（特种经济动物饲养专业论文）南极土壤中多环芳烃pahs降解菌的研究分离、鉴定和降解基因的检测.pdf

摘要 认识在南极特殊条件下降解污染物的细菌，对于我们了解人类活动对南极环 境的影响以及在寒冷地区环境污染的生物修复的实际应用都有着十分重要和积 极的意义。本文对南极及常温环境的多环芳烃降( p o l y c y c l i c a r o m a t i c h y d r o c a r b o n s ，p a l - i s ) 降解菌进行了研究，结果表明南极地区假单胞菌是p a h s 的主 要降解菌，并且存在明显的降解酶基因水平转移现象。主要研究结果如下： 1 降解菌的获得在低温条件下以荼或菲为唯碳源通过富集作用，从南 极不同地区的土壤中分离到了2 2 株p a h s 的降解菌，同时，作为对照，从常温 环境中分离到了两株菲的降解菌。 2 降解菌的鉴定通过1 6 sr d n a 测序和系统进化分析，从常温得到降解 菌w s c i i 和w s c i l l 分别为鞘氨醇单胞菌属和假单胞菌属i 而从南极分离到降解 菌只有一株同r a q u a t i l i s 有9 7 的相似性而属于r a h n e l l a 菌属，其它2 1 株均属 于假单胞菌属；其中大部分降解菌同一些已报导的低温菌处于一个较大的分枝 上，只有四株菌同w s c i i i 及一些常温菌同在一个较小的分枝上。从低温菌的分 枝上随机选取6 株菌测得其最适生长温度为1 6 2 0 。 3 降解效率的分析h p l c 方法测定了两株常温菌对菲的降解能力，降解 曲线显示，4 天内培养基中有7 0 的菲被降解。在4 c 时，所有的2 2 株南极降解 菌都能够高效地降解蓑，而且其中的一些菌株还可以降解菲，但效率相对较低。 此外，所得到的菌都不能降解烷烃类有机物。 4 降解途径关键酶基因的检测与降解酶基因的水平转移p c r 方法从1 6 株南极降解菌和一株常温降解菌( 假单胞菌属) 中克隆到双加氧酶基因片段，测 序及比对结果表明，这1 7 个双加氧酶基因可以分为两组，在这两组内基因的同 源性均超过9 9 以上，但两组间的基因同源性只有9 4 。 分别以细菌的双加氧酶基因片段及其1 6 sr d n a 构建的系统进化树显示，即 使1 6 sr d n a 相差很大的细菌，也可能拥有相近的双加氧酶基因，这表明基因在 南极地发生了水平转移。 5 双加氧酶的活性分析在不同碳源的培养条件下，测定了降解菌w s c i i 和w s c i i i 的双加氧酶的比活力，其结果是经菲诱导的酶比活力最高，这说明该 酶具较强的底物特异性。在不同的温度下，分别测定了低温菌l c y l 2 、l c y l 6 以及常温菌w s c i i i 在不同温度下的双加氧酶比活力，结果显示这三株菌双加氧 酶的最高活力温度并无明显的差别，均为3 0 左右，这表明南极这一低温环境 i v 下的双加氧酶基因可能最初来自常温菌。 关键词：p a i l s ；南极；降解菌：双加氧酶；基因水平转移 v s t u d y o n p a i t s - - b i o d e g r a d i n g b a c t e r i ai na n t a r c t i c s o i l ：i s o l a t i o n ，c h a r a c t e r i z a t i o na n d d e g r a d i n g g e n ed e t e c t i o n a b s t r a c t c o n t a m i n a n t r e m o v i n gb a c t e r i aa r ei m p o r t a n tf o ru si nl e a r n i n gt h ei n f l u e n c eo f h u m a na c t i v i t yo na n t a r c t i ce n v i r o n m e n ta n do fp r a c t i c a lu s ef o rb i o r e m e d i a t i o ni n c o l dr e g i o n s i nt h i ss t u d y , t h ei n v e s t i g a t i o no nt h ep a h - d e g r a d i n gb a c t e r i af r o mt h e a n t a r c t i cr e g i o na n dn o r m a lt e n a p e r a t u r ee n v i r o n m e n tw a sc o n d u c t e d ，m a dt h er e s u l t s h o w e dt h a tt h ep s e n d o m o n a ss p pw a sd o m i n a n ti nt h ea n t a r t i ca r e a ，w h e r eh g t p l a y e d a n i m p o r t a n t r o l ei ns i t ub a c t e r i a b i o d e g r a d a