（植物学专业论文）黄花蒿ssr引物开发.pdf

中山大学2 0 0 9 届硕士学位论文黄花蒿s s r 引物开发 论文题目：黄花蒿s s r 引物开发 专业：植物学 硕( 博) 士生：周广 指导教师：葛学军教授 摘要 黄花蒿“，幼卵捃砌册刀猢l ) 属于菊科蒿属的草本植物，它的提取物之一青蒿素是一种高效 低毒的抗疟药。疟疾作为世界上流行最广、危害最大的寄生虫病，每年约造成1 5 0 2 7 0 万人的 死亡，在非洲等地造成了极大的危害。通过干扰疟原虫滋养体的功能、杀灭红细胞内期裂殖体 和滋养体，青蒿素系列衍生药物已被世界卫生组织认定为治疗抗药性恶性疟的最有效的药物。 为了促进对黄花蒿的进一步研究，理解青蒿素含量与物种遗传变异之间的关系，需要人们对黄 花蒿的遗传结构有更深一步的认知。而微卫星标记以其所具备的多项优点，成为了研究该物种 的遗传多样性、遗传结构、基因流等的重要工具。 本文利用黄花蒿富集文库对s s r 位点进行开发，采用了高效的s s r 筛选分离策略：对黄 花蒿基因组d n a 进行酶切与选择性扩增，之后用5 端生物素标记的( a c ) 1 5 为探针与之杂交， 利用磁珠表面的链亲和素与杂交后片段相结合，再通过系列洗涤除去非目标片段，洗脱目标片 段再通过p c r 进行扩增，将产物连接到t 载体上并转化入感受态细胞中，从而得到黄花蒿的 微卫星富集文库。 在此之后，同时使用m 1 3 f 瓜、m 1 3 f ( a c ) l o 、m 1 3 r ( a c ) l o 三对引物通过p c r 检测对阳 性克隆进行筛选，筛选后测序得到6 5 条可分析序列。统计后发现，含p e 疵c t 型( a c ) n 的重复 序列共有4 1 条，其中有部分含相隔较远的两条或两条以上重复序列；含i m p e r f e c t 型( a c ) n 的 序列共有1 9 条；含有c o m p o u n d 型( a c ) n 序列的共有5 条，分别为( a g ) ( t g ) ( a g ) l 条、( g t ) ( a t ) 2 条、( a c ) ( t c ) ( 1 a ) 1 条、( t c ) ( a t ) ( a c ) l 条。除了( a c ) ns s r 之外，在这6 5 条序列当中还出现 了p e 疵c t 型( a g ) n 以及i m p e 彘c t 型( a g ) n 重复序列共1 2 次，此外，还有( a g ) ( a t ) 型c o m p o u n d 序列5 次。除了二核苷酸重复之外，三核苷酸重复( t t g ) n 与( t c c ) n 也各出现一次。 以基序重复数目为1 0 作为底限，对s s r 位点的侧翼序列进行分析，共得到3 2 条非同源 中山大学2 0 0 9 届硕士学位论文黄花蒿s s r 引物开发 性的适宜设计引物的序列，利用软件p r i m e rp r i m i e r 5 0 设计得到3 2 对引物。使用来自广西群 体的3 0 个个体与河北群体的2 4 个个体对所设计的3 2 对引物进行多态性检测，共得到8 对在 合适的反应体系中可以扩增出目的条带，并表现出多态性的引物，比例为2 5 。 实验首次利用磁珠富集法，构建得到黄花蒿的微卫星富集文库，对黄花蒿基因组中的微卫 星序列进行了有效的筛选分离，获得了多态性s s r 标记，为迸一步从黄花蒿基因组中分离得 到大量的多态性微卫星标记提供了可靠的试验方法，为对黄花蒿的遗传多样性，遗传结构等进 行分析奠定了基础。文章中还探讨了在物种e s t 得到大量快速开发的现在，e s t - s s r 在菊科 内部物种中的开发现状和跨属、种通用性，探讨了在黄花蒿上应用该科内其他物种e s t - s s r 的可能性。 关键词：黄花蒿，微卫星，e s t - s s r ，多态性 i i 中山人学2 0 0 9 届硕士学位论文黄花蒿s s r 引物开发 t i t l e ：t h ei s o l a t i o no f e i g h tp o l y m o r p h i cm i c r o s a t e l l i t el o c if o rt h ec h i n e s e m e d i c i n a lp l a m 么厂纪聊括砌口刀刀扰口l ( a s t e r a c e a e ) m 旬o r ：b o t a n y n 锄e ：g u a n gz h o u s u p e i s o r ：p r o f e s s o rx u e j u ng e a b s t r a c t 彳胞聊括胁口疗以“口l b e l o n g st og e n u sa l r t e m i s i a s t e r a c e t h ea r t e m i s i i l i ne x 仃a c t e d 丘o mi ti s ag r e a tm e d i c i n et oc u r em a l a r i a a sm eb r o a d e s t o v e r s p r e a d e da i l dw o r s tv e r m i n o s i s ，m a l a r i ac a l l s e