（分析化学专业论文）氨基酸在乙醇磷酸氢二钾双水相体系中分离行为的研究.pdf

摘要 亲水性有机溶剂无机盐双水相体系是一种性质温和的分离体系，可适用于生物化 工、金属及络合物的分离、中草药中有效成份的提取及有机物的分离等领域。该体系具 有体系简单、原料价廉、低毒、无乳化现象等优点，是一种具有潜在工业化应用价值的 分离体系。 本文对乙醇磷酸氢二钾双水相体系在2 9 8 土1k 条件下的成相行为及液液相平衡体 系特征进行了较为详细的研究，考察了单一氨基酸在乙醇磷酸氢二钾体系中的分配行 为，并探讨了混合氨基酸在双水相体系中的分离情况，主要内容如下： 1 在2 9 8 1 k 下，绘制不同p h 下乙醇磷酸氢二钾双水相体系的相图。考察了p h 值对体系成相的影响，随着体系p h 的增大，两相区逐渐增大，成相容易。当p h 5 时，体系出现盐沉淀而无液液分相现象。 2 通过测定两相平衡体系的物理参数( 两相组成，密度，折射率等) ，对体系进行表 征。从实验数据可以看出，乙醇，磷酸氢二钾双水相体系，上相富含乙醇，下相富含磷酸 氢二钾，分相时间在1m i n 内，这些实验数据及相图对配制和利用乙醇磷酸氢二钾双水 相体系进行物质萃取分离具有重要的参考价值。 3 首次考察了五种不同极性，不同支链结构的氨基酸( 谷氨酸、半胱氨酸、苯丙氨 酸、赖氨酸、精氨酸) 在乙醇磷酸氢二钾双水相体系中的分配行为，对磷酸氢二钾浓度、 p h 及乙醇浓度，温度等对氨基酸分配行为的影响进行了探讨，确定p h 和氨基酸的支链 结构对氨基酸的分配行为影响较大。 4 首次对谷氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、精氨酸五种混合氨基酸在乙醇 磷酸氢二钾双水相体系中的分离行为进行研究。在梯度洗脱条件下，采用d n f b 柱前衍 生反相高效液相色谱方法分析两相中的氨基酸，优选出分离苯丙氨酸和半胱氨酸的最佳 双水相体系。利用简单、易得、低成本的亲水性有机溶剂无机盐双水相体系，为分离混 合氨基酸提供了一种新的可能，也可以用来预测一些表面结构中含有这五种氨基酸的蛋 白质分子在双水相体系中的分离情况。 关键词：双水相体系，氨基酸，乙醇，磷酸氢二钾，分离 a b s t l a c t h y d r o p h i l i co r g a n i cs 0 1 v e m s i n o 唱a n i cs a hc o n t a i n i n ga q u e o u st 、v o p h a s es y s t e mi s 0 n eo fm o d e r a t es e p a m t i o ns y s t e m s ，w l l i c hc a nb ea p p l i e dt ot h ef i e l d so fb i o c h e m i c a l e n g i n e e r i n g ，a i l dt h es e p e r a t i o no fm e t a l 锄dc o m p l e xc o m p o u n dr e s p e c t i v e ly ，t l l ee x t r a c t i o n o ft h ee c t i v ee l e m e n t si nc h i n e s e 位【d i t i o n a lm e d i c m ea 1 1 dt h es e p a r a t i o no fo r g a l l i c c o m p o u n d s ni sas i m p l ep m m i s i n gs e p a r a t i o ns y s t e m 谢t ha b l l n d a n ta n di n e x p e n s i v er a w m a t e r i a l ，l o wt o x i c i t y ，n o n e m u l s i f i c a t i o na d v 趾诅g e sa n dm a yb e 印p l i e dt 0i n d u s t r yf i e l d a t2 9 8 士1 k ，t h eb e h a v i o ro ff o m i n gt w op h a s e sa n d 恤ec h a r a c t c r so fl i q u i d l i q u i d e q u i l i b r i 啪i na q u e o u st w o - p h a s eo fe t h a n o la 1 1 dd i s p o t a s s i u mh y d r o g e np h o s p h a t ew e r e s t u d i e da 1 1 dm ep a r t i t i o n i l l gb e h a v i o ro ff i v es i n g l ea m i n oa c i d sa 1 1 dm 政e da m i n oa c i d sw e r e i i e s t i g a t e di nm e s es y s t e m s t h em a i nc o m e l l t sa r