此乙醇生物传感器对于实际 样品的测定有着令人满意的结果。 将介孔碳作为催化剂载体制备了新型的葡萄糖生物传感器。介孔碳具有很大的 比表面积，能够担载更多的催化剂，并且两者之间协同作用能够使催化效果更加明 显。具体方法是将铂纳米粒子用化学还原法负载到介孔碳上，再滴涂于电极表面， 事实证明，此电极对于过氧化氢有更好的催化活性，基于这一点，我们通过电聚合 毗咯，将葡萄糖氧化酶以包埋于聚吡咯中的方式固定到电极表面，之后对制得的葡 萄糖生物传感器进行实验条件的优化。该生物传感器对葡萄糖的检出限为0 0 5m m ， 灵敏度为0 3 8 21 t a m m ，此电位下选择性和稳定性也较好，而且，其对于实际样品 的检测值与光谱法所测得的数值基本相符。 关键词：生物传感器；介孔碳；麦尔多拉蓝；铂纳米粒子；乙醇脱氢酶；葡萄糖氧化酶 a b s t r a c t ab i o s e n s o ri sa na n a l y t i c a ld e v i c ew h i c hc o n v e r t sab i o l o g i c a lr e s p o n s ei n t oa n e l e c t r i c a ls i g n a lu s i n gb i o l o g i cm a t e r i a l so ro r g a n i s ma st h em o l e c u l a rr e c o g n i t i o n s u b s t a n c e sa c c o r d i n gt ob i o c h e m i s t r ya n de l e c t r o c h e m i s t r yt h e o r y o v e rt h ep a s td e c a d e s ， m u c ha t t e n t i o nh a sb e e np a i dt oh o wt oi m p r o v et h ep e r f o r m a n c eo ft h eb i o s e n s o r s t o t h i se n d ，i nt h i sd i s s e r t a t i o n ，t w ok i n d so fn e wc o m p o s i t eb i o s e n s o rp l a t f o t i nh a v eb e e n c o n s t r u c t e da n de x p l o r e df o rt h ef a b r i c a t i o no fa m p e r o m e t r i ce t h a n o la n dg l u c o s e b i o s e n s o r s t h ee t h a n o lb i o s e n s o rw a sf a b r i c a t e db a s e do nm e l d o l a sb l u ef u n c t i o n a l i z e do r d e r e d m e s o p o r o u sc a r b o n ( m b o m c ) t h e m b o m cc o a t e d g l a s s y c a r b o ne l e c t r o d e ( m b o m c g c e ) w a sp r e p a r e db yn o n c o v a l e n ta d s o r p t i o no fm b o nt h es u r f a c eo fa n o r d e r e dm e s o p o r o u sc a r b o nc o a t e dg c e ( o m c g c e ) a l c o h o ld e h y d r o g e n a s e ( a d h ) w a st h e ni m m o b i l i z e do nt h em b o m c g c eb yc r o s s - l i n k i n gw i t hg l u t a r a l d e h y d ef o r t h ec o n s t r u c t i o no ft h ee t h a n o lb i o s e n s o r u n d e rt h eo p e r a t i o np o t e n t i a lo f - 0 1v ( v s a g a g c l ) ，t h ea sp r e p a r e db i o s e n s o rw a sh i g h l ys e l e c t i v ef o re t h a n o lw i t h o u ts u f f e r i n g a n yi n t e r f e r e n c ef r o ms o m ec o m m o ne l e c t r o a c t i v ec o m p o u n d sa n de x h i b i t e