t i o n t h em a i n a s p e c t sa st h ef o l l o w i n g ： 1 i s o l a t i o no f d e g r a d i n gb a c t e r i ai nt h i sr e p o r t ，t w e n t y - t w op a l - i s d e g r a d i n g s t r a i n sw e r ei s o l a t e df r o ma n t a r c t i cs o i l sa ts e v e r a ls i t e s b ye n r i c h m e n t a tl o w t e m p e r a t u r e sw i t hn a p h t h a l e n e o rp h e n a n t h r e n ea st h es o l ec a r b o ns o u r c e ；m e a n w h i l e ， t w o p h e n a n t h e r e n e d e g r a d i n gb a c t e r i aw e r e i s o l a t e df r o mn o r m a le n v i r o n m e n t 2 i d e n t i f i c a t i o no f d e g r a d i n gb a c t e r i a a sd e t e c t e db y1 6 sr d n a s e q u e n c i n g a n d p h y l o g e n e t i ca n a l y s i s ，t h e t w os t r a i n sw s c i ia n dw s c r if r o mn o r m a l e n v i r o n m e n tb e l o n g e dt os p h i n g o m o n a sa n dp s e u d o m o n a s ，r e s p e c t i v e l y ；a l lb u to n e o f t h eo b t a i n e ds 订a i n sf r o mt h ea n t a r c t i cb e l o n g e dt op s e u d o m o n a sa n dt h eo n ew a s i nt h eg e n u so fr a h n e l l aa n do f9 7 s i m i l a r i t yw i t hr a q u a t i l 缸m o s to ft h e s e p s e u d o m o n a ss t r a i n sw e r ei nt h es a m ep h y l o g e n e f i cg r o u p sw i t ho t h e rr e p o r t e dc o l d t o l e r a n ts p e c i e s ；o n l yf o u rs t r a i n sc l o s et o m e s o p h i l i cs p e c i e s t h eo p t i m a lg r o w t h t e m p e r a t u r eo f t h e s e s t r a i n s w a s f r o m1 6 “ct o2 0 ca s d e t e c t e d w i t hs i x r a n d o m l y s e l e c t e ds t a i n s 3 d e t e r m i n a t i o no fb a c t e r i ad e g r a d i n gr a t et h ed e g r a d i n gc u r v e so ft h et w o m e s o p h i l i cs t r a i n sw e r ed e t e r m i n e db yh p l c ，a n dt h er e s u l t ss h o w e dt h a tj u s ti n4 d a y s m o r et h a n7 0 p h e n a n t h r e n ei nm e d i u mw a sm e t a b o l i z e d a st ot h eo b t a i n e d2 2 a r t a r c t i cs t r a i n s ，a l ls h o w e dh i 【曲e f f i c i e n c yi nn a p h t h a l e n ed e g r a d a t i o na t4 。