ea sf 0 1 l o w i n g ： 1 协t h ec o n d i t i o no f2 9 8 士1 k ，m ep h a s em a p so fe m a n 0 1a n dd i s p o t a s s i u mh y d r o g e n p h o s p h a t e 谢t hd i 位r e n tp hv a l u e sw e r em a p p e d ，a n dt h ee 位c to fp ho f 廿1 ep h o s p h a t e s 0 1 u t i o n sw a si n v e s t i g a t e d ，谢t ht l l ei n c r e a s eo fp hv a l u e ，t 、oo ft h ed i s m c ti sg r a d l l a l l y i n c r e a s i n g ，a si se a s y ，i tc 锄tf o n n t 、 r ol i q u i d l i q u i ds y s t e mw h e np hv a l u ei sl e s st h a n6 5 2 t h ep h a s ep a r a m e t e r so ft h es y s t e m sw e r ed e t e n n i n e d ，s u c ha st h ec o m p o s i t i o n ， d e n s 畸趴dr e 丘a c t i v ei 1 1 d e x i tw a sf o l l l l dt h a tm o r ee m a n 0 1i sc o n t a i n e di nt o pp h a s ea n d m o r ed i s p o t a s s i u m h y d r o g e np h o s p h a t e i sc o n t a i n e di nb o 慨p l l a s e ， l i q u i d l i q u i d e q u i l i b r i u mi sf i n i s h e di n1m i n u t e t h e s ee x p e r i m e m a ld a t aa n dp h a s ep i c t u r e sa r ev a l u a b l e t ot h ep r e p a r a t i o na n de x t r a c t i o nm a f e r i a l u s i n go fe 廿1 a n o l a n dd i s p o t a s s i u mh y d r o g e n p h o s p h a t es y s t e m 3 t h ed i 矧b u t i o nb e h a v i o ro ff i v ed i 航r e n tp o l a r i 吼d i 胁1 tc 城ns t r u c t l l r co fm e a m i n 0a c i d ( g l u t 锄i ca c i d ，c y s t e i n e ，p h e n y l a l a n j n c ，l y s i n e ，a 瑁i 1 1 i n e ) i na q u e o u s 似o - p h a s e o fe t h a n o la n dd i s p o t a s s i 啪h y d r o g e np h o s p h a t ew a ss t i 】d i e df i s t ，a i l d 也ei n f l u e n c e so f c o n c e m a t i o no fd i s p o t a s s i 啪h y d r o g e np h o s p h a t e ，p hv a l u e ，c o n c e n 虹a t i o no fe t h a n o l ， t e m p e r 砒1 1 1 - ea n dc h a i l ls t r u c t u r eo f 枷n oa c i d so nm ed i s t r i b u t i o nc o e m c i e n t so ft h ea 芏1 1 i n o a c i d sw e r ed i s c u s s e d f i n a l l y ，i tw a sf o u i l dt l l a tp hv a l u ca n dc h a i nm u c t u r eo f 锄i n 0a c i d s i m p a c to nt h ed i 谢b u t i o no f a m i n oa c i d se v i d e n yt o 廿l em o s t 4 t h es e p a r a t i o nb e h a v i o ro f 丘v em i x e d 锄i n oa c i d si na q u e o u s et w o - p h a s eo fe t l l a n 0 1 a n dd i s p o t a s