（分析化学专业论文）毛细管电泳非接触式电导在线富集技术及其应用研究.pdf

毛细管电泳一非接触式电导在线富集技术及其应用研究专业：分析化学姓名：魏瑞霞指导老师：谢天尧副教授摘要迅速发展于上世纪8 0 年代中后期的毛细管电泳具有分离效率高、分析速度快、操作简单、样品用量少等优点，成为分离分析科学中最活跃研究技术之一。但由于毛细管的小内径，进样体积小，采用光学检测器时光程短，灵敏度较低，使毛细管电泳在痕量组分分析受到很大限制。如何提高检测的灵敏度，一直是分析工作者关注的重点问题之一。目前，提高毛细管电泳检测灵敏度的主要方法有：设计特殊构型的检测池、使用高灵敏度的检测器、采用离线预富集技术和在线富集技术等。其中前三种技术由于操作复杂，耗时，分析成本高等原因进一步发展的潜力受到限制，而在线富集技术仅对样品、背景缓冲溶液的组成以及进样程序进行简单的调控( 无需对仪器进行改造) 即可实现，富集倍数可达到几十倍到百万倍，极大提高了分析灵敏度，将毛细管电泳的应用拓展到痕量分析的领域。在线富集技术可应用于毛细管电泳的多种分离模式，分析对象由阴、阳离子到中性分子，在众多领域都显示出广阔的应用前景。此外，电导检测作为一种通用型的检测方法，具有操作成本低，线性范围宽，死体积小等优点，倍受关注。其中非接触式电导检测器由于电极不与溶液直接接触，从而有效地避免了电极污染和吸附以及高压电场对检测信号的干扰等问题，成为近年来的研究热点之一。本文将在线富集技术和非接触式电导检测二者结合起来，以防腐剂和化妆品添加剂为研究对象，开展了毛细管电泳在线富集方法的初步探索。本文共分三章，主要内容和方法如下：1 概述了毛细管电泳的基本理论和毛细管电泳中样品在线富集技术的原理及应用状况。2 建立了场放大样品堆积毛细管电泳非接触式电导测定酱油中的苯甲酸和山梨酸的新方法。采用c z e 模式，以未涂层融硅石英毛细管( 4 5c m 5 0 比m ，有效长度为4 0c m ) 为分离柱，2 0m m o l l h a g ：+ 6m m o l l t r i s + 0 2m m o l l c t a b为电泳运行液，分离电压1 5 0k v , 进样电压1 4 0k v , 苯甲酸和山梨酸在1 0r a i n 内获得良好分离，检出限分别为4 0 x1 0 7m o l l 和1 s x1 0 7m o l l ，灵敏度分别提高了1 4 8 倍和2 3 5 倍。详细考察了缓冲体系组成、浓度、p h 、进样时间以及操作电压对灵敏度和分离度的影响。该方法简单、迅速、富集效率高，应用于市售酱油中防腐剂( 苯甲酸和山梨酸) 的测定，取得满意结果。3 建立了胶束扫集毛细管电泳非接触式电导测定化妆品中邻苯二甲酸二甲酯( d m p ) 和邻苯二甲酸二乙酯( d e p ) 的新方法。采用m e c c 分离模式，以8m m o l lc i t + 1 4m m o l lh 3 8 0 3 + 1 6m m o l ld b s + 1 4 c h 3 0 h ( v v ) 和8m m o l lc i t + 1 4m m o l lh 3 8 0 3 + 1 6m m o l ld b s + 1 2 c h 3 c o c h 3 0 h ( v v ) 作为电泳运行液分别检测了中性分子d m p 和d e p 。实验对影响富集效果的主要因素进行了详细的讨论。在优化的s w e e p i n g m e c c 条件下，d m p 和d e p 可实现快速检测，重现性较好，检出限分别为2 0m g l * l0 9m g l ，与传统的m e c c方法相比，两者的富集倍数分别达到1 0 0 倍和1 5 0 倍。应用于化妆品添加剂( d m p 和d e p ) 的测定，结果满意。关键词：毛细管电泳；在线富集；非接触式电导检测：防腐剂；化妆品添加剂ns t u d yo nt h eo n - l i n ep r e c o n c e n t r a t i o nt e c h n i q u ef o rc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sw i t hc o n t a c t l e s sc o n d u c t i v i t yd e t e c t i o na n da p p l i c a t i o n sm a j o r ：a n a l y t i c a lc h e m i s t r yn a m e ：w 毡ir u i x i as u p e r v i s o r ：a s s o c i a t ep r o f e s s o rx i et i a n y a oa b s t r a c tc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ( c e ) h a sr a p i dd e v e l o p m e n ts i n c et h el a t e1 9 8 0 s f o rt h ea d v a n t a g e so fh i g hr e s o l u t i o n ，h i g he f f i c i e n c y , s h o r ta n a l y s i st i m e ，s i m p