（作物遗传育种专业论文）泡盛曲霉植酸酶基因转化烟草的研究.pdf

大连理工大学硕士学位论文 摘要 本论文的研究目的是纯化泡盛曲霉植酸酶蛋白，研究其酶学性质，并克隆泡盛曲霉 植酸酶基因，构建植物表达载体并转化模式植物烟草，分析比较烟草中重组植酸酶的酶 学性质。 本研究以半固体发酵方式培养泡盛曲霉( a s p e r g i l l u sa w o m o r i ) 生产植酸酶，通过超 滤、阴离子交换层析，凝胶层析等步骤，纯化了植酸酶蛋白，分子量约为1 1 8 k i ) a 。脱 糖基化结果显示，该酶糖基化程度为4 0 6 。酶学性质研究结果为：泡盛曲霉植酸酶反 应最适温度为5 5 ，最适p h 为5 5 ，3 7 条件下以植酸钠为底物的k 。值为1 0 3 n m ， v 。为2 1 3 t t m m i n 。金属离子对酶活性影响的研究结果表明，e d t a 基本不影响植酸酶 活性，c a 寸，m 矿，m n 2 + 有轻微的抑制作用，f ，z n 2 + 抑制作用显著。对该酶的耐热 性研究表明，在较高温度条件处理后，仍有较高残余酶活性，与当今商品化的植酸酶相 比，有较强的耐热性。 利用p c r 技术克隆了泡盛曲霉植酸酶基因及其编码区全序列，构建了植物表达载 体p b l l 2 1 s p p h y ，冻融法将质粒导入根癌农杆菌l b a 4 4 0 4 ，获得工程菌 l b a 4 4 0 4 - p b l l 2 1 - s p p h y 。 叶盘法将植酸酶基因导入了模式植物烟草，获得卡那霉素抗性植株，通过p c r ， s o u t h e r nb l o t t i n g 证明外源植酸酶基因已成功导入烟草，对烟草叶片的植酸酶活性检测 证明重组植酸酶基因在烟草中能得到表达并积累。 初步纯化了烟草叶片中的植酸酶蛋白，研究了其酶学性质，反应最适温度与最适p h 与泡盛曲霉植酸酶的性质相同，耐热性略有下降。初步说明重组植酸酶能在模式植物烟 草中得到正确表达。 关键词：植酸酶；酶学性质；泡盛曲霉；转基因烟草 泡盛曲霉植酸酶基因烟草转化的研究 t r a n s f o r m a t i o no f t h ea s p e r g i l l u sa w a m o r ip h y g e n ei nt o b a c c o a b s t r a c t t h ep a p e ra i m st op i l r i 黟a n d 曲m 锄t e r i z ep h y t a s ep r o d u c e db ya s p e r g i l l u sa w a m o r i , c l o n et h eg e n eo fp h y t a s e ，c o n s t r u g tt h ep l a n te x p r e s s i o nv e c t o r , a n dt r a n s f e ri ti n t ot o b a c c o ， a n da n a l y z et h ee x p r e s s i o no ft h ep h y t a s eg e n ei nt o b a c c oa n dt h ec h a r a c t e r i z a t i o no ft h e r e c o m b i n a n tc n z y n l e e x t r a c e l l u l a rp h y t a s ep r o d u c e db ya s p e r g i l l u sa w a m o r iu s i n gt e c h n i q u eo fs e m i s o l i d c u l t i v a t i o nw a s p u r i f i e dt oh o m o g e n e i t yb ye m p l o y i n g 趾i n i t i a lu l t r a f i l t r a t i o ns t e p f o l l o w e d b yc h r o m a t o g r a p h yu s i n ga n i o ne x c h a n g e ，g e lf i l t r a t i o na n dc h r o m a ：c o f o 吼塔i n gs t e p s t h e p u r i f i e de n z y m ew a sa l l l18 k d ap r o t e i n i n c l u d i n g4 0 6 g l y c o s y l a t i o n i tp o s s e s s e da t e m p e r a t u r eo p t i m u mo f5 5 c ，a n dap ho p t i m u mo f5 5 t h ek mv a l u eo ft h ep h y t a s ef o r d o d e c a s o d i u mp h y t a t ea t3 7 w a s1 0 3n mw i t hav l m 2 1 3j _ t m m i n p h y t a s ea