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d n a 类物质在离子液体修饰电极上的电化学分析 d n a 类物质在离子液体修饰电极上的电化学分析 摘要 脱氧核糖核酸( d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d ，d n a ) 是遗传信息的承担者和基因 表达的物质基础，在生物体的生长、发育、繁殖、遗传、变异和转化等生命过程 中具有十分重要的作用。在生命科学中，研究d n a 的电化学行为具有重要的理 论意义和实践意义。室温离子液体( r o o mt e m p e r a t u r ei o n i cl i q u i d s ，r t i l s ) 是一 类在室温或接近温度下为液体，且由阴、阳离子组成的有机类化合物。与其它溶 剂相比，室温离子液体有许多独特的理化性质，因而被誉为“绿色溶剂”且广泛 应用于化学研究的很多领域。本文制备了不同的离子液体修饰电极，研究了d n a 类物质在离子液体修饰电极上的直接电化学行为。论文主要包括以下内容： 1 制备了两种离子液体修饰碳糊电极。分别以室温离子液体六氟磷酸正丁基 吡啶( b p p f 6 ) 和1 乙基3 甲基咪唑四氟硼酸盐( e m i m i b f 4 ) 完全或部分代替 传统石蜡为粘合剂与石墨粉相混合制备了新型的离子液体修饰碳糊电极 ( c i l e ) 。采用扫描电子显微镜( s e m ) 和电化学法对离子液体修饰碳糊电极进 行了表征和研究，并与传统碳糊电极( c p e ) 进行了比较。实验结果表明：与c p e 相比，c i l e 的电流响应明显增加；同时c i l e 具有较好的机械强度和很好的稳定 性。 2 开展了d n a 类物质在c i l e 上的直接电化学行为研究。利用循环伏安法研 究了热变性单链d n a ( s s d n a ) 、双链d n a ( d s d n a ) 、腺嘌呤( a ) 、鸟嘌呤( g ) 等在b p p f 6 离子液体修饰碳糊电极上的直接电化学行为，并和c p e 进行了比较。 还以 e m i m b f 4 离子液体修饰电极为基底电极，将多壁碳纳米管( m w c n t s ) 修饰于该电极表面，进一步研究了鸟苷在m w c n t s c i l e 离子液体修饰电极上的 电化学特性。实验结果表明，离子液体修饰电极对这些物质有很好的电催化能力。 考查了p h 值、扫速、富集时间、富集电位对氧化峰峰电流和峰电位的影响，求 解了相关的电化学参数如电子传递系数a 、反应速率常数麟、电子转移数n 和表 面吸附量r 等。在最佳实验条件下，待测物质的峰电流与浓度在一定范围内成线 性关系，共存物质如常见的嘌呤类物质、金属离子、氨基酸等的存在对测定几乎 没有影响。 3 研究了邻苯二酚在b p p f 6 离子液体修饰电极上的电化学行为，实验结果表 明该修饰电极对邻苯二酚的电化学氧化有很好的催化作用。在p h3 0 的缓冲溶液 d n a 类物质在离子液体修饰电极上的电化学分析 中，邻苯二酚在离子液体修饰电极上可产生一对良好的氧化还原峰，氧化还原峰 电位分别为3 8 7m v ( e p a ) 和3 3 0m v ( z p c ) ，峰电位差为5 7m v ( v s s c e ) 。计 算了相关的电化学参数，电极反应的电子转移速率缸为1 2 7s 一，电子转移系数g t 为0 5 8 ，参加反应的电子数n 为2 。在所选实验条件下，氧化峰电流与邻苯二酚 的浓度在1 o 1 0 击到8 0 1 0 4m o l l 范围内成正比，检测限为6 0 1 0 7m o l l ( 3 0 ) 。该修饰电极对混合溶液中的邻苯二酚与抗坏血酸可以进行同时测定并成 功应用于模拟样品的测定。 关键词：d n a ，邻苯二酚，室温离子液体，碳纳米管，碳糊电极，直接电化学 u 青岛科技大学研究生学位论文 e l e c t r o c h e m i c a la n a i 二y s i s0 fd n ar e l a t e d s u bs t a n c e so ni o n i cl i q u i dm o d i f i e de l e c t r o d e a bs t r a c t d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d ( d n a ) i st h ec a r r i e ro fg e n e t i ci n f o r m a t i o na n dt h e m a t e r i a lb a s i so fg e n ee x p r e s s i o n i th a sv e r yi m p o r t a n tf u n c t i o n si nl i f ep r o c e s s e s ， s u c ha sg r o w t h ，d e v e l o p m e n t ，b r e e d i n g ，h e r e d i t y , a b e r r a n c ea n dc o n v