（分析化学专业论文）化学计量学光谱法研究某些小分子与牛血清白蛋白的相互作用.pdf

摘要 摘要 本论文共分为五章，主要对近年来小分子与血清白蛋白相互作用的研究概况进行了 综述，并分别研究了几种小分子与牛血清白蛋白( b o v i n es e r u ma l b u m i n ，b s a ) 的相互作 用。光谱法在小分子与生物大分子相互作用的研究领域中的应用日益广泛，但是用光谱 法结合化学计量学方法来探讨小分子与血清白蛋白的结合机理的文章还比较少。本论文 尝试将化学计量学方法平行因子和多元曲线分辨一交替最d x - - 乘法用于解析实验所得的光 谱数据。讨论了方法的原理和实际应用，并探讨了化学计量学在复杂体系中实现同时解 析多组分平衡浓度和纯光谱的可行性。 第一章：本章首先简要的介绍了蛋白质的定义、结构、功能和性质等，然后依次对 小分子与血清白蛋白相互作用的研究方法、研究内容和存在的问题等方面展开了评述， 探讨了化学计量学在小分子与血清白蛋白相互作用研究中的应用。最后还展望了小分子 与血清白蛋白相互作用研究的发展趋势，将新探针的开发、各种仪器方法的联用及化学 计量学方法的引入作为研究重点。 第二章：荧光光谱法研究异丙威及2 异丙基苯酚钠与b s a 的相互作用。实验发现，异 丙威与b s a 通过范德华力和氢键结合形成复合物，而2 一异丙基苯酚钠与b s a 通过静电引力 作用结合为复合物。采用同步荧光和三维荧光光谱法探讨了异丙威及2 异丙基苯酚钠对 b s a 构象的影响，结果表明异丙威及2 一异丙基苯酚钠对b s a 构象均有影响，甚至可能破坏 b s a 的结构。通过竞争实验发现2 一异丙基苯酚钠与异丙威在b s a 上有相同的结合位点，并 且2 异丙基苯酚钠能将结合在b s a 上的异丙威竞争出来。 第三章：荧光光谱法结合平行因子法( p a r a f a c ) 研究盐酸特拉唑嗪和盐酸哌唑嗪与 b s a 的相互作用，结果发现这两种药物都对b s a 的内源荧光有猝灭作用，且属于静态猝 灭。热力学参数证明盐酸特拉唑嗪与b s a 之间的作用力主要为氢键，盐酸哌唑嗪与b s a 之间的作用力主要为疏水作用力和静电引力。本文以华法林和安定作标记药物，采用三 维荧光技术分别对竞争实验进行扫描，用p a r a f a c 处理所得三维数据。根据血清白蛋 白结合位上药物的置换作用确定了盐酸特拉唑嗪和盐酸哌哗嗪的结合位点都是b s a 的 s i t ei 。 第四章：紫外吸收光谱和荧光光谱法结合多元曲线分辨一交替最小二乘法( m c r a l s ) 研究富马酸比索洛尔与b s a 的相互作用。由于体系中各组分的光谱曲线有部分重叠且现 象不明显，以及m c r a l s 解析单个矩阵时存在旋转不确定性，本文采用扩展矩阵进行交 替最d - - 乘迭代。m c r a l s 所分辨出的b s a 和富马酸比索洛尔的光谱曲线与实际光谱 曲线很好地吻合，保证了分辨的浓度趋势图可靠。m c r - a l s 很好地分辨出各组分的平衡 浓度变化趋势图，通过各图可以很直观地监测反应过程中各个组分的浓度变化，并算出 i i 摘要 富马酸比索洛尔与b s a 相互作用的表观结合常数。本文还通过同步荧光光谱法和紫外吸 收光谱法发现富马酸比索洛尔对b s a 构象有一定影响。 第五章：荧光光谱法结合多元曲线分辨交替最小二乘法研究伞形花内酯与b s a 的 相互作用。本实验采用两种不同的试剂滴加模式对伞形花内酯与b s a 的相互作用进行研 究，对经典的荧光光谱数据矩阵加以扩展，增加了实验数据的信息量；进而应用m c r a l s 对该扩展的荧光光谱矩阵进行迭代计算，较好地分辨出作用过程中的浓度变化趋势 图，并计算出伞形花内酯与b s a 的表观结合常数。通过同步荧光光谱法发现伞形花内酯 对b s a 的构象有一定的影响。 关键词：牛血清白蛋白；小分子；光谱法；平行因子法；多元曲线分辨一交替最小二乘法 i i i a b s t r a c t a b s t r a c t i nt h i sw o r k t h er e s e a r c hw o r ko fi n t e r a c t i o n sb e t w e e ns m a l lm o l e c u l e sa n ds e r u ma l b u m i ni n r e c e n ty e a r sh a sb e e nr e v i e w e da n dt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e ns o m ed r u g sw i t hb o v i n es e r u m a l b u m i n ( b s a ) w a ss t u d i e d s p e c t r o s c o p i ct e c h n i q u e sa r ew i d e l yu s e di na n a l y t i c a lc h e m i s t r y , h o w e v e r ，t h es p e c t r o s c o p i ci n v e s t i g a t i o nc o m b i n e dw i t hc h e