c t i v i t yw a s n o ts i g m f i c a n f l ya f f e c t e db ye d t a a c t i v i t yw a $ m o d e r a t e l yi n h i b i t e db yc a 2 + , m 矿，m n 2 + a n dw a se v i d e n t l yi n h i b i t e db yf 一+ z n 2 + t h ee n z y m ed i s p l a y e dh i g h e rt h e r m o s t a b i l i t ya tt 1 1 e h i 曲t e m p e r a t u r et h a nt h ec o m m e r c i a lp h y t a s ep r o d u c t t h ep h y t a s eg e n ea n di t so r fw a r ec l o n e db yt h ew a yo fp c r , a n dap l a n te x p r e s s i o n v e c t o r p b l l 2 1 - s p p h y w a sc o n s t r u c t e d t h er e s u l t a n t p l a s m i d sp b l l 2 1 一s p p h y w a s t r a n s f e r r e di n t oa g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s ( l b a 4 4 0 4 ) b yt h el i q u i dn i t r o g e n 矗e e z 协gt h a w m e t h o d t h ep h y t a g e n ew a st r a n s f e r r e di n t ot o b a c c ov i aa g r o b a c t e r i u mm e d i a t i o n t h er e s u l t s o f p c ra n ds o u t h e r nb l o t t i n gs h o w e dt h a tt h ep h y t a s eg e n eh a db e e nt r a n s f e r r e di n t ot o b a c c o t h ep h y t a s ea c t i v i t ya s s a y so f t o b a c c ol e a v e sd e m o n s t r a t e dt h a tt h er e c o m b i n a n tp h y t a s eg e n e c o u l db ee x p r e s s e di nt o b a c c o t h ep r i m a r yp u r i f i c a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no ft h er e c o m b i n a n te n z y m ee x p r e s s e di n t o b a c c oh a db e e nd o n e t h er e c o m b i n a n tb 日 l z y m ep o s s e s s e dt h es a m et e m p e r a t u r ea n dp h o p t i m u mw i t ht h ep h y t a s ep r o d u c e db ya s p e r g i l l u sa w a m o r i , a l t h o u g hi td i s p l a y e dal i t t l e l o w e rt h e r m o s t a b i l i t y a l lt h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h er e c o m b i n a n tp h y t a s eg e n ec o u l db e e x d l 销s e di nt o b a c c oe x a c t l y k e yw o r d s ：p h y t a s e ；c h a r a c t e r i z a t i o n ；a s p e r g i l l u sa w a m o h ；t r a n s g e n i ct o b a c c o 独创性说明 作者郑重声明：本硕士学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工 作及取得研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得大连理 工大学或者其他单位的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的贡献均己在论文中做了明确的说明并表示了谢意。 