e r s i o n t h es t u d y o nt h ee l e c t r o c h e m i c a lb e h a v i o ro fd n ai so fi m p o r t a n tt h e o r e t i c a la n dp r a c t i c a l s i g n i f i c a n c ei n l i f e s c i e n c e r o o mt e m p e r a t u r ei o n i cl i q u i d s ( r t i l s ) ，w h i c ha r e c o n s i s t e do fal a r g eo r g a n i cc a t i o nw i t haw e a kc o o r d i n a t i o na n i o n ，h a v ea t t r a c t e dt h e i n t e r e s t so fe l e c t r o c h e m i s tf o rt h e i rs p e c i f i cp r o p e r t i e s a sag r e e ns o l v e n t ，r t i l sc a n b eu s e da st h es u p p o r t i n ge l e c t r o l y t eo rt h em o d i f i e dm a t e r i a l sf o re l e c t r o d e i nt h i s t h e s i st h ee l e c t r o c h e m i c a li n v e s t i g a t i o no nd n aa n di t sr e l a t e ds u b s t a n c e sw e r e c a r r i e do u tb ye l e c t r o a n a l y t i c a lm e t h o d t h ep a p e rc a nb es u m m a r i z e da sf o l l o w s ： 1 t w or o o mt e m p e r a t u r ei o n i cl i q u i d s ( r t i l s ) m o d i f i e dc a r b o np a s t ee l e c t r o d e s ( c p e ) w e r ec o n s t r u c t e db a s e do nt h es u b s t i t u t eo fp a r a f f i nw i t hn - b u t y l p y r i d i n i u m h e x a f l u o r o p h o s p h a t e ( b p p f 6 ) o r1 - e t h y l - - 3 - m e t h y l i m i d a z o l i u m t e t r a f l u o r o b o r a t e ( e m i m b f 4 ) t om i xw i t hg r a p h i t ep o w e r t h eo p t i m a lc o n d i t i o n sf o rp r e p a r a t i o nw e r e s e l e c t e da n dt h es u r f a c em o r p h o l o g i e so ft h ec a r b o ni o n i cl i q u i de l e c t r o d e ( c i l e ) w e r e s c a n n e db yas c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p y t h ee l e c t r o c h e m i c a lb e h a v i o r so ft h e c i l ew e r ei n v e s t i g a t e db yu s i n gk 3 f e ( c n ) 6 a sp r o b ea n dc o m p a r e dw i t ht h a to f t r a d i t i o n a lc p e i tw a sf o u n dt h a tt h ec i l es h o w e dg o o de l e c t r o c a t a l y t i ca c t i v i t yt o e l e c t r o c h e m i c a lr e s p o n s e ，w h i c hw a sa t t r i b u t e dt ot h ep r e s e n c eo fi l so nt h ee l e c t r o d e s u r f a c ea n dt h ec i l es h o w e dg o o dm e c h a n i cp r o p e r t ya n ds t a b i l i t