m o m e t r i c s ，p a r t i c u l a r l yf o rt h e i n t e r a c t i o no fs m a l lm o l e c u l e sa n dm a c r o m o l e c u l e s , a r er e l a t i v e l yf e w t h ea p p l i c a t i o no f c h e m o m e t r i c sm e t h o d p a r a l l e lf a c t o ra n a l y s i s ( p a ra f a c ) a n dm u l t i v a r i a t ec h iv er e s o l u t i o n a l t e r n a t i n gl e a s ts q u a r e s ( m c r - a l s ) i np r o c e s s i n go fs p e c t r a ld a t aa l s oh a sb e e nd e v e l o p e d a n dt h ea p p l i c a t i o no fc h e m o m e t r i c si nc o m p l i c a t e db i o c h e m i c a ls y s t e r n sc a nb eu s e dt os o l v e s o m ep r o b l e m sa n dt h ee q u i l i b r i u mc o n c e n t r a t i o na n dp u r es p e c t r ao fe a c hc o m p o n e n tc a nb e o b t a i n e d t i l i st h e s i si sd i v i d e di n t of i v ec h a p t e r s ： c h a p t e r i i nt h i sc h a p t e r ，t h ed e f i n i t i o n ，s t r u c t u r e ，f u n c t i o na n dn a t u r eo fp r o t e i n sw e r ei n t r o d u c e db r i e f l y t h e nt h er e s e a r c hm e t h o d sa n de x i s t e n tp r o b l e m so fi n t e r a c t i o nb e t w e e ns m a l lm o l e c u l e sa n d p r o t e i n sw e r er e v i e w e di nt u r n s 1 1 1 ea p p l i c a t i o no fc h e m o m e t r i c si nt h ef i e l do fp r o t e i nr e s e a r c h w a sd i s c u s s e d a tl a s t ，t h ed e v e l o p m e n tt r e n d sw e r ef o r e c a s t e da n de x p l o i t i n gn e wp r o b e s ，u s i n g v a r i o u st e c h n i q u e ss i m u l t a n e o u s l ya n dt h eu s eo fc h e m o m e t r i c sw e r ec h o s e na st h ee m p h a s i so f t h i st h e s i s c h a p t e ri i t h eb i n d i n gi n t e r a c t i o no ft h ep e s t i c i d ei s o p r o c a r ba n di t sd e g r a d a t i o np r o d u c t ，s o d i u m2 一 i s o p r o p y l p h e n a t e ，w i t hb s a w a ss t u d i e db ys p e c t r o f l u o r i m e t r y b o t hi s o p r o c a r ba n ds o d i u m2 一 i s o p r o p y l p h e n a t eq u e n c h e dt h ei n t r i n s i cf l u o r e s c e n c eo fb s a t h i sq u e n c h i n gp r o c e e d e dv i aa s t a t i cm e c h a n i s m t h eb i n d i n go fi s o p r o c a r bt ob s ai n v o l v e dh y d r o g e nb o n d sa n dt h a to f s o d i u m 2 - i s o p r o