c ，a n d s o m es t r a i n ss h o w e dp h e n a n t h r e n ed e g r a d i n ga b i l i t yw i t hr e l a t i v e l yl o we f f i c i e n c y c o m p a r e d t on a p h t h a l e n e ，b u ta l lo f f l l e mc o u l dn o t d e g r a d ea l k y l h y r o c a r b o n 4 d e t e c t i o no f d e g r a d i n gk e y - e n z y m eg e n e sa n dh g t a l lt h eg e n o m i cd n a o f t h e2 2a n t a r c t i cs t r a i n s a n d o u e n o r m a l t e m p e r a t u r e s t r a i n a s t h e t e m p l a t e w e r e v i a m p l i f i e df o ra l p h as u b u n i tg e n eo fn a p h t h a l e n e - d i o x y g e n a s e ，a n dt h er e s u l ts h o w e d t h a ts e v e n t e e ns t r a i n sg a v ep o s i t i v er e s u l t sa n do t h e rs i xs h o w e dn os i g n a l s f u r t h e r , s e q u e n c i n g a n da l i g n m e n ta n a l y s i ss h o w e dt h e17o b t a i n e dn d o g e n e sc o u l db e g r o u p e di n t o t w oc l u s t e r s ，a n do n ew a so fa b o v e9 8 s i m i l a r i t y , t h eo t h e rw i t h a b o v e9 9 s i m i l a r i t y , b u to n l y9 4 s i m i l a r i t yb e t w e e nt h et w o c l u s t e r s i n t e r e s t i n g l y , i tw a sf o u n dt h a td i s t a n t r e l a t e ds t r a i n si np h y l o g e n e t i ct r e eh o s t e ds i m i l a re v e ns a m e n d o g e n e s ，i n d i c a t i n gt h a th o r i z o n t a lg e n et r a n s f e rp o s s i b l yh a p p e n e di na n t a r c t i c r e g i o n 5 t h ea c t i v i t yo fd e g r a d i n ge n z y m e f u r t h e r m o r e ，t h ew s c i ia n dw s c i i i d i o x y g e n a s es p e c i f i ca c t i v i t yi nd i f f e r e n tc a r b o ns o u r c e sw e r ed e t e r m i n e d ，a n dt h e h i 曲e s ta c t i v i t ys h o w e dt h a tt h ee n z y m ee x p r e s si n d u c e db ys p e c i f i cs u b s t r a t e ，a n d t h e o p r i m a la c t i v i t y t e m p e r a t u r e so f n d o i n t h ec o l d a d a p t e dl c y l 2 ，l c y l 6a n d m e s o p h i l i c w s c i l lw e r ea l la ta b o u t3 0 。ce x a m i n e db yi n d i g ot r a n s f o r m a t i o n t o g e t h e r , r e s u l t so f t h i sr e p o r ts u g g e s t e dt h a tp s e u d o m o n a sb a c t e r i aw e r ec r u c i a li n p a hb i o d e g r a d a t i o ni na n t a r c t i c s o i l s ，a n dt h ea b i l i t ym i g h tb ed e r i v e df r o m h o r i z o n t a lg e n et r a n s f e r k e y w o r d s ：p a h s ，d e g r a d i n g - b a c t e r i a ；a n t a r c t i c a ，d i o x g y e n a s e ，h g t v y6 0 1 7 6 3 关于学位论文原创性和使用授权的声明 本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研 究所取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重要 贡献的个人或集体，均在文中明确说明。