y 2 t h ee l e c t r o c h e m i c a lb e h a v i o r so fs s d n a ，d s d n a ，a d e n i n ea n dg u a n i n eo nt h e c i l ew e r ei n v e s t i g a t e db yt h ec y c l i cv o l t a m m e t r y , a n dt h er e s u l t sw e r ec o m p a r e dw i t h t h a to ft h ec p e t h em w c n t s c i l ew a sf a b r i c a t e db ya p p l y i n gm u l t i - w a l l e dc a r b o n i d n a 类物质在离子液体修饰电极上的电化学分析 n a n o t u b e s ( m w c n t s ) o n t h e 1 - e t h y l 3 m e t h y l i m i d a z o l i u m t e t r a f l u o r o b o r a t e ( e m i m b f a ) m o d i f i e dc a r b o ni o n i cl i q u i de l e c t r o d e ( c l l e ) a n du s e df o rt h e i n v e s t i g a t i o no fg u a n o s i n e t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ec i l ee x h i b i t e dag r e a t r e s p o n s eo fe l e c t r o c a t a l y t i ca c t i v i t yw i t ht h ei n c r e a s eo ft h ep e a kc u r r e n t sa n dt h e n e g a t i v es h i f to ft h ep e a kp o t e n t i a l si nc o n t r a s tt ot h a to nt h et r a d i t i o n a lc p e t h e e l e c t r o c h e m i c a lp a r a m e t e r ss u c ha st h ec h a r g et r a n s f e rc o e f f i c i e n t ( 0 c ) ，t 1 1 ee l e c t r o n t r a n s f e rn u m b e r ( n ) ，t h ee l e c t r o d er e a c t i o ns t a n d a r dr a t ec o n s t a n t ( 如) a n dt h es u r f a c e c o n c e n t r m i o no ft h ee l e c t r o a c t i v es u b s t a n c e ( f ) w e r ef u r t h e rc a l c u l a t e d u n d e rt h e s e l e c t e dc o n d i t i o n s ，t h ep e a kc u r r e n t si n c r e a s e dl i n e a r l yw i t ht h ec o n c e n t r a t i o ni na c e r t a i nr a n g e t h em o d i f i e de l e c t r o d es h o w e dg o o ds t a b i l i t ya n dr e p r o d u c i b i l i t y w i t h o u tt h ei n f l u e n c eo ft h ec o e x i s t i n gs u b s t a n c e s 3 t h ed i r e c to x i d a t i o no fc a t e c h o lw a ss t u d i e db vc i l e i np h3 0p h o s p h a t e b u f f e rs o l u t i o n ( p b s ) ap a i ro fr e d o xp e a k sa p p e a r e do nt h ec i l ew i t ht h ea n o d i ca n d t h ec a t h o d i cp e a kp o t e n t i ml o c a t e da t3 8 7m va n d 3 3 0m v ( v s s c e ) ，r e s p e c t i v e l y t h e e l e c t r o c h e m i c a lb e h a v i o r so fc a t e c h o lo