s i u mh y d r o g e np h o s p h a t ew a ss t u d i e df i s t h 1t h ec o n d m o no f 酎a d i e me l u t i o n ，t 1 1 e c o n c e n r a t i o no f 锄i n oa c i d sw a sd e t e r i n i n e d b yh p l cw i t hp r e - c 0 1 u i i l l l2 ，4 d i n i 打o n u o r o b e l l z n e ( d n f b )d e r i v a t i o n 1 1 1 eb e s t a q u e o u st w o p h a s es y s t e m s o fs e p a r a t i o n p h e n y l a l a i l i n ea n dc y s t e i n e 行o mf i v ei n i x e da m i n oa c i d sw a sc h o s e n t l l i ss i 埘【p l e ，a c c e s s i b i e ， l o w - c o s th y d r o p l l i l i c o r g a l l i cs o l v e m sa i l di n o 罾u n j cs a l ta q u e o u st w o - p h a s e s y s t e m p r o v i d eap o s s i b i l i t yf o rs e p a r a t i n gm i x e da m i n oa c i d s ，i tc o u l da l s ob eu s e dt of o r e c a s t s u r f a c es 咖c t u r eo f 廿l ep r o t e i nc o m a i m n gt h ea m i n of i v ee l e m e n t s p a r t i t i o n i n gb e h a v i o ro f t 1 1 i sa q u e o u st w o p h a s es y s t e m k e yw o r d ：a q u e o u st w o p h a s e ；眦i n oa c i d ；e t l l a n o i ；d i s p o t a s s i u mb y d r o g e np h o s p h a t e s 印a r a t i o n 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致射的地方外，沦文中 不包含其能人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东北师范大学 或其他教育机构的学位或证书丽使用过的材料。与我一同工作的同志对本研 究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：垄勰蕴坠。日期 铆5 、工 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者突全了解东北颊范大学有关保留、使用学位论文的规 定，即：东北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复 印j 孛积磁盘，允许论文被查阅葶翼氆阅。本人授权寒北耀范大学可以将学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行枪索，可以采用影印、缩印或其它 复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 1 学位论文作者签名：查垡蹩l 丝指导教师签名：l 堑壶盟 日期：迎：臼期： 鳗：占! l 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编： 第一章文献综述 1 1 双水相体系的研究 1 1 1 概述 当两种聚合物( 如蒙乙二醇( p e g ) 和葡聚糖( d e x ) ，p e g 和p e s ( 羟丙基淀粉) 】 或一种聚合物与一种盐( 如p e g 和硫酸铵，p e g 和磷酸钾) 在水中以一定浓度混合时， 可形成互不相溶的两相，其中一相富含一种聚合物，一相富含另一种聚合物或盐，这种 两相体系称之为双水相体系( a q u e o l l 8 1 1 w o 呻h a s es y s t 咖s ，a t p s ) 1 “引。b e 巧谢n c k 最早发 现了双水相体系，a 1 b e n s s o n 首次将双水相体系应用于萃取和分离，他主要研究了聚乙 二_ 醇 暂聚糖( p e g ，d e x ) 系统和p e g ，盐系统在分离纯化中的应用，z a s l a v s k y 出版了专著， 介绍了双水相体系在很多领域的应用情况。取水相体系具有分离条件温和，质量传输快， 成本低，易操作，可调节等特点，与传统的有机溶剂萃取体系相比较，双水梢筚取体系 在生物物质的分离中有独到的优越之处。