l i c i t ya n dl o ws a m p l ec o n s u m p t i o n ，i tb e c o m e so n eo ft h em o s ta c t i v et e c h n o l o g i e si nt h es e p a r a t i o ns c i e n c e h o w e v e r , b e c a u s eo ft h es m a l ld i m e n s i o n so fc a p i l l a r i e s ，o n l yv e r ys m a l ls a m p l ev o l u m e sm a yb el o a d e do n t ot h ec o l u m n a d d i t i o n a l l y , t h er e d u c e dp a t hl e n g t hh i n d e r sc o m m o no p t i c a ld e t e c t i o nm e t h o d s t h e s el i m i tt h ea p p l i c a t i o no fc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i si nd i l u t ea n a l y t em i x t u r e s o v e r c o m i n gt h ep o o rs e n s i t i v i t yo fc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sh a sb e e nt h ee m p h a s i so fm a n yi n v e s t i g a t i o n s m a n ym e t h o d sh a v eb e e nd e v e l o p e dt oi m p r o v et h es e n s i t i v i t yo fc ei nr e c e n ty e a r s ，w h i c hi n c l u d et h ei n s t a l l a t i o no fc a p i l l a r i e se q u i p m e n tw i t he x t e n d e dd e t e c t i o np a t h l e n g t h b e s i d e s ，t h e r ea r ea p p l i c a t i o n so fh i g hs e n s i t i v i t yd e t e c t o r , o f f - l i n es a m p l et e c h n i q u e sa n do n 。l i n es a m p l ep r e c o n c e n t r a t i o nt e c h n i q u e s e x c e p tf o rt h el a s tm e t h o d ，t h eo t h e r ss h o ws m a l lp o t e n t i a lf o rc o m p l e xo p e r a t i o n s ，a n a l y s tt i m ec o n s u m i n gp r o c e d u r e so rh i g hc o s t s w i t h o u tr e f o r m i n gt h ei n s t r u m e n t ，o n 1 i n es a m p l ep r e c o n c e n t r a t i o nt e c h n i q u e sc a nb ea c c o m p l i s h e db yc o n t r o l l i n gp r o c e d u r e so fi n j e c t i o ns a m p l e ，t h ec o m p o s i t i o no ft h eb a c k g r o u n db u f f e ra n ds a m p l em a t r i x t h i sm e t h o dn o to n l yi ss a m p l e ，e c o n o m i c a la n dp r a c t i c a l ，b u ta l s og r e a t l yi m p r o v e st h el l ls e n s i t i v i t y s ot h ea p p l i c a t i o no fc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sh a sb e e ne x t e n d e dt ot h ea n a l y s i so fd i l u t ea n a l y t em i x t u r e s a tt h es a m et i m e ，o n - l i n ep r e e o n c e n t r a t i o nt e c h n i q u e sc a nb ea p p l i e