（分析化学专业论文）活性氧诱导生物活性分子自由基的自旋标记荧光法表征.pdf

摘要 摘要 生物活性分子自由基的研究具有重要意义，通过对其产生位点、寿命、反 应活性、修复等机理的研究，能够进一步增加对生物分子的活性氧自由基损伤机 理的认识。生物活性分子自由基具有低浓度，短寿命以及高自聚反应活性等特点， 己建立的一些分析方法，如电子自旋共振法、免疫自旋捕集法和质谱法，还不 能够满足对生物活性分子自由基进行原位、适时、动态检测的要求。荧光表征技 术具有表征参数多，动态范围宽，灵敏度高，操作简便等特点，尤其是已发展成 熟的荧光显微技术，为原位、实时研究在细胞中发生的化学反应工程提供了有效 的手段。然而，荧光分析技术在应用于生物活性自由基的研究时，尚缺乏灵敏、 特效的自由基荧光探针。本论文的研究目标在于开发生物活性自由基的荧光探 针，并研究其在表征生物活性自由基方面的应用。论文共分七章，包括前言、实 验材料与方法、肽碳中心自由基的荧光表征、肽硫中心自由基的荧光表征、肌红 蛋白自由基的荧光表征、血红蛋白自由基的荧光表征，核苷酸自由基的荧光表征。 第一章，前言，综述了近年来生物活性分子自由基分析表征研究的进展。 综述以活性氧诱导生物活性分子的氧化损伤，包括蛋白质的氧化损伤、d n a 的 氧化损伤以及脂质过氧化为切入点，介绍了生物活性自由基分析表征研究的重要 意义。进而阐述了生物活性分子自由基的分析表征研究的现状，介绍了生物活性 自由基分析表征的实验技术，包括电子自旋捕集法、免疫自旋捕集法以及质谱法。 最后，在此基础上提出了论文的研究设想。 第二章，实验材料与方法，介绍了论文研究工作中所涉及的仪器与试剂， 介绍了自旋标记荧光探针( 萘氮氧自由基复合分子n a t e m p o 和丫啶氮氧自由 基复合分子a c t e m p o ) 的合成与表征，以及生物样品的制备。 第三章，肽碳中心自由基的荧光表征，介绍了应用自旋标记荧光探针 a c t e m p o 。表征肽碳中心自由基的研究。a c - t e m p o 为弱荧光物质，当其捕集辣根 过氧化物酶催化h 2 0 2 氧化酪氨酸衍生物产生的碳中心自由基后，荧光性质显著 变化，为应用荧光参量表征酪氨酸自由基提供了基础。论文对反应的实验条件和 荧光表征的机理进行了系统的研究，并对荧光产物进行了分析认定。实验结果表 摘要 明，根据实验条件的不同，自旋标记荧光探针a c t e m p o 或与肽碳中心自由基反 应生成荧光物质4 ( 9 丫啶酯) 2 ，2 ，6 ，6 四甲基哌啶( a c p i p e r i d i n e ) ，或直接捕集 肽碳中心自由基生成荧光加合物。研究表明a c p i p c d d i n e 的形成主要源自酪氨酸 自由基自身的共振结构，以及水中溶解氧的竞争反应。增加自旋标记荧光探针的 浓度或降低体系中溶解氧的浓度均可以促进加合物的生成，加合物的形成将为研 究自由基的形成位点和自由基的结构提供了有效的手段。相对于酪氨酸衍生物自 由基，a c t e m p o 对色氨酸衍生物产生的自由基的捕集效率较低，表明白旋标记 荧光探针对自由基的捕集受到空间位阻的影响。 第四章，肽硫中心自由基的荧光表征，介绍了应用自旋标记荧光探针 a c - t e m p o 表征肽硫中心自由基的研究。非荧光自旋标记荧光探针a c - t e m p o 捕 集过氧亚硝酸以及f c n t o n 反应产生的o h 氧化谷胱甘肽产生的硫中心自由基 后，荧光强度显著增加，为表征硫中心自由基提供了基础。论文对反应的实验条 件和荧光表征的机理进行了系统的研究。经h p l c m s 分析，表明a t - t e m p o 捕 集由过氧亚硝酸诱导谷胱甘肽氧化形成的硫中心自由基，生成荧光物质 a c p i p e f i d i n e ，a c t e m p o 。捕集由f e n t o n 反应诱导谷胱甘肽氧化形成的硫中心自 由基，产生的荧光物质为a c p i p e r i d i n e 和4 ( 9 丫啶酯) 2 ，2 ，二甲基吡咯 ( a c - p y r r o l i d i n e ) 。a c - p i p e r i d m e 的形成源自a c t e m p o 。与硫中心自由基反应后形 成不稳定的n o s 键的断裂。a c p y r r o l i d m e 的形成可能源自在g s h 存在下 f e n t o n 反应产生的f e 3 + 的作用。氮氧自由基为重要的自由基清除剂，研究其捕 集自由基及代谢机理，对其应用具有重要意义。本章实验结果表明，对于不同来 源的活性氧自由基，氮氧自由基与其反应后的产物不完全相同，这一结果为理解 氮氧自由基的代谢机理提供新的实验依据，丰富了氮氧自由基代谢的理论。 第五章，肌红蛋白自由基的荧光表征，介绍了应用白旋标记荧光探针 a c t e m p o 表征肌红蛋白自由基的研究。本章的研究工作是以肌红蛋白以及心脏 组织匀浆液作为蛋白质模型，通过a c - t e m p o 对h 2 0 2 氧化其产生的蛋白质自由 基进行表征。当a c t e m p o 捕集h 2 0 2 氧化肌红蛋白产生的蛋白质自由基后，荧 光强度显著增加，从而可对其进行表征。论文对表征的实验条件和机理进行了研 究，在所选择的实验条件下，a c - t e m p o 对肌红蛋白的最低响应量为6 8 1 0 4 e g m l ，对心脏组织匀浆液的最低响应量为1 3 1 0 5e m e 。经h p l c m s 分析， 摘要 确定形成的荧光物质为a c - p i p e r i d i n e 。a c - p i p e r i d i n e 的形成也主要源自于蛋白质 自由基自身的共振结构，以及溶液中0 2 分子的竞争反应。 第六章，血红蛋白自由基的荧光表征，介绍了应用自旋标记荧光探针 a c t e m p o 表征血红蛋白自由基的研究结果。本章的研究工作是以血红蛋白以及 红细胞裂解液作为蛋白质模型，通过a c t e m p o 。