迄今，双水相体系已经在生物化学、细胞生物 学、生物化： 等有机物分离提纯方面得到了较为广泛的应用，如：分离提纯蛋白质”4 j 、 生物酶i 、菌体1 ”、细胞、氨基酸盼1 ”、抗生素 1 9 删以及亲水性生物大分子等0 1 “， 而且技术已相当成熟。但由于舣水相的原料聚乙二醇( 简称p e g ) 和葡萄糖( 简称 d e x t 工a 1 1 ) 成本太高，目前真正工业化的例子还很少，所以开发廉价的双水相体系则成了 双水相萃取分离技术发展的方向。 当能与水混溶的普通的有机溶剂，如乙醇、异丙醇、丙酮等，加入到某些电解质水 溶液中，利用盐离子的水化作用，使盐离子夺取原来与有机溶剂水台的水分子而释放出 有机溶剂分子，可形成有机溶剂无机盐双水相体系口”。当生物物质或天然产物中的有 效成分进入双水相体系时，由于表面性质、电荷作用和各种力( 憎水键、氢键和离子键) 的存在和环境因素( 浓度、温度、p h 值以及离子的种类和强度等) 的影响，生物物质 或天然产物中的有效成分易在两相间形成选择性的分配。利用这一点，可以实现生物物 质和天然产物中有效成分的提取、浓缩和分离。这类新型的萃取体系，在众多领域中表 现出广阔的应用前景。如在分析领域，可用来富集被测定的痕量物质“j ，在生物工程领 域，可用于下游产品的提取，在中药制药巾，可用于中草药有效成份的提取”，在金 属分离中，i j 用于浮选金属口 “等。 l _ 1 2 形成机理 在适当的条件下，某些盐能够和与水混溶的有机物的水溶液形成液液平衡的萃取体 系，这种现象的产生与三元体系的离子、分子相互作用有关，而且相当复杂，不仅与成 相有机溶剂、无机盐的种类、浓度有关，还与体系的p h 值、温度等外界条件有关，且 有一些大致的规律f 3 ”w 。第一，与水溶性有机溶剂的极性有关，极性越大，则分相能力 越差，例如，乙醇与丙酮、异丙醇相比，能与乙醇形成液液平衡体系的盐很少；第二， 与无机盐的离子半径、电荷数有关。一般束说，离子半径越小，电荷数越多，分相能力 与无机盐的离子半径、电荷数有关。一般束说，离子半径越小，电荷数越多，分相能力 越大，因而高价金属离子的分相能力都较强；例如，对丙酮盐水体系的研究发现，三种 碱金属碳酸盐的成相能力强弱顺序为：n a 2 c 0 3 k 2 c 0 3 c s 2 c 0 3 ；第三，与溶液p h 值有 关，同一种有机溶剂、无机盐水溶液在不同的d h 值条件下成相能力相差极大，甚至不 能分相，例如，乙醇，硫酸铵水溶液随着酸度的增加，成相所需的硫酸铵也不断增加， 最后到无论加多少硫酸铵也无液液相平衡，这种现象的原因，可能是h 十改变了水分子 或有机溶剂分子的结构，也可能是这些因素综合作用的结果。第四，与体系的温度有关， 体系温度过高或过低都不能分相。 基于相分离影响因素很多，而又缺乏系统的研究，因此，目前对这一体系的相分离 现象的解释也很多，如，水离子化的结果、无机盐盐析效应的结果、无机盐与有机溶剂 夺取水分子的结果等等。这类体系的液液相分离现象的真正机理有待于进一步研究。目 前，报道的亲水有机溶剂无机盐双水相体系主要有以下类型，如表l 一1 ： 表1 1 亲水有机溶剂，无机盐双水相体系类型 双水相体系相平衡一般由相图表示。图1 1 是乙醇磷酸氢二钾双水相体系的相图。上 相( 轻相) 组成用t 点表示，下相( 重相) 组 成用b 点表示，由图中可以看出，上下相所含 组分有所偏重，上相主要含乙醇，下相主要含 有水。连接双节线上两点的直线称为系线，在 系线上各点处系统组成不同，但上下相的量服 从杠杆定律，即t 和b 的两相质量之比等于 系线上m b 与m t 的线段长度之比。系线的长 度是衡量两相问相对差别的尺度，系线越长， 乙0 6 醇 霎o 4 分 萋仉2 00 20 4 磷酸氢= 钾质量分数 图l - 1 乙醇，磷酸氢二钾双水相体系相图 两相间的性质差别越大，反之则越小。当系线长度趋向于零时，即在图上的双节线上c 点，两相的差别消失，任何溶质在两相中的分配系数均为1 ，因此c 点称为临界点或褶 点。 1 1 3 双水相体系特点 亲水有机溶剂无机盐水所形成双水相体系是一种新型的萃取体系，与传统的高聚 物高聚物或高聚物无机盐双水相体系相比，具有一些独特的优点h o 】： 1 溶剂成本低，原料丰富廉价； 2 溶剂粘度小，传质和分相速度快，无相乳化现象： ， 3 溶剂挥发度大，可省去反萃取步骤，降低操作费用； 4 体系简单，溶剂回收容易。 且已有的研究表明，此类体系可以为部分生物物质提供良好的生物环境，部分物质 在该环境下不受到损害，因此采用亲水有机溶剂无机盐双水相体系可望解决双水相萃取 技术原料成本偏高这一关键性问题，充分发挥双水相萃取的技术优势和成本优势，从而 实现双水相萃取技术提取分离生物物质和天然产物中有效成分的大规模工业化生产，并 为生物物质的分离纯化提供一种新体系的可能。 1 1 4 双水相体系萃取原理 双水相萃取与水有机相萃取的原理相似，都是依据物质在两相间的选择性分配。当 萃取体系的性质不同时，物质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用和各种力( 如 憎水键、氢键和离子键等) 的存在和环境因素的影响，使其在上、下相中的分配行为不 同，形成浓度差。