dav a r i e t yo fc em o d e st oa n a l y z ea n i o n sa n dc a t i o n sa n dt h en e u t r a lm o l e c u l e i tw o u l db eu s e dc o m m o n l yi nt h ef u t u r e i na d d i t i o n ，m a n yr e s e a r c h e r sp a ym o r ea t t e n t i o nt oa ne l e c t r i c a lc o n d u c t i v i t yd e t e c t o r , f o ri th a ss o m eb e n e f i t si n c l u d i n gl o wo p e r a t i o nc o s t ，w i d el i n e a rr a n g ea n dl i t t l ed e a dv o l u m e i np a r t i c u l a rt h er e c e n t l yd e v e l o p e dc a p a c t i v e l yc o u p l e dc o n t a c t l e s sc o n d u c t i v i t yd e t e c t o rb e c o m e so n eo fr e s e a r c hh o t s p o t s f o rt h ee l e c t r o d ec o n t a c t sw i t ht h es o l u t i o ni n d i r e c t l y ，t h ec o n t a c t l e s sc o n d u c t i v i t yd e t e c t o re f f e c t i v e l ye l i m i n a t e san u m b e ro fq u e s t i o n so fe l e c t r o d ea d s o r b e da n dp o l l u t e d ，t h ed e a c t i v a t i o na n dt h ed i s t u r b a n c eo fh i i g he l e c t r i cf i e l d i nt h i st h e s i s ，t h ec a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sm e t h o d sf o rs e p a r a t i o na n dd e t e c t i o no fp r e s e r v a t i v e sa n dc o s m e t i ca d d i t i v ew e r ed e v e l o p e d a n do n l i n ep r e c o n c e n t r a t i o nt e c h n i q u e sa n dc o n t a c t l e s sc o n d u c t i v i t yd e t e c t i o nw e r eu s e dt oi m p r o v et h es e n s i t i v i t yo ft h ea n a l y t i c a lm e t h o d s t h e r ea r et h r e ec h a p t e r si nt h et h e s i s t h ef o l l o w i n g sa r em a j o rc o n t e n t sa n dm e t h o d s ：1 t h eb a s i ct h e o r yo fc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sw a se x p l a i n e d a sw e l l ，t h ep r i n c i p l eo fo n l i n es a m p l ep r e c o n c e n t r a t i o nt e c h n i q u ei nc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sa n di t sa p p l i c a t i o n sw e r er e v i e w e d 2 an e wm e t h o do fs i m u l t a n e o u sd e t e r m i n i n gb e n z o i ca c i da n ds o r b i ca c i di ns o yb yc a p i l l a r yz o n ee l e c t r o p h o r e s i sw i t hf i e l da m p l i f i e ds a m p l es t a c k i n g ( f a s s )a n dc a p a c i t i v ec o u p l e dc o n t a c t l e s sc o n d u c t i v i