（药理学专业论文）甲氧苄啶对利福平药代动力学的影响.pdf

目录 一、摘要 中文论著摘要1 英文论著摘要3 二、英文缩略语5 三、论文 前言6 6日u 舌 论文一h p l c 测定生物样品中利福平和甲氧苄啶浓度9 前言9 9日u 舌 材料与方法9 实验结果11 讨论2 5 结论2 7 论文二利福平和甲氧苄啶的人体药代动力学研究2 8 前言2 8月u 百2 芍 材料与方法2 8 实验结果：3 1 讨论4 8 结论4 9 全文总结4 9 四、本研究创新性自我评价5 0 五、参考文献5 1 六、附录 综j j 苤5 4 在学期间科研成绩6 3 致谢。6 4 个人简介6 5 中文论著摘要 甲氧苄啶对利福平药代动力学的影响 目的 本课题旨在建立测定生物样品中利福平和甲氧苄啶浓度的h p l c 方法，考察健 康自愿者单剂量口服复方利福苄啶胶囊( 利福平+ 甲氧苄啶) 和利福平胶囊后，利 福平、甲氧苄啶的人体内药代动力学行为，获得药代动力学参数。并以此评价甲 氧苄啶对利福平体内药代动力学行为的影响，为二种制剂的联合用药提供理论基 础。 方法 利福平血药及尿药物浓度测定：采用a g i l e mz o r b a xe c l i p s ep l u sc l s 色谱 柱，以对硝基酚为内标，流动相：乙腈：o 0 5m o l l n h 4h 2 p 0 4 ( 用磷酸调p h = 3 5 ) ： 三乙胺= 3 6 ：6 4 ：0 1 ( v v v ) ；流速：1 0m u m i n ；检测波长：2 5 4n m l 柱温：3 0 ， 进行h p l c 分析。 甲氧苄啶血药及尿药物浓度测定：采用a g i l e mz o r b a xe c l i p s ep l u sc 1 8 柱， 流动相：( 血浆样品) 乙腈：o 0 5m o l ln h 4h 2 p 0 4 ( 用磷酸调p h = 3 5 ) ：三乙胺= 1 4 ：8 6 ：0 1 ( v v v ) ；( 尿液样品) 乙腈：0 0 5m o l ln h 4h z p 0 4 ( 用磷酸调p h = 3 5 ) ： 三乙胺= 1 5 ：8 5 ：0 1 ( v v v ) ；流速：1 0m l m i n ；检测波长：2 3 0n m ；柱温：3 0 ，进行h p l c 分析。 利福平和甲氧苄啶体内药代动力学研究：1 2 名健康志愿自愿者随机交叉单剂 量口服复方利福苄啶胶囊( 利福平3 0 0m g 、甲氧苄啶8 0m g ) 和利福平胶囊( 利福 平3 0 0m g ) 后，于给药前( 0h ) 和给药后不同时刻( 时间段) 采集血液样品和尿液 样品，采用上述建立的h p l c 方法测定生物样品中利福平和甲氧苄啶浓度，绘制血 药浓度时间曲线、尿药累积排泄量曲线，求算药代动力学参数。 结果 利福平药代动力学参数及分析：1 2 名自愿者单剂量口服利福平复方和单方制 剂( 相当于利福平3 0 0m g ) 后，利福平的体内药代动力学参数分别为：t m 舣：1 4 6 + 0 6 6 h 和1 2 9 士0 5 8h ；c m 觚：7 2 0 - a ：1 5 5 t g m l 和8 1 9 士2 1 0g g m l ；t l 2 ：3 4 2 士0 8 3h 和 3 2 1 + 0 6 2h ：v d f ：3 7 7 士3 9 8l 和3 5 6 士6 5 0l ；c l f - 8 1 5 + 2 4 4l h 和8 0 2 - 士2 3 3 l h ；m r t o t ：4 2 6 士0 3 8h 和4 0 1 士0 3 4h ；a u c o t ：3 5 5 + 9 0 8l a g h m l 和3 7 1 4 - 11 1 g g 。h m l ；a u c o - o o 4 0 1 + 1 2 4g g h m l 和4 0 9 + 1 3 7g g 。h m l 。1 2 名自愿者口服 复方制剂和单方制剂后，利福平从尿中排泄的百分率分别为：1 1 3 士3 8 6 和 l1 6 4 8 6 。尿药排泄最大速率在0 - - , 2h 内发生。采用s p s s l 3 0 软件对两种 制剂利福平主要药代动力学参数进行统计分析，结果表明，口服复方制剂和单方 制剂后不同组间利福平主要药代动力学参数无显著性差异。不同性别间利福平尿 最大排泄率、累积排泄量有显著性差异。 甲氧苄啶药代动力学参数及分析：1 2 名自愿者口服复方利福苄啶胶囊( 利福 平3 0 0m g ，甲氧苄啶8 0m g ) 后，甲氧苄啶的体内药代动力学参数分别为：t m 缸： 1 5 4 + 0 6 9h ；c m a x - o 8 4 + 0 1 5i t g m l ；t l 2 ：8 1 5 + 1 8 2h ；v d f ：8 8 3 + 1 8 9l ；c l f ： 7 7 4 士1 9 2l h ；m r t o - t ：1 0 5 + 1 8 0h ；a u c o - t ：1 0 6 + 2 6 4g g h m l ；a u c o 。