对h 2 0 2 氧化其产生的蛋白质自 由基进行表征。非荧光物质a c - t e m p o 捕集h 2 0 2 氧化血红蛋白产生的蛋白质自 由基，形成强荧光产物，达到对目标自由基表征的目的。论文对表征的实验条件 和机理进行了研究，在所选择的实验条件下，a c - t e m p o 对血红蛋白的最低响应 量为8 4 1 0 g m l ，对红细胞裂解液的最低响应量为1 6 1 0 6g m l 。m s m s 分析结果表明，形成的荧光物质为a c - p i p e r i d i n e 。在前期研究工作的基础上，根 据研究计划，进一步对自旋标记荧光探针应用于荧光显微技术，表征细胞中的蛋 白质自由基进行了初步的研究。实验结果尚未达到预期的效果。我们推测原因可 能为红细胞中血红蛋白的含量( n g 级) 低于该方法对血红蛋白的最低响应量。 该方法的灵敏度受到所使用的自旋标记荧光探针浓度的影响，若增加探针的水溶 性，则应该能够提高该方法的灵敏度。这为该课题后续研究工作的思路提出了新 的实验依据。 第七章，核苷酸自由基荧光表征，介绍了应用自旋标记荧光探针n a t e m p o 表征核苷酸自由基的研究结果。当n a - t e m p o 。捕集f e n t o n 反应产生的 o h 诱导 脱氧鸟嘌呤核苷酸、鸟嘌呤核苷酸产生的自由基后，荧光强度发生显著变化，构 成对其进行表征的实验基础。 关键词：氮氧自由基，白旋标记，荧光探针，氧化损伤，蛋白质自由基，d n a 自由基 i i i a b s t r a e t a b s t r a c t t h e s t u d yo f b i o m o l e c u l e - b a s e dr a d i c a l sh a s b e e no f i m p o r t a n ts i g n i f i c a n c e ，a n dt h i s s t u d yi n c r e a s e sm a n k i n d su n d e r s t a n d i n go fo x i d a t i v ed a m a g e so fb i o m o l e c u l e s i n d u c e db yr e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ，v i ac h a r a c t e r i z i n gt h ea c t i n gs i t e s ，l i f e t i m e sa n d r e a c t i v i t i e so f r a d i c a l s ，a sw e l la st h es e l f - r e p a i r e m e n to f b i o m o l e e u l e s c u r r e n t l yu s e d a n a l y t i c a lm e t h o d sf o rp r o b i n gt h er a d i c a l s ，s u c ha se l e c t r o np a r a m a g n e t i cr e s o n a n c e ， i m m u n o - s p i i lt r a p p i n ga n dm a s ss p e c t r u m , h o w e v e r , w e r eu n a b l et ot r a c e ，t i m e l ya n d d y n a m i c a l l y , t h eb i o m o l e e u l e - b a s e d r a d i c a l si ns i t u ，a sar e s u l to ft h el o w c o n c e n t r a t i o n s ，s h o r t l i f e t i m e sa n dt h eh i g hr a t e so fs e l f - r e a c t i o no fr a d i c a l s f l u o r e s c e n c es p e c t r o s c o p y , w i t hi t s m u l t i - p a r a m e t e r s ，w i d el i n e a rr a n g e ，h i 曲 s e n s i t i v i t ya n dc o n v e n i e n ti no p e r a t i n g , h a sb e e naw i d e l yu s e ds p e c t r o s c o p i c t e c h n i q u ei na r e ao fl i f e - s c i e n c e f l u o r e s c e n c em i c r o s c o p y , e s p e c i a l l y , h a sp r o v e dt o b eap o w e r f u lt o o lf o rt r a c i n gt h er e a c t i o n si nc e l l si ns i t u h o w e v e r t h e r ew e r ef e w s e n s i t i v ea n ds p e c i f i cf l u o r e s c e n tp r o b e sf o rb i o m o l e c u l e - b a s e dr a d i c a l s ，a n dt h e a p p l i c a t i o no ff l u o r e s c e n c es p e c t r o s c o p yi nr a d i c a lb i o l o g yh a sb e e nn o tm u c h t h