nt h ec i l ew e r ec a r e f u l l yi n v e s t i g a t e da n dt h e e l e c t r o c h e m i c a lp a r a m e t e r sw e r ec a l c u l a t e dw i t ht h er e s u l t so ft h ee l e c t r o d er e a c t i o n s t a n d a r dr a t ec o n s t a n tk sa s1 2 7s ，t h ec h a r g et r a n s f e rc o e 简c i e n t0 【a s0 5 8a n dt h e e l e c t r o nt r a n s f e rn u m b e rna s2 u n d e rt h es e l e c t e dc o n d i t i o n s ，t h ea n o d i cp e a kc u r r e n t i n c r e a s e dl i n e a r l yw i t ht h ec a t e c h o lc o n c e n t r a t i o no v e rt h e r a n g eo f1 0 10 击t o 8 0 xlo _ m o l lb yc y c l i cv o l t a m m e t r ya tt h es c a nr a t eo f10 0m w s n l ed e t e c t i o nl i m i t w a sc a l c u l a t e da s6 0 x10 叫m o l l ( 3 0 ) t h ec i l es h o w e dg o o da b i l i t yt os e p a r a t et h e e l e c t r o c h e m i c a lr e s p o n s e so fc a t e c h 0 1a n da s c o r b i ca c i d ( a a ) w i t ht h ea n o d i cp e a k p o t e n t i a ls e p a r a t i o na s2 5 2m vf w s c e ) t h ep r o p o s e dm e t h o dw a sf u r t h e ra p p l i e dt o t h es y n t h e t i cs a m p l e sd e t e r m i n a t i o nw i t hs a t i s f a c t o r yr e s u l t s k e yw o r d s ：d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d ，c a t e c h o l ，r o o m t e m p e r a t u r ei o n i cl i q u i d s ， c a r b o nn a n o t u b e s ，c a r b o np a s t ee l e c t r o d e ，d i r e c te l e l c t r o c h e m i s t r y i v d n a 类物质在离子液体修饰电极上的电化学分析 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得其他教育机构的学位或证书 使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了 明确的说明并表示谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 本人签名：右音卑 签字日期炒 年6 月j s 日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人 授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。本人离校后发表或使用使用 学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名单位仍然为青岛科技大 学。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 本学位论文属于： 保密口，在年解密后适用于本声明。 不保密囵。 本人签名： 导师签字： 耆音辱 劢c 串 i 签字日期：卅年i ，月i 岁日 签字日期：加1 年6 月j 歹日 青岛科技大学硕士生学位论文 第一章文献综述弟一早义陬琢尬 脱氧核糖核酸( d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d ，简称d n a ) 是重要的生命物质，是生 物遗传信息的主要载体，生物体的结构和生化功能是由其体内的d n a 中所包含 的遗传信息决定的。因此研究d n a 的结构和功能，可以从分子水平上了解生命 现象的本质，解释各种药物的作用机理，而有关d n a 的研究也就成为分子生物 学和生物化学的重要课题。