t yd e t e c t i o nw a se s t a b l i s h e d t h em o d eo fc a p i l l a r yz o n ee l e c t r o p h o r e s i sw a su s e d t h eb e n z o i ca c i d ，s o r b i ca c i dw e r ew e l ls e p a r a t e dw i t h i n1 0 m i nw i t ha nu n c o a t e df u s e d s i l i c ac a p i l l a r y ( 4 5c mx5 0 t mi d ，k 行= 4 0c m ) u n d e rt h eo p t i m u mc o n d i t i o n s ：2 0m m o l lh a c + 6m m o l lt r i s + 0 2m m o l lc t a ba st h er u n n i n gb u f f e r , - 1 5 0k vs e p a r a t i o nv o l t a g ea n d 一1 4 0k vi n j e c t i n gv o l t a g e t h ec a l i b r a t i o nc u r v ef o rb e n z o i ca c i d ，s o r b i ca c i ds h o w e dt h el o d = 4 0 x 1 0 7m o l la n d1 5 x 1 0 - 7m o l l , r e s p e c t i v e l y u pt 0 1 4 8a n d2 3 5f o l di m p r o v e m e n tw e r ea c h i e v e db ya p p l y i n gf a s sf o ro n l i n es a m p l ep r e c o n c e n t r a t i o n ，i vr e s p e c t i v e l y e f f e c t so fs e v e r a lf a c t o r sw e r ed i s c u s s e di nd e t a i l ，s u c ha st h ec o m p o n e n to ft h er u n n i n gb u f f e r , t h ep hv a l u e ，i n j e c t i o nt i m ea n ds e p a r a t i o nv o l t a g e ，a n ds oo n t h ep r o p o s e dm e t h o d ，a p p l i e dt ot h ed e t e r m i n a t i o no fp r e s e r v a t i v e s ( b e n z o i ca c i da n ds o r b i ca c i d ) i nc o m m e r c i a ls o yw a sd e m o n s t r a t e ds i m p l e ，r a p i da n dh i g hc o n c e n t r a t i o ne f f i c i e n c y 3 an e wm i c e l l ee l e e t r o k i n e t i cc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sm e t h o dw a se s t a b l i s h e dw h i c hw a sw i t ho n - l i n es w e e p i n gc o n c e n t r a t i o na n dc a p a c i t i v ec o u p l e dc o n t a c t l e s sc o n d u c t i v i t yd e t e c t i o nf o rt h ed e t e r m i n a t i o no fd i m e t h y lp h t h a l a t e ( d m p ) a n dd i e t h y lp h t h a l a t e ( d e p ) i nc o s m e t i cp r o d u c t s w i t h i nt h er u n n i n gb u f f e ro f8m m o l lc i t + 1 4m m o l lh 3 8 0 3 + 1 6m m o l ld b s + 1 4 c h 3 0 h ( v v ) a n d8m m o l lc i t + 1 4m m o l lh 3 8 0 3 + 1 6m m o l ld b s4 - 1 2 c h 3 c o c h 3 0 h( v v ) ，t h en e u t r a lm o l e c u l e sd i m e t h y lp h t h a l a t ea n dd i e t h y lp h t h a l a t ew e r ed e t e c t e dr e s p e c t i