i s d i s s e r t a t i o nw a sc o n c e n t r a t e do nt h ee x p l o i t a t i o no ft h ef l u o r e s c e n c ep r o b e sa n dt h e i r a p p l i c a t i o n si np r o b i n gb i o - m o l e c u l e b a s e dr a d i c a l s i ti n c l u d e ds e v e nc h a p t e r s ：t h e o v e r v i e wo nt h es t u d yo f p r o b i n gb i o m o l e c u l e - b a s e dr a d i c a l s ，m a t e r i a l sa n dm e t h o d s ， p r o b i n gp e p t i d e - b a s e dc a r b o n - c e n t e r e dr a d i c a l s ，p r o b i n gp e p t i d e - b a s e dt h i y lr a d i c a l s ， p r o b i n gm y o g l o b i nr a d i c a l s ，p r o b i n gh e m o g l o b i nr a d i c a l sa n dp r o b i n gn u e l e o t i d e a c i d - b a s e dr a d i c a l s i nc h a p t e r1 ，ab r i e f o v e r v i e wo nt h ep r e s e n ts t a t eo f a n a l y t i c a lc h e m i s t r yr e l a t e dt o t h eb i o m o l e c u l e b a s e dr a d i c a l ss t u d yw a sg i v e n i tb e g a nw i t ht h ei n t r o d u c t i o nt ot h e o x i d a t i v ed a m a g e so fb i o m o l e c u l e s ，i n c l u d i n gp r o t e i n , d n aa n dl i p i d ，i n d u c e db y r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ，a n de m p h a s i z e dt h ei m p o r t a n c eo f b i o m o l e c u l e - b a s e dr a d i c a l i n v e s t i g a t i o n s t h e n , s o m et e c h n i q u e sf o rp r o b i n gb i o m o l e c u l e - b a s e dr a d i c a l sw e r e i n 仃o d u c e d ，e g e l e c t r o np a r a m a g n e t i cr e s o n a n c e ，i u l l n u n o s p i nt r a p p i n ga n dm 嬲s s p e c t r u m f i n a l l y , t h er e s e a r c hp l a nf o rt h i sd i s s e r t a t i o nw a sp r e s e n t e d i n c h a p t e r2 ，m a t e r i a l sa n dm e t h o d sw e r ei n t r o d u c e d , i n c l u d i n gi n s t r u m e n t s ， r e a g e n t s ，t h es y n t h e s i so f t h es p i n l a b e l i n gf l u o r o p h o r e s a t e m p o 。a n da c t e m p o ) ， a n dt h ep r e p a r a t i o n sf o rs o m eb i o l o g i c a ls a m p l e s a b s t r a c t i nc h a p t e r3 ，t h ep r o b i n go f p e p t i d e - b a s e dc a r b o n - c e m e r e dr a d i c a l sb ys p i n - l a b e l i n g f l u o r o p h o r e ，a c t e m p o ，w a sd e s c r i b e d a t - t e m p o 。