作者签名：王国逾日期：出砀。醴。主j 大连理工大学硕士研究生学位论文 大连理工大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者及指导教师完全了解“大连理工大学硕士、博士学位论文版权使用 规定”，同意大连理工大学保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅。本人授权大连理工大学可以将本学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，也可采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论 文。 作者签名：互i 萤遭 导师签名： ! 薤珀丝： 。型丕年迭月立土日 大连理工大学硕士学位论文 引言 植物中的磷大部分( 6 0 刁o ) 以植酸磷的形式存在，单胃动物消化道中缺少植酸 酶，因此饲料中大量的磷不能被利用而随排泄物流入环境，不仅浪费了资源，又对环境 造成了污染。植酸酶能分解植酸及植酸盐释放出无机磷，提高植酸磷的利用率，我国饲 料工业和畜禽养殖业广泛推广应用植酸酶，不仅可以充分利用植物饲料中本身所含有的 植酸磷资源，大幅度减轻环境的磷污染，还提高了其他营养物质的吸收。随着世界对资 源与生态环境问题的日益重视，以及植酸酶价格的降低，耐热性能的提高，植酸酶的推 广应用必将得到长足的发展。 真菌植酸酶由于其反应最适温度及最适p h ，耐热性能等性质上的优点一直备受关 注。本论文通过半固体发酵培养泡盛曲霉生产植酸酶，利用阴离子交换层析，凝胶层析 等生物分离技术纯化了植酸酶蛋白，又对其最适反应温度，最适反应p h ，反应动力学 参数，金属离子对酶活性的影响以及耐热性能等方面进行了详细的检测。 由于天然的微生物中植酸酶含量太低，难以大量获得廉价的植酸酶产品，不足以满 足饲料工业发展的要求，将植酸酶基因导入饲料作物，提高植酸酶的表达量是植酸酶高 效利用的一个理想的途径。本研究通过基因工程的方法，克隆泡盛曲霉植酸酶基因及其 编码区序列，构建一个带有信号肽的植物表达载体，转化模式植物烟草，并对烟草表达 的重组植酸酶性质进行了测定分析，为今后转基因于饲料作物奠定理论基础。 泡盛曲霉植酸酶基因烟草转化的研究 1 文献综述 1 1 植酸 植酸( p h 蛐ca c i do ri n o s i t o lh e x a k i s - p h o s p h a t c ) ，缩写为p a 或者i p 6 ，分子式为 c 6 i l s o u p 6 ，通式为c 6 1 - 6 o p o ( o h ) 2 6 ，分子量为6 6 0 0 8 ，结构如图1 1 所示，是由6 分子磷酸与1 分子环己六醇形成的磷酸酯。分子中所含6 分子的磷酸可以解离出1 2 个 氢离子，在通常条件下，带有很强的负电荷，因而具有很强的络合或连接阳极复合物的 能力，且形成的络合物很稳定。 图l 1 植酸分子结构式 植酸是大多数谷物及豆科植物组织中磷的基本贮存形式，含量为1 0 o 5 ，它占植 物总磷的6 0 - - 8 0 【l 】。单胃动物胃肠中缺乏能分解植酸的酶，所以植酸不能被分解， 以楦酸形式存在的磷也难以被利用，利用率在4 0 以下f 2 】。在单胃动物的大规模集约式 饲养中，植物性饲料中的植酸会对饲喂过程造成了许多问题【3 ，4 5 l ： 一、饲料中磷源不足 磷是动物生长的必需元素，占动物有机体矿物质总量的l 4 以上，其中8 0 以羟磷 石灰的形式存在于骨骼中。骨骼不仅是动物体的骨架，也是钙、磷和其他矿物质的贮存 库，需要时它们会被调动到其他组织中。另外的2 0 的磷存在于肌肉、血液和软骨等组 织中，它们作为多种有机化合物的组成分，参与体内几乎每一种生命所需的生理生化反 应。由于磷有如此重要的生物学功能，所以在动物饲料中提供充足的磷非常重要，否则 组织的生长受到抑制、骨骼变软变脆。长期缺乏磷，会导致幼龄动物的佝偻病和成年动 物的骨质疏松症，进而影响动物的生长【6 7 一。 植物性原料为主的动物饲料中本身就含有丰富的磷( 表1 1 ) ，然而它们主要以单胃动 物不能利用的植酸的形式存在o l 。 饲料本身所含有的磷不能被充分利用，为了满足动物对磷的需求，必须向饲料中添 加无机磷，一般为添加1 左右的磷酸氢钙。我国是磷矿缺乏国，外加磷源不仅提高了 大连理工大学硕士学位论文 饲料成本，而且磷酸氢钙中的氟、重金属等元素还会造成饲养动物中毒，因中毒而死亡 的事件时有发生。 表1 1 常用饲料中植酸磷的含量( 呦 注：数据来源于中国饲料成分及营养价值表1 9 9 8 年修订版 二、环境的磷污染 饲料中的植酸大部分会被动物直接排出体外，导致土壤有机磷增加、土壤板结、有 效肥力下降、降低土壤生产能力、增加土壤改良成本。水体富磷污染，导致水生生物体 内有机磷积累，降低鱼产品和其他水产品品质，增加水产业养殖水域的治理成本。另外， 饲料用无机磷如磷酸氢钙的大量生产也造成环境污染【l ”。 三、植酸的抗营养作用 ( 1 ) 植酸在p h 3 5 - p i l l 0 的条件下能与z n 2 + 、c a ：+ 、m n 2 + 、f e 2 + 、m 矿等元素螯合形 成稳定的不溶性络合物，从而降低动物对这些矿物质元素的生物利用率，导致动物出现 矿物元素缺乏症，如缺锌症、缺铁症和钙磷代谢紊乱症等【1 2 1 。 ( 2 ) 在适宜的p h 条件下，植酸还能在消化道中与蛋白质作用形成难溶的植酸蛋白质 络合物，降低蛋白质的生物学功效，尤其是植酸与消化系统酶蛋白形成络合物，影响动 物对淀粉、脂肪等物质的消化吸收【1 3 1 。 泡盛曲霉植酸酶基因烟草转化的研究 ( 3 ) 植酸及其盐类是植物种子中肌醇( i n o s i t 0 1 ) 和磷酸肌醇( 口n ) 的主要来源。肌醇是微 生物和人类细胞生长和内环境稳定的基本因子之一，对治疗糖尿病、神经炎均有重要作 用。在植物中，肌醇是尿酸和细胞壁多糖或者戊糖残基的前体物质。五磷酸肌醇( i p 5 ) 能调节鸟类、爬行动物和两栖动物红细胞中血红蛋白与氧结合的亲和力；四磷酸肌醇( i p 4 ) 与三磷酸肌醇( 口3 ) 联合作用可以有效调节细胞内的钙离子水平；i p 3 还作为“第二信使” 在细胞信号传导中起重要作用【1 4 】。植酸的水解，将提高生物体内肌醇和磷酸肌醇的水平。 1 2 植酸酶简介 1 2 1 植酸酶 植酸酶( p h y m s c ，m y o i n o s i t a l l h c x a k i s p h o s p h a t cp h o s p h o h ) 7 d r o l a s ce c 3 1 3 8 1 是一类能 水解植酸及其盐类的磷酸单酯酶的总称，它水解植酸( p h y t a t c ) 或植酸盐，水解产物为磷 酸肌醇和磷酸磷酸盐，彻底水解形成肌醇和磷酸，磷酸盐，反应式见图1 2 。理论上植酸 酶能水解植酸并逐步释放所有的磷酸基团，生成终产物肌醇和磷酸，但对反应的终产物 做核磁共振分析发现，反应的终产物通常为2 - 1 磷酸肌醇( m 1 ) 和磷酸 1 5 , 1 6 。 礴+ 嬉蛰 船m y o - i n o a i l d | 图1 2 植酸酶反应通式 * 篓篡萝；：嚣。 wm m - 。m t + 一二。一一 d 自i 吐w q r 嘲e 。 。 植酸酶能在动物体内或体外将不被单胃动物利用的植酸降解成磷酸肌醇( 或肌醇) 和 磷酸。作为单胃动物的饲料添加剂，植酸酶的饲喂效果已经得到充分的确证：它可使植 物性饲料中磷的利用率提高6 0 ，减少饲料中无机磷的添加量；动物粪便中无机磷排出 量减少4 0 ，减轻环境的磷污染；植酸酶还能解除植酸对矿物质元素和蛋白质的螯合作 用，提高单胃动物对矿物质元素尤其是微量矿物质的吸收，提高蛋白质的利用率。因此， 植酸酶的应用，对提高畜牧业生产效益及降低磷对环境的污染有重要意义，同时植酸酶 也是一种新型食品添加剂和制备药用肌醇磷酸酯的催化剂刚，5 l 。 1 2 2 植酸酶的来源 植酸酶广泛存在于植物、动物和微生物中，因来源不同而具有显著不同的分子特征 和催化特性。植物植酸酶存在于大多数禾谷类作物籽实中，其活性差异很大。动物植酸 - 4 大连理工大学硕士学位论文 酶存在于哺乳动物的小肠粘膜及脊椎动物的红细胞和血浆原生质中，一般含量少且活性 低f l 刀。细菌、酵母菌和多种多细胞真菌均能产生植酸酶，目前已知微生物植酸酶大部分 属于组氨酸酸性磷酸酶( h i s t i d i n e a c i d p h o p h a t a s e ) 。微生物生长周期短、产酶高及分离提 纯比较容易。一般而言，丝状真菌植酸酶如根霉僻耽 印懈) 1 8 , 1 9 , 2 0 、毛霉( m u c o r ) 1 2 1 1 、曲 霉( a s p e r g i l l u s ) 圈是胞外酶，容易分离提纯，而细菌植酸酶往往是胞内酶( 除枯草杆菌 b a c i l l u ss u b t i l i 一2 3 】和肠杆菌属e n t e r o b a 醐一冽外) 。酵母植酸酶的报道很少，主要是酿酒 酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ，s c e r e v i s i a ) m 1 和s c h w a n n i o m y c e sc a s t e l l i i o j ，其中 s c h w a n n i o m y c e sc a s t e l l i i 产酶活性在酵母中较高。通常，来自于真菌的植酸酶产于细胞 外，而来自于细菌的植酸酶除了枯草杆菌和大肠杆菌外均来自于细胞内。 1 2 3 植酸酶的分类 国际生物化学分子生物学委员会将植酸酶分为两种类型： 3 植酸酶( e c3 1 3 8 ) ，系统名为肌醇六磷酸3 磷酸水解酶，它首先使六磷酸肌醇分 子第三位的磷酸酯键断裂，生成d 1 ，2 ，4 ，5 ，6 五磷酸肌醇和无机磷。大多数微生物 产生的植酸酶主要是3 植酸酶( e c3 1 3 8 ) 6 植酸酶( e c3 1 3 2 6 ) ，系统名为肌醇六磷酸6 磷酸水解酶，来源与植物的植酸 酶均属于6 植酸酶，主要存在于植物种子中。它首先使肌醇分子上第六位的磷酸酯键断 裂，生成d 1 ，2 ，3 ，4 ，5 五磷酸肌醇和无机磷。 最近的报道中，m u l l a n e y 、d a l y 和u l l a h e 2 n 根据结构及催化特性的不同，将植酸酶 分为三类：组氨酸酸性磷酸酶类( h a p s ) ，b 螺旋植酸酶( b p p ) 和紫酸磷酸酶类( p a p ) 2 0 。 