d aw i d e l i n e a rr a n g eu pt o10m mw i t hal o w e rd e t e c t i o nl i m i to f19 1l x ma sw e l la sah i g h s e n s i t i v i t yo f3 4 58n a m m m o r e o v e r ，t h ed e t e c t i o no f r e a ls a m p l e sw a sa l s os a t i s f i e d t h eg l u c o s eb i o s e n s o r ，b a s e do ne l e c t r o p o l y m e r i z a t i o no fg l u c o s eo x i d a s e ( g o d ) o nt h ep l a t i n u mn a n o p a r t i c l e s o r d e r e dm e s o p o r o u sc a r b o n ( p t o m c ) c o m p o s i t em o d i f i e d g o l de l e c t r o d e ，i sp r e s e n t e d t h e a u p t o m c e l e c t r o d ee x h i b i t e de x c e l l e n t e l e c t r o c a t a l y t i ca c t i v i t ya n dr a p i dr e s p o n s ef o rt h eo x i d a t i o n r e d u c t i o no fh 2 0 2i nt h e p r e s e n c eo ft h ep l a t i n u mn a n o p a r t i c l e sc o m p a r e dw i t ht h ea u o m c e l e c t r o d e a ss u c h ， w ei m p r o v e dt h eg l u c o s eb i o s e n s o rw h i c he x h i b i t e dal o w e rd e t e c t i o nl i m i to fo 0 5m m a sw e l la sa h i g hs e n s i t i v i t yo f0 38i t a m m i na d d i t i o n ，a n a l y t i c a ip a r a m e t e r ss u c ha s t h ee f f e c t so fp hv a l u e ，a p p l i e dp o t e n t i a l ，e l e c t r o a c t i v ei n t e r f e r e n t sa n dt h es t a b i l i t yo f t h eb i o s e n s o rw e r ea l s od i s c u s s e d t h ev a l u e so ft h ed e t e c t i o no fr e a ls a m p l e sa g r e e d w e l lw i t ht h o s eo b s t a i n e dw i t hs p e c t r o p h o t o m e t r y k e yw o r d s ：b i o s e n s o r ；o r d e r e dm e s o p o r o u s c a r b o n ；m e l d o l a sb l u e ；p l a t i n u m n a n o p a r t i c l e s ；a l c o h o ld e h y d r o g e n a s e ；g l u c o s eo x i d a s e n 独创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师指导下独立进行研究工 作所取得的成果。据我所知，除了特别加以标注和致谢的地方外，论文中不 包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。对本人的研究做出重要贡献的个 人和集体，均已在文中作了明确的说明。本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：毒蓝鲤 日期：2 塑皇业 学位论文使用授权书 本学位论文作者完全了解东：l k n 范大学有关保留、使用学位论文的规定， 即：东北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件 和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权东北师范大学可以将学位论文 的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复 制手段保存、汇编本学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：丕选鸯指导教师签名：三物基! 