，aw e a kf l u o r e s c e n tc o m p o u n d ， s h o w e dad r a m a t i ci n c r e a s ei nf l u o r e s c e n c e i n t e n s i t y a f t e ri n t e r a c t i o nw i t l l c a r b e n - c e n t e r e dr a d i c a l so f t y r o s i n a m i d e ，p r o d u c e dt h r o u g h h o r s e r a d i s h p e r o x i d a s e j h 2 0 2r e a c t i o n , a n dh a dp r o v e dt ob ea b l et op r o b ep e p t i d e - b a s e d c a r b o n - c e n t e r e dr a d i c a l s t h ev a r i a b l e sa n dm e c h a n i s mo f t h er e a c t i o nw e r es t u d i e di n d e t a i l a n dt h ef l u o r e s c e n tp r o d u c tw a si d e n t i f i e d n 地r e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a tt h e i n t e r a c t i o nb e t w e e na c - t e m p o a n dp e p t i d e - b a s e dc a r b o n - c e n t e r e dr a d i c a l sw o l l l d g e n e r a t ea c - p i p e r i d i n eo ra d d u c t sa c c o r d i n gt ot h er e a c t i o nc o n d i t i o n t h ef o r m a t i o n o fa t - p i p e r i d i n em o s t l yr e s u l t e df r o mt h er e s o n a n c e s t a b i l i z e dt y r o s i n er a d i c a l sa n d t h ec o m p e t i t i o nr e a c t i o no fo x y g e ni ns o l u t i o mt h ee x p e r i m e n tr e s u l ta l s o d e m o m t m t e dt h a tt h ef o r m a t i o no f a d d u c t sw o u l db eo b s e r v e dw h e nt h ec o n c e n t r a t i o n o fa c t e m p o w a sh i 曲i nc o m p a r i s o nw i t ht h a to fr a d i c a l s ，o rd e c r e a s i n gt h e c o n c e n t r a t i o no fs o l v e do x y g e n t h ef o r m a t i o no fa d d u c t sw o u l dp r o v i d eu s e f u l i n f o r m a t i o nf o rt h es i t ea n dt h es t r u c t u r eo fb i o - m o l e c u l e b a s e dr a d i c a l s a sf o r p r o b i n gt r y p t o p h a n - b a s e dc a r b o n c e n t e r e dr a d i c a l s ，t h es c a v e n g i n ge f f i c i e n c yw a s r e l a t i v e l yd e c r e a s e d , i n d i c a t i n gt h ei n f l u e n c eo fd i m e n s i o n a ls t r u c t u r eo nt h er a d i c a l s s c a v e n g i n g i nc h a p t e r4 ，p r o b i n gp e p t i d e b a s e dt h i y lr a d i c a l sb ys p i n - l a b e l i n gf l u o r o p h o r e , a c - t e m p o w a sp r o p o s e d a c - t e m p o ，aw e a kf l u o r e s c e n tc o m p o u n d ，s h o w e da d r a m a t i ci n c r e a s ei nf l u o r e s c e n c ei n t e n s i t ya f t e ri n t e r a c t i o nw i t hg l u t a t h i o n e b a s e d t h i y lr a d i c a l si n d u c e db yp e r o x y n i t r i t eo rh y d r o x y lr a d i c a l st h r o u g hf e n t o nr e a c t i o n , a n dw a sa b l et op r o b ep e p t i d e b a s e dt h i 【y lr a d i c a l s t h ev a r i a b l e sa n dm e c h a n i s mo f t h er e a c t i o nw e r es t u d i e di nd e t a i l h p l c - m sa n a l y s i ss h o w e dt h a tt h ef l u o r e s c e n t p r o d u c tw a sa c - p i p e r i d i n ed u r i n gt h ei n t e r a c t i o no f a c - t e