分配系数k 等于物质在两相的浓度比，根据各种物质的分配系数k 的差异，可对物质进行分离和提纯。 1 1 5 影响物质分配平衡的因素 物质在双水相体系中的分配系数不是一个确定的量，它要受许多因素的影响】。 研究表明生物物质在双水相中的分配系数取决于溶质与双水相系统间的各种相互作用， 其中主要有静电作用、疏水作用、生物亲和作用等。对于某一物质，只要选择合适的双 水相体系，控制一定的条件，就可以得到合适的( 较大的) 分配系数，从而达到分离纯 化目的。表1 2 所示是被分离物质在双水相体系中分配的主要因素。 表1 2 影响被分离物质分配的主要因素 1 1 5 1 成相物质的影响 对于成相聚合物，其相对分子量和浓度是影响溶质分配平衡的重要因素。若降低 聚合物的分子量，分配系数随之不同而改变。当成相系统的总浓度增大时，系统远离临 界点，系线长度增加，两相性质的差别( 疏水性等) 增大，分配系数将远离临界点处的 值，即分配系数大于1 或小于1 。 1 1 5 2p h 的影响 体系的p h 值对被萃物的分配有很大影响，这是由于体系的p h 变化能明显地改变 两相中的电位差，而且，p h 的改变还导致生物物质( 如蛋白质，氨基酸) 带电性质的 变化。如体系p h 与蛋白质的等电点相差愈大，则蛋白质在两相中的分配愈不平均。 1 1 5 3 电解质的影响 在双水相体系中加入电解质，由于阴、阳离子在两相中的分配差异，形成穿过相界 面的电位，从而影响带电大分子物质在两相中分配。如在p e g e x 系统中加入n a c l 0 4 或日时，可增加上相对带正电荷物质的亲和效应，并使带负电荷的物质进入下相。 1 1 5 4 温度的影响 温度影响双水相体系的相图，因而影响溶质的分配系数。但一般来说，当双水相体 系离双节线足够远时，温度的影响很小，1 2 的温度改变不影响目标产物的萃取分离。 1 1 6 亲水有机溶剂无机盐双水相体系的应用 传统的高聚物，高聚物或高聚物无机盐双水相体系，已经成功用于分离和提取各种 蛋白质( 多肽和酶) ，分离和提取各种抗生素，分离和提取氨基酸，分离和提取金属， 分离和提取中药的有效成份等领域。由于新型的有机溶剂无机盐双水相体系与传统的双 水相体系相比，具有分相清晰，成本低，萃取相不含粘度大、难处理的聚合物，对测定 干扰小等优点，而成为国内外研究的热点，其应用见下表1 3 。 表1 3 亲水有机溶剂，无机盐双水相体系的应用实例 1 1 6 1 在生物工程中的应用 亲水有机溶剂无机盐双水相体系在适当的浓度范围内，两相的含水量很高，能形成 温和的萃取体系，因此被生物工程作为中下游产物分离的一种新手段。目前，国内外在 这方面的研究虽然还不多，但已有的报道表明，它可能是一种有潜在价值的分离体系， l o u w r e r p 列用乙醇磷酸氢二钾体系萃取分离b s a ，n 酪蛋白，核糖核酸酶等生物物质， 实验结果表明，被萃取物在该体系中能得到良好的分离，分配系数随p h 值等的变化而 变化，而且部分生物大分子的生物活性不会损失。谭平华 4 2 ) 等人，以乙醇磷酸氢二钾 双水相体系萃取分离l 一赖氨酸，在k 2 h p 0 4 叭= o 2 5 ，c 2 h 5 0 h = 0 2 0 ，p = 1 3 时， 赖氨酸的分配系数k 可达1 2 8 。这为赖氨酸的分离和精制提供了一种新可能。 1 1 6 2 中草药有效成份提取中的应用 由于中草药有效成份的鉴定和提取技术在国内发展一直比较缓慢，这就限制了中药 药理学的发展、深化以及中药现代化的步伐。近几年来，有关亲水有机溶剂无机盐双水 相体系萃取技术提取中草药有效成份的文献开始报道，显示出良好的应用前景。林强， 霍清【4 驯利用乙醇磷酸氢二钾体系萃取甘草有效成份，研究表明，当双水相体系的总量 为1 0 向，乙醇与水体积比为3 ：2 ，磷酸盐的质量为1 5 9 ，在上述条件下，乙醇，磷酸氢 二钾体系的两相分配完全，分配系数最大为1 2 8 0 ，收率高达9 8 1 3 。 1 1 6 3 在金属分离及络合物中的应用 马万山】等研究了硫酸铵存在下，溴化钾一乙醇体系萃取分离金的行为，实验表明， b r 一与a u b 形成的a u b 。一很容易被萃取到乙醇相中，当溶液中k b r 、硫酸铵和无水乙醇 浓度分别为0 0 4 9 m l ，0 3 0 9 m 1 ，3 0 ( v 厂v ) ，p h = 2 4 时能使a u b 的萃取率达到1 0 0 ，a l b 、n 认、m n a 、c r b 、c o a 、f e b 、z n a 、c u a 、m o e 、u c 基本不被萃取， 实现了a u b 与上述离子的分离。 李全民等【4 ”6 】运用这种新型双水相进行贵重金属及络合物的研究。其中在碘化物一 乙基紫一异丙醇体系萃取分离镉中，研究表明，异丙醇作为萃取剂，能萃取中性离子缔 合物。溶液p h = 1 6 时，该体系能使c d 2 + 从常见过渡元素f e 3 + 、c 0 2 + 、n i 2 + 、m n 2 - 、z i l 2 + 的混合液中分离出来。在运用硫酸铵一水杨基荧光酮一乙醇体系萃取分离钨中，研究表 明，作为萃取剂的乙醇，既能萃取电中性的螯合物，又能萃取带电荷的螯合物。