s m ed e a t ho f15 0 0 ，o o o 一2 7 0 0 ，o o op e o p l ee v e 巧y e 屿e s p e c i a l l yi na 衔c a t h r o u 曲d i s t u r b i n gt h e 觚c t i o n so fp l a s m o d i u mt r o p o z o i t e ，k i l l i r 培t h et r o p o z o i t ea i l da g 锄o n ti ne r y t i l l o c y t i cp h a s e ，t h e s e r i e so fm e d i c i n e sd e r i v e df 而ma r t e m i s i n i nh a sb e e nr e c o g l l i z e d 嬲t h em o s te 伍c i e n tt oc u r e n l a l a r i ab yw h 0 t op r o m o t em e 如n h e rs t u d ya b o u t 甜纪肌括切口玎聆獬l ，u n d e r 咖dt 1 1 er e l a t i o n s l l i p b e “v e e nm e 锄o u n to fa r r t e m i s i n i na i l dt h es p e c i e sg e n o m e ，p e o p l eh a v et ol m o wm o r ea _ b o u tt h e g e n e t i cs t n l c t u r eo f 甜舷唧厕切册刀獬l d u et ot h e 铲e a ta d v a n t a g e so fm i c m s a t e l l i t em 0 1 e c u l a r m a f k e r ，i th a sb e c o m eag r e a tt o o lt o 咖d yt 1 1 eg e n e t i cd i v e r s i 劬g e n e t i cs t m c t u r e ，g e n en o wo fa s p e c l e s t h eo b j e c t i v eo f t m s 、v o r ki st os e e kn e wm i c r o s a t e l l i t em a r k e r sf o ra r 胞聊话砌口珂刀z 以l ，u s i n g m ec o n s t r u c t i o no fe n r i c h e dm i c r o s a t e l l i t el i b r a 巧、h i c hi sa r a p i da 1 1 de 硒c i e n tm e m o d m i c r o s a t e l l i t e sw e r ee n r i c h e db yh y b r i d i z i n gb i o t i n - l a b l e ds s r p r o b e sw i t hg e n o m i c 舶g m e n t sa 1 1 d c 印t u r i n gt h es s l o c o n t a i n i n gi j r a g m e n t sb ym a g n e t i cb e a d sc o a t e dw i ms 仃e p t a v i d i n a r e rw a s h i n g t or e m o v et h en o n s s rf h g m e n t s ，t h ee l u t e ds i n 9 1 e s t r a d e dd n a sw e r ee 1 1 r i c h e d a r e rp c r ，t h e m l g n l e n t sw e r el i g a t e di n t otv e c t o r ，a n dt h e nt r a n s f o m e di n t oe c o l ic o m p e t e n tc e l l st 0p r o d u c ea m i c r o s a t e l l i t ee 血c h e dl i b r 跚v ， a r e rt h a t ，u s em 1 3 f r 、m 1 3 f 一( a c ) l o 、m 1 3 r - ( a c ) l ot oc h e c ka l l dc h o o s et h ep o s i t i v ec l o n e s b yp c r 6 5s e q u e n c e sw e r ef o u n dt ob es u t i b l ef o ra n a l y s i s u s es s rh u n t e rt oa i l a l y z et h e s e q u e n c e s ，t h ec o n s e q u e n c e sa r ea sf o l l o w s ：1 1 1 e r ea r e41p e 彘c t ( a c ) n ，19i m p e 疵c t ( a c ) na n d5 c o m p o u n d ( a c ) n ；e x c e p tm e ( a c ) n ，t h e r ea r e12p e 疵c ta i l di i i l p e 彘c t ( a g ) n 趾d5c o m p o u n d ( a g ) n ； a tl a s t ，t i l e r ea r e1 ( t t g ) na n d1 ( t c c ) n i i i 中山大学2 0 0 9 届硕士学位论文 黄花蒿s s r 引物开发 c h o o s em es e q u e n c e sw l l i c hr e p e a tm o r et h a j l10t i m e sa n da u r es u i t a b l ef o rd e s i g m n gp r i m e r s a tl a s t3 2n o n - h o m o l o g i c a ls s r c o n t 撕n i n gs e q u e n c e sw e r es e l e c t e dt od e s i g np r i m e r su s i n gp r i m e r p r i m i e r 5 o 3 2p a i r so f p r i m e r sw e r et e s t e du s i n g3 0i n d i v i d u a l s 舶mg u a n g ) ( ia 1 1 d2 4i n d i v i d 蹦s 丘o mh e b e it ot e s tt h ep o l y m o 印1 1 i s m 8p a j r so fp r i m e r sw e r e 锄p l i f i e ds u c c e s s 如l l y 锄dr e v e a l e d p o l y m o 印h i s m 1 1 l ec o i l s t m c t i o no fe n r i c h e dm i c r o s a t e l l i t el i b r a 巧t 0g e ts s r p r i m e r si n 讲钯聊函泐口 ，彳绷l s u c c e e d sf o rt h ef i r s tt i m e ，a n di th a sp r o v e nt 0b ear e l i a b l em e t h o df o ri s o l a t i n ga b 吼d a i n t m i c r o s a t e l l i t e sf o r 甜钯朋括缸口玎船船l ，a i l de s t a b l i s h e dt h ef o l l r l d a t i o nf o rt h em r t h e rs t u d yo f g e n e t i c d i v e r s i 吼g e n e t i cs t m c t u r ei nt h i ss p e c i e s a st h ee s t sa r ed e v e l o p e dr a p i d l yi ng r e a t 锄。眦，u s i n g t h et 啪s f e r a b l ee s t - s s 黜o fo t h e rs p e c i e si na s t e r a c e a eo n 卯陀胧括勉口刀甩“口l i sd i s c u s s e di nt h i s 、) r o r k k e yw o r d s ： 么，纪朋括妇绷刀甜口l ，m i c r o s a t e l l i t e s ， e s t _ s s p o l y m o 印h i s m 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究 工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人 或集体己经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位敝作者躲r 于 日期：c i 耵郎1 日 学位论文使用授权声明 本人完全了解中山大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版，有权将学 位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆、院系资料室被查 阅，有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索，可以采用复印、缩印或其 他方法保存学位论文。 伊、 引 闭翕11月钎针 作 ：o f姊孙1 论 签 ： i 业 币 妇 位 师 期 学 导 日 中山大学2 0 0 9 届硕士学位论文黄花蒿s s r 引物开发 1 1 青蒿综述 第一章文献综述 黄花蒿研，纪朋括砌册刀训是属于菊科( a s t e r a c e a e ) 蒿属( a n e m i s i a ) 的一年生草本植物，别名草 蒿、臭蒿、青蒿。