：1 0 9 士2 7 8 g g h m l 。尿中排泄百分率为：4 9 6 士6 1 5 ；尿药排泄最大速率在0 4h 内发生。 采用s p s s l 3 0 软件对男女自愿者的主要药代动力学参进行，检验，统计结果表 明，单剂量口服复方利福苄啶胶囊后不同性别间甲氧苄啶主要药代动力学参数无 显著性差异。 结论皇口匕 健康志愿者口服利福平复方制剂和单方制剂后，利福平的体内药代动力学参 数无统计学差异。研究结果表明，甲氧苄啶与利福平联合用药不改变利福平的体 内过程，可用于临床联合药物治疗。 关键词 利福平；甲氧苄啶；高效液相色谱法；药代动力学 2 英文论著摘要 e f f e c to ft r i m e t h o p r i mo np h a r m a c o k i n e t i c s o fr i f a m p i c i n 0 b j e c t i v e as e n s i t i v ea n dr a p i dh p l cm e t h o dw a sd e v e l o p e dt od e t e r m i n a t i o no fr i f a m p i c i n a n dt r i m e t h o p r i mi nb i o l o g i c a ls p e c i m e n t h ep h a r m a c o k i n e t i c so fr i f a m p i c i na n d t r i m e t h o p r i mw a se v a l u a t e di n1 2h e a l t h ys u b j e c t sr e c e i v e dc o - r i f a m p i c i n - t r i m e t h o p r i m c a p s u l e sa n dr i f a m p i c i nc a p s u l e s t h ep h a r m a c o k i n e t i c so fr i f a m p i c i na n dt r i m e t h o p r i m w e r ei n v e s t i g a t e di no r d e rt oe v a l u a t et h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nt h et w od r u g sa n dt h e r a t i o n a l i t yo fd r u gc o m b i n t i o n m e t h o d s t od e t e r m i n a t i o nt h ec o n c e n t r a t i o no fr i f a m p i c i ni np l a s m aa n du r i n e ：t h e a n a l y s i sw a sc o n d u c t e d 谢t haz o r b a xe c l i p s ep l u sc 1s ( 4 6 x15 0m i l l ，5 岬) c o l u m nu s i n gp - n i t r o p h e n o la si n t e r n a ls t a n d a r d a c e t o n i t r i l e - 0 0 5m o l l 叫a m m o n i u m d i h y d r o g e np h o s p h a t e t r i e t h y l a m i n eb h 3 5 ，3 6 ：6 4 ：0 1 斗| 、| 吣w a s s e r v e da sm o b i l e p h a s e ，t h ed e t e c t i n gw a v e l e n g hw a sa t2 5 4n n l ，f l o wr a t ew a s1 m l m i n 1 t od e t e r m i n a t i o nt h ec o n c e n t r a t i o no ft r i m e t h o p r i mi np l a s m aa n du r i n e ：t h e a n a l y s i sw a sc o n d u c t e dw i t h az o r b a xe c l i p s ep l u sc 1 8 ( 4 6 x15 0l l l n l ，5 岬) c o l u m n , a c