当溶液 p h = l 一2 ，能使w ( v i ) 与f e ( ) 、c u ( i i ) 、c o ( i i ) 、n i ( i i ) ，m n ( i i ) 分离。此外运 用氯化钠丙醇体系浮选铋，用氯化钠丙醇体系萃取分离汞也取得了满意的结果。 高云涛1 4 7 5 叫等运用这种新型双水相体系进行贵重金属及络合物的研究。其中在运用 丙醇一硫酸铵双水相体系萃取铂( i i ) 三氯亚锡酸络合物中，研究表明，影响分配比的因素 有酸度、氯化亚锡浓度及硫酸铵用量，铂( i i ) 的分配比随硫酸及氯化亚锡浓度的增加 而增加，萃取的最佳条件是：氯化亚锡浓度0 0 2 m o l l 盐酸浓度0 3 6 m o l l ，硫酸铵用量 3 0 。使用斜率法测定了萃合物的组成是：p t ( i i ) ：s n c l ”：r o h ”= 1 ：2 ：2 。通过红 外光谱、吸收光谱等实验事实提出萃取是基于离子缔合机理。在运用丙醇一氯化钠双水 相体系萃取铑( i i i ) 一氯化亚锡一2 一巯基苯并噻唑( m b t ) 络合物中，研究表明，在 h c l 介质中，铑( i i i ) 的萃取率是9 9 ，方法可从f e 、a l 、p b 、z n 、c a 等常见金属基 体中分离铑( i i i ) ，并建立了双水相体系萃取分光光度法测定微量铑( i ) 的新方法。 在用丙醇一氯化钠双水相体系中还分离了铂钯铑金中的铱，在运用乙醇一氯化钠一水双 水相体系萃取测定金的研究中，研究表明，在氢溴酸介质中体系可定量萃取金( i i i ) ， 萃取率可达9 9 。 1 1 - 6 4 有机物分离中的应用 溶剂萃取分离技术在化学研究及实际生产中有着广泛的应用，但常规的溶剂萃取体 系在分离某些有机化合物时存在一些限制，例如利用氯仿萃取分离p ：a r 【5 】，只能在d h 值范围3 5 5 o 之间进行，且只有9 4 9 5 的回收率。因而研究开发其他的萃取体系是 必要的，文献表明盐诱导液液平衡体系，乙醇，碳酸钠或硫酸铵体系在萃取分离p a r 时 p h 值在1 o 一1 4 0 的范围内，回收率都能达到9 8 以上。 1 1 _ 7 双水相萃取技术的发展趋势 1 1 7 1 双水相萃取技术与相关分离技术集成 双水相萃取技术作为一个很有发展前景的生物分离单元操作，除了有其独特优势 外，也有一些不足之处，如易乳化、相分离时间较长、成相聚合物的成本较高、分离效 率不高等，一定程度上限制了双水相分配技术的工业化推广和应用。双水相萃取技术与 电泳、层析、温度诱导相分离、渗透释放和亲和技术等实现集成化后，在技术上互相渗 透，实现优势互补，从而体现了集成化的优势，具体表现在三个方面口2 | ”j ：与温度诱 导相分离、磁场作用、超声波作用、气溶胶技术等常规技术结合来解决双水相萃取本身 的难点问题；与亲和沉淀、高效层析等新型生化分离技术实现过程集成，充分融合了 双方的优势以提高分离效率，简化分离过程；将生物转化、化学渗透释放和电泳等技 术引入双水相分配，给已有的技术赋予了新的内涵，为新分离过程的诞生提供了新的思 路。 1 1 7 2 新型双水相系统的开发 在生物物质分离过程中得到应用的双水相系统有两类，一类是聚合物和聚合物双水 相体系，一类是聚合物和无机盐双水相体系。因为所用的聚合物无毒性，已被许多国家 的药典所收录，而且其多元醇、多元糖结构能使生物大分子稳定，但在实际应用中这两 类双水相系统各有优缺点，前者体系对生物活性物质变性作用低，界面吸附少，但是所 用的聚合物( 如葡聚糖) 价格较高，成本高，而且体系黏度大，影响工业规模应用的进 展；后者成本相对低，黏度小，但是由于高浓度的盐废水受到环保限制，且有些对盐敏 感的生物物质会在这类体系中失活。因此，寻求新型双水相体系成为双水相萃取技术的 主要发展方向之一，新型双水相体系的开发主要有两类：廉价的双水相体系和新型功能 双水相体系。 廉价双水相体系的开发目前主要集中在寻找廉价的高聚物取代现有昂贵的高聚物， 如用变性淀粉、乙基羟乙基纤维素、糊精、麦芽糖糊精等有机物代替昂贵的葡聚糖，羟 基纤维素、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮等代替p e g 都获得了阶段性的成果。 新型功能双水相体系是指高聚物易于回收或操作简便的双水相体系。随着双水相技 术研究的不断深入，新的双水相体系，表面活性剂一表面活性剂一水体系【5 ”，普通有机 物一无机盐一水体系，双水相胶束体系等相继被发现。现有的研究表明，这些双水相体 系各有优势，表面活性剂双水相体系与高聚物双水相体系相比，有更高的含水量，因而 条件更为温和，表面活性剂的增溶作用，不仅可以用于可溶性蛋白质分离，而且可用于 水不溶性蛋白质的分离；普通有机物型双水相体系的最大优点是价格便宜，分离后续工 作处理简单。另外，有一种新的体系是只有一种成相聚合物的双水相体系，上相几乎1 0 0 是水，聚合物绝大部分集中在下相，该体系不仅操作成本低，萃取效果好，还为生物 物质提供了更温和的环境。 1 1 7 3 双水相萃取相关理论的发展 虽然双水相萃取技术在应用方面取得了很多进展，但目前这些工作几乎都只是建立 在实验数据的基础上，至今还没有一套比较完善的理论来解释生物大分子在体系中的分 配机理。