2 0 0 3 年人类基因组测序草图的完成，标志着人类在揭 示生命奥秘、认识自我的漫漫长路上又迈出了重要的一步。对人类基因草图的分 析已经使人们开始对遗传疾病的基因识别，以及在疾病过程中扮演重要作用的单 个碱基变异的识别进行研究。这些发现已对临床疾病的诊断产生了深远的影响， 疾病基因水平上的诊断必然要求快速、准确地测定d n a 。 1 1d n a 的研究进程 核酸是1 8 6 8 年瑞士科学家f m i e s c h e r 首先从富含白细胞的脓中分离得到的， 1 9 3 9 年e k n a p p 等第一次证明它是遗传的物质基础，1 9 4 4 年o t a v e r y 等证实了脱 氧核糖核酸( d n a ) 的功能。1 9 5 3 年w a t s o n 和c r i c k t l 】创立的d n a 双螺旋结构模型， 标志着生物科学的发展进入了分子生物学阶段，成为现代分子生物学发展史上最 为辉煌的里程碑。它不仅阐明了d n a 分子的结构特征，更重要的是它还提示了 d n a 的复制机制，通过碱基互补配对，保证了d n a 复制能够精确地进行。从此核 酸研究受到了前所未有的重视。 双螺旋结构创始人之一的c r i c k 于1 9 5 8 年提出的分子遗传中心法则揭示了核 酸与蛋白质问的内在关系，以及r n a 作为遗传信息传递者的生物学功能。遗传 信息从d n a 传递给r n a ，再从r n a 传递给蛋白质的转录和翻译的过程，以及 遗传信息从d n a 传递给d n a 的复制过程，即d n a n r n a 蛋白质的遗传信息流 向，这是所有有细胞结构的生物所遵循的法则。1 9 7 7 年，m a x a m 和g i l b e r t 的化 学降解法，s a n g e r 的末端终止法使大片段d n a 顺序快速测定技术得到了迅猛发 展，成为核酸结构与功能研究中不可缺少的分析手段。2 0 0 3 年中、美、日、英、 法、德六国科学家完成了人类基因组图谱的绘就，是人类探索自身奥秘史上的 一个重要里程碑，从此人类进入了生物技术世纪。 d n a 类物质在离子液体修饰电极上的电化学分析 图1 1d n a 双螺旋结构示意图 f i g 1 - 1t h es c h e m a t i cd i a g r a mo f d n ad o u b l eh e l i xs t r u c t u r e 1 2d n a 的结构和性质2 】 1 2 1d n a 的组成与结构 在活细胞中含有大量d n a 与r n a 核酸分子，这些分子是核苷酸的多聚体。 核苷酸由核苷与磷酸组成，而核苷又分解成戊糖( 核糖与脱氧核糖) 和碱基。d n a 是由脱氧核糖、磷酸和四种含氮碱基( a 、g 、c 、t ) 组成的，其组成如图1 2 所示。碱基、核苷和核苷酸均由于碱基内的共轭双键的存在而在波长2 4 0 2 9 0 n m 具有强烈的紫外吸收特性。 ，磷酸 i d n a 脱氧核苷酸1 d 2 脱氧核糖 脱氧核苷r 腺嘌呤 ( a ) l 碱基j鸟嘌呤 ( g ) 1胞嘧啶 ( c ) l 胸腺嘧啶( t ) 图1 - 2d n a 的组成 f i g 1 - 2t h ec o n s t i t u t i o no fd n a 2 青岛科技大学硕士生学位论文 ( 1 ) d n a 的一级结构 d n a 的一级结构是指d n a 分子中脱氧核苷酸之间的连接顺序以及它们在 d n a 分子中的排列顺序。即四种核苷酸( 也蝴p 、d c m p 、d g m p 、d t m p ) 按照 一定的排列顺序，通过磷酸二酯键连接形成的多核苷酸，由于核苷酸之间的差异 仅仅是碱基的不同，故又可称为碱基顺序。d n a 由多条脱氧核糖核苷酸链构成， 每条链均以磷酸基( 磷酸酯键) 为桥，从一个核苷的3 连接到相邻核糖的5 位置 上，这就是d n a 的一级结构。 ( 2 ) d n a 的二级结构 1 9 5 3 年，w a t s o n 和c r i c k 在前人工作基础上提出了著名的d n a 双螺旋结构 模型( 即d n a 的二级结构) ：d n a 分子由两条多脱氧核糖核酸链组成，每条链 的骨架由3 ，5 磷酸二酯键将脱氧核苷基连接而成。链的内侧是碱基，两条链以 反平行方向盘绕同一条轴形成右旋的双螺旋结构。主链的骨架由脱氧核糖和磷酸 基组成处在双螺旋的外侧，由于糖和磷酸根的化学性质，d n a 主链的骨架是亲水 性的。而嘌呤和嘧啶碱基处于双螺旋的内侧，由氢键连接在一起，碱基之间依 照碱基互补配对原则，a 与t 配对，可形成两个氢键；g 与c 配对，可形成 三个氢键，只要一条链上的碱基序列确定，另一条互补链的碱基序列也就随 之被确定了。碱基互补配对是d n a 双螺旋结构的主要特征。 ( 3 ) d n a 的三级结构 d n a 的三级结构是指在双螺旋基础上分子的进一步扭曲或再次螺旋所形成 的构象，包括不同二级结构单元间的相互作用，单链与二级结构单元问的相互作 用以及d n a 的拓扑特征。其中，超螺旋是最常见也是研究最多的d n a 三级 结构。根据螺旋的方向可分为正超螺旋和负超螺旋。