（生物化学与分子生物学专业论文）atecb2基因影响拟南芥叶绿体的早期发育.pdf

摘要 绿色植物的光合作用是地球上一切有机体生存和发展的能量来源。叶绿体是 植物非常重要的细胞器，除了进行光合作用外，还参与了其他的生物代谢。叶绿 体的正常发育是植物进行光合作用的前提条件，这一过程需要核基因组和叶绿体 基因组编码的蛋白共同参与。然而，关于叶绿体发育过程的了解还很少。而分析 白化或灰绿突变体是研究叶绿体发育的一个有效途径。 在高等植物中，叶绿体的生物发生是一个复杂的生物过程，它需要核基因和 叶绿体基因的协调表达。因为质体基因组的有限功能，控制叶绿体生物发生的基 因大部分是核基因。本文中，我们筛选到白化突变体a t e c b 2 ，它的表型是子叶白 化及幼苗致死。电镜观察表明该突变体的叶绿体中没有明显的片层结构，即表明 该突变体在叶绿体发育的早期受到抑制。遗传学分析表明，a t e c b 2 突变体受隐性 单基因控制，连锁分析表明该位点与白化表型连锁。遗传互补实验进一步证明 a t e c b 2 的突变导致拟南芥的白化表型。a t e c b 2 基因编码的是p p r 家族的蛋白， 且定位在叶绿体中，与子叶和幼苗的表达高度相关。a t e c b 2 突变体与野生型拟 南芥植株相比，在叶绿体相关基因的表达模式有很大差异。免疫分析也表明在 a t e c b 2 突变体中光合作用相关的蛋白发生了很大一部分的降解。由于该基因在子 叶和幼苗中表达较高，所以详细分析了该基因的缺失突变体a t e c b 2 的特征结果 表明该蛋白质对于叶绿体早期的发育是必需的同时，我们分析3 4 个已报道的 r n a 编辑位点，发现1 个位点并没有编辑综合数据和论文的结果，4 t e c b 2 是质体转录本a c c d 的r n a 编辑所必需的特异因子；a c c dr n a 编辑的缺陷可能 导致了叶绿体早期的生物发生受阻 关键词： 拟南芥；白化突变体； 叶绿体发育；r n a 编辑 a b s t r a c t p h o t o s y n t h e s i so fg r e e np l a n ti st h em a j o re n e r g ys o u r c ef o ro r g a n i s m so ne a r t h t os u r v i v ea n dd e v e l o p c h l o r o p l a s ti sav e r yi m p o r t a n to r g a n e l l eo fp l a n tc e l l s b e s i d e sp h o t o s y n t h e s i s ，i ta l s oc a r r i e so u to t h e re s s e n t i a lm e t a b o l i s m t h eb i o g e n e s i s o fc h l o r o p l a s tf r o mp r o p l a s t i di st h ep r e r e q u i s i t eo fp h o t o s y n t h e s i s t h ec h l o r o p l a s t d e v e l o p m e n tr e q u i r e sc o o r d i n a t e de x p r e s s i o no ft h en u c l e a ra n dt h ep l a s t i dg e n o m e h o w e v e r ，w es t i l l k n o wl i t t l ea b o u tt h i s p r o c e s s t h ea n a l y s i s o fa l b i n oo r p a l e g r e e nm u t a n ti sa ni m p o r t a n tw a yt oi n v e s t i g a t ec h l o r o p l a s tb i o g e n e s i s c h l o r o p l a s tb i o g e n e s i si sac o m p l e xp r o c e s si nh i g h e rp l a n t s ，w h i c hn e e d st h e c o o r d i n a t e dg e n ee x p r e s s i o nb o t ht h en u c l e a ra n dt h ec h l o r o p l a s tg e n o m e d u et ot h e l i m i tp l a s t i dg e n o m ec a p a b i l i t y ，m o s tg e n e sc o n t r o l l i n gc h l o r o p l a s tb i o g e n e s i sa r ei n n u c l e a rc o m p a r t m e n t i nt h i sw o r k ，w es c r e e n e dam u t a n ta t e c b 2 ，w h i c hs h o w e d a l b i n o c o t y l e d o n s a n ds e e d l i n gl e t h a l m i c r o s c o p yo b s e r v a t i o ns h o w nt h a t c h l o r