p y l p h e n a t e t ob s ai n v o l v e d h y d r o p h o b i ca n de l e c t r o s t a t i c i n t e r a c t i o n s s y n c h r o n o u sf l u o r e s c e n c es p e c t r o s c o p yo ft h ei n t e r a c t i o no fb s aw i t he i t h e ri s o p r o c a r bo r s o d i u m2 - i s o p r o p y l p h e n a t es h o w e dt h a tt h em o l e c u l a rs t r u c t u r eo ft h eb s aw a sc h a n g e d s i g n i f i c a n t l y ，w h i c hi sc o n s i s t e n tw i t ht h ek n o w nt o x i c i t yo f t h ep e s t i c i d e t h er e s o l u t i o no ft h e t h r e e w a ye x c i t a t i o n - e m i s s i o nf l u o r e s c e n c es p e c t r ab yt h ep a r a f a cm e t h o de x t r a c t e dt h e r e l a t i v ec o n c e n t r a t i o np r o f i l e so fb s a t h e s ep r o f i l e ss h o w e dt h a tt h ed e g r a d a t i o np r o d u c t ， s o d i u m2 - i s o p r o p y l p h e n a t e ，d i s p l a c e dt h ep e s t i c i d ei nac o m p e t i t i v er e a c t i o nw i t ht h eb s a p r o t e i na n dt h eb i n d i n gs i t eo fs o d i u m2 - i s o p r o p y l p h e n a t ea n di s o p r o c a r bo nb s a i st h es a m e o n e c h a p t e ri i i i nt h i sp a r t ，t h eb i n d i n gi n t e r a c t i o no ft h et e r a z o s i nh y d r o c h l o r i d ea n dp r a z o s i nh y d r o c h l o r i d e w i t hb s aw a ss t u d i e db ys p e c t r o f l u o r i m e t r yu n d e rs i m u l a t e dp h y s i o l o g i c a lc o n d i t i o n s b o t h i v a b s t r a c t t e r a z o s i nh y d r o c h l o r i d ea n dp r a z o s i nh y d r o c h l o r i d eq u e n c h e dt h ei n t r i n s i cf l u o r e s c e n c eo fb s a t h i sq u e n c h i n gp r o c e e d e dv i aas t a t i cm e c h a n i s m t h et h e r m o d y n a m i cp a r a m e t e r s ( 刖， a n da g u ) o b t a i n e df r o mt h ef l u o r e s c e n c ed a t am e a s u r e da tt w od i f f e r e n tt e m p e r a t u r e ss h o w e d t h a tt h eb i n d i n go ft e r a z o s i nh y d r o c h l o r i d et ob s ai n v o l v e dh y d r o g e nb o n d sa n dt h a to f p r a z o s i n h y d r o c h l o r i d et ob s ai n v o l v e dh y d r o p h o b i ca n de l e c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o n s i nt h i sw o r k t h e c o m p e t i t i v ei n t e r a c t i o