e t o n i t r i l e 一0 0 5m o l l 1a m m o n i u md i h y d r o g e np h o s p h a t e - t r i e t h y l a m i n e b h 3 5 ，1 4 ：8 6 ：0 1 w a ss e r v e da sm o b i l ep h a s e ，t h ed e t e c t i n gw a v e l e n g hw a sa t 2 30n n l ，f l o wr a t ew a s1m l m i n - 1 t ob ea p p l i e dt ot h ec l i n i c a l p h a r m a c o k i n e t i c ss t u d y o f r i f a m p i c i n a n d t r i m e t h o p r i m ：t h es t u d yw a sd e s i g n e d i nac r o s s o v e r , r a n d o m ，t w o t r e a t m e n t ， t w o - p e r i o dt e s t 12h e a l t h yv o l u n t e e r sp a r t i c i p a t i n gi nt h i ss t u d yw e r eg i v e nas i n g l e o r a ld o s ea sf o l l o w s ：t h es i n g l eg r o u p 、析t hr i f a m p i c i nc a p s u l e sa d m i n i s t e r e da tad o s e o f3 0 0m g ；t h ec o m b i n a t i o ng r o u p 谢t l lc o - r i f a m p i c i n t f i m e t h o p r i mc a p s u l e s ( w h i c hi s c o m p o s e do fr i f a m p i c i n 3 0 0m g ，t r i m e t h o p r i m8 0r a g ) t h ed r u gc o n c e n t r a t i o n so f e a c hi n g r e d i e n tw e r em e a s u r e db yh p l ca s s a yi n d i v i d u a l l y t h ep h a r m a c o k i n e t i c p a r a m e t e r so ft w oi n g r e d i e n t sw e r ec a l c u l a t e db ys t a t i s t i c a ls o f t w a r ed a s 2 1 1 3 r e s u l t s 1 1 1 em a i np h a r m a c o k i n e t i c sp a r a m e t e r so f r i f a m p i c i nw e r ev e r ys i m i l a ri nt h et w o g r o u p s ：t m x ：1 4 6 - 4 - 0 6 6ha n d1 2 94 - 0 5 8h ；c m 馘：7 2 0 士1 5 5 i _ t g m la n d8 1 9 士2 1 0 l x g m l ；t l 2 ：3 4 24 - 0 8 3ha n d3 21 4 - 0 6 2h ；v d f ：3 7 7 士3 9 8la n d3 5 64 - 6 5 0 l ；c l f ：8 154 - 2 4 4l ha n d8 0 24 - 2 3 3l h ；m r t o - t ：4 2 64 - 0 3 8ha n d4 0 14 - 0 3 4h ； a u c 0 - t ：3 5 54 - 9 0 8l a g h m la n d3 7 14 - 1 1 1 昭h m l ；a u c o 。