m p o a n dg l u t a t h i o n e b a s e d t h i y lr a d i c a l si n d u c e db yp e r o x y n i t r i t e ，a n da c - p y r r o l i d i n ea n da c - p i p e r i d i n ed u r i n g t h ei n t e r a c t i o no f a c - t e m p o a n dg l u t a t h i o n e - b a s e dt h i y lr a d i c a l si n d u c e db yh y d r o x y l r a d i c a l sp r o d u c e di nf e m o nr e a c t i o n t h eg e n e r a t i o no fa c - p i p e r i d i n em i g h tr e s u l t f r o mt h ec l e a v a g eo ft h eu n s t a b l en - o sb o n da f t e ra c - t e m p o i n t e r a c t e dw i t ht h e t h i y lr a d i c a l s f 矿g e n e r a t e di nf e n t o nr e a c t i o ni nt h ep r e s e n c eo fg l u t a t h i o n em i g h t r e s u l ti nt h ef o r m a t i o no fa c - p y r r o l i d i n e n o n t o x i cn i t r o x i d e sa r ec o n s i d e r e da s e f f e c t i v ea n dp r o m i s i n ga n t i o x i d a n t s e l u c i d a t i o no fn i t r o x i d er a d i c a ls c a v e n g i n g m e c h a n i s m si sc r u c i a lf o rt h e i ro p t i m i z e da p p l i c a t i o n t h e s er e s u l t si nt h i sc h a p t e r v a b s t r a e t s h o w e dt h a td i f f e r e n tm e t a b o l i t ew o u l db eo b s e r v e dw h e nd i f f e r e n tr a d i c a l sw f f r e s c a v e n g e d , w h i c h f i c h e dt h et h e o r yo f t h em e t a b o l i s m so f n i t r o x i d e s i nc h a p t e r5 ，t h em e t h o do f p r o b i n gm y o g l o b i nr a d i c a l sb ys p i n - l a b e l i n gf l u o r o p h o r e ， a c - t e m p o ，w a sg i v e n a c t e m p o ，aw e a kf l u o r e s c e n tc o m p o u n d ，s h o w e dad r a m a t i c i n c r e a s ei nf l u o r e s c e n c ei n t e n s i t ya f t e ri n t e r a c t i o nw i t hm y o g l o b i nr a d i c a l sf r o mt h e o x i d a t i o no fh 2 0 2 ，a n dh a db e e ne m p l o y e dt op r o b ep r o t e i n - b a s e dr a d i c a l sb o t hi n p u r em y o g l o b i na n di nr a th e a r ts u p e m a t a n t t h ev a r i a b l e sw e r es t u d i e d a n dt h e s i g n a ld e t e c t i o nl i m i tt om y o g i o b i n , a tt h eg i v e ne x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n s ，w a s6 8 1 0 4g r r l la n d1 3 1 0 5e g m l , r e s p e c t i v e l yf b a s e do n3 s ) h p l c m sa n a l y s i s s h o w e dt h a tt h ef l u o r e s c e n t p r o d u c t w a sa c - p i p e r i d i n e ，a sar e s u l to ft h e r e s o n a n c e s t a b i l i z e dp r o t e i nr a d i c a la n dt h ec o m p e t f f i o nr e a c t i o no fo x y g e ni n s o l u t i o n i nc h a p t e r6 ，t h ee x p e r i m e n