日 期：丞盟z 羔扣 日 期：浏! 弓i 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编： 东北师范大学硕士学位论文 1 1 生物传感器 第一章文献综述 1 1 1 生物传感器的定义及原理 生物传感器是一门由生物、化学、物理、电子技术等多种学科相互交叉渗透成 长起来的新学科，是指利用生物化学和电化学反应原理，用固定化的生物材料( 酶、 抗原、抗体、激素、d n a 、r n a ) 或生物体本身( 细胞、细胞器、组织) 作为敏感 元件将生化反应信号转化为电信号，通过对电信号进行放大和模数转换，测量出被 测物质及其浓度。传统的分析方法以化学法为主，常常包括一系列繁琐的操作过程， 而且周期较长，因此，具有分析速度快、操作简单、灵敏度和准确度高、选择性好、 检出限低、稳定性好及仪器价格低廉等特点的生物传感器受到广泛关注，尤其近年 来科学技术的迅猛发展，科研工作者们将生物传感器应用于生物、临床医学、农业、 军事和环境检测等领域中1 1 - 3 】，使得生物传感器的研究受到越来越多的重视。 生物传感器的传感原理如图1 1 所示，其构成包括两部分：生物敏感膜( 又称 分子识别元件) 和换能器。被分析物扩散进入固定化生物敏感膜层，经分子识别， 发生生物学反应，产生的信息继而被相应的化学换能器或物理换能器转变成可定量 和可处理的电信号，再经二次仪表( 检测放大器) 放大并输出，便可知道待测物浓 度。 1 1 2 生物传感器的分类 图1 1 生物传感器原理示意图 生物传感器的类型和命名方法较多且不统一，主要有两种分类法：分子识别元 件分类法和器件分类法【4 1 。 东北师范大学硕士学位论文 根据分子识别元件的不同可以将生物传感器分为七大类：酶传感器、免疫传感 器、组织传感器、细胞传感器、核酸传感器、微生物传感器、分子印迹传感器。 器件分类法是根据换能器不同对生物传感器进行分类，主要包括：电化学生物 传感器或生物电极、光生物传感器、热生物传感器、半导体生物传感器、电导阻抗 生物传感器、声波生物传感器、微悬臂梁生物传感器。 依据生物传感器的特性还有一些其他的命名或分类。如尺寸在微米级甚至更小 的生物传感器称为微型生物传感器、纳米生物传感器；凡是以分子之间特异识别并 结合为基础的生物传感器统称为亲和生物传感器；能够同时测定两种以上指标或综 合指标的生物传感器称为多功能传感器，如血液成分传感器；由两种以上不同的分 子识别元件组成的生物传感器或采用两种或多种反应原理构成的生物传感器称为 杂合生物传感器，如多酶传感器。 关于个别生物传感器的命名，一般采用“功能+ 构成特征”的方法，以符合 1 9 7 5 年国际纯化学和应用化学协会( i u p a c ) 分析化学分会命名委员会的推荐方法。 如：葡萄糖氧化酶电极、谷氨酸脱氢酶电极、b o d 微生物电极等。 1 2 酶生物传感器 1 2 1 酶生物传感器的定义及特点 电化学生物传感器是指由生物体成分( 酶、抗原、抗体、激素等) 或生物体本身 ( 细胞、细胞器、组织等) 作为敏感元件，电极( 固体电极、离子选择性电极、气敏 电极等) 作为转换元件，以电势或电流为特征检测信号的传感器。其中，以酶作为 分子识别器件的电化学生物传感器称为酶生物传感器。酶生物传感器是由一个固定 化的酶敏感膜和与之密切结合的电极组成的换能系统，它把固化酶和电极结合在一 起，因而具有以下独特的优点： ( 1 ) 它既有不溶性酶体系的优点，又具有电化学系统的高灵敏性； ( 2 ) 由于酶的专属反应性，使其具有很高的选择性，能够直接在复杂试样中进 行测定。 在众多关于生物传感器的报道中，约有8 5 的工作是关于酶生物传感器的，可 见其在生物传感器领域中占有多么重要的地位。本论文的主要工作都是围绕酶生物 传感器展开的，以下我们重点介绍一下酶生物传感器。 1 2 2 酶生物传感器的分类 当酶生物传感器浸入被测溶液后，溶液中的待测物质通过扩散进入酶膜，发生 酶促反应，产生或消耗一种电活性物质，这种物质与待测物质之间具有严格的化学 计量关系。电活性物质的产生或消耗量可以通过电位或电流模式进行检测。因此， 2 东北师范大学硕士学位论文 酶生物传感器可分为电势型和电流型两类。 电势型酶生物传感器是将酶促反应所引起的物质量的变化转化成电势信号输 出，电势信号的大小与底物浓度的对数值呈线性关系。基础电极能影响酶生物传感 器的响应时间、检出下限等性能。同时固定酶的膜层厚度、致密性、孔径大小、电 荷、亲水性、甚至形貌等与酶生物传感器的响应、稳定性、寿命也密切相关。电势 型酶生物传感器的使用范围不仅取决于底物的溶解度，更重要地取决于基础电极的 检测限，一般为1 0 。1 0 一m o l l 。 电流型酶生物传感器是指酶促反应产生的物质在电极上发生氧化或还原反应 产生的电流信号，在一定条件下，与被测物浓度呈线性关系。