3 植酸酶中的霉菌植酸酶又分为p h y a 和p h y b 两种类型。p h y a 和p h y b 的氨基酸 序列同源性很低；在p h 稳定范围、最适作用p h 、对蛋白酶的抗性有很大差异；对底物 特异性也不同，p h y b 植酸酶的最适底物并非植酸盐随2 9 1 。但是p h y a 与p h y b 植酸酶 的氨基酸序列中均存在组氨酸酸性磷酸酶类的活性位点保守序列r h g x r x p ，其中包括 组氨酸残基h ，所以将它们划归为高分子量酸性磷酸酯酶中的组氨酸酸性磷酸酯酶，其 反应机制中形成组氨酸残基与磷酸根基团结合的中间体，它们的酶活性不需要辅助因子 来维持。从枯草杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i sv t te - 6 8 0 1 3 ) 发现的一类分泌型植酸酶，核酸及 氨基酸序列对比发现，它与其它植酸酶及已知的磷酸酯酶相比没有同源性，因此将该植 酸酶及其基因分别定义为p h y c 和p h y c 。p h y c 没有通常植酸酶活性中心的保守序列 r h g u 口，由此也推断p h y c 不属于组氨酸酸性磷酸酯酶，它是一种有植酸酶活性的 新酶【2 3 1 。 泡盛曲霉植酸酶基因烟草转化的研究 1 2 4 植酸酶的酶学性质 1 2 4 1 植酸酶的理化性质 植酸酶是酯水解酶，不同物种来源的植酸酶分子量主要分布在3 5 k d a 2 0 0 k d a 之_ 问， 最大达7 0 0 k d a ，最小仅1 0 k d a 1 3 k d a ，这两个极限值同时出现在细菌k l e b i e l l aa e r o g e n e s 不同菌株中。酵母s c a s t e l l i i 植酸酶分子量为4 9 0 k d a ，它是一个四聚体蛋白，由一个1 2 5 k d a 的大亚基和三个7 0 k d a 的小亚基组成。a t e r r e u s 植酸酶分子量为2 1 4 k d a ，由六个约3 7 k d a 的小亚基组成忉。玉米幼苗植酸酶由两个3 8 k d a 的同型二聚体组成，分子量为7 6 k d a t 3 0 1 。 其余来源的植酸酶基本上都是单体蛋白。不同来源植酸酶的理化性质如k 。、最适p h 值 及热稳定性均不相同( 表1 2 ) 。即使是同一物种来源的植酸酶，在不同的生长环境下， 其酶性质也存在差异。 表1 2 不同来源植酸酶的部分物理化学性质 耋型壅透量重量廑兰星重p 丛f 四坌王量 尘 枯草杆菌 6 06 0 - 6 53 6 - 3 8 大肠杆菌5 54 5 4 2 细菌：肠道杆菌 5 07 0 - 7 5一 产气杆菌6 0 - 7 04 5 - - 2 0 1 0 1 3 假单胞菌 一5 5 无花果曲霉5 5 6 0 4 - 6 。6 5 黑曲霉5 32 0 - 2 58 5 真菌：土曲霉 7 0 5 5 ，2 52 1 4 米曲霉5 04 51 2 0 1 4 0 少孢状霉 5 55 5 4 5一 卡氏酵母 7 7 4 4 4 9 0 酵母：面包酵母4 5 4 6 一 c a n d i a n 1 c r u s e i 5 035 大葫芦4 84 86 6 5 长百合5 58 08 8 玉米5 54 87 6 植物：绿豆 5 77 51 6 0 大豆5 54 5 - 4 86 0 斯佩耳特小麦4 5 6 06 8 麦麸5 5 5 5 5 6 4 7 人一7 4一 动物组织鸡 一8 2 一 ( 肠粘膜) ： 牛一87一 鼠一7 0 、7 5 7 87 0 - 9 0 注：“一”为文献中没有报道 一6 一 大连理工大学硕士学位论文 来源于真核细胞的植酸酶一般为糖蛋白，其糖基化程度与物种相关，也与氨基酸序 列中糖基化位点数目相关，植酸酶分子量的差异主要是由于糖基化之故。植酸酶基因在 不同的表达系统中，糖基化程度不一样，主要是由于潜在的n 端糖基化位点个数不一样。 但糖基化对于酶的专一性酶活没有多大的影响，而对于酶的分子量和热稳定性具有显著 的影响，对于酶的等电点也有影响。 多数被分离的植酸酶在p h 4 5 , - , 6 0 范围内具有活性，并且当p h 值低于3 或高于7 5 时，酶活性的稳定性显著下降；然而，来源于大肠杆菌i 硼，绿豆【3 1 1 和l i l i u ml o n g i f l o r u m 3 2 1 的花粉在p h 7 5 左右活性最佳，但这些酶的p i 值没有重要的差别。 一般在5 0 7 0 的范围内植酸酶都具有高度活性，最佳温度在4 5 - , 6 0 范围内。然 而，从嗜温微生物m y c e l i o p h t h o r a t h e r m o p h i l a 等分离到的高温植酸酶最适温度可在 7 0 - 8 0 ，虽然有很好的耐温性，但它在3 7 c ( 酶作为饲料添加剂最终的作用温度与体温 相同) 时酶的活性极低，没有使用价值。而来源于h s p e r g i l l u st e r r e u s 等的植酸酶在3 7 时具有较好的酶活性，但又不能经受制粒时的高温，所以如何使得酶能短暂的耐高温且 在动物正常体温下具有高酶活性是目前包括植酸酶在内的饲用酶制剂急需解决的一个 问题。 