：4 0 14 - 1 2 4 鹏h m l a n d4 0 94 - 13 7p g h m l 1 1 1 ec u m u l a t i v eu r i n a r ye x c r e t i o nr a t e so fr i f a m p i c i nw e r e ( 1 1 34 - 3 8 6 ) a n d ( 1 1 64 - 4 8 6 ) i n2 4h ，r e s p e c t i v e l y s t a t i s t i c a la n a l y s i sw a s p e r f o r m e du s i n gt h e s p s ss o f t w a r e ( v e r s i o n13 0f o rw i n d o w s ) t h e r ew a sn o s i g n i f i c a n td i f f e r e n c eb e t w e e nt h et w og r o u p se x c e p tt h ec u m u l a t i v eu r i n a r ye x c r e t i o n r a t e sa n de x c r e t et h eb i g g e s tv e l o c i t yb e t w e e ng e n d e r s 2 n l em a i np h a r m a c o k i n e t i c s p a r a m e t e r so ft r i m e t h o p r i mw e r e ：t m 双：1 5 44 - o 6 9h ；c m 麒：o 8 44 - 0 15k t g m l ；t l 2 ：8 15 4 - 1 8 2h ；v d f ：8 8 3 士1 8 9l ；c l f ：7 7 4 士1 9 2l h ；m r t o - , ：1 0 54 - 1 8 0h ：a u c o t ：1 0 64 - 2 6 4l a g 。h m l ；a u c o 。：10 94 - 2 7 8 鹇h m ll 1 1 1 ec u m u l a t i v eu r i n a r ye x c r e t i o n r a t e so ft r i m e t h o p r i mw e r e ( 4 9 64 - 6 15 、i n2 4h s t a t i s t i c a la n a l y s i sw a sp e r f o r m e d u s i n gt h es p s ss o f t w a r e ( v e r s i o n 13 0f o r w i n d o w s ) t h e r ew a sn os i g n i f i c a n t d i f f e r e n c eb e t w e e ng e n d e r s c o n c l u s i o n t h e r ew a sn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c ei nm a i np h a r m a c o k i n e t i c sp a r a m e t e r sa f t e rt h e h e a l t h ys u b je c t sr a n d o m l yr e c e i v e das i n g l eo r a ld o s eo fr i f a m p i c i nc a p s u l e sa n d c o r i f a m p i c i n - t r i m e t h o p r i mc a p s u l e s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tn oi n t e r a c t i o nw a sf o u n d w h e nt h et w o d r u g sw e r ea d m i n i s t e r e di n c o m b i n a t i o n t l l i ss t u d yc a no f f e ra v a l u a b l e r e f e r e n c ef o rc l i n i ct h e r a p y ，l k e yw o r a s r i f a m p i c i n ；t r i m e t h o p r i m ；p h a r m a c o k i n e t i c s ；h i g hp e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h y 4 英文缩略语 论文 甲氧苄啶对利福平药代动力学的影响 刖瞢 药物相互作用( d r u gi n t e r a c t i o n ) 是指两种或两种以上药物在同时或前后序贯 用药时，在体内产生作用的干扰，结果使疗效增强甚至产生毒副作用，或疗效减 弱甚至治疗失败。由于药代动力学过程是药物作用的重要方面，并且在吸收、分 布、代谢及排泄的过程中药物相互作用发生率较高，因此药代动力学相互作用具 有重要的临床意义【”】。药代动力学相互作用中最常见的是代谢性相互作用，即 c y p 4 5 0 酶的诱导和抑制。