本声明的法律责任由本 人承担。 本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规 _ 定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质 本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可 以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名：望断 导师签名： 日期：迹参卅 p a h s m m c 中文缩略词 p o l y c y c l i ca r o m a t i ch y d r o c a r b o n s 多环芳烃 m i n i m a lm i n e r a lc u l t u r e无机培养基 r e p p c rr e p e t i t i v ep c r n a p h e a n p y r n c b i n a p h t h a l e n e p h e n t h e r e n e a n t h r a c e n e p y r e n e 重复p c r n a t i o n a lc e n t e rf o r b i o t e c h n o l o g y 美国国家生物 i n f o r m a t i o n技术信息中心 n d o n a p h t h a l e n ed i o x y g e n a s e 萘双加氧酶 i i 萘 菲 蒽 芘 山东农业大学硕士学位论文 l 刖吾 1 1 环境中p a h s 的主要来源 多环芳香烃类化合物( p o l y c y c l i ca r o m a t i ch y d r o c a r b o n s ，p a h s ) 广泛存在于石油、煤炭中，具有潜在的致畸性、致癌性和基因毒性”，其 中的苯并芘是已知的具有极强致癌性的此类化合物”。由于这类化合物 具有极低的水溶性，所以在环境中很难消除，且其毒性随着p a h s 分子量的 增加而增加“”“。因此，p a h s 被美国环保局( e p a ) 和欧共体( e c ) 同 时确定为必须要首先控制的污染物，并把其中的十六种化合物作为环境污 染的监测参数”。”。 自然界中的p a h s 主要来源于火山爆发、森林大火，以及少量的生物合 成，但同时在自然界中对这类化合物也存在着生物降解、水解、光作用裂 解等消除方式，使得环境中的p a h s 含量始终有一个动态的平衡，从而保持 在一个较低的浓度水平上。但是近些年来，随着人类生产活动的加剧：石 油、煤炭的大量开采使用，海上轮船的频繁活动，汽车尾气的排放，工厂 活动的增加等等，使得环境中的p a h s 大量的增加。因此，如何加快p a h s 在环境中的消除，如何减少p a h s 对环境的污染等问题，日益引起人们的注 意。 工业和生活痉承 有机物的稀全燃竺l ij r 光作用裂解和化学作用裂解 漏少一础一一解l 火山爆技和生物台成 i 化石燃料的使用l l l 图卜1 环境中p a h s 主要的来源和去处 f i g1 1 t h eo r i g i na n de l i m i n a t i o no fp a h si ne n v i r o n m e n t 马迎飞：南极土壤中多环芳烃( p a h s ) 降解苗的研究：分离、鉴定和降解基因的检趔 在自然界p a h s 的几种消除方式中，现在认为各种生物尤其是微 生物( 包括细菌和真菌等) 对p a h s 的降解是主要的消除方式。生物直接 将这类化合物转化为c o 。和h ：o ，或者转化成较为简单的水溶性较高、容易 降解的化合物，从而最大限度的减少其对环境中其它生物的影响。不论是 细菌、真菌，还是其它生物，对p a h s 的降解是一个复杂的过程。 1 2 生物对p a h s 的降解 1 2 1 细菌对p a h s 的降解 细菌在地球上有着广泛的分布，而且能在很多极端的条件下顽强的生 存。t r e c c a n i 等人在1 9 5 4 年从土壤中分离并鉴定出一株能降解萘的细菌 “”，在此后的半个世纪里，陆续有数以百计的属于不同菌属的p a h s 降解 菌从不同的环境中被分离和鉴定( 表卜1 ) 。虽然人们从环境中发现的p a h s 降解菌几乎在各个菌属中都有分布，但是目前的研究表明，不同的细菌对 不同的p a h s 的降解能力存在着很大的差别，假单胞菌是目前发现的降解 菌种类最多、降解范围最广的菌属，已发现的假单胞菌可以降解几乎所有 的四环以下的p a h s 。 