其发展主要包括三个 阶段：采用酶的天然介体氧的催化原理设计制作的酶传感器称为第一代酶生物传 感器；第二代酶生物传感器将人工合成的媒介体掺入酶层中，改进了分析参数并简 化了处理步骤，能进行无试剂的测量；在无媒介体存在下的条件下，利用酶与电极 之间的直接电子转移制作的生物酶传感器称为第三代酶生物传感器。也有人认为第 三代酶生物传感器包括传感体中的电子信号处理、微型化与多功能传感。 1 ) 第一代酶生物传感器一以氧为中继体的电催化 第一代酶生物传感器是1 9 6 2 年c l a r k t 5 1 首先提出的，采用酶的天然介体一氧来 沟通酶与电极之间的电子通道，直接检测酶反应底物的减少或产物的生成的传感 器。以葡萄糖氧化酶为例，第一代电流型酶生物传感器的响应机理如下( g o x ( 。x 1 和 g o x ( 托d 1 分别代表葡萄糖氧化酶的氧化态和还原态) ： 酶层：g g 啦o x ( o 删) + + g q u 篓三耄墨孑耐+ 6 啦硼 电极： 马q d 2 + 2 日+ + 2 e 可以通过此反应过程中氧含量的消耗量或者生成的h 2 0 2 浓度的增加来测定葡 萄糖的含量。 这种电极结构简单，适合微型化。但是具有以下缺点：( 1 ) 检测过程依赖于溶液 中氧的扩散速度、浓度及氧的含量，而氧的溶解度有限，当溶解氧贫乏时，响应电 流明显下降，从而影响检出限。( 2 ) 电极的响应性能受溶液的p h 值及温度影响很大。 ( 3 ) 电极测定h 2 0 2 的电位较高，试样中共存的还原性电活性物质给测定带来干扰， 因此该传感器的灵敏度和选择性相对较差。 为解决上述弊端，人们现在普遍采用的是第二代酶生物传感器即介体型酶生物 传感器。 3 东北师范大学硕士学位论文 2 ) 第二代酶生物传感器一介体型酶生物传感器 第二代生物传感器利用人工合成的电子介体代替氧，在酶和电极之间传递电 子，以电子介体修饰电极为基础进行电催化的传感器。 g l u c o s e g l u c o n i a c i d g o x ( 0 x ) g o x ( r e d ) m ( 删 m ( o x ) 图1 2 第二代葡萄糖生物传感器 e 以葡萄糖生物传感器为例，第二代生物传感器的响应、检测机理如图1 - 2 所示， 图中g o x ( 。x ) 、m ( 。x ) 和g o x ( r e d ) 、m ( r e d ) 分别代表葡萄糖氧化酶、电子媒介体的氧化态 和还原态： 电极： 2 m r 删一2 m r 甜) + 2 e 一 媒介体在近十年来得到了迅速发展，其种类也越来越多，按作用的机理主要可 分为两大类：( 1 ) 含有过渡金属元素的化合物或配合物，通过过渡金属的价态变化来 传递电子：( 2 ) 通过分子中的特殊官能团的结构变化来传递电子。这些化合物的共同 特点是都含有大兀键的环及与环相连的双键，这些双键容易打开与再形成，电子的 传递就是靠这些双键的打开与再形成来实现的。常见的媒介体主要有二茂铁及其衍 生物【6 - 1 0 1 、钌和锇等金属的配合物1 1 - 1 4 1 、钴酞菁【15 1 、铁氰化物【1 6 - 2 0 1 、金属卟啉【2 1 1 、 醌类【2 2 脚】、有机染料2 4 拼】、四硫富瓦烯( t t f ) 3 8 】、四氰基对醌二甲烷( t c n q ) 3 9 】、 紫精【4 0 】以及有机导电盐【4 1 】等。 使用电子媒介体作为酶促反应的受体，不仅避免了氧在电极上的还原，摆脱了 电极对氧的依赖性，而且由于工作电位受媒介体的氧化电位决定，使用低氧化电位 的电子媒介体，能够消除共存电活性物质在检测过程中对被分析物产生的干扰【4 2 。 4 3 1 。但该方法的缺点是：加入的媒介体易污染电极，影响电极的性能。 4 啦擅 瓮蕊如弛仍徽 东北师范大学硕士学位论文 3 ) 第三代酶生物传感器 利用酶在电极上的直接氧化或还原而构造成的生物传感器称为第三代酶生物 传感器。在这类生物传感器中，电子传输与氧和其它电子受体无关，无需任何媒介 体的加入。 以葡萄糖氧化酶为例，第三代生物传感器的响应及检测机理【4 4 1 如下： 酶层： g 啦。) + g l u c o s e g l u c o n i ca c i d + g o x ( 删) 电极： g o x ( r , a ) 一g o x , 。) + 2 日+ + 2 e 一 实现酶的直接电化学一直是生物电化学工作者们努力的方向，这对于研制非媒 介体的酶生物传感器是很有意义的。由于酶通常具有较大的分子量，酶分子的电活 性中心深埋在分子内部【4 副，且在电极表面吸附后易发生变形，所以酶与电极间难以 直接进行电子转移。到目前为止，仅有过氧化物酶【4 6 4 8 1 、氧化酶【4 9 引】、氢化酶和脱 氢酶【5 2 ，5 3 1 、对甲酚甲基羟化酶【5 4 1 、超氧化物歧化酶【5 5 ，5 6 1 等少数几种分子量相对较 小的酶，能够在电极上直接进行有效的电子转移。寻找更有效的方法和手段实现更 多酶的直接电化学，以满足生物医学，环境监测和工业快速分析的需要，必将称为 这个领域的发展趋势。 1 2 3 酶的固定化 早期的生物活性物质测量法，如酶分析法，是在水溶液中进行的，由于酶在水 溶液中一般不太稳定，且酶只能与底物作用一次，因此，使用起来很不方便。