no ft h et e r a z o s i nh y d r o c h l o r i d e ( p r a z o s i nh y d r o c h l o r i d e ) a n ds i t em a r k e r ( w a r f a r i no rd i a z e p a m ) w i mb s aw a ss t u d i e db yt h r e e w a ye x c i t a t i o n e m i s s i o nf l u o r e s c e n c e w i t ht h ea i do fp ara f a c t h ee s t i m a t e dr e l a t i v ec o n c e n t r a t i o np r o f i l e so ft h ec o m p o n e n t s s h o w e dt h a tt h eb i n d i n gs i t eo ft h et e r a z o s i nh y d r o c h l o r i d ea n dp r a z o s i nh y d r o c h l o r i d eo nb s a i ss i t ei c h a p t e ri v t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nb i s o p r o l o lf r u m a r a t e ( b s p ) a n db s aw a ss t u d i e db yf l u o r e s c e n c ea n d u v - v i sa b s o r b a l i c es p e c t r o s c o p yw i t ht h ea i do fm c r a l s t h es p e c t r u mo f e a c hc o m p o n e n ti n t h eb s p b s as y s t e ms h o w e do v e r l a p p i n gb e t w e e ne a c ho t h e r m o r e o v e r , t h ea n a l y s i so f i n d i v i d u a ld a t am a t r i c e sb yt h em c r - a l sm e t h o dm i 曲te x i s tp o s s i b l eu n r e s o l v e du n d e r l y i n g f a c t o ra n a l y s i sa m b i g u i t i e s t h e r e f o r e ，t h ew h o l es e to fs p e c t r o s c o p i cd a t am a t r i c e sw e r e a u g m e n t e da n da n a l y z e db yt h em c r a l sm e t h o ds i m u l t a n e o u s l y t h i sp r o c e d u r ea l l o w e dt h e r e c o v e r yo ft h ec o n c e n t r a t i o np r o f i l e sa n dp u r es p e c t r af o re a c hs p e c i e sa n dt h ea p p a r e n t e q u i l i b r i u mc o n s t a n t t h ee f f e c to fb i s o p r o l o lf r u m a r a t eo nt h ec o n f o r m a t i o no fb s aw a sa l s o a n a l y z e du s i n gs y n c h r o n o u sf l u o r e s c e n c ea n du v v i sa b s o r b a n c es p e c t r o m e t r y c h a p t e rv t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nu m b e l l i f e r o n ea n db o v i n es e r u ma l b u m i n ( b s a ) w a ss t u d i e db y f l u o r e s c e n c es p e c t r o s c o p ya n dm c r a l si n t h i sp a r t t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nu m b e l l i f e r o n e a n db s aw a ss t u d i e db yt a k i n gt w od i f f e r e n tk i n d so ft i t r a t i o nm o