1 2 4 2 植酸酶的动力学性质 植酸酶催化植酸脱磷酸作用的动力学参数己被广泛研究，不同来源的植酸酶水解植 酸钠的k 。值如表1 3 所示。以植酸酶水解植酸钠的水解速率为1 0 0 ，考察不同来源的 植酸酶对各种磷酸酯的底物特异性，结果如表1 4 所示。 由表1 3 和表1 4 可见，植酸酶对各种磷酸酯的特异性依来源不同有很大差别，但 是不同来源的植酸酶对植酸或植酸盐均具有相当高的底物特异性。植酸酶对多种底物具 有特异性的性质与其晶体结构中活性位点所占据的区域远大于植酸所占区域的结构特 点相吻合。 表1 3 植酸酶水解植酸钠的k 。值 来源k 。( m l v l )来源k f u m l 绿豆0 6 5 无花果曲霉 4 0 枯草杆菌0 5玉蜀黍9 l 玉米0 1 1 7 麦麸 2 2 斯佩耳特小麦0 4花粉1 7 种子0 3 6大豆种子 4 8 棉花种子0 3 7& c a s t e 肺3 8 泡盛曲霉植酸酶基因烟草转化的研究 表1 4 不同来源植酸酶的底物特异性 注；。一”为文献中没有报道 1 2 5 植酸酶的酶活测定 国外虽然早在2 0 世纪6 0 年代就已经有人开始研究植酸酶，但真正引起广泛关注也 是2 0 世纪9 0 年代以后，因此有关植酸酶酶活性定义方法及酶活测定方法都非常混乱， 到目前为止尚无统一的、得到大家公认的酶活定义和酶活测定方法。目前酶活主要有以 下几种定义方法：以每分钟从一定浓度的植酸钠溶液中释放l g m o l 的无机磷为一个酶 活力单位；以每分钟从一定浓度的植酸钠溶液中释放l n m o l 的无机磷为一个酶活力单 位；以每秒钟从一定浓度的植酸钠溶液中释放l n m o l 的无机磷为一个酶活力单位； 以每小时从一定浓度的植酸钠溶液中释放l m g 的无机磷为一个酶活力单位( 黄遵锡等 【3 3 】) 。第一种酶活力单位最大，目前s i g m a 公司采用此标准，国外采用此单位较多，常 称之为国际单位，第二种酶活力单位是第一种的1 0 0 0 倍，第三种酶活力单位为第一种 的1 7 倍，与第四种酶活力单位大小相近。 植酸酶酶活力测定的机理都是利用酶水解植酸钠底物形成无机磷，然后测定无机磷 的释放量，目前普遍采用的无机磷测定方法有4 种：第一种为丙酮一磷钼酸铵法，依据 的原理是磷酸盐与过量的钼酸铵在酸性条件下混合后，可慢慢声称黄色磷钼酸酸铵，加 入丙酮后使黄色物质抽提出来，使灵敏度增加1 0 倍，生成的黄色物质在3 5 5 n m 波长下 有最大吸收峰( g r e e n w o o da je ta 1 1 9 7 7 ) ；第二种为b a s f 和g i s t - - b r o c a d e s 公司采用的钒 钼磷法，它是利用在酸性条件下无机磷与钒一钼试剂形成钒钼磷黄色络合物，在4 1 5 n m 一8 一 大连理工大学硕士学位论文 波长下测定林的含量( c r e a v e sm p e ta 1 1 9 6 7 ) ；第三种为维生素c 一钼蓝法，它的原理是 在酸性条件下，定磷试剂中的钼酸铵以钼酸形式与样品中的磷酸反应，当有还原剂存在 时，磷钼酸立即变成蓝色的还原物质一钼蓝，形成的蓝色物质最大吸收峰在6 5 0 - 6 6 0 h m ， 在此波长下测定无机磷的含量( v i s h n uk p 1 9 8 2 ) ；第四种也为钼蓝法，其还原剂为硫酸 亚铁，形成的蓝色物质最大吸收峰为7 5 0 r i m ，我们称之为f e s 0 4 一铝蓝法( s h i m i z um 1 9 9 2 ) a 1 3 植酸酶的分离纯化 1 3 1 细菌植酸酶的纯化 几种产植酸酶的细菌已经被检测出来。它们大多数是细菌中的枯草杆菌1 2 3 1 ，大肠杆 菌剀，假单胞菌和克雷伯菌属。通常，通过典型的硫酸铵沉淀或者离子交换结合凝胶过 滤层析后超滤可纯化植酸酶。两类周质大肠杆菌植酸酶通过4 步层析技术被纯化了1 6 0 0 0 倍，此外，枯草杆菌可以在固体培养基，豆制品和液面下培养基内生长。从培养基 上清中通过交联葡聚糖g 1 0 0 三次凝胶过滤后纯化出3 2 2 倍的蛋白。这个酶在p h 6 0 6 5 和6 0 * ( 3 范围内有活性，并且很大程度上受到e d t a ，z n 2 + ，b a ，c u 2 + ，c d 2 + ，f e 2 + 以及 a 1 3 + 的抑制。 从豆科植物根部附近的土壤中分离出一种胞外分泌植酸酶的细菌菌株，3 7 下培养 3 天后，在最小盐浓度，p h 5 5 培养基中是生产这种植酸酶的最佳条件。当对e n t e r o b a c t e r 的植酸酶活性部位进行确定时，研究者发现8 2 酶的活性存在于胞外，5 位于胞质空 间，余下的活性在细胞相接位置。在p h 7 肚7 5 范围内以5 0 为最佳温度获得最大的植 酸酶活性。加入l m m 的z i l 2 + ，b a 2 十，c u 2 + 和a 1 3 + 和e d t a 可以抑制植酸酶的活性 3 4 1 。 芽孢杆菌中性植酸酶具有比来源于真菌和大肠杆菌的酸性植酸酶更好的热稳定性。 