要使 酶作为生物敏感膜使用，必须研究如何将酶固定在各种载体上，这称为酶的固定化 技术。与游离相的酶相比，固定化酶具有以下优点：( 1 ) 当酶被固定化时，可以很快 从反应混合物中分离，并能重复使用；( 2 ) 通过合适地控制固定化酶的微环境( 即电 极表面) ，可获得很多要求的性质，如增加的稳定性、高灵敏度以及快速的响应等； ( 3 ) 在选择电极尺寸和形状方面具有较大的灵活性、易微型化或采用复杂的表面如网 状玻碳；( 4 ) 可防止溶液中其他物质的干扰和对电极表面的玷污等。 将酶固定在电极表面即在电极表面覆盖一层敏感膜。膜的厚度，致密性，均匀 度与分子排列的有序性等都对酶生物传感器的性能有影响。而且在固定过程中，既 要保持酶本身的固有特性，又要避免自由酶应用上的缺陷。因此酶的固定化技术决 定着酶生物传感器的稳定性、选择性和灵敏度等主要性能，同时也决定酶生物传感 器是否具有研究和应用价值。 为了研制价格低廉、灵敏度高、选择性好和寿命长的酶生物传感器，固定化技 术已成为世界各国竞相研究和探索的目标。经过二十多年的不断研究，已经建立了 5 东北师范大学硕士学位论文 多种酶固定化方法，目前，被广泛应用的主要有：吸附法、共价键合法、交联法、 包埋法和电化学聚合法等等。 1 2 3 1 吸附法 吸附法就是在基质表面直接吸附生物敏感试剂。这种方法的优点是操作简便， 无需化学试剂，极少的活化和清洗步骤，以及同其他化学法相比，很少发生酶降解， 对酶分子活性影响较小。z a i t s e v 等【57 j 曾采用卵磷脂( p c ) 溴化十六烷基三甲胺 ( c t a b ) 单层来吸附葡萄糖氧化酶；s r i y u d t h s a k 等【5 8 】分别采用花生酸( c 2 0 ) 、花 生酸甲酯( c 2 0 m e ) 、氧化十八烷三甲基铵( c 1 8 n ) 三种类脂在亚相中形成单层，然 后转移到含酶的溶液中，让酶吸附到类脂膜中，再将酶吸附的类脂单层转移到响应 过氧化氢的基体电极上，通过检测过氧化氢来估测葡萄糖的含量；s u a u d c h a g n y 和 g o r t o n 5 9 】采用微电极，在电化学沉积的b s a 蛋白质外鞘上吸附乳酸脱氢酶( l d h ) ， 在约1 5 0 小时的时间范围内，传感器对于n a d h 具有稳定和重现的响应；g o r t o n 等【6 0 】表明，作为媒介体的麦尔多拉蓝与酶在电极表面吸附的顺序对电极的响应具有 明显的影响，先吸附媒介体再吸附酶可以得到更好的电流响应和较低的噪音 吸附法的不足之处是对溶液的p h 变化、离子强度、温度及电极基底较为敏感， 而且由于酶与电极基底表面结合力弱，容易发生生物分子的泄漏，从而降低了传感 器的灵敏度及选择性，并进一步影响到了所制备传感器的使用寿命。所以这种固定 化方法在生物传感器的制备中应用范围比较j x 6 1j 。 1 2 3 2 共价键合法 共价键合法是通过共价键与不溶性载体结合而固定的方法。这种方法通常要求 在低温、低离子强度和生理p h 条件下进行，并常加入酶的底物以防止酶的活性部 位与电极表面发生键合。共价键合法的特点是结合牢固，蛋白质分子不易脱落，载 体不易被生物降解，使用寿命长。缺点是操作步骤较多，酶活性可能因为发生化学 修饰而降低，制备具有高活性的固定化酶比较困难。 载体包括无机载体和有机载体。有机载体如纤维素及其衍生物、葡萄糖、琼脂 粉、骨胶原等，、无机载体使用较少，主要有多孔玻璃、石墨等。 酶与载体共价键合有三种方式：( 1 ) 与载体直接反应连接；( 2 ) 通过同源双功能试 剂与载体连接；( 3 ) 通过异源双功能试剂与载体连接后再与载体反应连接。确定选择 哪种方法，需要了解酶的氨基酸残基的反应性、出现频率和可接近性。 根据酶与载体之间的共价结合形式可以有重氮法、肽键法、烷化法等，以重氮 法【6 弘6 6 j 较为多用。 在酶的共价固定中，尤其要注意保护活性中心的氨基酸。如果活性中心的氨基 酸残基在共价固定过程中被化学修饰，酶活性会下降。有效保护活性中心的方法有 6 东北师范大学硕士学位论文 两种：第一种方法是在共价反应之前加入酶的底物或底物结构类似物或竞争抑制 剂，将活性中心保护起来；第二种方法是结合使用共价反应的化学选择性和生物特 异性异源双功能试剂。这种双重选择性在某些条件下不仅能保护蛋白质活性部位， 还可能实现酶分子的定向固定。目前已经掌握了多种反应类型可以应用这种选择。 共价键合法是非常普遍应用的一种固定化方法，i a n n i e l l o 等【67 j 将石墨电极表面 经等离子体刻蚀或电化学氧化处理，在表面形成一系列含氧基团，这些基团被还原 为醇后，可被氰尿酰氯有效地活化，并通过与赖氨酸残基的共价键合而将酶固定在 电极表面；t h o m a s 等【6 8 】先将铂电极进行阳极氧化使其表面形成氧化物，然后与硅 烷化试剂反应，形成带胺基的表面基团，再与戊二醛反应，形成可以与葡萄糖氧化 酶赖氨酸残基发生反应的醛基，而将葡萄糖氧化酶固定在电极表面。 综上所述，采用共价键合法可以将酶有效地固定于电极表面或基质中，很好地 解决了酶在使用过程中的泄漏问题。