考虑到生物物质在双水相系统中的分配时是一个由聚合物，聚合物( 或无机盐) 、 生物分子和水等构成的四元系统，系统中的组分性质千差万别都不可避免地造成理论计 算的复杂性，因此，建立溶质在双水相系统中分配的机理模型一直是双水相系统相关研 究的重点和难点。目前，比较成功的模型有两类：e d m o n d 等人提出的渗透维里模型， 即e d m o n d o g s t o n 方程，f 1 0 r y 和h u g g i n s 根据热力学的基本原理提出晶格模型，前者 在预测聚合物的成相行为和蛋白质的分配上有较高的准确度，后者在粒子的能量概念上 可以很好地拟合实验数据。 1 2 氨基酸的研究概况 氨基酸是生物有机体的重要组成部分，是构成蛋白质的基本单位，具有极其重要的 生理功能，广泛用于食品、医药、添加剂及化妆品行业。随着生物工程技术产业逐渐成 为2 1 世纪全球的主要产业之一，氨基酸生理作用研究的不断深入，加之人们健康保健 意识的增强，氨基酸作为营养强化剂而倍受关注，其需求量越来越多，质量要求越来越 高，品种变更越来越快，工艺改革越来越新。目前全世界氨基酸每年的产量为1 0 0 万吨， 需求8 0 0 万吨，且还在逐年上升，其中蛋氨酸2 5 万吨，赖氨酸5 0 万吨；我国氨基酸的 需求总量为1 0 1 5 万吨( 实际产量为3 万吨) ，其中蛋氨酸5 万吨，赖氨酸6 4 万吨。从 组成上看，我国自2 0 世纪6 0 年代起，食品工业的氨基酸用量占6 1 ，饮料工业的氨基 酸用量占3 0 ，医药、日用化工、农业、冶金、环保、轻工、生物工程技术等方面占用 的比例逐年增加。 1 2 1 氨基酸的应用 1 2 1 1 在食品行业的应用【5 5 】 谷氨酸钠是人类应用的第一个氨基酸，也是世界上应用范围最广、产销量最大的一 种氨基酸。从1 9 0 8 年日本投入工业化生产到现在，人们己陆续发现具有甜味的甘氨酸、 丙氨酸，具有酸味的天冬氨酸、谷氨酸，具有鲜味的天冬酸钠，它们都可以用作食品添 加剂。如甘氨酸用于清凉饮料、肉汤、酱菜的加工，不仅能增加甜味，还能缓和苦味。 赖氨酸是人体必需氨基酸之一，也是蛋白质的第一限制氨基酸，具有增强胃液分泌和造 血机能，人体缺乏赖氨酸，就会发生蛋白质代谢障碍和机能障碍。我国已把赖氨酸列入 食品营养强化剂使用卫生标准，并开发出多种赖氨酸食品和饮料。同时将蛋氨酸等人体 必需的氨基酸也作食品添加剂，用以提高食品的营养价值。此外，氨基酸在食品行业的 功能还有：赖氨酸可作食品除臭剂，甘氨酸可作抗菌剂，赖氨酸聚合物可用作食品防腐 剂，甘氨酸、l 一谷氨酸等可作食品香料，赖氨酸、精氨酸可用作食品发色剂，甘氨酸可 作膨化食品添加剂等。 1 2 1 2 在医药行业的应用 氨基酸是合成人体蛋白质、激素、酶及抗体的原料，在人体内参与f 常的代谢和生 理活动，用氨基酸及其衍生物可以治疗多种疾病，如作为营养剂、代谢改良剂，具有抗 溃疡、防辐射、抗菌、治癌、催眠、镇痛及为特殊病人配削特殊膳食的功效。氨基酸的 混合液可供病人注射用，氨基酸的混合粉荆可作宇航员、飞行员的补品。又如，精氨酸 药物用于治疗由氨中毒造成的肝昏迷；丝氨酸药物用作疲劳恢复剂；蛋氨酸、觥氨酸用 予治疗艏臆肝：甘氨酸、谷氨酸用予调节胃液；l 一谷氨酸与l 一谷氨酰胺用于治疗脑出血 后的记忆力障碍等。近年来又开发了复含氨基酸剁荆，如赖氨酸一维生索漓剂等，具有 促进儿童生长发育、治疗各种梅毒及提高良血球等疗效。以氨基酸为原料的激素、抗 菌素、酶抑制齐电抗癌药等生物活性多肽也不断出现，爵在工业上生产的多肽有谷胱甘 肽、促胃液素、催产素、促a c t h 、降钙素等。氨基酸药物世晃年总需量现已达4 5 万 吨。 1 2 。l 。3 在饲料添加剂行业上豹应用 氨基酸在饲料工业中主要被熊作饲料强纯添加铡，蕊爨之大已l 成为漓耗氨基酸最大 的部门。世界饲料工救所用的蛋氨酸和赖氨酸已近4 0 万吨，且还在逐年上升。我国在饲 料添加剂行业用的氨基酸主要有蛋氨酸和赖氨酸，其功效主要是：促进动物生长发育； 改善宠质，提高畜禽生产能力，增加产奶产蛋量 提高饲料利用率，节省蛋臼质饲料； 簿低成零。另外，色氨酸和苏氨酸是家畜禽饲料的第3 、第4 限制氨基酸，甘氨酸、精氨 酸也是小鸡及其它幼禽及水产品饵料的需求添加剡。 1 2 1 4 在化妆品行业的应用 氮基酸及其衍生物与人体皮肤结构相似，易被皮肤吸收，使老化鞠硬化的表皮恢复 水合性和弹性，延缓皮胶衰老。因此氨基酸在日用化工上的应用已有取代常用化工原精 的趋势，如氨基酸和薅级脂肪酸隶l 成的表面活性剂、抗菌荆成为最离效的添龆剂而被广 泛使用；精氨酸或甘、丽、缬氨酸的碳酸盐、聚天门冬氨酸或聚谷氨酸盐、胱氨酸或半 胱氨酸盐( 酯) 等制成的护发荆、染发剂、永久型烫发剂己成为时兴商品供应市场。添加 丝氨酸、酰基谷氨酸钠或酰基丙氨酸钠及月桂酰肌氨酸钠、焦谷氨酸、碱性氨基酸制 成的护肤用品，用氨基酸合成的氢基酸羧黢型两性表面活性剂，具有毒性低、刺激小、柔 软、抗静电、蓉蓥等性能，在洗涤用品、化妆晶、纺织印染、制药等方蕊有较大的用途。 1 2 1 5 在其它行业豹应月 在农业方鬣，一些氨基酸在体外并无杀菌功能，但它们能干挠植物与病原菌之间的 生化关系，健植物的代谢及抗瘸能力发生变化，从而达到杀菌的嗣的。如忍甘氨酸捌成 的除草剂，这类农药易被微生物分解，不会造成环境污染。在轻工嫩方面，聚谷氨酸和 聚嚣氨酸正在被磅制成具有良好保温性鄹透气性的人造皮孳和高级人造纤维。