k i l n 等p 5 l 报道的芽孢杆菌bs p d s l l 植酸酶在9 0 处理1 0m i n 后酶活可保留5 0 。h a 等【3 6 】报道的淀粉液化芽孢杆菌植酸酶在9 0 ( 2 处理l o m i n 后酶活可保留5 0 。 r y e 等【3 7 1 报道的地衣芽孢杆菌植酸酶在9 5 1 2 处理1 5 m i n 后酶活可保留6 1 。k e r o v u o 等【2 3 】研究表 明，枯草芽孢杆菌植酸酶在5 m mc a 2 + 溶液6 0 培育1 0 m i n 后保留酶活9 0 以上，若没 有c a 2 + 存在则无酶活，在含有c a 2 + 溶液中1 0 0 c 保温1 0r a i n 仍保留酶活2 0 ，中性植酸 酶对c a 2 + 具有较强的依赖性。 无论在有钙还是无钙情况下，芽孢杆菌中性植酸酶对木瓜蛋白酶、胰酶、胰蛋白酶 都具有很强的抵抗力，即使在这些高浓度的蛋白酶作用后仍可保留1 0 0 的酶活。然而， 无论c a 2 + 存在与否，芽孢杆菌中性植酸酶对胃蛋白酶却相当敏感。 泡盛曲霉植酸酶基因烟草转化的研究 1 3 2 真菌和酵母植酸酶的纯化 超过2 0 0 种真菌，分别属于曲霉属，毛霉属，青霉属和根霉属认为可以生产植酸酶， 并且几乎都可产生具有细胞外活性的植酸酶。a ，n i g e r 被识别为是生产活性的真菌植酸酶 能力最强的。在a n i g e r 的生长阶段结束时，三种细胞外酸性磷酸酶可以从富有营养的 培养基中分离出来：植酸酶( p h ya ) ，非特定性磷酸单酯酶( e c 3 1 3 2 ，p h yb ) 和其他的 非特定性磷酸单酯酶( p a s e ) 。这些酶在以6 3 c 为最佳温度，p h 分别为2 5 ，5 0 和6 0 时 酶的活性最高。 对于生产细胞外植酸酶的真菌的研究已经被报道过。在迸食油菜中，超过5 8 种真 菌菌株有水解植酸盐的能力。它们当中，生产植酸酶活性最有效的是a f i c u u m 。从 a f i c u u m n r r l3 1 3 5 的部分纯化样品中获得了酸性磷酸酶。从这种真菌得来的植酸酶产 物可以用三种培养方法获得，分别叫做：固体，半固体和深层发酵。深层批式培养中， 植酸酶的产物被高浓度的葡萄糖和低水平的通风所抑制。然而，可以通过半批式的操作 来克服。特别地，在固体发酵中水的含量对细胞和酶的生产都起着重要的作用。一系列 的研究表明补充了充足水分的小麦糠，大豆制品，玉米食品和油菜籽( 富含有植酸盐) 产 生高产量的酶。与水中的条件相比固体和半固体培养基中可以产生更高产量的植酸酶。 在其它曲霉素菌种，比如a a m s t e l o d a m i ，a c a n d i d u s ，a f l a v u s 和a r e p e n s 中，也被发现 有胞外植酸酶。 酵母中只有少数研究被报道，如s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e 和s c h w a n n i o m y c e s c a s t e l l i i 。s c a s t e l l i i 与其它产植酸酶的酵母相比具有更高的产植酸酶的潜力。一个在 s c a s t e l l i i 中三步纯化植酸酶包括阴离子和凝胶过滤层析的方法已经被提出，然而 s c a s t e l l i i 的植酸酶产量似乎可以被培养基中的阳离子，磷酸盐和植酸浓度所影响。特别 是因阳离子和植酸相互作用所形成的植酸与阳离子的联合体间接地影响着s c a s t e l l i i 对 植酸的水解能力。 1 3 3 植物植酸酶的纯化 据报道，许多作物籽实及其加工副产品中均含有天然植酸酶，如小麦、玉米、大麦、 黑麦、小黑麦、燕麦、水稻、豆类等籽实中植酸酶己被分离并鉴定。种子休眠期的植酸 盐和植酸酶是分开的，但在其萌发或加工及动物消化时植酸酶和植酸盐底物相互接触而 使植酸盐分解。植酸酶的活性一般随萌发时间而增强，在小麦种子中干种子为6 8 0 i u k g ， 吸水第1 天为9 3 0 i u k g ，第2 天为1 4 0 0 i u k g ，第3 天为2 1 2 0 i u k g 。莴苣种子萌发7 2 h 后植酸酶的活性增大6 倍。1 9 9 7 年c h e n 等报道大豆发芽5 d 后，植酸酶活性提高2 0 2 7 大连理工大学硕士学位论文 倍，d w a r f 灰豆和a l a s k a 豆分别提高8 0 7 倍和3 7 5 6 倍。大麦在籽粒萌发期间植酸酶活 性可增至8 倍左右，在绿素芽中其活力更强。 只有来源于小麦，绿豆和大豆子叶的植酸酶已经被纯化为单体并对大部分性质做了 分析。在发育的种子或花粉中，植酸酶似乎对植酸的降解起作用。在种子或花粉的萌发 期，植酸酶的活性增加伴随着植酸含量的降低，然而，这种植酸酶活性的增加是否与前 体酶的激活或是蛋白质的重新合成有关目前尚不清楚。 g i b s o n 和u l l a h 提出一个四步的纯化方法，包括硫酸铵沉淀和三个柱层析步骤制备 植酸酶，并获得两个片段。来源于小麦糠的植酸酶可以被d e a e 纤维素分裂为具有不同 底物降解方式的两个片断( f 1 和f 2 ) 。在草酸盐缓冲液中的纸电泳使植酸酶的分离应用为 植酸盐的水解产物的分析提供了快速的方法。