d e s t h et w os p e c t r o s c o p i c d a t am a t r i c e sw e r ea u g m e n t e d a n dt h e nt l l ei n f o r m a t i o no fe x p e r i m e n td a t aw a si n c r e a s e d t h e a u g m e n t e de x p e r i m e n td a t am a t r i xw a sa n a l y z e db yt h em c r a l sm e t h o d t l i sp r o c e d u r e a l l o w e dt h er e c o v e r yo ft h ec o n c e n t r a t i o np r o f i l e sa n dp u r es p e c t r af o re a c hs p e c i e sa n dt h e a p p a r e n te q u i l i b r i u mc o n s t a n t t h ee f f e c to fu m b e l l i f e r o n eo nt h ec o n f o r m a t i o no fb s a w a sa l s o a n a l y z e du s i n gs y n c h r o n o u sf l u o r e s c e n c es p e c t r o m e t r y k e yw o r d s ：b s a ；s m a l lm o l e c u l e s ；s p e c t r o s c o p i c ；p a r a f a c ；m c r a l s c a n d i d a t e ：l i ug e n l a n ( a n a l y t i c a lc h e m i s t r y ) s u p e r v i s e db yp r o f e s s o r ：n iy o n g n i a n v 学位论文独创性声明 学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得直昌太堂或其他教育机构的学位或证书而使用过 的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并 表示谢意。 学位论文作者签名( 手写) ：引亦霞至签字日期：加诏年12 月刁日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解直昌太堂有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权直旦 大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或扫描等复制手段保存、汇编本学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位 论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向社会公众提供信息服务。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) ， 学位论文作者签名( 手写) ：友、) 齐曼互导师签名( 手写) ：倪球二习 j| 签字同期：诉ft ，月叼日 签字日期：pd 簪明叼日 i 第一章小分子与血清白蛋白相互作用的研究概况 第一章小分子与血清白蛋白相互作用的研究概况 1 1 引言 蛋白质( p r o t e i n ) 是生物体的主要组成成分，是生命活动所依赖的物质基础，没有蛋白 质就没有生命。正是由于蛋白质本身的重要性，所以对它的研究一直受到人们的重视， 尤其是在当前的生命科学、化学、药学及临床医学等领域。研究小分子与蛋白质之间的 相互作用，有助于在分子层次的水平上探讨小分子与蛋白质相互作用的机理，了解蛋白 质结构与功能的关系，为生命科学研究提供有用的信息和数据，并有助于了解药物小分 子在体内的运输和分布情况，认识药物药效作用的药理及有毒物质毒副作用的机理之微 观机制，为药物小分子的设计与筛选及新药的开发提供重要的理论依据。 1 2 蛋白质介绍 1 2 1 蛋白质的定义及概述 组成蛋白质的基本单位是氨基酸，氨基酸通过脱水缩合形成肽链。蛋白质由一条或 多条多肽链组成的生物大分子，每一条肽链有二十到数百个氨基酸残基不等，各种氨基 酸残基按一定的顺序排列。 蛋白质是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的物质。机体中的每一个 细胞和所有重要组成部分都有蛋白质参与。蛋白质占人体重量的1 6 3 ，即一个6 0 k g 重 的成年人其体内约有蛋白质9 8 k g 。人体内蛋白质的种类很多，性质、功能各异，但都是 由2 0 多种氨基酸按不同比例组合而成的，并在体内不断进行代谢与更新。 1 2 2 蛋白质的历史 在1 8 世纪，f o u r c r o y 和他的一些研究者发现蛋白质是一类独特的生物分子，他们发 现用酸处理，一些分子能够使其凝结或絮凝。