在生物工 程方面，半胱氨酸等正被开发成新的保护测，亮氨酸、胱氨馥等正作为发酵工业中多种 氨基酸生产菌的添加荆丽被应用，在贵金涡提取和电镀工业方颟，天门冬氨酸、组氨酸、 丝氨酸在溶金培养液中应用，使溶金能力提高1 0 0 _ 2 0 0 倍；谷氨酸等可用于电镀工业麴 电解溶液，胱氨酸可用于铜矿探测，氨基酸烷基酪可用予海上流油回收。 1 2 。2 氨基酸的性质 氨基酸是一种其有两性官能疑的物质1 5 6 】。程氨基酸都有一个8 氨基，个羧基及 一个侧链，通式为r c h ( n h 2 ) c o o h 。根据酸碱性质的不同，氨基酸可以分为三类：酸性 氨基酸，碱性氨基酸和中性氨基酸。当介质的p h 值达到一定值时，氨基酸分子呈电中 性，此时的p h 称为氨基酸的等电点( p i ) 。当介质的p h 值低于等电点，氨基酸以阳离 子形式存在：当p h 高于等电点，氨基酸以阴离子形式存在，氨基酸的溶解度随p h 值 的变化很大，在等电点处溶解度最小，氨基酸分子的净电荷符号和各类存在形态摩尔分 数的大小是随溶液的p h 值变化而变化。 1 2 2 1 谷氨酸 l _ 谷氨酸g l u t 锄i c a c i d 是一种一氨基和二羧基的酸性氨基酸，又名2 一氨基戊二酸， 分子式c 5 h 9 n 0 4 ，相对分子质量1 4 7 1 3 。无色或白色结晶性粉末，味微酸。在热水 中溶解，在水中微溶，在乙醇、丙酮或乙醚中不溶。水溶液中谷氨酸的解离常数，pk l = 2 1 9 ( 0 【一c 0 0 h ) ，p k 2 = 4 2 5 ( 丫一c o o h ) ，p k 3 = 9 6 7 ( a n h 2 ) ，等电点p i = 3 2 2 。 下图是l 谷氨酸的结构式： 0n h0 0i 0 图1 2l 谷氨酸的结构式 谷氨酸是人类应用的第一个氨基酸，也是世界上应用范围最广、产销量最大的一种 氨基酸，是参加人体脑代谢的唯一氨基酸，能促进智力发育，维持和改进大脑机能。 1 2 2 2 半胱氨酸 l 半胱氨酸c y s t c i n e ，是一种不带电荷的极性氨基酸，又名a - 氨基- p - 巯基丙酸，学 名巯基丙氨酸，相对分子质量1 2 1 1 2 ，无色晶体，是一种含巯的氨基酸，溶于水、乙醇、 乙酸和氨水，不溶于乙醚、丙酮、乙酸乙酯、苯、二硫化碳和四氯化碳。水溶液中半胱 氨酸的p k l = 1 7 1 ，p k 2 = 8 3 3 ，p k 3 ( 一s h ) = 1 0 7 8 ，p i 5 0 2 。下图是l 一半胱氨酸的结构 式： 图l - 3l 半胱氨酸的结构式 1 2 2 3 苯丙氨酸 l - 苯丙氨酸p h e n y l a l a i l i n e ，又称氨基化肉桂酸，学名2 氨基，3 一苯基丙酸，分子式 为c 9 h 1 l n 0 2 ，分子量为1 6 5 1 9 ，等电点为p i = 5 4 8 ；在水溶液中，存在两个平衡，其 p k l 和p k 2 分别是1 8 3 和9 1 3 。白色粉末，味苦，溶于热水和乙醇，稍溶于乙醚，不溶 于苯。其结构式如下： 图1 _ 4l 苯丙氨酸的结构式 苯丙氨酸在自然界中广泛存在，但含量都不高。l 一苯丙氨酸具有生理活性，人和动 物都不能合成，必需从外界摄取。在生物体内，l 一苯丙氨酸是转化酪氨酸的原料，l - 苯 丙氨酸和酪氨酸的缺乏与代谢正常与否和人的健康有密切关系。因此，l 一苯丙氨酸成为 一些氨基酸输液、氨基酸胶囊和氨基酸营养品所必需的成份。同时作为人体所需的八大 氨基酸之一，在医药、食品领域有广泛的应用。可以作为食品添加剂、抗癌药物中间体， 合成二肽甜味剂阿斯巴甜。 1 2 2 4 赖氨酸 赖氨酸l y s i n e ，为三种天然碱性氨基酸中的一种，学名2 ，6 二氨基己酸，或n ， s 二氨基己酸，其化学分子式为c 6 h 1 4 0 2 n 2 ，其分子量1 4 6 2 ，呈无色针状晶体，极易溶于 水，微溶于乙醇，水溶液中赖氨酸的解离常数，p k l - 2 2 0 ( - c o o h ) ，p k 2 = 8 9 0 ( n h 2 ) ， p k 3 = l o 2 8 ( n h 2 ) ，等电点p i _ 9 4 9 。由于其分子结构中具有a 一位不对称碳原子，故 有二种光学活性的异构体。而生物所能直接利用的只有左旋体( l 型) ，即下图所示的 结构式。 r 日 n c h 2 一c h r c 吁一c h 广c h c o h 图1 5 赖氨酸的结构式 赖氨酸是人类和动物生长所必需，而又不能在体内合成的氨基酸之一，广泛用于食 品、饲料和医药工业，在平衡氨基酸组成方面也起着十分重要的作用。随着世界饲料工 业和制药工业的蓬勃发展，赖氨酸的消费量逐年增加，我国赖氨酸市场总供应量逐年递 增，目前世界赖氨酸供应偏紧，为我国赖氨酸生产市场提供了有广阔的发展前景。 1 2 2 5 精氨酸 精氨酸a 唱i n j n e ，学名2 一氨基一5 一胍基戊酸，其化学分子式为c 6 h 1 5 0 2 n 3 ，分子量 1 7 4 4 ，在水溶液中，解离常数p k l _ 2 1 7 ，p k 2 = 9 0 4 ，p k 3 = 1 2 4 8 ( 胍基) ，等电点p i = 1 0 7 6 。 无色晶体，溶于水，微溶于乙