总体上来说，利用这种方法制备的生物传感器 的使用寿命要比采用吸附法制备的传感器的寿命长，然而由于共价键的形成，在一 定程度上降低了酶活动的自由度，甚至影响到酶的化学结构而降低了酶的生物活 性，从而影响到了传感器的整体性能。 1 2 3 3 交联法 交联法是通过采用双功能团试剂，在酶分子之间、酶分子与凝胶聚合物之间交 联形成网状结构而使酶固定化的方法。双功能团试剂具有两个功能基团，能与蛋白 质中赖氨酸的一氨基、n 端的q 一氨基、酪氨酸的酚基或半胱氨酸的巯基发生共价交 联。可供交联的双功能团试剂有戊二醛、环己烷二异氰酸酯、n ，n l 双顺丁烯二酰亚 胺己烷、双环氧己烷、双亚胺甲酯、双重氮联苯胺一2 ，2 t _ 二磺酸、甲苯基一2 ，4 一二 异氰酸酯和2 ，4 ，6 一三氯一三氮杂苯等，其中以戊二醛最经常使用，它能与蛋白质 分子中的游离基形成s h i f t 碱而发生交联。 采用这种方法的局限性是膜的形成条件不易确定，须仔细地控制p h 、离子强度、 温度及反应时间。w i n g r a d 等【6 9 】研究表明交联膜的厚度及戊二醛的含量对传感器的 响应具有重要的影响。当膜较厚时，由于扩散受到阻碍，致使响应信号下降，响应 时间延长；戊二醛的浓度较低时，蛋白质溶液不会被固定化，而戊二醛的浓度较高 又会使酶失活；同时，双功能团试剂也可能不是选择性的，既可能发生分子间键合 又可能发生分子内键合。 s n 0 2 电极上的交联可负载比共价键合多1 5 0 倍的酶，尽管如此，灵敏度仅增加 3 0 倍，表明约8 0 的酶是非活性的，因此，可认为大多数非活性的酶是以某种方式 进行交联，在活性中心不能为底物所接近。很多研究工作【7 0 。7 8 】均采用牛血清蛋白 ( b s a ) 来产生酶膜，使用b s a 的原因是可让较多的分子间成键及防止酶分子过于拥 挤。当酶的浓度较低时，加入戊二醛难以发生分子间交联，只形成水溶性低聚物， 达不到固定酶的作用，因此，需要加入大量惰性蛋白质，当蛋白质浓度较高时，加 7 东北师范大学硕士学位论文 入戊二醛易发生酶与惰性蛋白质、蛋白质与蛋白质分子间的交联，形成非水溶性的 聚合物，最常用的惰性蛋白质是b s a ，因它含有丰富的赖氨酸残基，易与戊二醛作 用产生非水溶性的聚合物。 1 2 3 4 包埋法 包埋法是将酶分子包埋于高分子聚合物三维空间网状结构基质中，形成稳定的 酶敏感膜。用于包埋酶的高分子材料包括天然高分子和合成高分子。其中天然高分 子材料有琼脂糖凝胶、脂质体及纤维素等，合成高分子材料有聚甲基丙烯酸衍生物、 聚砜、聚吡咯及聚酰胺等。由于合成的灵活性、结构的预设性以及性质的多样性， 合成高分子材料在生物活性组分的固定化方面发挥了重要作用。可用于包埋酶的合 成高分子材料很多，若按结构特点和性能可分为电生聚合物、氧化还原型聚合物、 离子交换聚合物、高分子复合物和溶胶一凝胶材料等几种。 包埋法的特点是：( 1 ) 可采用温和的实验条件，一般不产生化学修饰；( 2 ) 对酶的 活性影响较小；( 3 ) 膜的孔径和几何形状可任意控制；( 4 ) 包埋的酶不易泄漏，可固定 高浓度的酶，并可采用其他固定技术如共价键合和交联进一步改善膜的稳定性。它 是目前使用最多的一种酶固定化方法。其缺点是：分子量大的底物在网格内扩散较 困难，因此不适合大分子底物的测定。 k a r y a k i n 等【7 9 】把葡萄糖氧化酶植入由水有机溶剂混合而成的n a t i o n 膜，然后 利用这种聚合物将酶固定。这种酶n a t i o n 溶液修饰到普鲁士蓝修饰的玻碳电极，可 以制备高灵敏度的葡萄糖传感器。鞠烷先等【8 0 】提出了一种简易的气相沉积新方法制 备了二氧化钛凝胶。通过这种方法在电极表面制备二氧化钛凝胶膜，同时固定辣根 过氧化酶，制备过氧化氢传感器响应快、检出限低。 1 2 3 5 电化学聚合法 用电化学聚合法制备生物传感器通常在中性溶液中进行。在酶、聚合单体、介 体和辅酶同时存在时，通过恒电势或电势循环扫描法使单体氧化或还原聚合到基础 电极上。聚合过程中由于吸附或静电作用，酶或介体等其他物质同时嵌入聚合膜中。 与传统的固定化方法相比，有以下优点：( 1 ) 简单，电化学聚合和酶的固定化可 一步完成并直接固定于电极表面；( 2 ) 聚合层厚度和酶的聚合量容易控制和调节，从 而制得重现性好的电极；( 3 ) 有些高分子膜具有选择性透过某些物质的功能，可起到 降低干扰，防止电极污染的作用。 k a n u n g o 等 8 1 】采用聚苯乙烯磺酸盐聚苯胺复合物来固定酶，这种复合物是在聚 碳酸酯膜风化后的气孔中合成的，在聚合的同时固定上酶。它与经典的聚苯胺膜传 感器相比，有更大的线性响应范围和更短的响应时间。s u n g 和b a e 8 2 j 将葡萄糖氧化 酶掺杂在聚吡咯中，一起电聚合制备灵敏膜。酶在共价聚合后保持了它原来的活性， 8 东北师范大学硕士学位论文 由这种方法修饰的电极，检测浓度大于2 0m m o l l 的葡萄糖时，有很灵敏的电流信 号，而且响应时间也小于3 0 秒。同样j 在有辅酶喹啉苯醌存在的情况下，对聚吡 咯进行电聚合就能制备硫醇传感器【8 3 1 。