原产于亚洲，现为世界性分布。在我国，从海拔5 0 m 的沿海地带到海拔3 6 5 0 m 的青藏高原均有黄花蒿的分布【l 】，它们主要生长于海拔4 0 0 m 以下的丘陵平地、山坡、林缘及 荒地，在全国各地均有分布，其中以广西、广东、四川、湖南、江苏、陕西等地为黄花蒿主产 地区。 黄花蒿为浅根系植物，主根短而侧根发达，多而密集【2 l 。植株高4 0 1 5 0 厘米，茎直立，上 部分枝多，有棱槽。基部及下部叶在花期枯萎，中部叶为卵形，三次羽状深裂，裂片及小裂片 为矩圆形或倒卵形，顶端尖，基部裂片常抱茎，两面被有短微毛，上部叶小，常为一次羽状细 裂。头状花序为黄绿色，球形，直径1 5 2 m m ，有短梗，极多数密集成金字塔状的复圆锥花序， 总苞球状，苞片2 3 层，外层为狭矩圆形，内层椭圆形，花托长圆形，小花均为管状，雌花较 小，通常位于外轮，两性花位于中央。果实为瘦果，呈卵形，淡褐色，表面有隆起的纵条纹， 长不超过1 m m ，无毛。全株有浓烈香气。花果期为8 1 0 月。黄花蒿是一种短日照植物，喜温 和的气候，适宜在雨量充沛、土壤肥沃、阳光充足的地区生长。 黄花蒿性寒味苦，是我国传统中药的一种，用作解暑，止汗，驱风，退热等。黄花蒿的使 用记载最早的是从马王堆出土的西汉时期的五十二病方，而作为提取物用来治疗疟疾相关 的疾病已经有一千多年的历史，公元3 4 0 年东晋医学家和炼丹化学家葛洪所著的肘后备急方 即有关于黄花蒿治疗疟疾的记载。以后在宋朝圣剂总录、元丹溪心法、明普剂方、 明本草纲目和清本草备要均有记载【3 j 。1 9 7 2 年，我国科研人员首次从菊科植物黄花蒿 中分离得到抗疟疾的有效单体，命名为青蒿素e a n n u i n ，a n e m i s i n i n ，q i n g h a o s u ) ，异名黄花 蒿素【4 】。它是一种倍半萜内脂类化合物，是一种高效，速效，低毒的抗疟药【5 】，结构式如图1 1 。 疟疾作为世界上流行最广、危害最大的寄生虫病，据联合国世界卫生组织近年统计报告，每年 约造成3 5 亿的疟疾病例，死亡人数在2 0 0 。3 0 0 万人之间，其中以非洲、东南亚和拉丁美洲最 为严重。青蒿素能干扰疟原虫滋养体的功能，对红细胞内期裂殖体和滋养体有杀灭作用，是国 内外公认的抗疟药物。我国成功研制出的青蒿素系列衍生药物，已被世界卫生组织( w h o ) 认定 中山大学2 0 0 9 届硕士学位论文黄花蒿s s r 引物开发 为治疗抗药性恶性疟的最有效的治疗药物。2 0 0 4 年新的“艾滋病、肺结核和疟疾全球基金 已经批准1 1 个国家购买青蒿素，同时指示另外3 4 个国家停止再申请奎宁等传统药物，改用青 蒿素。黄花蒿虽然是世界分布种，但是青蒿素的含量随产地不同差别极大。除了我国的少数地 区以外，世界上大多数地区所生长的黄花蒿中，青蒿素含量都很低( 1 ) 【1 1 ，而在我国各地区 的黄花蒿中，青蒿素含量也有很大差别。钟凤林等人【6 】调查了福建厦门的黄花蒿，其青蒿素的 含量为1 6 0 。随后，钟国跃等人【1 】对贵州铜仁、湖南华容、四川酉阳等地的黄花蒿资源进行 了大规模的调查研究，经测定，上述各地黄花蒿中青蒿素的含量分别为：0 8 3 5 7 、o 4 2 2 4 和o 8 8 5 3 。江苏高邮盛产黄花蒿，但青蒿素的含量仅为0 0 9 o 1 6 【7 1 。陕西凤县黄花蒿中青 蒿素的含量为o 1 9 6 o 2 3 0 【8 1 。内蒙古东北地区黄花蒿资源丰富，但是青蒿素的含量仅为 o 1 2 o 1 7 【9 1 。可见，我国的黄花蒿中青蒿素含量从南到北基本呈递减的的趋势。桂、黔、川 黄花蒿资源丰富，青蒿素含量也较高，具有很广阔的开发前景。综上可见，黄花蒿具有极高的 经济价值，市场发展潜力很大。 c r h l - - hi 1 2 遗传标记概述 h 3 图1 1 青蒿素化学结构式 遗传标记( g e n e t i cm a r k e r ) 是指可以确切反映遗传多态性、在遗传分析上用作标记的基因。 它具有两个基本特征：可遗传性与可识别性。因此，生物中任何有差别表型的基因突变型均可 作为遗传标记。1 9 世纪中期，奥地利学者孟德尔首次创立了将形态学性状作为遗传标记的应 用先例，在这之后，遗传标记技术得到了充分的发展和丰富。遗传标记主要可以划分为以下五 种类型：形态学标记( m o 巾h o l o g i c a lm a r k e r ) 、细胞学标记( c y t 0 1 0 9 i c a lm a r k e r ) 、生物化学标记 惭o c h e i i l i c a lm a r k e r ) 、免疫学标记( i m m u n eg e n e t i cm a r k e r ) 和分子标记( m o l e c u l a rm a r k e r ) 。 2 中山大学2 0 0 9 届硕士学位论文 黄花蒿s s r 引物开发 1 2 1 形态学标记 形态学标记是指可以明确表现遗传多态性的外观特征，如株高、果色、毛色、外形等，以 这些形态性状、生理性状以及生态地理分布等为标记，研究物种之间的关系、分类以及鉴定。 