tr e s u l to fp r o b i n gh e m o g l o b i nr a d i c a l sb ys p i n l a b e l i n g f l u o r o p h o r e ，a e t e m p o ，i sr e p o r t e d a c - t e m p o ，aw e a kf l u o r e s c e n tc o m p o u n d , s h o w e dad r a m a t i ci n c r e a s ei nf l u o r e s c e n c e i n t e n s i t y a f t e ri n t e r a c t i o nw i t h h e m o g l o b i nr a d i c a l sp r o d u c e df r o mh e m o g i o b i n h 2 0 2r e a c t i o n , a n dh a db e e n e m p l o y e dt op r o b ep r o t e i n - b a s e dr a d i c a l sb o t hi np u r eh e m o g l o b i na n di nh e m o l y s a t e s t h ev a r i a b l e sw e r es t u d i e d ，a n dt h es i g n a ld e t e c t i o nl i m i tt oh e m o g l o b i n , a tt h eg i v e n e x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n s ，w a s8 4 1 0 。7g m l a n d1 6 1 0 6g m e ，r e s p e c t i v e l y ( b a s e d o n3 s ) m s m sa n a l y s i ss h o w e dt h a tt h ef l u o r e s c e n tp r o d u c tw a sa c - p i p e r i d i n e h o w e v e r , a c - t e m p o w a sf a i l e dt op r o b ep r o t e i n - b a s e dr a d i c a l si nr a tr e dc e l lv i a f l u o r e s c e n c em i c r o s c o p y t h ef a i l u r eo fa p p l y i n gs p i n - l a b e l i n gf l u o r o p h o r ei nc e l l f l u o r e s c e n c em i c r o s c o p yw a st h o u g h tt ob et h a tt h es i g n a ld e t e c t i o nl i m i to ft h i s m e t h o dw a sh i g h e rt h a nt h ec o n c e n t r a t i o no f h e m o g i o b i ni nr e dc e l l t h es e n s i t i v i t yo f t h i sm e t h o dw a sl i m i t e db yt h ec o n c e n t r a t i o no fa t - t e m p o u s e d t h u s ，i tw o u l d i m p r o v e di t ss e n s i t i v i t yi f i n c r e a s i n gt h es o l u b i l i t yo f a c - t e m p o i nc h a p t e r7 ，am e t h o df o rp r o b i n gn u c l e o t i d ea c i d - b a s e dr a d i c m sb ys p i n l a b e l i n g f l u o r o p h o r e ，n a - t e m p o ，w a sp r o p o s e d n a - t e m p o 。，aw e a kf l u o r e s c e n tc o m p o u n d ， s h o w e dad r a m a t i ci n c r e a s ei nf l u o r e s c e n c ei n t e n s i t ya f t e ri n t e r a c t i o nw i t l l5 - d g m p 5 - g m p b a s e dr a d i c a l si n d u c e db yh y d r o x y lr a d i c a l sf r o mf e n t o nr e a c t i o n , a n dc o u l d b ee m p l o y e dt op r o b en u c l e o t i d ea c i d - b a s e dr a d i c a l s k e y w o r d s ：n i t r o x i d e ，s p i n - l a b e l i n g , f l u o r e s c e n c ep r o b e ，o x i d a t i v ed a m a g e ，p r o t e i n r a d i c a l s ，d n ar a d i c a l s v i 第一章前言 第一章前言 羟基自由基( o h ) 、超氧阴离子自由基( 0 2 。) 