固定在聚吡咯膜中的辅酶的电化学性质是受 电聚合电势影响的，而且膜的厚度能影响辅酶的灵活性。 1 2 4 酶的作用机理 1 2 4 1 降低反应活化能 在一个封闭的反应体系中，反应开始时，反应底物分子的平均能量水平较低， 为初态，只有少数分子具有比初态更高一些的能量。使这些分子进入活化态( 或过 渡态) ，才能进行反应，这些活泼的分子称为活化分子。反应中，活化分子越多， 反应速度就越大。而活化能是指在一定温度下，1m o l 底物全部进入活化态所需要 的自由能。酶能够大幅度的降低反应所需的活化能，这样，大量的反应物分子就比 较容易地进入活化态，从而使反应在常温下极快地进行。与一般的催化剂相比，酶 催化使活化能降低幅度更大，如丁酸乙酯的水解，氢离子催化时，活化能为7 0 2 2 4 k j m o l ，而胰脂酶催化时，活化能仅为1 8 8 1 0k j m o l 。 1 2 4 2 酶的辅助因子 单纯酶是基本组成单位仅为蛋白质的一类酶。它的催化活性仅仅决定于它的蛋 白质结构。脲酶、消化道蛋白酶、淀粉酶、酯酶、核糖核酸酶等均属此列。结合酶 的催化活性，除蛋白质部分( 酶蛋白) 之外，还需要非蛋白质的物质，或还需要一 些其他物质的参与才能发挥作用，即所谓的酶的辅助因子。辅助因子包括金属离子 和有机化合物，它们构成酶的辅基或辅酶，与酶蛋白共同组成全酶。脱去辅基的酶 蛋白不含有催化活性，称为脱辅基酶蛋白。辅基与辅酶没有严格的区别，一般地， 与酶蛋白松弛结合的辅助因子称为辅酶，可以通过透析法除去；与酶蛋白牢固结合 的辅助因子称为辅基，如黄素单核苷酸和许多金属离子。大约5 0 的酶都需要以金 属离子为辅酶，它们称为金属酶，如碱性磷酸酶的辅助因子为z n 2 + 和m 9 2 + 。z n 2 十 还是碳酸酚酶、d n a 聚合酶、r n a 聚合酶等几十种酶的必须成分。常见的有机化 合物辅助因子有脱氢酶的辅酶n a d + ( 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸) 和n a d p + ( 烟酰胺 腺嘌呤二核苷磷酸) ，各种过氧化物酶的辅酶铁卟啉( 亚铁血红素) ，酰基转移酶 的辅酶辅酶a ，还有黄素单核苷酸( f m n ) 和黄素腺嘌呤二核苷酸( f a d ) ，它们 是许多氧化还原酶的辅酶，在氧化还原反应中起着传递氢的作用。辅助因子通常存 在于酶的活性中心部位，对酶的催化起重要作用。 9 东北师范大学硕士学位论文 1 2 4 3 酶的活性中心 酶分子中直接与底物结合，并催化底物发生化学反应的部位，称为酶的活性中 心，它往往位于分子表面的凹穴中。对不需要辅酶的酶来说，活性中心就是酶分子 中在三维结构中空间位置相邻的几个氨基酸残基共同构成的。对需要辅酶的酶分子 来说，辅酶分子，或辅酶分子上的某一部分结构往往就是活性中心的组成部位。活 性中心的各基团与附近的其他残基有序地排列，使得这个部位的空间结构恰好适合 与底物分子直接紧密接触，并具有适宜的非极性微环境，以利于基团间发生静电作 用。一般认为，酶的活性中心包括两个功能部位：一个是结合部位，是酶与底物结 合的基团，决定酶的专一性；另一个是催化部位，催化底物敏感键发生化学变化的 基团，决定酶的催化能力。但这两个部位并不是各自独立存在的，而是相互联系的。 1 2 4 4 “邻近 效应和“定向”效应 “邻近 效应指两个反应分子的反应基团需要互相靠近才能反应。曾经测到过 某底物在溶液中的浓度为0 0 0 1m o l l ，而在某酶的活性中心的浓度竟达1 0 0m o l l ， 比溶液中的浓度高一万倍。但是仅仅“邻近还不够，还需要两个将要反应的集团 的分子轨道交叉，而交叉的方向性极强，称为“定向 。这样就使得两个分子间的 反应变为分子内的反应，提高了反应速率。 生物体系中的许多反应属于双分子反应，在酶的作用下，原游离存在的反应物 分子被结合在活性中心，彼此靠得很近，并且分子轨道也按确定的方向发生一定的 偏转，使反应易于进行。有人估计，“邻近 效应和“定向”效应可能使反应速度 增长上亿倍。 1 2 4 5 酶与底物结合模型 真正认识酶是从1 9 世纪开始的，对酶的催化特性和催化作用理论进行了广泛 的研究。酶一般是通过其活性中心氨基酸侧链基团，先与底物形成一个中间复合 物，随后再分解成产物，释放出酶。酶的活性部位是它结合底物和将底物转化为产 物的区域，通常是整个酶分子中相当小的部分，它是由在线性多肽链中可能相隔很 远的氨基酸残基形成的三维实体。酶活性部位的活性残基与底物分子结合，首先将 它转化为过渡态，然后生成产物。 目前有两种模型解释酶如何与它的底物结合：( 1 ) 锁和钥匙模型：1 8 9 0 年e m i l f i s h e r 提出底物和酶的活性部位形状像钥匙插入锁中一样，当正确组合在一起时， 正好相互补充，底物分子或底物分子的一部分就像钥匙一样，只有契合到特定的活 性中心部位的某一适当位置，才能与酶分子形成中间复合物，顺利地进行催化反应。 就是说，一把锁只能被一把钥匙打开，或是被在构象上相近的钥匙打开。