形态标记具有很显著的简单直观的优势，但是从形态学的角度来研究物种是基于个体的性状描 述，因此得到的结论未必完善，而且由于形态标记数量少，可以鉴别标记的基因数目有限，而 且数量型性状受环境影响很大，难以剔除，还需使用生物统计学知识进行严密分析，使得它的 应用受到一定限制。 1 2 2 细胞学标记 细胞学标记是指能明确显示遗传多态性的细胞学特征。常见的细胞学特征主要有染色体的 核型和带型，以及缺失、重复、易位、倒位等。由于物种的染色体数目、形态以及行为等核型 特征的稳定是相对的，因而可以用作遗传标记来对基因所处的染色体以及在染色体上的相对位 置进行测定。可以通过比较物种与它的近缘种的染色体数目和结构，来追溯物种的起源和演化， 对物种的遗传特性进行检测。但是该方法通常需要花费大量的人力物力来培养选择，以便获得 适用的标记材料，而且有些物种的染色体结构和数量多态性不佳，很难获得适用的标记材料。 1 2 3 生化标记 生化标记是以动植物的某些生化性状作为遗传标记，如同工酶、血清蛋白等。该种标记主 要使用蛋白电泳技术，操作简便快速，费用较低，具有经济、方便的特征，而且相对于形态学 标记和细胞学标记来说，多态性更加丰富，但是仍然存在诸多不足之处，比如，蛋白和同工酶 作为基因的表达产物而非遗传物质本身，容易受到环境和发育状况的影响；标记数量有限等。 1 2 4 免疫学标记 免疫学标记是以动物的免疫学特征，主要指红细胞抗原，白细胞抗原，胸腺细胞抗原等作 为遗传标记。该标记只能应用于动物，比如通过主要组织相容性复合体( m h c ) 的重要特性与疾 病和生理性状的关系进行研究，以及利用动物个体淋巴细胞抗原特异性来研究品种或个体之间 3 中山大学2 0 0 9 届硕士学位论文黄花蒿s s r 引物开发 的抗病力强弱差异等等。 以上描述的4 种标记虽然一直被广泛应用于各个领域，但是它们都只是遗传物质的间接反 映，容易受到环境的影响，不能够直接反映遗传物质的特征，因此具有很大的局限性。随着 2 0 世纪8 0 年代以来分子生物学技术和分子遗传学的迅速发展，对基因结构和功能的研究不断 深入，以遗传物质的载体d n a 作为研究对象，在分子水平上寻找d n a 的多态性，由此产生 的分子标记由于可以直接反映d n a 水平上的遗传变异，而且消除了环境产生的影响，具有能 够稳定遗传，信息量巨大，可靠等特征，从而得到了广泛的应用以及不断的发展。 1 3 分子标记概述 1 3 1 分子标记特征 分子标记是继形态标记、细胞标记和生化标记之后发展起来的一种较为理想的遗传标记形 式，它以个体间的遗传物质内核苷酸序列变异为基础，能够反映生物个体或者种群间基因组中 的差异特征。每一种分子标记都有其自身的特点和特定的应用范围，但就一般意义而言，作为 d n a 水平的遗传多态性的直接反映，与其它几种遗传标记相比，分子标记具有很多明显的优 越性【l o 】，首先，大多数分子标记是共显形，能够区分纯合体和杂合体，有利于对隐性的农艺性 状进行选择：第二，基因组的变异是十分丰富的，分子标记的数量很多，几乎是无限的，遍及 整个基因组，而且多态性高；第三，在生物的任何发育阶段，任意组织的d n a 都可用来进行 标记分析，而不像其它标记会受到季节、环境、发育状况、表达与否等问题的限制；第四，表 现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状没有必然的连锁；第五，多态性高，自然存在 许多等位变异；第六，操作简单迅速，易于自动化；第七，提取的d n a 样品在适宜条件下可 长期保存，这对于进行追溯性或仲裁性鉴定非常有利。鉴于以上优点，白面世以来，d n a 分 子标记技术引起了生物学家极大的兴趣，得到了迅猛的发展，在作物遗传育种、绘制遗传图谱 和物理图谱、基因定位、亲缘关系鉴别等多个方面得到了广泛的应用。 1 3 2 分子标记分类 白面世以来，分子标记得到了充分的发展，主要可以划分为以下4 类： 4 中山大学2 0 0 9 届硕士学位论文黄花篙s s r 引物开发 1 3 2 1 基于分子杂交技术的分子标记 这种技术利用限制性内切酶酶解及凝胶电泳分离不同生物体的d n a 分子，然后用经过标 记的特异探针进行杂交，通过放射自显影或非同位素显色技术来检测d n a 的多态性。在这一 类分子标记技术中，最具有代表性的是发现最早的限制性片段长度多态性( i 沁s t r i c t i o n f m g m e n tl e n g t hp o l y m o 叩h i s m ，r f l p ) 。 1 9 8 0 年b o t e s n 提出的限制性片段长度多态性( i u l p ) 可以作为遗传标记，开创了直接应用 d n a 多态性的新阶段，是最早应用的分子标记技术【1 1 1 。i 江l p 的基本原理是利用特定的限制 性内切酶识别并切割不同生物个体的基因组d n a ，得到大小不等的d n a 片段，通过检测所产 生的d n a 数目和各个片段的长度来反映d n a 分子上不同酶切位点的分布情况。经过凝胶电 泳分离、s o u t h e m 印迹转移到硝酸纤维膜上，然后与放射性标记探针进行杂交和放射显影，从 而获得反映个体特异性的l 强l p 多态性图谱。它显示了由于不同个体的等位基因之间碱基的替 换、重排、缺失等变化导致限制内切酶识别和酶切发生改变，从而造成基因型间限制性片段长 度的差异，凡是可以引起酶切位点变异的突变和导致位点间长度变化的d n a 重组等均可导致 i u l p 的产生。 