v e l y e f f e c t so fm a i np a r t sf o rc o n c e n t r a t i o nf a c t o rw e r ei n v e s t i g a t e di nd e t a i l -u n d e rt h eo p t i m u mc o n d i t i o n s ，d m pa n dd e pc a nb eu pt o1 0 0a n d1 5 0f o l d ，c o m p a r e dw i t ht h et r a d i t i o n a lm e c c ，r e s p e c t i v e l y t h el o do fd m pw a s2 0m 叽a n dt h ed e ps h o w e d0 9m g l w i t h o u tp r e t r e a t m e n t ，t h ec o m m e r c i a lt o i l e tw a t e rw a si n j e c t e di n t ot h ec o l u m nd i r e c t l y t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ep r o p o s e dm e t h o d ，a p p l i e dt ot h ed e t e r m i n a t i o no fc o s m e t i ca d d i t i v e ( d m pa n dd e p ) w a sc o n v e n i e n t ，r a p i d ，g o o dr e c o v e r ya n dr e p r o d u c i b l e k e y w o r d s ：c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ；o n l i n ep r e c o n c e n t r a t i o n ；e o n t a c t l e s sc o n d u c t i v i t yd e t e c t i o n ；p r e s e r v a t i v e s ；c o s m e t i ca d d i t i v ev原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：兹勉端i 廖日期：如o 年石月日知识产权保护声明本人郑重声明：我所提交答辩的学位论文，是本人在导师的指导下完成的成果，该成果属于中山大学化学与化学工程学院，受国家知识产权法保护。学期间与毕业后以任何形式公开发表论文或申请专利，均需由导师作为通讯联系人，未经导师的书面许可，本人不得以任何方式，以任何其它单位作全部或局部署名公布学位论文成果。本人完全意识到本声明的法律责任由本人承担。学位论文作者签名：劫包揣穷日期：如o 年多月日学位论文使用授权声明本人完全了解中山大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版，有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆、院系资料室被查阅，有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索，可以采用复印、缩印或其他方法保存学位论文。学位论文作者签名：日期：p 年多月躺隹导师签名：否日日期：测d-日中山大学硕士论文毛细管电泳一非接触式电导在线富集技术及其应用研究第一章绪论毛细管电泳( c e ，c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ) ，又称高效毛细管电泳( h p c e ，h i 【曲p e r f o r m a n c ec a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ) 是一类以毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，以样品的多样性( 电荷、大小、等电点、极性、亲和行为、相分配特性等) 为依据的液相微分离技术【。它具有分离效率高、分析速度快、样品用量少、应用范围广和便于自动化等优点，迅速发展于上世纪8 0 年代中后期，成为2 0 多年来发展最快的一种技术。1 1 毛细管电泳简介1 1 1 毛细管电泳的发展简史毛细管电泳的发展历史可追溯到上世纪6 0 年代或者更早。为克服传统电泳的高电压引起的焦耳热，1 9 6 7 年，h j e r t e n t 2 】最先提出采用内径为3 0 0 z m 的毛细管在高电场下进行自由溶液的区带电泳，但仍未完全克服传统电泳的弊端。1 9 8 1年，j o r g e n s o n 和l u k a c s l 3 , 4 1 采用7 5 z m 熔融石英毛细管作分离通道，对丹酰化氨基酸实现了高效、快速分离；并首次论证了毛细管区带电泳的可观分离度，创立了现代毛细管电泳。1 9 8 4 年，t e r a b e 5 j 等开辟了胶束电动毛细管色谱，将胶束引入毛细管电泳中分离中性组分，扩大了毛细管电泳的应用范围，毛细管电泳开始向多种分离模式发展。