细菌对p a h s 的降解虽然在降解的底物、降解的途径上存在着差异， 但是在降解的关键步骤上却是一致的，即通过被降解底物或是某些重要的 中间代谢产物所激活的双加氧酶基因的表达，在其所产生的双加氧酶的催 化作用下，将两个氧原子加在底物苯环的活性部位上，从而生成一种不稳 定的顺式二羟二醇式( c 5 - d i h y d r o d i o l s ) 的结构，进而在一组多酶体系 的作用下，经过三羧酸循环最终生成h ：o 和c o 。( l 0 3 , 4 0 , 1 0 1 ) 如图1 - 2 。对这 一降解过程中的关键酶双加氧酶的研究表明，其主要由三种亚基组 成：还原酶( r e d u c t a s e ) 、铁氧化还原蛋白( f e r r e d o x i n ) 和一个铁硫蛋 白( i r o n s u l f u rp r o t e i n ) ( 4 0 ) a 通过各种细菌对p a h s 降解过程中的产物 的分析，人们发现在这一过程中儿茶酚( 1 ，2 一d i h y d r o x y b e n z e n e ) 、龙胆 酸( 2 ，5 一d i h y d r o x y b e n z o i ca c i d ) 年j 泵j l 裔；酚( 3 ，4 一d i h y d r o x y b e n z o i c ) 是最常见的三种可能中间关键代谢物“”，通过可能的五种途径分别生成 琥珀酸、反丁烯二酸、丙酮酸、乙酸、乙醛等，这几种物质被细菌用来合 成蛋白或用作生长代谢的能量。 2 山东农业大学硕士学位论文 表卜1 ，已发现主要的p a l l s 降解菌 t a b l e1 1 m a i np a l l d e g r a d i n gg e n u sf o u n d 发现的年代降解菌( 碳源) y e a rd e g r a d i n g - b a c t e r i ac a r b o ns o u r c e s 参考文献 r e ie r e n e e s 1 9 5 0 s b e i j e r n i c k i as p ( 菲，葸，苯并蒽)1 3 ，1 4 ，6 9 - 1 9 6 0 sp s e u d o m o n a ss p ( 萘，苊，菲，9 9 ，7 ，8 ，1 5 ，1 6 ， 葸，荧蒽，芘苯并葸)2 6 ，2 7 ，3 0 ，4 6 ，1 0 6 1 9 7 0 sa e r o m o n a ss p ( 菲) 5 6 m y c o b a c t e r y u ms p ( 萘，菲 葸，荧葸，芘) 4 ，4 7 ，5 7 ，4 9 ，8 5 ，8 6 a r t h r o b a c t e rs p ( 菲，葸)8 7 ，5 9 1 9 8 0 s a l c a l i g e n e ss p ( 萘，苊，菲， 荧葸，芘，苯并葸)6 0 ，8 8 ，1 0 5 m j c r o c o c c u ss p ( 菲) ， a c i n e t o b a c t e rs p ( 萘，菲，荧葸，芘) 3 4 ，8 4 ，6 5 1 9 9 0 sb u r k h o l d e r i as p ( 萘，菲，c h r y s e n e ，苯并葸)5 l r h o 咖c o c c u ss p ( 萘，菲， 荧蒽，芘)1 ，3 6 ，9 7 ，1 0 5 c y c l o c l a s t i c u ss p ( 萘，苊，菲， 蒽，芘，荧蒽)2 8 ，2 ，3 7 h a l o m o n a ss p ( 萘，菲) s p h i n g o m o n a ss p ( 萘，菲，荧葸，芘，苯并葸)6 1 ，1 0 7 c o m o m o n a ss p ( 萘，菲，葸)3 5 a g r o b a c t e r i u ms p ( 萘，菲，c h r y s e n e 苯并蒽) 由于p a h 的分子量越高，其水溶性越低，对于以其作为唯一碳源的细 菌来说越难利用。在从上世纪五十年代到八十年代的近三十多年里，人们 多将注意力集中在细菌对萘、芴、菲等一些分子量较低、水溶性相对较高 的多环芳香化合物上的降解机理的研究上。直到1 9 8 8 年，h e i t k a m p 和 c e r n i g l i a 首次从靠近油污地的沉积物样品中分离出了一株格兰氏阳性细 菌，可以降解 3 马迎飞：南极土壤中多环芳烃( p a h s ) 降解菌的研究：分离、鉴定和降解基因的检测 r 、厂1 型! 立旦| i ”、j ， # q a 图卜2 ：细菌降解萘的司能路线 f i g 卜2 ：t h ep o s s i b l eb a c t e r i ad e g r a d i n gp a t h w a y so fn a p h t h a l e n e 一系 列的p a h s “”。与此同时，m a h a f f e y 等人用核磁共振和质谱等分析方法， 首次检测到，降解菌b e i j e r i n c k i as p b 1 在联苯、二甲苯和水杨酸盐存 在的情况下对高分子量p a h 一苯并蒽( b e n z ( a ) a n t h r a c e n e ) 的降解时， 首先会将其氧化成三种可能的含有羟基和羧基的较低分子量的芳香烃，用 c “标记苯并蒽表明，最终其被降解成为“c o ：( 如图卜3 ) 佑9 。