研究人员已经在发芽的斯佩耳特小麦中识 别出四类可溶性植酸酶。尽管有很多纯化的方法可以利用，然而四种植酸酶中没有一种 可以被纯化为单体。称为d 2 1 的最纯的斯佩耳特小麦植酸酶制备物包含植酸酶( 主要成 分) 和一种酸性磷酸酶( 次要成分) 。植酸酶作为单体蛋白质分子量约为6 8 k d a 并表现广泛 的底物特性。在p h 6 0 以及温度为4 5 对斯佩耳特小麦植酸酶对植酸盐具有最佳降解能 力。 1 4 植酸酶基因工程 1 4 1 植酸酶基因 8 0 年代末，荷兰w a g n i n g e n 大学克隆了第一个植酸酶基因，从此以后，植酸酶的 研究进入分子水平，这为解决植酸酶产量及耐热性问题奠定了基础。到目前为止，共有 十余个植酸酶基因得到分离克隆，其中绝大多数是微生物植酸酶基因，仅有一个植物植 酸酶基因。最先分离出来的植酸酶基因是a f i c u u m n r a u 3 1 3 5 的p h y a 基因，该基因全 长1 5 0 6 b p ，其中+ 4 6 - - + 1 4 7 的1 0 2 b p 核苷酸序列是一典型的真菌内含子序列，其上存有 真菌内含子的特征保守序列：d o n o r 序列g t a t g c ，l a r i a t 序列- - c , - c t 2 g a c 及a c c e p t o r 序列c a g 。该基因编码4 6 7 个氨基酸，n 端的1 9 个氨基酸为信号肽，形成的植酸酶 是一种糖基化蛋白。在p h y a 编码的氨基酸序列上，发现了1 0 个潜在的n - 糖基化位点。 从氨基酸推断出该植酸酶的理论分子量为5 1 1 4 k d a ，氨基酸序列上存在组氨酸酸性磷酸 酶的活性位点保守序列：s r h g a r y p t ，它位于氨基酸序列的+ 5 2 - 4 - 7 4 ，可归为组氨酸 酸性磷酸酶这一家族。p h y a 基因中g 屺含量达6 8 1 3 ，这是丝状真菌中高表达蛋白编 码序列所具有特征之一。我国分离的a n i g e r 9 6 3 ( 姚斌等) 植酸酶基因p h y a 2 与p h y a 相 比较，其结构基因长度、所编码氨基酸的长度、信号肽编码序列、内含子序列及位置等 均相同。在d n a 序列上只有1 2 3 个核苷酸的差异，同源性为9 1 1 8 。编码氨基酸序列 泡盛曲霉植酸酶基因烟草转化的研究 上有3 9 个氨基酸不同，同源性为9 1 1 6 。p h y a 2 基因e 屺含量达5 4 1 7 ，在p h y a 编码的p h y a 蛋白上有1 0 个潜在的糖基化位点，而在p h y a 2 上有9 个，其中8 个与 p h y a 上的位置相同。王红宁等分离的a n i g e rn 2 5 的植酸酶基因序列与a n i g e r n r r l 3 1 3 5 相比，其结构基因长度、所编码氨基酸的长度、信号肽编码序列、内含子序 列及位置等均相同。在d n a 序列上仅有4 9 个位置上的碱基不同，同源性达9 6 1 7 5 ， 其g 屺含量为5 2 。编码氨基酸序列上有1 1 个氨基酸残基不同，同源性高达9 7 1 6 4 ， 有1 0 个潜在的n 糖基化位点，植酸酶活性位点序列位于氨基酸序列的+ 7 1 曲3 。 a f i c u u m 的第二个植酸酶基因p h y b 于1 9 9 3 年得到分离克隆，p h y b 与p h y a 的核苷酸序 列及所编码的氨基酸序列同源性低，但p h y b 也属组氨酸性磷酸酶家族，氨基酸序列上 也有活性位点保守序列：r h c , x r x p ( x 为任意氨基酸) 。p h y b 基因全长1 6 0 5 b p ，p h y b 共 编码4 7 9 个氨基酸，其上至少有8 个糖基化位点，p h y b 编码的植酸酶最适p n 值为2 5 ， 而p h y a 的最适p h 值为5 0 。细菌的植酸酶基因较短，与己报道的p h y a 及p h y b 同源 性低，且编码的氨基酸序列上不存在活性位点保守序列：r h g x r x p ( x 为任意氨基酸) ， 因此，它不属于组氨酸酸性磷酸酶家族。1 9 9 8 年，k e r o v v o 等首次从b a c i l l u ss u b t i l l s 中 分离出完整的植酸酶基因p h y c ，该基因全长11 5 2 b p ，编码3 8 3 个氨基酸，其中n 端的 2 6 个氨基酸是信号肽序列。到且前为止，分离出来的植物植酸酶基因只有玉米的植酸酶 基因p h y s l l ，是m a v g e n s e t 等于1 9 9 8 年从萌发的玉米种子中分离得到的，该基因全长 11 6 7 b p ，编码3 8 8 个氨基酸，它所编码的氨基酸序列与黑曲霉植酸酶只有3 3 个氨基酸 同源区，该区有r h g x r x p ( x 为任意氨基酸) 活性保守序列存在。 1 4 2 植酸酶的植物基因工程 过去十几年问，生物技术的研究开发主要集中在医药领域，商品化的基因工程药物 占生物技术产品的6 0 - 8 0 ，形成了生物技术产业发展的“第一个浪潮”。近年来这 一态势开始发生变化，随着动植物转基因技术的不断成熟和发展，围绕着农业转基因技 术和产品开发，已在世界范围内掀起