1 9 8 7 年，h j e r t e n l 6 】等建立毛细管等电聚焦( c i f ) 。同年，c o h e n 和k a r g e r i 7 l 发表了毛细管凝胶电泳( c g e ) 的工作，分离效率达到百万理论塔板数。随着毛细管电泳技术的不断发展，毛细管电泳分析仪器也逐渐完善，1 9 8 8 年以来，c e 的商品化仪器逐步推出，进一步促进了毛细管电泳技术的不断改进及发展。现在，毛细管电泳技术已成为一种非常普遍的微量分析方法。1 1 2 毛细管电泳的基本原理电泳是带电粒子在电场作用下在一定介质( 溶剂) 中所发生的运动。带电粒中山大学硕士论文毛细管电泳一非接触式电导在线富集技术及其应用研究第一章绪论毛细管电泳( c e ，c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ) ，又称高效毛细管电泳( h p c e ，h i 【曲p e r f o r m a n c ec a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ) 是一类以毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，以样品的多样性( 电荷、大小、等电点、极性、亲和行为、相分配特性等) 为依据的液相微分离技术【。它具有分离效率高、分析速度快、样品用量少、应用范围广和便于自动化等优点，迅速发展于上世纪8 0 年代中后期，成为2 0 多年来发展最快的一种技术。1 1 毛细管电泳简介1 1 1 毛细管电泳的发展简史毛细管电泳的发展历史可追溯到上世纪6 0 年代或者更早。为克服传统电泳的高电压引起的焦耳热，1 9 6 7 年，h j e r t e n t 2 】最先提出采用内径为3 0 0 z m 的毛细管在高电场下进行自由溶液的区带电泳，但仍未完全克服传统电泳的弊端。1 9 8 1年，j o r g e n s o n 和l u k a c s l 3 , 4 1 采用7 5 z m 熔融石英毛细管作分离通道，对丹酰化氨基酸实现了高效、快速分离；并首次论证了毛细管区带电泳的可观分离度，创立了现代毛细管电泳。1 9 8 4 年，t e r a b e 5 j 等开辟了胶束电动毛细管色谱，将胶束引入毛细管电泳中分离中性组分，扩大了毛细管电泳的应用范围，毛细管电泳开始向多种分离模式发展。1 9 8 7 年，h j e r t e n l 6 】等建立毛细管等电聚焦( c i f ) 。同年，c o h e n 和k a r g e r i 7 l 发表了毛细管凝胶电泳( c g e ) 的工作，分离效率达到百万理论塔板数。随着毛细管电泳技术的不断发展，毛细管电泳分析仪器也逐渐完善，1 9 8 8 年以来，c e 的商品化仪器逐步推出，进一步促进了毛细管电泳技术的不断改进及发展。现在，毛细管电泳技术已成为一种非常普遍的微量分析方法。1 1 2 毛细管电泳的基本原理电泳是带电粒子在电场作用下在一定介质( 溶剂) 中所发生的运动。带电粒中山大学硕士论文毛细管电泳一非接触式电导在线富集技术及其应用研究子在单位电场下的电泳速度称为淌度。毛细管电泳是以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组成成分之间淌度和分配行为上的差异，而实现分离的一类液相分离技术。在毛细管中，其内壁的s i o h 解离为硅氧基( s i o )阴离子与h + ，h + 与h 2 0 形成h 3 0 + 使溶液( 缓冲溶液，电解质) 带正电，硅氧基吸引溶液中阳离子使其聚集在自己周围形成所谓的“双电层”。在高压作用下毛细管中的溶液整体向负极移动，形成电渗流( e l e c t r o o s m o t i cf l o w ，e o f ) ( 如图1 - 1 ) 。施加高压电场后，带电粒子在毛细管中受到电场和电渗双重作用，因此正、负离子迁移速度是其电泳速度和电渗流速度的矢量和。对于正离子，两种效应的方向一致，在负极最先流出；而中性粒子，无电泳现象，仅受电渗流影响，在阳离子后流出；阴离子的两种效应运动方向相反；v 电洛漉 v 电泳时，在负极最后流出。所以，样品各组分按其迁移速度大小的不同，依次到达检测器分别检出，从而得到随时间分布的电泳谱图，然后分别以其迁移时间( t ) 和峰高( h ) 或峰面积( a ) 作为定性和定量分析。0 o 00o 固no o o 0o 三一e 善善匿写礅+ o 伊u 伊膨帕扩o o o o o oo 力0o o og图1 - 1 毛细管壁引起的电渗流f i g 1 - 1t h ee l e c t r o o s m o t i cf l o wc a u s e db yc a p i l l a r yw a l l由于电渗流可以控制组分的迁移速度和方向，直接影响到c e 的分离效率和重现性，所以对它的控制是c e 研究的关键。影响电渗流的因素很多，如外加径向电场强度、毛细管内径、缓冲溶液组成及其p h 、温度、湿度、添加剂等。稳定的电渗流是提高分离重现性的关键，改变电渗流大小则可调节分离度、提高选择性和灵敏度，从而使待测组分达到最佳分离分析。