在从那以后 的数十年里，先后有多株可以降解高分子量的p a h s 的细菌被分离鉴定： a l c a l i g e n e sd e n i t r i f i c a n ss t r a i nw w l ，p s e u d o m o n a s ( s p h i n g o m o n a 句 p a u c i m o b i l i s e p a 5 0 5 ，m y c b a c t e r i u m s p s t r a i np y r 一1 ， m y c o b a c t e r i u ms p s t r a i nr j g i i 一1 4 5 ，g y c o b a c t e r i u mf l a v e s c e n s ， m y c o b a c t e r i u ms p s t r a i nk r 2 ，r h o d o c o c c u s s p s t r a i ni n l “7 “”。”“。进一步的研究表明，在对芘等四环的p a h s 的降解中，有些 菌株需要有少量其他碳源的存在，称之为共代谢( c o m e t a b o l i c ) ，而有 些则不需要。但对于五环以上诸如苯并芘等p a n s 的细菌降解，现在通常 认为只能是共代谢“”。 上述细菌对p a h s 的降解无一例外都需要氧气的参与，但是在很多无 氧的环境中也有相当数量的p a h s 和烷烃的存在，比如湖底的深层沉积物、 深海沉积物，特别是发生溢油污染时，油污的底层通常是属于厌氧的环境 等等。因此厌氧降解越来越受到人们的重视，直到上世纪八十年代，才有 关于细菌在无氧条件下对p a h s 降解的研究报道。 4 一 o o j j 。j 驴一p 一，步 严一 互呼l 舻 山东农业大学硕士学位论文 。j 警。7 7 毋。o 。h 图卜3 苯并葸的三种可能的中间代谢产物( b e i j e r i n c k i as p s t r a i nb 1 ) f i g 卜3 t h r e ep o s s i b l em e t a b l i t e so fb ( a ) p ( b e i j e r i n c k i as p s t r a i nb 1 ) 可以厌氧降解p a r i s 的细菌相对较少，而且大多集中在紫细菌 ( p r o t e o b a c t e r j a ) 这个类群里面。现在的研究表明，细菌在无氧状态下 对p a h s 降解的生化机制完全不同于在有氧状态下细菌对p a h s 的降解“”。 在厌氧环境中，m n ( i v ) 、f e ( i i i ) 、硫酸盐、硝酸盐等氧化剂作为最终电 子受体，参与细菌对多环芳香烃的降解，如图卜4 。已有的实验表明在厌 氧的条件下细菌对p a h s 的降解仅限于萘、菲、芴、荧蒽等一些结构简单、 水溶性较高的有机物。 囝了。 能量 图卜4 ：萘的厌氧降解 f i g l 一4 ：a n a e r o b i cd e g r a d a t i o no fn a p h t h a l e n e 细菌对p a h s 厌氧降解的具体机制还不是十分清楚。在硫酸盐还原的环 境中，对细菌降解代谢产物的检测表明，萘首先通过羧化作用生成2 一萘甲 a 抓 l r ，一 可办 马迎飞：南极土壤中多环芳烃( 队h s ) 降解菌的研究：分离、鉴定和降解基因堕望型 酸，在琥珀酰一辅酶a ( s u c c i n y l c o a ) 作用下，生成萘酰一辅酶a ( n a p h t h y 卜c o a ) ，最终导致苯环的裂解( 图卜4 ) “”。用同位素标记法 对菲的厌氧降解的研究表明，其遵循和萘的降解类似的步骤“”。 1 2 2 真菌对p a h s 的降解 真菌在自然界也有广泛的分布，根据是否对木质素降解，可以将其分 可降解木质素和不可降解木质素两大类，在这两类中都存在相当数量可以 降解p a h 的真菌，但是它们在对p a h s 的降解的机制上存在差别。 真菌对p a h s 的降解的生化机制完全不同于细菌，很多真菌对p a h s 的 降解要依靠细胞色素p - 4 5 0 这个酶系。在这个系统中，p a h s 的代谢要分 为两步：第一步中有两种酶，首先是细胞色素p - 4 5 0 单加氧酶，在这种 酶的作用下将一个氧原子加到多环芳烃的苯环上，形成一种环氧化物 ( e p o x i d e ) ，有一些环氧化物是不稳定的，会继续反应生成酚类，还有些 环氧化物会在另一种酶一环氧化物水解酶( e p o x i d eh y d r o l a s e ) 的作用下 生成反式二氢二醇式( t r a n s - d i h y d r o d i o l s ) 结构。第一步反应的产物会 在第二步反应中做为底物，在酶的作用下真菌细胞内的谷光甘肽、硫酸盐， 和一些糖基结合到这些底物上去，这一步反应通常会使得这些芳香类化合 物的水溶性变高、毒性变低、更容易降解“。 