正超螺旋使双螺旋结构 更紧密，双螺旋圈数增加，而负超螺旋可以减少双螺旋的圈数。由于d n a 双螺旋为右旋，负超螺旋( 左旋) 有利于双螺旋解旋，自然界存在的环状 d n a 几乎全是负超螺旋。 1 2 2d n a 的物化性质 ( 1 ) 溶解性 d n a 为白色纤维状固体，微溶于水，其钠盐在水中溶解度较大。不溶于一般 有机溶剂如乙醇、乙醚、氯仿、戊醇和三氯乙酸等。d n a 能被乙醇或异丙醇 沉淀。在酸性溶液中不稳定，易破坏，在中性及碱性溶液中很稳定。 ( 2 ) d n a 酸碱性质 碱基上含有酮基的核苷酸有酮式和烯醇式的互变异构现象。在体内核酸 结构中酮式占优势，这对于核酸分子中氢键的形成是很重要的。当溶液的p h 3 d n a 类物质在离子液体修饰电极上的电化学分析 值大于4 时，多核苷酸分子呈多阴离子状态，这种多阴离子状态的d n a 可 与金属离子结合成盐。碱基对之间氢键的性质与其离解状态有关，而碱基的 离解状态又与p h 有关，因而溶液的p h 直接影响d n a 双螺旋结构中碱基对 之间氢键的稳定性。对d n a 而言，碱基对之间的氢键在p h4 0 1 1 0 之间最 稳定，酸性和碱性过强均会导致双链解旋或d n a 变性。 ( 3 ) d n a 的紫外吸收 d n a 中含有共轭双键的嘌呤和嘧啶碱残基，所以具有强的紫外吸收性 质，核苷和核酸的吸收波段在2 4 0 2 9 0n m ，其最大吸收值在2 6 0n m 附近( 蛋 白质的最大吸收波长为2 8 0n m ) ，利用这一性质，通过测定在2 6 0n l 1 处和 2 8 0n m 处吸光度并根据它们的比值可估计d n a 的纯度。当a 2 6 0 a 2 8 0 比值为 1 8 2 0 之间，表明d n a 试样的纯度较高，d n a 在2 6 0n m 处的摩尔吸光系 数为6 6 0 0( m o l l ) 。1 c m 。1 【引。 ( 4 ) d n a 的变性与复性 d n a 二级结构的破坏称为变性。在较高的温度，极端的p h 或者在非水溶 剂中，d n a 双螺旋结构解体，分子由双链( d s d n a ) 变为单链( s s d n a ) 的过程称为d n a 变性。d n a 的变性包括氢键的裂开和堆积反应的紊乱，但 不包括任何共价键的断裂。d n a 变性后，其许多物理性质随之改变，如粘 度降低、沉降速度增加，旋转偏振光能力改变等。 d n a 的变性是可逆的，解除变性条件，满足一定条件后，解开的两条d n a 互补链又可以重新恢复形成双螺旋结构，并恢复有关的性质和生物功能，这个过 程称为d n a 的复性。之所以变性d n a 能够复性，是由于互补链的存在，且满足 了复性条件，如复性温度、d n a 浓度、溶液离子强度等。 1 3d n a 的电化学性质 1 3 1d n a 的电化学活性 d n a 的电化学行为研究源自2 0 世纪5 0 年代末p a l e c e k 的发现，该课题组系 统地研究了d n a 在汞以及汞齐电极上的电化学行为【4 5 】，汞电极显示出对于d n a 结构变化不同寻常的灵敏度和d n a 的预熔化与双螺旋的多晶型现象的早期证据。 碳电极的引入【6 】和悬汞电极的应用【卜9 】扩展了电化学方法在d n a 研究中的应 用。在d n a 的组分中，核苷以及核苷酸中的核糖和磷酸基团是非电活性的， 只有碱基能在汞电极和碳电极上发生氧化还原反应，其氧化还原的部位如图 1 3 所示。鸟嘌呤和腺嘌呤既可在碳电极上氧化【l 们，又可在汞电极上发生还 4 青岛科技大学硕士生学位论文 原反应，而胞嘧啶只能在汞电极上还原得到还原峰。在碳电极上，鸟嘌呤的 氧化峰约在+ 1 0v ，腺嘌呤的氧化峰比鸟嘌呤的更正约在+ 1 2v 【1 1 】。在中性 p h 条件下，s s d n a 和r n a 中的胞嘧啶( c ) 和腺嘌呤( a ) 可以在汞电极 上还原，产生的还原峰接近1 4v 。而鸟嘌呤在汞电极1 6v 下还原的产物 还可在0 3v 左右产生一个氧化峰【1 2 ，l3 | 。胸腺嘧啶和尿嘧啶仅仅能在非水介 质中而且在很负的电势下发生还原反应。 a t g c 亡：= 】还原部位o 氧化部位 图1 - 3d n a 中碱基的氧化还原部位 f i g 1 - 3t h er e d o xp o s i t i o no fd n a b a s e s h 1 3 2d n a 结构对电化学响应的影响 d n a 的结构对a 和c 的还原信号影响很大，所以汞电极非常适合于研究 d n a 的结构转变和局部的构象变化。在d n a 的双链内部，a 和c 的主要还原位 点形成了w a t s o n c r i c k 氢键系统的一部分。在微分脉冲极谱中，变性小牛胸腺 s s d n a 能出现双链d n a 所不能产生的还原峰，而且变性d n a 的峰高比双链d n a 的峰高几乎高2 0 倍。利用汞电极已经证明了线状和环状d n a 中单链的断裂、超 螺旋d n a s 中超螺旋密度的差别以及超螺旋d n a 中由超螺旋密度决定的结 构转变。然而，g 在汞电极上的氧化信号以及g 和a 在碳电极上的氧化峰 对d n a 结构的变化不是太灵敏，这限制了碳电极在核酸分析中的应用。 