、氢过氧自由基( h 0 2 ) 、过 氧化氢( h 2 0 2 ) 、脂质过氧化自由基( l d 、l o o 。) 、单线态氧( 1 0 2 ) 、一氧化氮 ( n 0 ) 、过氧亚硝基阴离子( o n o o - ) 等含氧的活性物质都具有较氧活泼的化 学性质，遂通称为活性氧( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ，r o s ) 。活性氧的一般特征为 低浓度、短寿命、高反应活性，这也决定了活性氧的研究具有一定的挑战性。 活性氧自由基普遍存在于生物体内。生物体内进行能量代谢，就会有氧化 还原反应的发生，无论是酶促反应，还是非酶促反应，均可产生自由基和自由基 反应。自由基和自由基的反应遍及整个生命系统，如果说没有蛋白质就没有生命， 那么没有自由基和自由基反应生命也会停止。图1 1 表示的是生物体内0 2 的代 谢过程中所产生的活性氧自由基，以及生物体内的抗氧化酶对其的清除作用。 0 2 在生物体内接受单电子还原为水的过程中，所经历的四次反应活性氧产物分 别为：0 2 。、h 0 2 、h 2 0 2 和o h 。机体的首要防御手段是阻断0 2 通过4 次单电子 还原反应产生活性态氧，其机制是0 2 在细胞色素氧化酶的催化下，接受4 个单 电子与4 个氢离子直接还原为水。机体的第二道防御手段，是利用超氧化物歧化 酶( s o d ) 催化0 2 “、h 0 2 歧化为0 2 和h 2 0 2 ，过氧化氢酶催化h 2 0 2 分解为0 2 和h 2 0 ，以及谷胱甘肽过氧化物酶或谷胱甘肽转硫酶催化脂质过氧化物转化为脂 肪醇。 0 2 _ + 0 2 。_ h 0 2 _ 1 1 2 0 2 + o h 0 2 + h 2 0 l o o f i g 1 1r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e sg e n e r a t e dd u r i n gt h em e t a b o l i z i n g o f0 2a n d s c a v e n g e db ya n f i o x i d a n te n z y m e i nl i v i n gb o d y 1 第一章前言 在正常情况下，机体活性氧自由基的产生、利用、清除三者之间处于一种 动态的生理平衡。但随着年龄的增长，以及在某些病理条件下，无论是活性氧产 生的增加，还是清除作用的减弱，都会产生一些不利的生物效应，导致机体的氧 化损伤，如蛋白质、d n a 、脂质体、生物膜的氧化损伤。 随着自由基生物学研究的不断深入，自由基的生物功能及与生物体疾病的 密切关系已为大家所认识，例如，自由基的信号传导功能，以及对基因表达的调 节，进而对细胞功能的调节；自由基与机体的免疫；自由基与衰老；自由基与疾 病；自由基与营养学；自由基与中医研究等。一些与自由基相关的疾病如表1 1 【1 】。 t a b l e1 1d i s e a s e sr e l a t e dt or e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s 系统 循环 呼吸 消化 神经 其他 高血压，动脉粥样硬化，心肌缺血再灌注损伤，心肌损伤 急性呼吸窘迫综合症，慢性阻塞性肺部疾病，肺缺血再灌注损 伤，吸烟 胃溃疡，急性出血性胰腺炎，急性肠炎，慢性病毒性肝炎、肝 硬化及肝癌变，内毒素血症所致的肝损伤，酗酒 阿尔茨海默病，帕金森病，脑卒中 肿瘤，糖尿病，类风湿性关节炎等 1 1 活性氧诱导生物活性分子的氧化损伤 在正常的细胞代谢过程中以及环境胁迫( 包括化学物质、电离辐射等) 下 都能够产生活性氧自由基。据估计，每个哺乳动物细胞每天受到活性氧的氧化攻 击达1 万次，其能够导致蛋白质、d n a 的氧化，以及脂质的过氧化。在健康人 体中，氧化损伤与机体的修复处于一种动态的平衡。但在衰老、疾病等情况下， 氧化损伤程度远远超过了机体的修复能力；即使重新修复，也可能不及时，并且 错误率极高，从而导致一些生物分子功能的降低，甚至丧失。并且，生物分子氧 化损伤的降解产物，若有毒性，能够进一步损伤其他生物分子，加重细胞、组织 2 第一章前言 功能的紊乱。 机体的调节机制会使体内自由基的产生和抗氧化体系处于相对自稳态 ( h o m e o s t a s i s ) ，当内源性或外源性刺激使机体代谢异常而骤然产生大量的活性 氧自由基，其远远超过了机体抗氧化体系的还原能力，该种状态称为氧化应激态。 氧化应激的生物标志有：还原型谷胱甘肽与氧化型谷胱甘肽含量的比值，抗坏血 酸自由基、羟基自由基的测定( 二羟基苯甲酸法) ，多形核白细胞的功能，淋巴细 胞d n a 的损伤( 包括d n a 双螺旋断裂，8 0 x 0 鸟嘌呤、核酸内切酶的含量) ， 蛋白质氧化羰基化产物的含量。在临床上，用来评价机体氧化应激状态的指标有： 总抗氧化活性的测定，脂质过氧化产物丙二醛( m d a ) 产物含量的测定，超氧 化物歧化酶、过氧化氢酶以及过氧化物酶含量的测定等。 1 1 1 蛋白质的氧化损伤 活性氧自由基与蛋白质的反应包括氢抽提、电子转移( 氧化、还原反应) 、 加成、裂解与重排、二聚、歧化和取代。活性氧自由基与蛋白质的反应具有不确 定性，除了蛋白质碳骨架外，侧链氨基酸上也存在多个反应位点。这主要取决于 活性氧自由基的性质，亲电性自由基( 比如。o h 、r o ) 优先氧化电子富集的位 点，亲核性自由基( 比如碳中心自由基) 优先进攻缺电子的位点。 目前，对于活性氧自由基与氨基酸的反应研究得较为清楚，其中包括反应 位点、反应速率的确定【2 3 】。氢抽提反应主要发生在半胱氨酸的巯基，加成反应 主要发生在苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、组氨酸的苯环，以及甲硫氨酸、半胱氨 酸的硫原子。活性氧自由基与氨基酸乙酰化产物、二肽的反应速率要低得多，与 结构庞大且复杂的蛋白质的反应