在一些能够降解木质素的真菌一如属于担子菌纲( b a s i d i o n y c e t e s ) 的白腐真菌( w h i t or o tf u n g a l ) 中，由于降解木质素的酶系不具有很强的 底物特异性，因此这一系统中的酶对p a r s 的降解也表现出很强的能力。、 在对白腐真菌的研究中表明，与木质素降解有关的酶只有在一些主要的营 养物质缺乏时才会分泌。这时，首先激活能分泌产生h ：0 ：的氧化酶，h 2 0 ： 的作用是激活过氧化物酶。真菌中的过氧化物酶主要有两组，木质素过氧 化物酶( l i g n i np e r o x i d a s e ，l i p ) 和依靠锰的过氧化物酶( m n p ) 实现 降解。h a m m e l 等人的实验发现真菌在这两组酶的作用下可以将p a h s 降解 成醌类。 总之，真菌降解p a h s 的各种酶类，都是先在真菌的细胞内生成，然 后再分泌到细胞的外面，从而实现对p a h s 降解。 山东农业大学硕士学位论文 图卜5 ：真菌对p a t t s 的降解( b y 尸。s ”a f s ) f i g1 5 ：f u n g u sd e g r a d a t i o no fp a h sb y 尸o s t r e a t u s 1 2 3 其它生物对p a i l s 的降解 藻类是海洋环境中的一类重要的微生物，包括藻青菌、绿藻、硅藻菌 等。这些藻类可以通过不同的途径代谢降解各种不同的p a h s 。 有些藻类对p a h s 的代谢是依靠和细菌类似的双加氧酶系统，首先生 成顺式的二氢二醇式( c f s - d i h y d r o d i o l s ) 结构“”，而有些藻类对p a h s 的代谢途径类似于哺乳动物和真菌对p a h s 的作用。”。有实验表明，在藻 类对p a h s 的代谢过程中，生长会出现受到抑制的现象，这主要是因为在 p a h s 的代谢过程中会形成醌类结构，这些醌类通过氧化还原、芳基化、 插入等机制导致d n a 链的断裂，并且影响线粒体的呼吸作用，从而对细胞 产生毒害作用。”。 大多数藻类对p a h s 的代i 9 需要光的参与，但是目前我们对p a h s 在藻 类中具体代谢方式还不清楚，尤其是在代谢过程中产生一些有毒物质的机 制及其消除方式还不了解。藻类作为水体生态环境中重要的组成部分，更 好的了解其对p a h s 的代谢机制，有助于我们将来在此类污染中的应用。 自然界很多植物可以在被某些包括p a h s 等有机物严重污染的地区正 常的生长，甚至有些植物可以将这些有机污染物吸收并且迅速的转化为低 毒或是无毒的代谢物，或者是利用其根际释放出的酶类等先将有机物分解 成为可被自身利用的物质，然后作为营养物质参与植物的生长而被植物吸 收。有证据表明，植物可以吸收并代谢一些高分子量的p a h s 如：苯并芘、 二苯并葸、荧葸等。不同的植物对这类污染物表现出不同的代谢降解能力 f3 1 ) 马迎飞：南极土壤中多环芳烃( p a h s ) 降解菌的研究：分离、鉴定和降解基因的检测 p a h s 作为环境的污染物，主要是因为其对包括人在内的动物有很强 的毒性，但是动物实验显示多环芳烃本身对动物并无多大的负效应，它们 只有被动物本身的酶系统代谢，转化为多种代谢产物后，其中的某些活性 物质和d n a 发生共价结合后，刁可以导致机体的基因发生突变从而诱发癌 症的发生“。高等的哺乳动物对p a h s 的代谢是通过其自身机体类似真菌 的细胞色素p - 4 5 0 单加氧酶系统，生成的代谢产物具有很高活性的醌类， 从而诱导细胞发生癌变反应( 9 2 ) o 1 3 极地环境中p a h s 的污染现状 南极是一片长年为冰雪所覆盖的大陆，四周为大洋所恩绕，南极地区 在研究全球气候变化中具有突出的地位，通过生物地化循环、深层大洋环 流、大气环流、能量的输送同地球上其它地方发生着联系，从而影响着整 个地球系统。反过来，极地地区也对全球气候变化起着“放大器”的作用， 而且，南极地区是唯一一块没有被人类活动大量影响的地区，所以对南极 地区生态环境的研究具有重要的意义。 北极和南极一样，大部分地面长期是处于冰冻状态，只有在夏天几个 星期是解冻的。这些寒冷环境几乎是无菌状态的，但是在极低温度的液体 水中某些微生物存在。尤其另人惊奇的是，南极一这块曾经被认为是地球 上最洁净的土地上，也在一些动物体内发现了被异源物质污染的证据，早 几年发现南极的企鹅体内含有高浓度的d d t ；最近又发现北极熊中有一部 分变成了两性熊，专家推断可能是多氯联苯中毒所致。 鉴于南极地区寒冷，干燥和少光照，营养元素缺乏等严酷的地理环境 气候，使得一但被污染，那么这些污染物在自然下很难分解( c r i p p s 、 p r i d d l e1 9 9 1 ) 。但是最近有文献报导从类似南极环境的北极和高山环境 等地区发现存在可以降解油污的细菌活动的证据，并且先后从其中分离到 了这些降解菌。系统的研究表明，在这些严酷自然环境下可以降解烃类的 细菌多为一些在常温环境下长见的菌属如：假单胞菌属、鞘氨醇单胞菌属、 红球菌属、分枝杆菌属、和a c i n e t o b a c t e 等，其中一些菌甚至具有为适 应在这种环境下降解污染物的特性，如耐低温、耐紫外线照射、耐冰晶作 用等悟3 _ “7 ”。 