只有可以 l o 东北师范大学硕士学位论文 进入活性中心并与酶分子形成中间产物的底物分子才可被酶催化；不能进入活性中 心，或者虽然可进入中心但不能与酶分子形成中间复合物的物质，均不能被催化。 这个理论虽然可能解释酶与底物的结合和催化，但是无法解释酶催化的逆反应。( 2 ) 诱导契合模型：1 9 5 8 年，d k o s h l a n d 提出底物的结合在酶的活性部位诱导出构象 变化。当酶分子与底物分子接近时，酶蛋白受底物分子的诱导，其构象发生有利于 底物结合的变化，酶与底物在此基础上互补契合，它说明了酶作用的专一性。经诱 导契合形成酶与底物复合物，一部分结合能被用来使底物发生形变，使敏感键更易 于破裂而发生反应。 1 3 介孑l 材料 如何制备出性能更加优异的生物传感器一直是科研工作者们研究的方向，根据 某些材料的特殊性质制备复合生物传感器，其灵敏度，检出限，稳定性都得到了很 大程度上的改善。介孔碳就是其中之一，其催化和负载两项功能可以提高传感器的 灵敏度，降低检出限，增强稳定性，并且，在工作电位下还可以排除常见活性物质 的干扰，大大提高了传感器的选择性。本论文正是基于介孔碳制备了乙醇和葡萄糖 的生物传感器，并详细研究了电极性能的变化。下面我们具体介绍一下介孔材料和 介孔碳。 1 3 1 介孔材料 根据国际纯粹和应用化学联合会( i u p a c ) 的建议【8 4 1 ，按照孔径大小，多孔材料 可以分为以下3 种：微孔( 5 0n m ) 。微孔材料一 般都有较规则的孔道，比表面积很大，但由于孔径太小，故而并不适合于对有机大 分子的催化与吸附作用。大孔材料的孔径大，但比表面积相对较小。早期的介孔材 料，孔径范围较大，但却存在着孔道形状不规则、孔径尺寸分布范围大等缺点。 有序介孔材料的合成早在七十年代就已经开始了瞵5 1 ，日本的科学家们在1 9 9 0 年也已经开始了它的合成工作【8 6 1 。1 9 9 2 年，m o b i l 公司关于m c m 4 1 等介孔材料的 报道引起人们广泛的注意【8 7 驯】。这些新颖的介孔材料突破了原有沸石分子筛孔径范 围过小的局限，孔径从微孔扩展到介孔领域，为人们从微观角度去研究纳米材料的 小尺寸效应、表面效应及量子效应提供了理想的物质基础，所以这种材料一经产生， 就引起了物理学界、化学界及材料学界的高度重视。 介孔材料的研究和开发对理论研究和实际生产应用均有显著意义。介孔材料的 诱人之处在于它具有一些其它多孔材料所不具备的优异性质【9 2 】： ( 1 ) 具有高度有序的孔道结构，基于微观尺度上的孔道高度有序性； ( 2 ) 孔径呈单一分布，且孔径尺寸可以在很宽的范围内调控( 1 3 3 0n m ) ； ( 3 ) 可以具有不同的结构、孔壁( 骨架) 组成和性质，介孔可以具有的不同形状； 东北师范大学硕士学位论文 ( 4 ) 经过优化合成条件或后处理，可具有很好的热稳定性和水热稳定性； ( 5 ) 无机组分的多样性； ( 6 ) 高比表面，高孔隙率； ( 7 ) 颗粒可能具有规则外形，可以具有不同形体外貌( 微米级) ，并且可控制； ( 8 ) 在微结构上，介孔材料的孔壁为无定形，这与微孔分子筛的有序骨架结构 有很大差别，但是这并不意味着孔壁一定不存在微孔； ( 9 ) 广泛的应用前景，如大分子催化、生物过程、选择吸附、功能材料等。 1 3 2 介孔碳 介孔碳是最近发现的一类新型的非硅基介孔材料，1 9 9 9 年，有序介孔碳被首次 报道，r y o o 等以蔗糖为碳源，用m c m 4 8 为模板首次合成出有序介孔碳c m k 1 【9 3 1 。 这种有序介孔碳在x r d 小角区呈现三个狭窄的衍射峰，显示出c m k 1 具有较高的 有序介孔分布。c m k l 开启了介孔碳材料发展的新高潮。随后，除了使用蔗糖外， r y o o 还合成了一系列不同构型和形貌的有序介孔碳纳米管( c m k 5 【9 4 】，c m k 9 【9 5 】) 和介孔碳纳米棒( c m k - 2 9 6 1 ，c m k 3 【9 7 1 ，c m k - 4 9 8 1 ，c m k 8 【9 5 1 ) 。 碳的纳米材料，尤其是碳纳米管，在吸附一分离、催化、色谱分析、能量储存 等方面具有广泛的应用价值，因而受到人们的密切关注【9 9 0 1 2 】。但碳纳米管也有它的 不足之处，就是它孔径分布不均匀。而有序介孔碳为非硅系材料，具有规则排列的 孔道结构，较大的比表面积、有序的孔径分布面【1 1 3 ，1 1 4 1 ，化学稳定性比较好【9 7 1 ，所 以被广泛应用于催化、储氢、分离、提纯和吸附大分子等领域【1 1 5 1 1 7 】。 有序介孔碳材料具有高比表面积和吸附容量，是一种理想的吸附材料。目前人 们已经利用其吸附性能来分离有机大分子、生物大分子和重金属离子【1 18 1 。一般生物 大分子如蛋白质、酶、核酸等，当它们的分子质量大约在1 1 0 0 万之间时尺寸小 于1 0n l t l ，相对分子质量在1 0 0 0 万左右的病毒其尺寸在3 0n i n 左右。有序介孔碳材 料的孔径可大范围内连续调节和无生理毒性的特点使其非常适用于酶、蛋白质等的 固定和分离。 有序介孔碳可以加速生物分子和底物之间的电子转