荷兰化学家m u l d e r 对一般的蛋白质进行元 素分析发现几乎所有的蛋白质都有相同的实验公式。用“蛋白质 这一名词来描述这类 分子是由m u l d e r 的合作者b e r z e l i u s 于1 8 3 8 年提出。m u l d e r 随后鉴定出蛋白质的降解产 物，发现其中含有为氨基酸的亮氨酸，而且得到它( 非常接近j 下确值) 的分子量为1 3 1 d a 。 著名化学家p a u l i n g 成功的预测了基于氢键的规则蛋白质二级结构，而这一构想最早 是由a s t b u r y 于1 9 3 3 年提出。随后，k a u z m a n 在总结自己对变性的研究成果和之前l a n g 的研究工作的基础上，提出了蛋白质折叠是由疏水相互作用所介导的。1 9 4 9 年，s a n g e r 首次正确的测定了胰岛素的氨基酸序列，并验证了蛋白质是由氨基酸所形成的现性( 不具 有分叉或其他形式) 多聚体。原子分辨率的蛋白质结构首先在1 9 6 0 年代通过x 射线晶体学 第一章小分子与血清白蛋白相互作用的研究概况 获得解析；到了1 9 8 0 年代，n m r 也被应用于蛋白质结构的解析；近年来，冷冻电子显微 学被广泛用于对于超大分子复合体的结构进行解析。截止到2 0 0 8 年2 月，蛋白质数据库 已存有接近5 0 ，0 0 0 个原子分辨率的蛋白质及其相关复合物的三维结构的坐标1 1 i 。 1 2 3 蛋白质的结构与功能 蛋白质的分子结构是蛋白质功能的物质基础。因此要想深入了解蛋白质的性质与功 能，首先必须了解蛋白质的结构。蛋白质是由各种氨基酸通过肽键连接而成的多肽链， 再由一条或一条以上的多肽链按各自特殊方式组合成具有完整生物活性的分子。随着肽 链数目、氨基酸组成及其排列顺序的不同，就有不同的三维空间结构也就形成了不同的 蛋白质。蛋白质结构通常分为分为一级结构、二级结构、超二级结构、结构域、三级结 构和四级结构【2 j 。 蛋白质的一级结构( p r i m a r ys t r u c t u r e ) 是指由肽链连接成的多肽中的氨基酸序列，即线 性序列。蛋白质的一级结构对维持蛋白质分子的立体结构和行使蛋白质的功能都起着重 要的作用，也就是说蛋白质的一级结构决定高级结构，决定蛋白质的生物学功能。 蛋白质的二级结构( s e c o n d a r ys t r u c t u r e ) 主要是指蛋白质多肽链本身的折叠和盘绕方 式。蛋白质的二级结构包括：0 【一螺旋机构、p 折叠结构、d 转角结构和自由回转( 无规则 卷曲、自由绕曲) 。 超二级结构( s u p e r s e c o n d a r ys t r u c t u r e ) 矛1 结构域( s t r u c t u r ed o m a i n ) 是过渡结构，是近年 来在研究蛋白质构象、功能和进化中的变化时，常常被引入作为蛋白质二级结构至三级 结构层次的一种过渡态构象层次。超二级结构是指若干相邻的二级结构中的构象单元彼 此相互作用，形成有规则的，在空间上能辨认的二级结构组合体。它在结构层次上高于 二级结构，但没有聚集成具有功能的结构域。结构域是指二级结构和结构模体以特定的 方式组织连接，在蛋白质分子中形成两个或多个在空间上可以明显区分的三级折叠实 体。结构域是球状蛋白质的折叠单位。多肽链在超二级结构基础上进一步绕曲折叠成紧 密的近似球状的结构。在空间上彼此分隔，各自具有部分生物功能的结构。 蛋白质的三级结构( t e r t i a r ys t r u c t u r e ) 是指多肽链借助各种次级键，如疏水作用、离子 键( 盐键) 、氢键和范德华力等，在三维空间中沿多个方向进行卷曲、折叠，盘绕成紧密的 近似球状结构的构象，形成包括主链和侧链在内的所有原子的特定空间排布，是在二级 结构基础上的肽链再折叠。如果蛋白质分子仅由一条多肽链组成，三级结构就是它的最 高结构层次。 蛋白质的四级结构( q u a r t e r n a r ys t r u c t u r e ) 是指几个各具有独立三级结构之多肽链的相 互结集、以特定的方式接触、排列形成更高层次的大分子蛋白质的空间构象。大多数相 对分子质量大的蛋白质都是由几条多肽链组成为1 个活性单位。这些肽链相互以非共价键 联结成一个相当稳定的单位，这种肽链就称为该蛋白质的亚基。蛋白质四级结构也是指 亚基的相互关系，空间的排布，亚基问通过非共价键聚合而成的特定构象。亚基单独存 2 第一章小分子与血清白蛋白相互作用的研究概况 在，无生物活力或活力很小，只有通过亚基相互聚合成四级结构时，蛋白质才具有完整 的生物活性。具有四级结构的蛋白质有变构作用。变构作用是指一些生理小分子物质， 作用于具有四级结构的蛋白质，与其活性中心外的某一部位结合，可引起其亚基间一些 键的断裂或形成，改变了亚基及亚基间空间接触和排布，使整个蛋白质分子的构象发生 轻微变化，包括使一些分子变得稍松散或紧密，从而使蛋白质的生物活性增高或降低的 过程。蛋白质的变构作用使得蛋白质在生物体内可以不断调整其活性，更好地适应环境 的变化，从而能更有效地完成其生理功能，这是蛋白质分子进化到具有四级结构水平的 重要特点。 蛋白质在生物体中有多种功能，可以简略概括：( 1 ) 作为有机体新陈代谢的催化剂 酶：这是最重要的生物学功能即催化功能，几乎所有的酶都是蛋白质。