o p l a s tc o n t a i n sn ol a m e l l a ，i m p l y i n gc h l o r o p l a s td e v e l o p m e n ti sa r r e s t e da tt h e e a r l ys t a g e g e n e t i ca n a l y s i si n d i c a t e dt h a tt h em u t a n tp h e n o t y p ew a sas i n g l e r e c e s s i v el o c u sa n dc o - s e g r e g a t e dw i t ht h et - d n ai n s e r t i o ns i t ec o m p l e m e n tt e s t a n a l y s i sd e m o n s t r a t e dt h a ta t e c b 2i sr e s p o n s i b l ef o ra t e c b 2m u t a n tp h e n o t y p e a t e c b 2 g e n ee n c o d e sap p rp r o t e i nl o c a li z e dt oc h l o r o p l a s t ，w h i c hd i s p l a y sh i g h l y e x p r e s s i o nl e v e li nc o t y l e d o na n ds e e d li n g t h ea t e c b 2m u t a n td i s p l a y e do b v i o u s d i f f e r e n te x p r e s s i o np a t t e r no nc h l o r o p l a s t - r e l a t e dg e n e si nc o n t r a s tt ot h o s eo fw i l d t y p e i m m u n b l o ta n a l y s e sa l s oi n d i c a t e dt h a tt h ea m o u n to fp h o t o s y n t h e t i cp r o t e i n w a sl a r g e l yd e c r e a s e di na t e c b 2m u t a n t p c rf r a g m e n ts e q u e n c ei n d i c a t e dt h a to n e p u b l i s h e dr n ae d i t i n ge v e n t sh a v en o to c c u r r e di na t e c b 2m u t a n t c o m b i n e dt h e s e d a t aa n do u rr e s u l t si n d i c a t e st h a ta t e c b 2i sa s p e c i f i c i t yf a c t o rf o ra c c dt r a n s c r i p t s r n a e d i t i n g ，a n dt h ed e f e c t i v ea c c dr n ae d i t i n gc o u l dl e a dt ot h eb l o c ko fe a r l y c h l o r o p l a s tb i o g e n e s i s k e yw o r d s ：a r a b i d o p s 括；a l b i n om u t a n t ；c h l o r o p l a s tb i o g e n e s i s ；r n ae d i t i n g 论文独创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除 了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或机构已经发表或撰写过的研究 成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中做了明确的声明并表 示了谢意。 轹孙 论文使用授权声明 本人完全了解上海师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部 分内容，可以采用影印、缩印或其它手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此 规定。 作者签名：导师签名：，日期： 御市 叩。 上海师范大学硕士学位论文文献综述 1 文献综述 绿色植物光合作用对整个生物界和人类的生存发展，以及保持自然界的生态 平衡具有极其重要的作用，它是地球上唯一大规模把无机物转变为有机物，把光 能转变为化学能的过程。叶绿体是植物进行光合作用的场所，因而叶绿体生物发 生与叶绿体功能维持的研究倍受关注。 叶绿体是植物细胞中所特有的细胞器，具有双层膜结构。其起源于内共生的 蓝藻，在长期的进化过程中，叶绿体中的绝大多数基因被转移到核中，只有少量 基因仍保留在叶绿体基因组中。叶绿体中能量转换贯穿于整个光合作用过程。从 表面看，光合作用反应式仅为一个简单的氧化还原反应过程，但实质上包括一系 列光化学步骤和物质转变问题。 近年来，叶色突变体的利用价值受到越来越多的关注。