c e 中，用以评价表观淌度相近的组分分开能力的是分离度( r s ) ，可以通过读取c e 谱图上相邻两峰的迁移时间( t ) 和峰宽( w ) ，利用式( 1 - 1 ) 计算得到，当r s = 1 5 时，表明相邻的两峰完全分开，即两组分实现完全分离。r s ；2 粤( 1 - 1 )职+ 彬中山大学硕士论文毛细管电泳一1 接触式电导在线富集技术及其应用研究式中，t 为样品组分的迁移时间，形为峰底宽，下标1 ，2 表示相邻的两个峰。1 1 3 毛细管电泳的分离模式随着毛细管电泳技术研究的不断深入，毛细管电泳的分离模式也朝多方向发展，现在，h p c e 包括多种灵活的分离模式【8 9 1 。1 1 3 1 毛细管区带电泳( c a p i l l a r yz o n ee l e c t r o p h o r e s i s ，c z e )毛细管区带电泳是目前c e 中最简单、应用最广泛的一种分离模式。它仅在毛细管中充入缓冲溶液，基于离子或荷电粒子在背景运行液中淌度差异进行分离，在食品、化学、生物科学、环境、药学及临床医学等诸多领域均有广泛应用。1 1 3 2 胶束电动毛细管色谱( m i c e l l a re l e t r o k i n e t i cc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，m e c c )胶束电动毛细管色谱是在缓冲液中加入其浓度大于临界胶束浓度的离子型表面活性剂，表面活性剂的单体结合在一起，形成胶束，待测物质在水和胶束相之间发生分配并随电渗流在毛细管内迁移，达到分离。它是电泳技术与色谱技术的巧妙结合，既用于带电组分1 1 皿1 2 】的分离，又用于中性物质【1 3 - 1 5 j 的分离，从而拓宽了毛细管电泳的应用范围。1 1 3 3 毛细管凝胶电泳( c a p i l l a r yg e le l e c t r o p h o r e s i s ，c g e )毛细管凝胶电泳是在毛细管中装入单体，引发聚合形成凝胶，基于溶质分子大小与荷质比的差异进行分离。由于凝胶粘度大，抗对流，能减少溶质的扩散，因此所得谱带窄，峰形尖锐；凝胶可以有效地防止溶质在毛细管壁的吸附并减少电渗流。它是毛细管电泳中柱效最高的一种模式，理论塔板数可达到1 0 7 。主要应用于蛋白质和核酸【1 6 ，1 7 】等生物大分子的检测。1 1 3 4 毛细管等电聚焦电泳( c a p i l l a r yi s o e l e c t r i cf o c u s i n g ，c i e f )毛细管等电聚焦电泳是将普通等电聚焦电泳转移到毛细管中进行，通过内壁涂层使电渗流减到最小，在两个电极槽中分别装入酸、碱，施加高压后，在毛细管内建立p h 梯度，溶质在毛细管中向各自的等电点迁移，形成明显的区带，3中山大学硕士论文毛细管电泳一非接触式电导在线富集技术及其应用研究依据各分析组分等电点的不同而实现分离。聚焦后，用压力或改变检测器末端电极槽储液的p h 使溶质通过检测器实现检测。它已经成功用于测定蛋白质的分离 1 s , 1 9 1 与鉴定【驯等。1 1 3 5 毛细管电色谱( c a p i l l a r ye l e c t r oc h r o m a t o g r a p h y ，c e c )毛细管电色谱是将高效液相色谱中的固定相微粒填充到毛细管中，以样品与载体之间的相互作用为主要分离机制，电渗流为流动相驱动力，依据分配系数的不同使物质分离。它综合了c e 和h p l c 的优势，可同时分离带电离子和中性分子，在药物分析中已取得良好的应用。1 1 3 6 亲和毛细管电泳( a f f i n i t yc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，a c e )亲和毛细管电泳是上世纪九十年代出现的一种将亲和作用与毛细管电泳结合起来的分离模式，是在缓冲液或毛细管内加入亲和试剂，利用生物分子和其他受体分子与其相应的专一可逆特性来进行分离。此模式可用于研究抗原抗体或配体受体等特异性相互作用的结合常数、结合位点数等。1 1 3 7 毛细管阵列电泳( c a p i l l a r ya r r a ye l e c t r o p h o r e s i s ，c a e )毛细管阵列电泳是在常规毛细管电泳原理和技术的基础上，结合微型制造技术设计出来的一种检测技术，是将几十根甚至上百根等长的毛细管平行并列在一起，同时分离检测大量样品，具有单个样品分析成本低的优点，尤其适合于复杂生物样品的分离分析。1 1 3 8 芯片毛细管电泳( c h i pc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，c c e )芯片毛细管电泳是将传统毛细管电泳技术与微电机加工技术相结合的分离分析技术。利用微加工技术，在c m 2 级的芯片上刻蚀出通道和其它的功能单元等各种微细结构，以高压直流电场为驱动力，实现样品的分离检测。它具有高效、快速、耐用性好、成本低、系统体积小等优点，已用于d n a l 2 1 1 、氨基酸【勿、核酸【2 3 】等的检测与分析，具有广阔的应用前景。1 1 4 毛细管电泳的检测技术毛细管电泳存在多种潜在检测方法，如光吸收法、电导法、化学发光、磷光、荧光、质谱技术等。由于毛细管电泳中溶质区带超小体积的特性，对检测器灵敏4中山大学硕士论文毛细管电泳一非接触式电导在线富集技术及其应用研究度要求相当高，因此检测技术成为毛细管电泳的关键问题之一。