酶诱导可增加生物转化率，从而降低药物的浓度，而酶 抑制可增加药物的浓度，延长药理作用时间，增加药物毒性反应。酶诱导或抑制 存在较大个体差异，种族、年龄、疾病、基因多态性、诱导剂的半衰期和剂量及 个体的肝功能等都对其产生影响。其中酶抑制作用导致药物相互作用占代谢性相 互作用的7 0 ，酶诱导作用占2 3 。 复方利福苄啶( c o m p o u n dr i f a m p i c i n - - t r i m e t h o p r i mc a p s u l e ) 是由利福 平( r i f a m p i c i n ，r f p ) 与甲氧苄啶( t r i m e t h o p r i m ，t m p ) 组成的复方制剂【4 5 。， 是我国尚没有上市的产品，国外已经有该药品并投入临床应用。利福平是一种广 谱抗生素，是抗结核病的一线用药，其特点为杀菌性强，但对肝脏、肾脏的毒性 也较大，单独应用易产生耐药性。甲氧苄啶又名甲氧苄氨嘧啶、三甲氧苄啶等， 属抑菌剂，为亲脂性弱碱，化学结构为乙胺嘧啶类( 2 0 0 5 年版药典将其单独列为 一类：甲氧苄啶类) ，是一种广谱抗菌增效剂，临床上常与磺胺类药联用以增强磺 胺类药的抗菌作用。此外，它与其他多种抗生素和一些单昧中药或复方合用，可 产生协同作用【6 】。利福平与甲氧苄啶的化学结构式见图1 。 6 c c h 3 i 0 几 h = n 。弋t 屿 c h a o c - 1 3 0 c h 3 ( a ) 图1 ，利福平与甲氧苄啶化学结构a 利福平b 甲氧苄啶 ，n 、 ry n h 2 h 2 弋女 n i - 1 2 ( b ) 利福平抑菌的作用机制是抑制细菌和分枝杆菌体内依赖于d n a 的r n a 聚合 酶的形成，从而阻止r n a 初始链形成，达到抑制细菌蛋白质合成的目的。甲氧苄 啶是一种磺胺增效剂，可抑n - - 氢叶酸还原酶，阻止细菌内某些氨基酸、嘌呤、 嘧啶合成过程中所必需的二氢叶酸还原成四氢叶酸的过程，使细菌的叶酸代谢过 程受到阻断。研究发现，利福平和甲氧苄啶联合使用可以降低单独使用任何一种 药物产生细菌耐药性的几率【7 】，对尿路感染具有显著疗效【8 ，研究证实二者联合 用药具有重要的临床意义【9 , 1 0 。利福平是多种细胞色素p 4 5 0 酶的诱导剂，包括 c y p 2 c 1 9 、c y p 2 8 6 、c y p 3 a 4 、c y p 2 c 8 、c y p 2 c 9 、c y p l a 2 和c y p 2 a 6 其中 对c y p 3 a 4 的诱导作用较强j ，而对c y p l a 2 、c y p 2 a 6 的作用较弱。甲氧苄啶 是c y p 2 c 8 酶的底物，可选择性的抑带i j c y p 2 c 8 1 1 2 】。n i e m im 等的研究结果显示： 利福平和甲氧苄啶分别与c y p 2 c 8 底物罗格列酮合用时，可降低或升高罗格列酮 的血药浓度。 利福平口服吸收良好，服药后1 5 - 4 小时血药浓度达峰值。成人一次口服6 0 0 m g 后血药峰浓度( c m 默) 为7 9m g l ，6 个月至5 岁小儿一次口服1 0m g k g ，血药峰 浓度( c m 戤) 为1 1m g l 。表观分布容积( v d ) 为1 6l k g 。蛋白结合率为8 0 9 1 。 进食后服药可使药物的吸收减少3 0 ，该药的血消除半衰期( t l 2 ) 为3 5 小时，多 次给药后有所缩短，为2 3 小时。6 0 - - - 6 5 的给药量经粪便排出，6 - - - 1 5 的 药物以原形、1 5 为活性代谢物经尿排出，7 则以无活性的3 一甲酰衍生物排出。 甲氧苄啶口服后吸收完全，约可吸收给药量的9 0 以上，血药峰浓度( c i i l 戤) 在给药后1 - - - 4 d 、时到达，口服0 1g 后峰值血药浓度约为1m g l 。本品表观分布容积 为1 3 一- 1 8l k g ；蛋白结合率为3 0 - - 4 6 ；血浆消除半衰期( t 1 2 ) 为8 1 0 d 时。 7 t m p 主要自肾小球滤过，肾小管分泌排出，2 4 d 时约可排出给药量的5 0 6 0 ， 其中8 0 9 0 以药物原形排出，而其余部分以代谢物形式排出。平均尿药浓度 为9 0 - 1 0 0 m g l ，尿中峰值浓度约为2 0 0m g l 。在酸性尿中本品自尿排泄增加，碱 性尿中排出减少。本品少量自胆汁及粪便中( 约为给药量的4 ) 排出。 利福平和甲氧苄啶的药动学研究已有许多报道【1 3 。17 】，但是有关利福平和甲氧 苄啶联合应用的药动学研究国内未见报道。为探讨甲氧苄啶和利福平合用时药动 学相互作用，本课题对利福平和甲氧苄啶联合应用时在健康人体内的药动学进行 了研究，为临床合理用药提供理论依据。 