i u l p 的等位基因具有共显性特点，i 讧l p 标记位点数量不受限制，通常可检测到的基因 座位数为1 4 个，而且结果稳定可靠，重复性好。但是也存在一些缺陷，克隆可以表现检测基 因组d n a 多态性的探针比较困难，不同科之间可通用的探针多态频率不高，用放射性同位素 及核酸杂交技术，既不安全又不易自动化。另外i 疆l p 对d n a 多态性检出的灵敏度不高，r f l p 连锁图上还有很多大的空间斟他】。自i 疆l p 问世以来，在基因定位及分型、遗传连锁图谱的构 建、疾病的基因诊断等研究中得到了较为广泛的应用，但是上述缺点限制了它的进一步应用。 1 3 2 2 基于p c r 技术的分子标记 p c r 技术即利用d n a 聚合酶进行体外扩增d n a 的技术，问世不久便由于简便、快速、 高效等特点迅速成为分子生物学研究的重要工具。根据所使用的引物的差异，可分为以下两种。 1 3 2 2 1随机引物p c r 标记 随机引物p c r 所使用的引物的核苷酸序列是随机的，扩增得到的d n a 区域事先未知，具 5 中山大学2 0 0 9 属硕士学位论文黄花蒿s s r 引物开发 有随机性和任意性。模板d n a 扩增区段上引物结合位点的碱基序列产生突变即是随机引物 p c r 所扩增的d n a 区段产生多态性的分子基础，因此不同来源的基因组的多态性在该区段上 表现为扩增产物有无差异或扩增片段大小的差异。随机引物p c r 标记表现为显性或共显性。 目前常用的随机引物p c r 有随机扩增多态性d n a ( r a i l d o ma m p l i f i e dp o l y m o 印l l i s md n a ， r a p d ) 。 w i l l i 锄s 等人于1 9 9 0 年建立了随机扩增多态性d n a ( 凡谨d ) 技术，由于其独特的检测d n a 多态性的方式使得凡心d 技术很快渗透于基因研究的各个领域【1 3 1 。黜廿d 技术是利用一个随 机引物( 通常为8 1 0 b p ，大约常规p c r 引物长度一半) 通过p c r 反应非定点地扩增d n a 片段， 然后用凝胶电泳分离扩增产物，从而研究d n a 片段的多态性。扩增片段多态性便反映了基因 组相应区域的d n a 多态性。r a p d 所使用的引物各不相同，每对特定引物在基因组d n a 上 都有其特定的结合位点，一旦基因组d n a 在这些区域发生d n a 片段插入、缺失或碱基突变 等变异，就可能使得这些特定引物的结合位点的分布产生变化，导致扩增产物发生数量和大小 方面的改变，从而展现出多态性。之所以使用短的p c r 引物是为了加强揭示多态性的能力。 单一的心d 引物只能够检测出基因组特定区段的多态性，但是如果利用一系列引物，就可 以使得检测区域扩展至整个基因组。 相对于i 心l p 而言，r a p d 具有以下优点：技术操作简单，检测速度快，而且不需要接触 放射性物质；r a p d 分析对d n a 样品用量和质量均要求不高；不依赖于种属特异性和基因组 结构，一套引物即可用来分析不同生物的基因组，检测范围可扩展到整个基因组；一个引物就 可以扩增得到许多片段，通常为6 1 2 个片段，多态性高；引物已经商品化，成本较低。但同 时r a p d 也存在很多缺点：r a p d 标记作为一个显性标记，不能鉴别杂合和纯合基因型，无法 识别杂合子位点，这使得遗传分析相对复杂【1 4 】；存在共迁移问题，凝胶电泳只能分离具有不同 长度的d n a 片段，却不能将分子量相同但碱基序列不同的d n a 片段区分开来；由于使用较 短的引物，p c r 很容易被实验条件所影响，稳定性和重复性差【1 5 1 。 d n a 扩增指纹印迹( e i n aa m p l i f i c a t i o nf i n g e 叩r i m i n g ，d a f ) 是一种改进的r a p d 分析技 术。相对凡心d 而言，它具有以下不同点：分析所使用的引物浓度更高，长度更短( 一般为5 8 b p ) ， 因此能提供的更多的谱带信息。例如当使用5 b p 的引物时，大约可扩增得到l o 1 0 0 个d n a 片 段。p c r 扩增产物在凝胶上进行分离之后，通过银染得到非常复杂的带型，从而对不同d n a 的多态性进行研究。 1 3 2 2 2 特异引物p c r 标记 6 中山大学2 0 0 9 届硕士学位论文黄花蒿s s r 引物开发 特意引物p c r 所扩增的区域是事先已知的。特异引物p c r 所使用的引物是通过对研究物 种基因组信息的了解，然后针对已知序列设计得到的，具有特定的核苷酸序列。利用所设计的 特定引物对模板d n a 进行p c r ，从而对基因组d n a 的特定区域进行多态性分析。常用的有 s s r 、s t s 、s c a r 等，这类标记为共显性，多态性、分辨率、稳定性、重复性等特征俱佳。 序列标记位点( s e q u e n c et a g g e ds i t e s ，s t s ) 是一种等位点的标记，在不同基因组间具有特异 性，它是将r f l p 技术转化为基于p c r 的方法。