南极海地区碳氢化台物污染的程度非常低“”，但是在过去的几十年 山东农业大学硕士学位论文 中，南极洲发生了几起石油泄漏事件( c o m n a p2 0 0 0 ) ，其中最大的一次是 b a h i ap a r a i s o 在南极半岛附近航行时发生的，有6 0 万升燃料泄漏，少 量的柴油泄漏对南极地区的海洋和沿海环境产生较小的、局部性和短期影 响。g r e e n1 9 9 2 ，c r i p p s 、s h e a r s 等人先后分别对采自位于普里兹湾的 凯西站、位于南奥克尼群岛的西格尼站以及位于南极半岛的帕尔墨站的土 壤样品进行了分析测定，发现所有的供试土壤样品中均含有不同水平的烯 烃化合物与多环芳香烃化合物( p a h s ) 。大量的碳氢化合物流入到海豹 等重要生物生长繁殖的生态系统中会造成明显的影响。因为南极地区的船 只，包括游船，预期还会增加，这个问题引起越来越多的关注。漏油对环 境造成严重污染，油轮翻沉造成的漏油事故也导致企鹅栖息地被严重破 坏。非洲企鹅的数量在过去3 0 年里大大减少，目前只剩下1 8 万对。南非 开普敦附近水域的沉船漏油事件迄今恶果犹存，油污迅速扩散到邻近的非 洲企鹅聚居地达森岛和罗本岛，污染了近2 万只企鹅。虽然救援人士帮它 们清理了身上的油污，但专家发现，在这么多曾被污染的企鹅中，至今只 有7 能重新繁殖。另外，油污还会使企鹅的羽毛失去保温和防水功能， 令它们冻死或因无法潜到海里捉鱼而饿死。 南极一向被认为受到人类污染最小的大陆“”，但是另人凉奇的是在 一些像各科学考察站位附近等长期有油污的地区，也发现有类似的降解菌 存在5 3 7 3 ”。因此，研究这个环境中烃降解菌的种类以及相关降解酶及降 解特性，对于人们认识日益严重的南极以及相关地区的污染问题及其治理 应用，有着重要的意义。 1 4 环境污染的生物修复 生物修复( b i o r e m e d i a t i o n ) 是自然界中微生物对有机污染物的降解 作用，由于自然的生物修复过程一般较慢，难于实际应用，生物修复技术 通常是指工程化的人为促进条件下的生物修复。对于环境中一些难降解的 且有毒害的烃类物质，生物修复是一种主要的治理方式“4 ”。生物修复的 基础研究始于2 0 多年前，集中在水体，土壤和地下水环境中石油生物降 解的实验室研究。8 0 年代后被应用于大范围的污染环境治理，并取得了 相当大的成功，从而发展成为一种新的生物治理技术。美国环保局在阿拉 斯加的石油泄漏的生物修复项目中，短时间内消除了污染，治理了环境， 马迎飞：南极土壤中多环芳烃( 队h s ) 降解菌的研究：分离、鉴定和降解基因的检测 为生物修复提供了一个成功的例证”“7 ”。 与化学、物理处理方法相比，生物修复技术具有下列优点6 4 3 。6 ”：( 1 ) 污染物在原地被降解清除，( 2 ) 修复时间较短，( 3 ) 就地处理，操作简便， 对周围环境干扰少，( 4 ) 较少的修复经费，仅为传统化学、物理修复经费 的3 0 “5 0 ，( 5 ) 人类直接暴露在这些污染物下的机会减少，( 6 ) 不产生 二次污染，遗留问题较少。 虽然生物修复技术已取得很大的成功，但是仍然存在很多的问题，主 要是以下因素制约生物修复的效果：( 1 ) 共存的有毒物质对生物降解作用 的抑制，( 2 ) 电子受体( 营养物) 释放的物理性障碍，( 3 ) 物理因子( 如 温度) 引起的低反应速率，( 4 ) 污染物的生物不可利用性，( 5 ) 污染物被 转化成有毒的代谢产物，( 6 ) 污染物分布的不均一性，( 7 ) 缺乏具有高效 降解污染物的微生物。 因此，为了进一步提高生物修复的治理效果，获得环境污染治理方面 的新突破，人们希望通过具有极大潜力的遗传工程微生物系统，获得对极 毒和极难降解有机污染物高降解能力的工程微生物，即把编码降解污染物 酶的质粒或是基因，整合到能在污染地生长存活的土生微生物的d n a 中， 使具有很强的野外存活能力的微生物获得较强的污染物降解能力，充分发 挥生物修复的作用；此外，对生物修复的实验室模似、生物降解潜力的 指标、修复水平的评价、实验室研究的接种物以及风险评估等方面的更深 入研究，也会进一步促进生物修复技术的发展和应用“”。 1 5 生物修复的应用前景展望 石油是由上千种化学性质不同的物质组成的复杂混合物，主要包括饱 和烃、芳香烃类化合物、沥青质、树脂类等。石油的开采、冶炼、使用和 运输过程的污染和遗漏事故，以及含油废水的排放、污水灌溉、各种石油 制品的挥发、不完全燃烧物飘落等引起一系列土壤石油污染问题。特别是 石油开采过程产生的落地原油，已成为土壤矿物油污染的重要来源。 8 0 年代以前，治理石油烃污染土壤还仅限于物理和化学方法，即热 处理和化学浸出法。热处理法是通过焚烧或煅烧，可净化土壤中大部分有 机污染物，但同时亦破坏土壤结构和组分，且价格昂贵而很难实施。化学 浸出和水洗也可以获得较好的除油效果，但所用的化学试剂的二次污染问 l o 山东农业大学硕士学位论文 题限制了其应用。8 0 年代以来，污染土壤的生物修复技术越来越引起人 们的关注。生物修复是利用生物的生命代谢活动减少土壤环境中有毒有害 物的浓度，使污染土壤恢复到健康状态的过程。生物修复技术是在生物降