8 论文一 t t p l c 测定生物样品中利福平和甲氧苄啶浓度 莉置 利福平是一种广谱抗生素，是治疗结核病的一线药物，其特点为杀菌性强， 单独应用易产生耐药性。甲氧苄啶是一种广谱抗菌增效剂。临床上常与磺胺类药 物联用以增强药物的抗菌作用。根据上述二种药物的作用特点，目前已有利福平+ 甲氧苄啶的复方制剂在国外上市，但其体内过程研究尚未见报道，本试验分别建 立了测定生物样品中利福平和甲氧苄啶浓度的h p l c 法，为进一步研究该药物的 体内过程提供研究方法。 材料与方法 一、实验材料 ( 一) 药品与试剂 试验药物：复方利福苄啶胶囊，规格为利福平3 0 0m g ，甲氧苄啶8 0 m g ，批号： 0 8 0 1 2 2 ，药品来源：广州环球生物科技有限公司；对照药物：利福平胶囊，规格 为利福平1 5 0m g ，批号：0 7 0 9 1 3 ，药品来源：浙江京新药业股份有限公司；利福 平对照品：中国药品生物制品检定所，批号：1 3 0 4 9 6 2 0 0 7 0 2 ；甲氧苄啶对照品： 中国药品生物制品检定所，批号：1 0 0 3 1 2 0 0 3 0 4 对硝基酚：沈阳市试剂厂，含量 9 9 5 ；甲醇色谱纯，天津四友生物医学技术有限公司；乙睛色谱纯，天津四友生 物医学技术有限公司；水亚沸二蒸水；空白血浆由中国医科大学附属盛京医院输 血科提供；其他试剂均为分析纯。 ( 二) 实验仪器 a g i l e n th p - 1 1 0 0 高效液相色谱仪( 安捷伦科学仪器有限公司) ，包括在线真 空脱气机，高压二元梯度泵，自动进样器，柱温箱，紫外检测器，a g i l e n t1 1 0 0 色 谱工作站；t g l 1 6 c 型高速台式离心机( 上海安亭科学仪器厂) ；x w - 8 0 型旋涡 混合器( 上海精科实业有限公司) ；a s l 0 2 0 0 b 型超声波清洗器( a u t os c i e n c e 9 c o l t d ) ：电热恒温水浴锅( 北京西城区医疗器械厂) ；c p 2 2 5 d 万分之一电子天 平( s a r t o r i u sa g ) ；s y z b 石英亚沸纯水蒸馏器( 仪兴新建石英玻璃仪器厂) 二、实验方法 ( 一) 建立测定血浆及尿液中利福平浓度h p l c 方法 1 、色谱条件 色谱柱：a g i l e n tz o r b a xe c l i p s ep l u sc 1 8 柱( 4 6 x 1 5 0m i n i ，5 岬) ；流动相： 乙腈：0 0 5m o l l n h 4 h 2 p 0 4 ( 用磷酸调p h = 3 5 ) ：三乙胺= 3 6 ：6 4 ：0 1 ( v v v ) ： 流速：1 0m l m i n ；检测波长：2 5 4i l l t i ；柱温：3 0 ；进样量：5 0 止。 2 、生物样品预处理 ( 1 ) 血浆样品的预处理 取血浆样品0 5m l 置于具塞塑料试管中，补加5 0p , 1 水，加入5 0 “l 内标( 1 0 0 “g m l 对硝基酚的甲醇溶液) ，加0 5m l 乙腈，涡旋混合1 m i n ，1 0 0 0 0 r m i n 离心 10m i n ，取上清液5 0 0r t l ，10 0 0 0r m i n 离心2m i n ，取上清液进样5 0 肛l 。 ( 2 ) 尿液样品的预处理 取2 5 0 “l 尿样置于具塞塑料尖底试管中，7 b l j 口5 0 “l 水，加入5 0p 1 内标( 1 0 0 p g m l 对硝基酚的甲醇溶液) ，力h 1 5 0 斗l 流动相，涡旋混合1 0 s ，1 0 0 0 0r m i n 离 心5m i n ，取上清液进样5 0 “1 。 ( 二) 建立测定血浆及尿液中甲氧苄啶浓度h p l c 方法 1 、色谱条件 色谱柱：a g i l e n tz o r b a xe c l i p s ep l u sc l s 柱( 4 6 1 5 0n l l t i ，5 岬) ；流动相： ( 血浆样品) 乙腈：0 0 5m o l l n h 4h 2 p 0 4 ( 用磷酸调p h = 3 5 ) ：三乙胺= 1 4 ：8 6 ： 0 1 ( v v v ) ；( 尿液样品) 乙腈：0 0 5m o l l n i - 1 4h 2 p 0 4 ( 用磷酸调p h = 3 5 ) ：三乙 胺= 1 5 ：8 5 ：o 1 ( v v v ) 。流速：1 0m l m i n ；检测波长：2 3 0a m ；柱温：3 0 c ； 进样量：1 0 0l x l ( 血浆样品) ；5 0 “l ( 尿液样品) 。 