设计特定的引物与基因组d n a 的特定结合位 点结合，从而通过p c r 反应扩增基因组的特定区域，对其多态性进行分析。由于在过程中利 用了特异引物p c r 技术，它得到的信息十分可靠，不像r f l p 和r a p d 那样具有模糊性。 序列特异性扩增区( s e q u e n c e c h a r a c t e r i z e da m p l i f i e dr e g i o n ，s c a r ) 通常是在凡廿d 、a f l p 技术的基础之上发展起来的。为了提高所获得标记在应用上的稳定和简便性，它将目标片段从 凝胶上进行回收，然后进行克隆并和测序，再根据其碱基序列设计出特异引物，再使用这对特 异引物再次对基因组d n a 进行p c r 特异扩增，从而得到与原片段相对应的单一位点。s c a r 标记是共显性遗传，直接通过扩增产物的有无来显示目的d n a 之间的差异。它方便、可靠、 稳定、重复性高，可以快速的对大量个体进行检测。 1 3 2 3 基于限制性酶切和p c r 技术相结合的d n a 标记 该类技术主要可分为两类，一类是先进行限制性酶切，然后对限制性酶切片段进行选择性 扩增，从而展现出限制性片段长度的多态性，如a f l p 。另一类是先进行p c r 反应，然后通过 对p c r 扩增片段的限制性酶切揭示出扩增区段的多态性，如c a p s 。 扩增片段长度多态性( a m p l i f i e df r a g m e n tl e n 舒hp o l y m o 印h i s m ，a f l p ) 是由荷兰科学家 z a b e a u 等在1 9 9 3 年创建的分子标记技术【1 6 】，是将i 江l p 与p c r 相结合所得到的。其基本原理 是先使用限制性内切酶对基因组d n a 进行酶切，得到大小不同的d n a 片段，然后将特定序 列的接头连接在d n a 片段的两端，形成带接头的特异片段作为扩增反应的模板，以人工接头 的互补链为引物进行预扩增，之后在接头互补链的基础上添加1 3 个选择性核苷酸作引物再次 同模板d n a 进行特异性扩增，最后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳对扩增得到的d n a 片段进行分 离，得到扩增片段长度的不同的多态性带型。引物由三部分组成：与人工接头互补的核心碱基 序列、限制性内切酶识别序列、引物3 端的选择碱基序列，其中接头与接头相邻的酶切片段的 数个碱基序列为结合位点。为了使酶切位点分布均匀，通常会使用两个限制性内切酶，其中一 7 中山大学2 0 0 9 届硕士学位论文黄花蒿s s r 引物开发 个酶为多切点限制性内切酶，另外一个酶切位点数则较少。a f l p 标记检测的多态性的分子基 础是酶切位点的变化或酶切片段中d n a 序列的插入和缺失。结合了i 珂l p 和r a p d 两种技术 的优点，a f l p 分辨率高、稳定性好、可靠性佳、简便，通过控制引物中随机核苷酸的种类和 数目，可以对目标d n a 片段及其数目进行选择，用少量的选择性引物能在较短时间内检测到 大量位点，并且每对引物所检测到的多个位点都或多或少的随机分布在多条染色体上，各染色 体上a f l p 标记的数目与染色体长度呈正相关( r = o 5 0 1 ) ，而一对引物获得的标记涉及的染色体 数与标记数呈正相关( f 0 8 2 6 ) 。因此，通过少量效率高的引物组合，可获得覆盖整个基因组的 a f l p 标记【1 7 】。目前a f l p 作为一种高效的指纹技术，已在遗传育种研究中发挥它的优势【1 8 1 。 但它也具有一些缺点，如费用昂贵，对基因组纯度和反应条件要求很高【l9 1 。另外用于遗传作图 时，少数的标记与图谱紧密度有出入【1 7 j 。 酶切扩增多态性序列( c l e a v e da m p l i f i e dp o l y m o 印h i s ms e q u e n c e s ，c a p s ) 是特异引物p c r 技术的一种延伸。它的基本原理是利用己知的d n a 序列设计得到特异性的p c r 引物，然后对 该d n a 片段进行扩增，然后用一种专一性的限制性内切酶对所得扩增产物进行酶切，再通过 琼脂糖或者聚丙烯酰胺凝胶电泳分离酶切片段，对其多态性进行检测。c a p s 标记揭示的是特 异p c r 片段中的内切酶位点变异的信息。c a p s 是一类共显性分子标记。 1 3 2 4基于d n a 芯片技术的分子标记 这种标记是基于d n a 序列中由于单个碱基的变异所造成的遗传多态性的d n a 分子标记， 如s n p 标记。直接对特定区域的核苷酸序列进行测定，并将其与其他相关基因组的对应区域 进行比较，这无疑是最彻底精确的研究d n a 水平上的多态性的方法。核苷酸多态性( s i n g l e n u c l e o t i d ep o l y m o r p l l i s m ，s n p ) 是指同一位点的不同等位基因之间的个别核苷酸的差异，这种 差异包括单个碱基的缺失或插入【2 0 】，更常见的是单个核苷酸的替换，且常发生在嘌呤碱基( a 与g ) 和嘧啶碱基( c 与t ) 之间。