应用较广泛的几种检测器的各自特点如下( 表1 1 ) ：表1 - 1 不同检测方法的特点检测方法优点缺点方法成熟，绝大多数商品仪器的主由于毛细管电泳的吸收光程短而难紫外吸收力检测手段以达到高灵敏度检测器的价格贵且常需要对组分进荧光检测可提高检测的灵敏度行衍生化，属1 e 普适性方法激光诱导灵敏度高，能达到单分子检测水平，仅适合具有荧光的样品或易于荧光荧光选择性好衍生的样品，检测器价格高电导检测通用性好，灵敏度高检测系统的制作和重现性有待改进灵敏度高，选择性好，线性范围宽，只用于电活性物质分析，需要专门的安培检测仪器简单器件和毛细管改性操作简单，适用于小的阴、阳离子由于其容易致使峰变形，且重现性相电位检测检测对较著，使其在分析中虑州较少发光的试剂系统不稳定，检测需要混化学发光灵敏度极高合过程，使用不方便间接紫外比直接紫外检测通用比直接紫外检测灵敏度低，分离的重光检测现性著灵敏度高，专属性强，并能提供分尚无c e 专用的检测器，均以联用的质谱子结构信息方式实现柱后检测1 1 5 毛细管电泳的进样方法毛细管的容量很小，只允许进纳升级溶液，因此为使c e 实现高效，需采用无死体积的进样方法，即毛细管直接与样品接触，由重力、电动力或其他驱动力使样品流入管中。常用的进样方法有电动进样、压力进样和扩散进样，其各自的进样原理及特点如表1 2 所示：表1 2 常用进样方法的进样原理和特点压力进样进样电动进样重力加压负压扩散进样方法进样进样进样利用电场作为驱利用利用压力差将样调整样品池高度，使其液面与毛细管进样动力，依靠电渗流虹吸品压入管内，或出口端的液面严格水平，利用进样端和样品离子自身原理者使毛细管两端管口处样品溶质与毛细管中电解质原理的电迁移将样品进样产生位差缓冲溶液存在浓度梯度的原理使样注入品直接扩散进入管内优势普适性方法，能完没有进样歧视现象较好的定量特性，较强的抗样品基质5中山大学硕士论文毛细管电泳非接触式电导在线富集技术及其应用研究全自动化干扰和一定的抗区带电场畸变能力局限进样时存在组分选择性差，只适合自由溶工作效率慢性歧视液的电泳模式1 1 6 毛细管电泳的特点1 1 6 1 毛细管电泳的优点毛细管电泳将经典电泳技术和现代微柱分离有机的结合，可以与高效液相色谱互为补充，但是它自身具有突出的优点：( 1 ) 分离效率高：毛细管电泳在外电场力驱动下产生的电渗流为平头塞状( 图1 2 a ) ，与h p l c 中的泵推动产生的抛物线流型( 图1 2 c ) 不同，它使整个流体像塞子一样以均匀的速度向前运动，克服h p l c 中泵推动产生的抛物线流型导致的溶质区带扩散作用。毛细管电泳的柱效可达到1 0 5 1 0 6 理论塔板数米，c g e 可达到1 0 7 理论塔板数米以上。q -图1 2c e 中的电渗流型和h p l c 中的泵推流型及相应的溶质区带f i g 1 2p r o f i l e so fe l e c t r o o m o t i cf l o wi nc ea n dp u m p - d r i v e nf l o wi nh p l ca n dc o r r e s p o n d i n gd e t e c t i v ez o n e sa ：电渗的塞状流型b ：c e 中检测区带分布c ：泵推动抛物线流型d ：h p l c 中检测区带分布( 2 ) 分析速度快：由于c e 具有良好的散热性，在其两端可施加高达3 0k v的分离电压，毛细管纵向电场强度可达4 0 0v c m 以上，因此可在几十秒至十几分钟内完成一次分离。( 3 ) 样品用量少：毛细管的内径很小，进样体积仅在n l 级，c e 的样品用量仅为h p l c 的几百分之一。6中山大学硕士论文毛细管电泳、非接触式电导在线富集技术及其应用研究( 4 ) 应用模式多：可根据不同样品的特点选择不同的分离模式，可实现一机多用。( 5 ) 适用范围广：可用于分离分析离子( 无机、有机离子) 、小分子( 氨基酸、药物等) 、生物活性大分子及各种颗粒( 细胞、硅胶颗粒) 等。( 6 ) 分析成本低、污染少：实验中仅需毛细管和少量缓冲液流动相，而h p l c则要消耗价格昂贵的色谱柱和大量的流动相。1 1 6 2 毛细管电泳的局限性毛细管电泳显著的优点使其在2 0 世纪后期被广泛应用于诸多领域。但由于毛细管内径一般为2 5 1 5 0 m ，进样体积小，在柱检测的光程短，通用型紫外检测器虽能达到很低的质量检出限，但样品的浓度检出限通常比h p l c 高几个数量级，使c e 在痕量组分分析中受到很大限制。如何提高检测灵敏度是毛细管电泳技术发展中至关重要的问题。1 2 毛细管电泳的在线富集技术1 2 1 毛细管电泳在线富集技术的意义为满足痕量分析的要求，经过分析工作者不懈的探索与研究，近年发展起来的提高检测灵敏度的方法主要有3 种：对检测池的构型进行特殊的设计，通过增加检测光程来提高灵敏度，如使用矩形检测池【2 4 、z 型检测池【2 5 , 2 6 】、泡状检测澍2 7 ，2 8 】、袖状检测池1 2 9 1 等。此法可以将紫外检测的灵敏度提高1 0 倍至几十倍。但是这种方法的制作过程复杂，并且毛细管内径的改变或连接易造成样品谱带展宽，降低c e 的分辨率，重现性差，不易获得推广，进一步发展的潜力较小。使用高灵敏度的检测