1 4d n a 的测定方法 目前，d n a 定量的测定方法有光度分析法、荧光光度法、共振光散射法、化 h 一 卅 一 r箩h n x d n a 类物质在离子液体修饰电极上的电化学分析 学发光法以及电化学方法等。其中以荧光光度法使用较多。 1 4 1 光度分析法 d n a 由磷酸根、碱基和脱氧戊糖三部分组成，因而可以通过光度分析 法，基于其组成成分对它进行测定。其中又包括基于磷含量的光度分析法、 基于碱基的紫外吸收光度分析法和基于戊糖含量的光度分析法三种。由于核 酸中都含有磷酸基，且纯的核酸含磷元素的量为9 5 ，故可通过测定磷的 量来测定核酸含量。定磷法的适用范围为1 0 1 0 0 “g ，此法准确度好，灵敏 度高，常作为d n a 其他测定方法的基准。基于组成d n a 的碱基具有共轭双 键，使得d n a 在2 4 0 2 9 0n m 的紫外吸收可以用于计算d n a 的浓度。该方 法测定波长为2 6 0 和2 8 0n m ，而在该测定波长下，许多有机物都能产生干 扰。利用d n a 中脱氧戊糖与一些显色试剂如硫酸、二苯胺、硫代巴比妥等 进行反应生成有色产物，从而测定d n a 含量。但此方法耗时长且易受干扰， 灵敏度低。近年来，人们利用某些染料如甲苯胺蓝作为显色标记物测定 d n a 14 1 ，在灵敏度上有较大提高。同样，结晶紫【15 1 、维多利亚b 【16 1 、灿烂绿 【l7 1 、喹哪啶蓝【l 8 】等染料在d n a 定量分析中具有较好的性能。 1 4 2 荧光分析法 荧光分析法灵敏度高、选择性好、操作方便，已发展成为分析化学工作 者必须掌握的一种重要的分析方法。由于d n a 内源荧光很弱，因而不能利 用荧光技术直接测定d n a 含量，必须引入荧光探针。目前，用于核酸研究 和测定的荧光探针有有机染料、金属离子及金属配合物等。 1 4 3 共振光散射分析法 共振光散射技术是一项在普通荧光分光光度计上进行测量的光散射分 析技术。它不需要专门的仪器，在普通的荧光分光光度计上选择合适的激发 和发射通带宽度，采用相等的激发和发射波长同时扫描激发和发射单色器所 得的同步光谱( 即九= o ) ，即为光散射粒子的共振散射光谱【l9 1 。共振光散射 技术研究和测定核酸，是p a s t e r n a c k 2 0 j 于1 9 9 3 年首次报道的。通过染料阳 离子或金属螫合阳离子生色团在核酸分子上的聚集作用或长距离组装，并引 起核酸超螺旋结构的形成，导致共振瑞利散射的增强，且散射强度与核酸浓 度成正比，此法能检出纳克级的d n a 。之后，李原芳等【2 1 】利用共振光散射 研究了天青a 与d n a 的相互作用，d n a 的线性范围为0 2 0i _ t g m l 。类似， 组蛋白【2 2 1 、铝离子【2 3 1 、维多利亚蓝b f 2 4 1 、荧光素2 5 1 、j a n u s 绿b 【2 6 1 等均可与 6 青岛科技大学硕士生学位论文 d n a 发生静电或插入作用，导致共振光散射信号增强，由此建立灵敏的核 酸共振光散射分析法。 1 4 4 化学发光法 化学发光分析是根据化学反应中所产生的辐射光强度，确定待测物含量 的分析方法，具有灵敏度高、仪器简单及线性范围宽的特点，在生物学、医 学、环境检测等领域得到广泛应用。测定时通过化学发光试剂与d n a 发生 作用产生很强的化学发光，且发光强度在一定范围内与d n a 的浓度成线性 关系而进行d n a 的测定。t o m a s 等【2 7 】研究了9 ，l o 蒽醌2 ，6 二磺酸钠与双链 c t d n a 的相互作用，在某一蒽醌浓度下，加入d n a 的浓度与化学发光信号 的减弱程度存在线性关系，d n a 测定的线性范围为0 0 4 5 5g g m l ，检测限 为1 7n g m l 。朱霞萍等【28 】利用在硝酸介质中d n a 被高锰酸钾氧化而发光， 结合流动注射进样测定了d n a 的浓度，检出限为6 21 t g m l ，该法可应用于 人体血清中d n a 的测定。 1 4 5 电化学方法 由于电化学方法能够获取d n a 在生命体中的电荷转移本质，了解生命 现象电本质的相关信息，而且不易受样品浑浊、溶血等干扰，因此有独特的 优点。鸟嘌呤( g ) ，腺嘌呤( a ) ，胞嘧啶( c ) 和胸腺嘧啶( t ) 四种碱基 是d n a 的重要组成部分，d n a 分子的电活性主要是由d n a 碱基所引起的。 在这四种碱基中，g ，a 既可发生电还原又可发生电氧化，其还原位点主要 是g 的n 7 位，a 的n 1 位；其氧化位点主要是g 的c 8 位，a 的c 2 位。 c 只能在电极上发生电还原，其还原位点为c 的n 3 位。t 既不会发生电氧 化也不发生电还原。其中，d n a 中g ，a 的氧化不涉及到氢键，而a ，c 的 还原需要破坏碱基间的氢键。天然d n a 具有刚性，在电极表面不易发生形 变，其氧化还原位点不易接近电极，所以较之于变性d n a 来说，天然d n a 的氧化还原峰峰电流下降，峰电位正移。 