2 、生物样品预处理 ( 1 ) 血浆样品的预处理 取血浆样品0 5m l ，置于具塞塑料试管中，, b 加5 0p l 甲醇，加5 0 “l5 0 - - 1 0 氯醋酸，涡旋混合! m i n ，1 0 0 0 0 r m i n 离心1 0r a i n ，取上清液3 0 0 “l ，加入l m o l l 氢 氧化钠溶液1 5p l ，涡旋混合5 s ，1 0 0 0 0r m i n 离一d , 2 m i n ，取上清液进样1 0 0p 1 。 ( 2 ) 尿液样品的预处理 取o 1m l 尿样，稀释1 0 倍，置于具塞塑料尖底试管中，补加1 0 0 “l 甲醇， 加3 0 0 “1 流动相，涡旋混合1 0s ，1 0 0 0 0r m i n 离心5m i n ，取上清液进样5 0p 1 。 实验结果 一、h p l o 法测定血浆和尿液中利福平浓度分析方法确证 ( 一) 方法的专属性 分别取6 名自愿者的空白血浆0 5m l ，按“生物样品预处理”项下操作，进样 5 0p l ，得色谱图2 a ；将一定浓度的利福平标准溶液和内标溶液加入空白血浆中， 依同法操作，得色谱图2 b ；取自愿者给药后收集的血浆样品，依同法操作，得 色谱图2 一c 。同法操作考察尿液专属性，色谱图见图3 a 、图3 b 和图3 c 。结果 表明：空白血浆和尿液中的内源性物质不干扰利福平和内标的测定。 潮韵嘲瞪蹋i 啦麒臻黝m嗍 韵嘲蝴嘲；嗣 帮黻船孵 始咧绣静艄 图2 ，h p l c 法测定血浆中利福平色谱图 a 空白血浆样品色谱图 b 空白血浆样品加5 0 斗l 内标( 峰1 ) 和5 0l x l 禾u 福平标准溶液( 8 0 “g m l ， 峰2 )、 c 自愿者口服试验药物后2 0h 的血浆样品色谱图 猕& 鞠嘲姻蕾需麓蝴矾粒娼 翰 翔卿霸劂黜嘲臻鞠嘲& 蝴舶蒯嗍庵嘲啪口 图3 ，h p l c 法测定尿液中利福平色谱图 a 空白尿样色谱图 b 空白尿样加5 0 肛l 内标( 峰1 ) 和5 0p , 1 利福平标准溶液( 8 0r t g m l ，峰2 ) c 自愿者口服试验药物后4 0 8 0h 的尿样色谱图 ( 二) 标准曲线的制备 取空白血浆0 5m 1 ，依次加入浓度为2 5 0 ，5 0 0 ，1 0 0 ，2 0 0 ，4 0 0 ，8 0 0 ，1 6 0 “g m l 利福平标准系列甲醇溶液，配制浓度相当于0 2 5 ，0 5 0 ，1 0 0 ，2 0 0 ，4 0 0 ， 8 0 0 ，1 6 0p m l 的血浆样品，每个浓度为3 样本；取空白尿液0 2 5m l ，依次加 入浓度为2 5 0 ，5 o o ，1 0 0 ，2 0 0 ，4 0 0 ，8 0 0 ，1 6 0p g m l 利福平标准系列甲醇 溶液，配制相当于0 5 0 ，1 0 0 ，2 o o ，4 0 0 ，8 o o ，1 6 0 ，3 2 0 “g m l 的尿液样品， 每浓度为3 样本。按“1 2 项下操作，取5 0 此进行h p l c 分析，记录色谱图； 以待测物浓度为横坐标，待测物与内标物的峰面积比值为纵坐标，用加权 ( w = l x 2 ) 最d , - 乘法进行回归运算，求得的直线回归方程，即为标准曲线。每 个分析批( 每天) 建立一条标准曲线。测定血浆样品和尿液样品中利福平标准曲 线见表1 和表2 ，典型图例分别见图4 和图5 。 表1 ，h p l c 法测定人血浆中利福平浓度方法确证标准曲线 1 2 表2 ，h p l c 法测定人尿液中利福平浓度方法确证标准曲线 分析批 回归方程相关系数 481 2 浓度( i _ t g m l ) 图4 ，h p l c 法测定人血浆中利福平 浓度的典型标准曲线 31 62 43 2 浓度( w g n l ) 图5 ，h p l c 法测定人尿液中利福平 浓度的典型标准曲线 ( 三) 定量下限( l l o q ) 血浆中利福平的线性范围为o 2 5 1 6 0g g m l ，定量下限0 2 51 t g m l 尿液中 利福平的线性范围为0 5 0 3 2 01 t g m l ，定量下限为o 5 0p , g m l ，见表3 。 表3 ，h p l c 法测定人血浆( 尿液) 中利福平浓度最低定量限( p , g m l ) 血浆样品尿液样品 8 6 4 2 o 一一sv趔芏 8 6 4 2 o (s一蝈：h ( 四) 精密度与准确度 取空白血浆0 5m l 和空白尿液0 2 5m l ，按“标准曲线的制备”项下操作，制 备利福平低、中、高三个浓度的质量控制( q c ) 样品，每个浓度6 样本，血浆样 品连续测定3 天，尿液样品连续测定3 天。根据当日的标准曲线，计算q c 样品 的测得浓度，根据q c 样品结果计算本法的准确度与精密度，血浆样品和尿液样 品中利福平的准确度与精密度结果分别见表4 和表5 。 