生物体新陈代谢 的全部化学反应都是由酶催化来完成的；( 2 ) 生命活动过程中，许多小分子及离子的运输 是由各种专一的蛋白质来完成的，这为运输的功能；( 3 ) 生物体为了维持自身的生存，拥 有多种类型的防御手段，其中不少是靠蛋白质来执行的，即为免疫和防御功能；( 4 ) 运 动功能；( 5 ) 机械支持和保护功能；( 6 ) 调节功能。因此，蛋白质作为生命活动中起重要作 用的生物大分子，与一切揭开生命奥秘的重大研究课题都有密切的关系。 1 3 血清白蛋白的性质 血清白蛋白是脊椎动物血浆中含量最丰富且极易纯化的蛋白质。在过去的3 0 年 中，血清白蛋白以其特有的地位成为物理学家、化学家和生物学家研究的一种典型和理 想的蛋白质。人血清白蛋白( h u m a ns e r u ma l b u m i n ，h s a ) 及牛血清白蛋白( b o v i n es e r u m a l b u m i n ，b s a ) 的部分氨基酸序列于1 9 7 5 年即已得到【3 l 。 h s a 是由5 8 5 个氨基酸残基组成的单肽链蛋白质，分子量约为6 6 5 0 0 d a 。h s a 肽链含 有3 5 个半胱氨酸残基，仅3 4 位有一个巯基，其余都为二硫键，二硫键中有8 对组成交叉二 硫键，只有接近n 端的是一个单个二硫键，二硫键对维系蛋白质空间结构的稳定性起着重 要作用。h s a 含有十八个酪氨酸残基，在2 1 4 位上含有一个色氨酸残基。n 端为天冬氨酸 残基，c 端为亮氨酸残基。 h s a 分子具有良好的弹性，在不同的环境条件或结合不同的配体后，其形状极易发 生改变，但由于拥有较多的二硫键，分子极易回复其形状，尤其是在生理条件下。而在 剧烈的温度、p h 值、离子强度的改变下，h s a 可能发生变性。 1 9 8 9 年，c a r t e r ：j x 组发表了h s a 的低分辨晶体结构| 4 i ，并于1 9 9 0 年进行了一些修正 1 5 j ，而后，又于1 9 9 2 年发表了h s a 的高分辨晶体结构【6 l ，从而最终揭丌了这一生物大分子 的真面目。正像以前的预测一样，h s a 分子包括三个结构上相似的功能域( d o m a i ni ，i i 和 i i i ) ，每个功能域又包含两个相似的螺旋结构的亚域( s u b d o m a i na 和s u b d o m a i nb ) ，六个亚 3 第一章小分子与血清白蛋白相互作用的研究概况 域聚集在一起，形成了一个不对称的心型分子。分子有约6 7 的螺旋结构，其余则为转角 及伸展肽链。 b s a 是由5 8 2 个氨基酸残基组成的单肽链蛋白质，其氨基酸序列与h s a 非常类似。 b s a 肽链也含有3 5 个半胱氨酸残基，仅3 4 位有一个巯基，其余都为二硫键，二硫键中有8 对组成交叉二硫键，只有接近n 端的是一个单个二硫键。与h s a 不同的是，b s a 在1 3 4 及 21 2 位各含有一个色氨酸残基，因此两者的荧光性质略有不同。 血清白蛋白是血液系统的重要组分，具有结合和运输内源性及外源性物质，维持血 液胶体渗透压，清除自由基，抑制血小板，抗凝血以及影响动脉血管渗透性等生理功 能。 1 4 研究小分子与血清白蛋白相互作用的意义 随着药代动力学及临床药理学迅猛发展，药物一蛋白质结合对药代动力学影响作用已 进行了较广泛的研究。药物进入人体后，总要通过血浆的贮存和运输，达到受体部位发生 药理作用，多数有机药物在血浆中都或多或少地与血浆蛋白( 主要是白蛋白) 结合，结合后 的药物不易穿透毛细血管壁，限制其进一步运输，这对药物在体内的代谢和分布产生重 要影响【7 1 。 药物与血清白蛋白结合是一个迅速、可逆的过程，很快达到动态平衡。各种药物与 血清蛋白的结合是非特异性的，具有饱和性和竞争抑制性，其结合率和结合能力不同， 影响到药物的最大作用强度、作用幅度以及作用时间。一些重要的药动学性质和稳态分 布容积，也取决于药物的浓度。建立药物与血清白蛋白结合的体外模型，了解结合的程 度、结合部位、结合力、结合位数等，不仅对于揭示体内药物动力学问题、指导临床合 理用药具有一定意义，而且对于进行药物分子设计、开发新药等也具有重要的指导意 义。因此，研究药物与血清白蛋白的相互作用是药物动力学及临床药理学的重要内容， 已经成为引人注目的课题。 农药小分子与血清白蛋白相互作用的研究也受到广大研究者的青睐。随着科学技术 的发展和人们生活水平的不断提高，农药的使用日益广泛。1 9 8 6 年美国就有2 3 个洲发现 地下水农药污染。衣阿华洲5 0 0 多口井中有3 9 受到杀虫剂的污染。如今，各种农药小分 子依然存在于水及食品中，构成了对人类健康的潜在危害。因此，研究农药小分子与血 清白蛋白的相互作用有助于了解其在体内的转化、再分布、排泄等，还能够很好的评价 和预测有毒物对人类健康危害性。 总之，研究小分子与血清白蛋白的相互作用具有重要的实际意义。从药物小分子的 药理学角度看，对一些药物尤其是天然药物的研究己经深入到从细胞和分子水平上研究 药物的作用机理，从而寻找发挥药效的活性基团。对于农药小分子来说，了解它与血清 4 第一章小分子与血清白蛋白相互作用的研究概况 白蛋白的结合方式、明确它在生物体内的代谢过程、研究它的中毒机制及指导农药中毒 急救、解毒等方面具有重要意思| 8 i 。 