从分子水平上对单个核苷酸的差异进行检测，s n p 标记可以帮 助区分两个个体的遗传物质的差别，被认为是应用前景最好的遗传标记。人类基因组中大约每 1 3 k b 出现一个s n p ，目前已有2 0 0 0 多个标记定位于人类染色体，这对人类基因组学的研究具 有重要意义。在拟南芥上也已发展出2 3 6 个s n p 标记。在这些s n p 标记中大约有3 0 包含限 制性位点的多态性。检测s n p 的最佳方法是d n a 芯片技术，通过高通量、微型自动化的d n a 分析，可以进行大规模的s n p 检测。最新报道的微芯片电泳( m i c r o c l l j pe l e c 仃o p h o r e s i s ) 可以高 速度地检测临床样品的s n p ，它比毛细管电泳和板电泳的速度可分别提高1 0 和5 0 倍【2 l 】。与 8 中山大学2 0 0 9 届硕士学位论文黄花蒿s s r 引物开发 过往技术相比，s n p 不再以d n a 片段的长度变化作为检测手段，而直接以序列变异作为标记， 其二，s n p 标记分析完全摒弃了经典的凝胶电泳，代之以最新的d n a 芯片技术。 1 4 微卫星分子标记 1 4 1 微卫星分子标记简述 生物的基因组中，尤其是高等生物的基因组中含有大量的重复序列。按照重复序列在基因 组中的分布形式的不同，主要可以划分为两类：( 1 ) 串联重复序列( t a n d e m l yr e p e a t e ds e q u e n c e s ) ： 由相关的重复单位首位相连、成串排列而成的序列，主要可以划分成两类，是由功能基因组成 的，这一类又可分为d n a 序列相同、基因功能也相同的串联重复序列( 如r r n a 和组蛋白基因) 以及序列相似而功能不同的串联重复序列( 如球蛋白) ，或者由无功能的序列组成的；( 2 ) 散布重 复序列( i n t e r s p e r s e dr e p e a t e ds e q u e n c e s ) ：重复单位与其它的无关重复序列或者单拷贝序列相间 排列。根据重复序列中重复单位的长度，还可将串联重复序列分为卫星d n a ( sa c e l l i t ed n a ) 、 小卫星d n a ( m i n i s a t e l l i t ed i n a ) 、微卫星d n a ( m i c r o s a t e l l i t ed n a ) 等。 微卫星d n a 又叫简单重复序列( s i m p l es e q u e n c er e p e a t ，s s r ) ，是最近发展起来的建立在 p c r 基础上的分子标记，指的是基因组中由1 6 个核苷酸组成的基元通过多次重复构成的一段 妊，广泛分布于整个基因组的不同位置，长度一般在2 0 0 b p 以下。根据s s r 基元的排列方 式，可将其划分为完全型( p e 彘c t ) 、不完全型( i m p e 疵c t ) 和复合型( c o m p o u n d ) 。完全型指s s r 重复单元以首尾串联形式所组成，中间无间断；不完全型是指重复单元之间为3 个以下数目的 碱基所间断，但两端的基元无间断重复次数大于3 ：复合型是指数目不少于2 个的重复单元被 3 个或3 个以上的连续的非重复碱基间隔，但是该连续的重复序列重复次数不少于5 ，其中完 全型s s r 是它的主要存在形式，所占比例通常最高。 研究发现，微卫星中重复单位的数目存在高度变异，表现为微卫星重复基元的数目变动或 重复序列中的碱基序列的差异，因而造成多个位点的多态性，将这些变异揭示出来，就能发现 不同的s s r 在不同的种甚至不同个体间的多态性。s s r 标记的基本原理：由于基因组中特定 的微卫星d n a 的侧翼序列通常都是具有很强的保守性的单拷贝序列，因此可以通过对微卫星 d n a 的侧翼区域进行克隆、测序，并根据其序列设计引物，然后通过特异p c r 反应扩增目的 微卫星d n a ，之后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据分离后的多态性带型决定个体基因型并计 算其等位基因发生频率。由于不同个体的特定微卫星位点重复单元在数量上的差异，它们的扩 9 中山大学2 0 0 9 届硕士学位论文黄花蒿s s r 引物开发 增产物在长度上的变化就展现了长度的多态性，这一多态性称为简单序列重复长度多态性 ( s s l p ) ，每一扩增位点就代表了这一位点的一个等位基因。微卫星的突变率在不同物种之间或 同一物种的不同等位基因之间可能存在很大差异。 1 4 2 微卫星分子标记特点 与其它分子标记相比，s s r 标记具有以下优点：( i ) 数量丰富，广泛而均匀的分布于整个 基因组；( 2 ) 通常检测到的是一个单一的多等位基因位点，提供的信息量高；( 3 ) 以孟德尔方式 呈共显性遗传，可鉴别杂合子和纯合子；( 4 ) 所需d n a 量少；( 5 ) s s r 大多不具备功能，因此受 到中性选择可能性大，重复序列发生变异的频率高，多态性高；( 6 ) s s r 两侧序列通常为保守 的单拷贝序列，在同种的不同个体间多相同，有时候在亲缘关系较近的不同种之间也能通用； ( 7 ) 重