表4 ，h p l c 法测定人血浆中利福平浓度的准确度与精密度 1 4 表5 ，h p l c 法测定人尿液中利福平浓度的准确度与精密度 ( 五) 提取回收率 取空白血浆0 5m l 和空白尿液0 2 5m l ，按“标准曲线的制备”项下操作，制 备低、中、高三个浓度的q c 样品。同时另取空白血浆0 5m l 和空白尿液5 0p l ， 按“血浆样品和尿液样品的分析方法”项下操作，向获得的空白血浆和空白尿液上 清液中加入标准溶液5 0 肛l 和内标溶液5 0 肛l ，配制成相应浓度，涡流混合，取5 0 1 5 p l 进行h p l c 分析，获得相应峰面积，以每一浓度两种处理方法的峰面积比值 计算提取回收率，血浆样品中利福平低、中、高3 个浓度回收率分别为： 8 5 4 0 硅3 6 、8 6 i o 社i 7 、9 1 5 0 硅1 5 ，参见表6 1 ；尿液样品中利福平低、中、 高3 个浓度回收率分别为：1 0 3 4 0 硅5 8 、1 0 8 2 0 硅4 7 、1 0 5 7 0 硅1 1 ，参见表 6 1 、表6 - 2 。 表6 1 ，h p l c 法测定人血浆中利福平的提取回收率( n = 6 ) ( 六) 稳定性考察 表7 - 1 ，h p l c 法测定人血浆中利福平反复冻融三次稳定性数据( g g m l ) 融值测越。( 肛g - ，z l 洳定n 。( ；g - 0 ：勰一惋值。主釉 0 5 0 2 0 0 8 o o 0 4 7 ( 5 4 ) 0 4 5 ( 1 0 6 ) 0 ，4 8 ( _ 4 0 ) 2 0 3 ( 1 4 ) 1 9 7 ( 1 7 ) 2 0 5 ( 2 7 ) 7 7 0 ( 3 8 ) 7 7 9 ( 2 6 ) 0 5 0 ( 1 o ) 0 5 2 ( 4 0 ) 0 5 0 ( o 3 ) 2 0 1 ( 0 7 ) 2 1 0 ( 5 1 ) 1 9 6 ( - 2 2 ) 8 1 2 ( 1 5 ) 8 1 2 ( 1 4 ) 0 4 7 ( 6 5 ) 0 5 0 ( _ 0 8 ) 0 5 0 ( 0 2 ) 1 9 0 ( - 4 8 ) 2 0 4 ( 1 8 ) 1 8 6 ( 7 0 ) 7 7 5 ( - 3 1 ) 7 4 8 ( 6 5 ) 8 0 0 ( o 1 ) 8 2 8 ( 3 5 )7 6 4 ( 4 5 ) 1 6 取空白血浆0 5m l 和空白尿液0 2 5m l ，依据“标准曲线的制备”项下方法制 备q c 样品，经反复三次2 0 冰冻，室温溶解后，测定样品浓度。结果表明：所 有冻融试验测定值与添加值的相对误差( 1 迎) 均小于1 5 ( 结果见表7 1 、表7 2 ) 。 即血浆样品和尿液样品可以进行反复冻融，保障了整个分析过程中的数据真实、 可靠。试验中对2 4h 室温放置处理后的q c 样品，每个浓度3 样本，进行了稳定 性考察，结果显示所有室温放置试验测定值与添加值的相对误差( r e ) 均小于 1 5 ( 结果见表8 1 、表8 2 ) ，说明分析测试过程中的样品较为稳定。 表7 2 ，h p l c 法测定人尿液中利福平反复冻融三次稳定性数据( 1 , t g m l ) 添加值测定值( 第一次冻融) 测定值( 第二次冻融) 测定值( 第三次冻融) ( r e ) ( r e ) ( r e ) 1 o o 4 0 0 1 6 0 0 0 9 7 ( 3 0 ) 1 0 4 ( 4 2 ) 1 0 3 ( 3 3 ) 3 8 0 ( 4 9 ) 4 0 2 ( 0 5 ) 4 0 1 ( 0 3 ) 1 5 1 1 ( 5 6 ) 1 5 3 2 ( - 4 2 ) 1 0 2 ( 2 4 ) 1 0 0 ( o 0 ) o 9 9 ( - 0 9 ) 4 0 7 ( 1 7 ) 3 7 5 ( 6 3 ) 4 0 1 ( 0 1 ) 1 5 9 0 ( 0 6 ) 1 5 8 8 ( 0 8 ) 0 9 3 ( 7 0 ) 1 0 1 ( 0 8 ) 1 0 5 ( 5 5 ) 4 0 6 ( 1 4 ) 3 9 7 ( o 7 ) 3 9 0 ( 2 5 ) 1 4 6 9 ( 8 2 ) 1 5 7 6 ( - 1 5 ) 1 5 9 6 ( - 0 3 ) 1 5 4 2 ( 3 6 ) 1 5 2 3 ( - 4 8 ) 表8 - 1 ，h p l c 法测定人血浆中利福平室温放置2 4h 稳定性数据( 1 a g m l ) 添加值放置前测定值( r e )放置后测定值( r e ) 0 5 0 2 0 0 8 o o 0 4 9 ( 2 6 ) 0 5 3 ( 5 7 ) o 5 l ( 1 9 ) 1 9 7 ( 1 7 ) 2 0 9 ( 4 7 ) 2 1 0 ( 4 9 ) 7 6 3 ( - 4 6 ) 7 7 3 ( 3 4 ) 0 4 5 ( 1 0 3 ) 0 4 8 ( 3 7 ) 0 4 5 ( 9