1 5 小分子与血清白蛋白相互作用的研究现状 1 5 1 研究方法 小分子与血清白蛋白相互作用的研究方法多种多样，传统的方法包括平衡透析法、 超滤法、电化学方法和一些光谱分析法。随着科学技术的迅猛发展，圆二色谱法、毛细 管电泳法、高效液相色谱法、傅罩叶红外光谱、核磁共振法等逐渐被引入小分子与血清 白蛋白相互作用的研究，各自利用不同的参数表征相互作用情况。以下简单介绍如今常 用的几种方法。 1 51l 荧光光谱法 荧光光谱法具有灵敏度高、选择性强、用样量少、方法简便等优点，在小分子与血 清白蛋白的相互作用研究中应用比较广泛【9 1 。荧光光谱法是研究血清白蛋白构象的一种常 用而有效的方法，能提供包括激发光谱、发射光谱以及荧光强度、量子产率、荧光寿 命、荧光偏振等许多物理参数，这些参数能从各个角度反映分子的成键和结构情况，该 法不但可以做一般的定量分析，而且还可以推断血清白蛋白在各种环境下的构象变化， 从而阐明血清白蛋白结构与功能之间的关系。小分子与血清白蛋白相互作用后可能引起 小分子自身荧光光谱和血清白蛋白自身荧光( 内源荧光) 光谱以及同步荧光光谱的变化，如 荧光强度和偏振度的改变、新荧光峰的出现等，这些均可以提供小分子与血清白蛋白结 合的信息。例如，吕中掣m 1 用荧光光谱法研究抗癌药物白黎芦醇与人血清白蛋白的相互 作用。结果显示，在生理条件下，人血清白蛋白使得白黎芦醇的荧光最大发射峰发生明 显的蓝移，说明药物与蛋白质之间发生相互作用且形成复合物。通过理论计算出白黎芦 醇与人血清白蛋白的结合常数，结合距离和热力学参数等。张国文等【1 1 l 采用荧光光谱研 究橙皮苷与牛血清白蛋白相互作用特征。通过实验证实了橙皮苷与牛血清白蛋白的相互 作用为单一的动态猝灭过程，求出了不同温度下的猝灭常数和热力学参数。根据f 6 r s t e r t l z 辐射能量转移理论，计算出橙皮苷在蛋白质中的结合位置与2 1 2 位色氨酸残基间的距离为 3 2 9 n m 。用三维荧光光谱及同步荧光光谱技术探讨了橙皮苷对牛血清白蛋白构象的影 响。 1 5 1 2 紫外可见吸收光谱法 紫外可见吸收光谱法是研究在2 0 0 至8 0 0 n m 光区内的分子吸收光谱的一种方法。它 广泛地应用于无机和有机物质的定性和定量测定，仪器设备简便，易于操作。在小分子 与血清白蛋白相互作用的研究过程中，可用紫外可见吸收光谱法对反应过程进行监测。 部分小分子配体与血清白蛋白结合后其分子结构发生了一定的变化，相应的出现了吸收 峰位移或谱峰宽度变化，据此可研究血清白蛋白与小分子间的结合强弱和结合机理，并 5 第一章小分子与血清白蛋白相互作用的研究概况 探讨小分子对血清白蛋白的构象的影响，因而紫外可见吸收光谱法也是这一研究领域中 最方便，最常用的一种技术。当部分小分子与血清白蛋白发生相互作用后，其紫外吸收 光谱一般与血清白蛋白的荧光发射光谱有重叠i l2 ，”l ，可利用二者图形的重叠部分，按能量 转移定理计算出小分子与血清白蛋白之间的结合距离。此外，单独的药物一蛋白吸收光谱 也能反映出重要的结合信息。例如，l i a n g 等| 1 4 j 用紫外可见光谱的方法研究了c o ( i i ) 等离 子与h s a 的相互作用。实验发现，当c o ( i i ) 等离子与蛋白作用时，有一个从最初形成的 弱复合物a 到最终形成强复合物b 的转换过程。利用不同时间的紫外光谱的变化，梁宏 等作出了相关的解释。何梅等【i5 】也用紫外光谱研究大黄有效成分：大黄素、大黄酸和大 黄酚与牛血清白蛋白的相互作用，了解大黄有效成分的生物结合活性。苏忠等l m j 利用紫 外光谱研究3 ，3 ，4 ，7 四羟基黄酮醇( f i s ) 在不同p h 值条件下的解离行为，发现f i s 在生 理条件下以离子和中性分子的混合形式存在。与蛋白质的结合使f i s 的紫外吸收光谱i 带 发生了明显的红移( 与中性分子相比红移幅度超过了4 0 n m ) ，证明了药物分子离子状态以 静电力与蛋白质发生结合。其紫外光谱的二阶导数谱显示，药物分子与蛋白质的结合分 为特征和非特征形式。 1 5 1 3 电化学方法 大多数生物化学反应过程的本质是电化学过程【l7 1 ，生物现象的许多方面都涉及电势 与电流，而对这些现象的阐明在许多方面必须借助于电化学【i 引。电分析化学法具有高灵 敏度和高选择性，并且它不会受到传统生物样品中的混浊、黄疸等颜色的干扰，近年来 在生命科学领域中得到了广泛的应用。蛋白质分子与电极之间的电子转移过程在某种程 度上类似于生物体内蛋白质与生物膜之间的电子转移过程，成为目前研究的热门课题 1 1 9 1 。因此，电化学研究方法是研究、揭示生命奥秘的有利工具之一。 当具有电化学活性的药物分子与血清白蛋白相互作用后，药物分子的特征还原峰电 流会下降，同时峰电位也有所移动。采用电化学方法研究药物小分子与蛋白质的相互作 用，虽然在一定程度上受药物分子电活性的限制，但对于一些吸收光谱比较弱，或者由 于其电子跃迁谱带与蛋白质的发生重叠，而无法用光谱法等其它方法来研究的药物分子 与蛋白质分子的相互作用，却有可能用电化学法( 极谱法和伏安法) 进行研究，同时能够获 得其它方法得不到的信息。 近年来发展起来的修饰电极，由于其灵敏度高等特点