1 5 离子液体在电分析化学中的应用 1 5 1 离子液体的理化性质 室温离子液体( r o o mt e m p e r a t u r ei o n i cl i q u i d s ，r t i l s ) 是指在室温或接近室 温条件下为液体，且由阴、阳离子组成的有机类化合物，简称离子液体2 9 , 3 0 】。 7 d n a 类物质在离子液体修饰电极上的电化学分析 与其它常见的固体或液体物质相比，离子液体具有独特的物理化学性质，如无毒、 稳定性好、极低的蒸汽压、不易燃、导电性好、较宽的电化学窗口以及溶解 多种有机无机材料的能力等，因而室温离子液体被誉为绿色溶剂【3 1 1 。室温 离子液体已广泛地应用于催化3 2 1 、有机合成【3 3 1 、电化学【3 4 1 、分析和分离【3 5 】 等基础研究和应用研究方面。室温离子液体所具有的热稳定性、低挥发性等 特点使其在分析化学中具有潜在的应用前景【3 6 , 3 7 】。 1 5 2 离子液体在电分析化学中的应用 由于离子液体具有电化学窗口宽、导电能力强、挥发性小、溶解性好、酸碱 性可调等特点，使其在电分析化学领域中具有较明显的优点，近年来已引起研究 者的极大兴趣。如e n d r e s 3 8 】和b u z z e o 【”】详细地介绍了室温离子液体在各种电化 学过程的应用，主要有以下几个方面： ( 1 ) 做溶剂和支持电解质。g i o v a n e l l i 等【4 0 】研究了氨在离子液体1 乙基3 甲基 眯唑双三氟甲磺酰亚胺盐 e m l m n ( t f ) 2 】中进行的定量检测，实验结果表明检测 灵敏度高、重现性好，其检测线性范围为1 0 9 5p p m ，检测限为4 2p p m ，同时解 决了氨对水和湿度敏感的问题。c o m p t o n 掣4 l 】报到了氯化血红素在咪唑盐类离子 液体中的电化学行为，并探讨了离子液体的疏水性和加入的配体配位能力的强弱 对其氧化还原行为的影响。研究发现，在不同的离子液体中，由于离子液体的溶 剂强度和介电常数的不同，氯化血红素的氧化还原式电位有所不同。e v a n s 等【4 2 】 考察了n ，n ，n ，n 一四甲基对苯二胺( t m p d ) 和n ，n ，n ，n 四丁基对苯二胺 ( t b p d ) 在p p j , n ( t f ) 2 - 为阴离子的一系列离子液体中的氧化反应。采用计时安培法 和循环伏安法测量了溶于离子液体中化合物的扩散系数，发现离子液体粘度的大 小与组成中的阳离子有关，且对于同一种物质，在不同离子液体中的扩散系数近 似地与离子液体的粘度呈反比。h u l t g r e n 等【4 3 】在离子液体1 丁基3 甲基咪唑六氟 磷酸盐( b m i m p f 6 ) 中研究了 c o ( c p ) 2 + 的直接电化学行为，发现 c o ( c p ) 2 + 可 在玻碳电极、金电极或铂电极上发生氧化还原反应，且氧化还原电位基本与工作 电极材料、溶液浓度以及扫速无关，故可用来作为离子液体体系中的参比电极。 王欢等】采用循环伏安和计时库仑等电化学方法研究了间硝基苯酚在离子液体1 乙基3 甲基咪唑溴化物( e m i m b r ) 中的电化学还原行为，考察了扫描速度、 温度和底物浓度等因素对其电化学行为的影响，求得扩散系数d 为9 1 8 x 1 0 刁 c m 2 s ，电子转移系数0 【为0 3 7 ，证明了在 e m i m b r 体系中，其反应是受扩散控制 的不可逆反应。季巍巍等【4 5 】研究了有机溶剂二氯甲烷对二茂铁在 b m i m p f 6 中的 电化学行为，应用循环伏安和交流阻抗法表明，二氯甲烷可促进离子液体的离子 解离，减小离子液体粘度，增加离子液体电导率，加速二茂铁在离子液体中的扩 8 青岛科技大学硕士生学位论文 散，加快电极表面的反应速率。杨家振等【4 6 4 1 7 j 以室温离子液体四氟硼酸正丁基吡 啶( b p b f 4 ) 为溶剂研究了f e ”的电化学行为，求解了在不同温度和浓度下f e ” 的扩散系数和扩散活化能，结果表明扩散活化能随浓度增加而增大。 ( 2 ) 做粘合剂和修饰剂。m a l e k i 等人【4 8 j 最初以正辛基吡啶六氟磷酸盐( o p p f 6 ) 为粘合剂制备了高性能的碳糊组合电极，有效地提高了各种有机无机电活性物质 的电子转移速率，随后又开发研究了多种不同的离子液体修饰电极。近年来研究 发现，离子液体与聚合物、纳米粒子或碳纳米管形成的凝胶材料具有良好的 电化学性能。如z h a o 等【4 9 】分别将辣根过氧化物酶( h r p ) 和微过氧化物酶 ( m p 1 1 ) 包埋于碳微颗粒离子液体和多壁碳纳米管离子液体 ( m w n t s b m i m j p f 6 ) 复合材料中，进一步研究了固定在该复合膜中的h r p 和 m p 1 1 的直接电化学行为以及对h 2 0 2 、0 2 的催化性能。“u 和z h a n g 等【5 0 , 5 1 也制 备了多种基于离子液体的凝胶复合材料，如含离子液体1 丁基3 甲基咪唑四氟硼 酸盐( b m i m b f 4 ) 的硅溶胶凝胶，含h r p 的离子液体硅溶胶凝胶以及不含离 子液体的h r p 硅溶胶凝胶。z h a o 等【5 2 j 将m w n t s b m i m p f 6 混合膜修饰于玻 碳电极表面，然后通过吸附的方法将血