叶色突变的主要特点 是叶色表型发生了变异，表现为不正常的白化、浅绿、黄绿和条纹等( a w a ne t 耐，1 9 8 0 ) ，并可导致控制叶绿素生物合成和叶绿体发育的重要基因的沉默或失 活，直接或间接影响叶绿素的合成和降解，改变叶绿素含量( m o t o h a s h ie la 1 ，2 0 0 3 ； h i r o k ie la 1 ，2 0 0 4 ；a n n ae ta 1 ，2 0 0 4 ；j u n ge ta 1 ，2 0 0 3 ) 。在育种工作中，叶色变异 不仅可以作为标记性状，简化良种繁育( 吴殿星1 9 9 5 ) ，和杂交种生产，提高杂 交种种子纯度( z h a oe ta 1 ，2 0 0 0 ) ，而且常绿突变体还可为高光效育种提供优良种 质资源( g a l aa n da m a s i n o1 9 9 5 ) 。另外，叶色突变体也是光合作用( f a m b r i n ie ta 1 ， 2 0 0 4 ) 、质一核基因互作以及信号传导途径( m o c h i z u k ie la 1 ，2 0 0 1 ；r o b e r te la 1 ， 2 0 0 3 ；s t e me ta 1 ，2 0 0 4 ) 等水稻光合系统结构、功能及其调控机制研究的理想材 料。 1 1 叶绿体起源学说 1 1 1 内共生起源学说 内共生假说则认为，叶绿体的祖先是蓝藻( c y a n o b a c t e r i u m ) ；蓝藻也称蓝细 菌( b l u e - g r e e na l g a e ) 1 9 7 0 年m a r g u l i s 分析了大量资料，提出了一种设想，认 上海师范大学硕士学位沦文文献综述 为真核细胞的祖先是一种体积巨大的、不需氧的、具有吞噬能力的细胞，能将吞 噬所得的糖类进行酵解取得能量。当时的生态系统中存在着另一种需氧的真细 菌，它们含有进行三羧酸循环所需的酶系，能够更好地利用糖类，将其分解得更 彻底以产生更多的能量。在生命演化过程中，这种古核生物将这种真细菌作为食 物吞噬进体内，并与之建立起了一种互惠的共生关系：古核细胞为细胞内的真细 菌提供保护和较好的生存环境，并供给真细菌未完全分解的糖类。而真细菌可以 轻易地得到这些营养物质，产生更多的能量，并可以供给宿主利用。一部分这样 的古核生物在吞噬真细菌的同时，还吞噬了蓝藻，蓝藻为宿主细胞完成光合作用， 而宿主细胞为其提供营养条件。 这种细胞内共生关系对双方都有益处，因此双方在进化中就建立起了一种逐 步固定的关系。 1 1 2 非共生起源学说 该学说的支持者提出一种线粒体和叶绿体起源的设想，认为真核细胞的前身 是一个进化上较高等的好氧细菌，它比典型的原核细胞大，这样就要逐渐增加具 有呼吸功能的膜表面，开始是通过细菌的细胞膜内陷、扩张和分化，后逐渐形成 线粒体和叶绿体的雏形。据1 9 7 4 年u z z e l l 等人的论点，在进化的最初阶段，原 核细胞的基因组进行复制并不伴有细胞分裂，然后基因附近的质膜内陷形成双层 膜，分别将基因组包围其中，从而形成了原始线粒体、叶绿体等细胞器。后来在 进化过程中进一步发生分化，质体发展成光合作用的场所：线粒体则变为专具有 呼吸功能的细胞器，于是逐渐形成了现在的真核细胞。 从目前看，这两个学说尚有争议，各有其实验证据和支持者。关于线粒体和 叶绿体的起源，有待进一步探讨和研究。 1 2 拟南芥叶绿体研究进展 植物细胞区别于动物细胞，是它有自己独特的质体细胞器。在植物细胞中， 质体以不同的形态和功能存在的，分为叶绿体、有色体和白色体。其中叶绿体是 质体中研究的最详细、功能最重要的细胞器，它进行光合作用，是植物细胞所特 9 上海师范凡学碗i ：学位论文文献综述 有的能 砖转换场所。叶绿体除丫进行光合作j j 外，还参j 其他生物代谢如脂肪酸 和色祟的合成、氨基酸以及次生代谢物质的合成等( m ul l e tf ，a l1 9 8 8 ) 。日前叶绿 体及光合作用相戈萆岗的功能研究，己成为当前植物基冈功能基闻组学研究n q 个重要方向。 1 2 1 叶绿体形态结构及功能 在高等植物中叶绿体象双n 或平凸透镜。短径2 4 l j m 长径5 一l o 胛n ，厚 2 3 1 m 。高等植物的叶肉细胞一般含5 0 2 0 0 个叶绿体叶绿体的数日因物种t 细胞类型，生态环境，生理状态而有所不同。| 封植物种类不同，叶绿体形状变化 很大同时它伴随不同的环境条件，如光照、温度条件，产生不同的适应性的变 化。 蹭警 图1 叶绿体结构示意图和透射电子显微镜 叶绿体足m 叶绿体膜、类囊体和基质构成。是双层腕结构，外膜透性大而内 膜具选抒性。叶绿件内部基质( s t r o m a ) 主要含有j 碳同化栩关的酶、时绿体d n a 和虽白质合成系统及一些淀粉粒等物质，呈高度流动性。基质里有许多由单层膜 包被，沿叶绿休的长轴甲行排列的类囊体( t h y l a k o i d ) 。两个以上的类囊体垛叠在 一起形成基粒( g r a n a ) 。由于相邻的基柠由基质类囊体相连，类囊体实质上是一个 相互贯通的封闭系统。类囊体膜亦称光合膜，光能转化为化学能就是在类囊体上 进行的。光合作用分为二步：原初反麻、电了传递和光台磷酸化、碳同化。它们 互相配合品终有教的将光能转化为化学能。前硝步属丁光反应，在类囊体上进行， 把光能转化为活跃的化学能，形成a t p 和n a d p h 。碳同化属r 略反应，在牡质 叶1 进行利用光反应产牛的a t p 和n a d p h 还原c 0 2 将活跃的化学能转化为稳 定的化学能，储存于有机物中。 上海师范大学硕士学位论文文献综述 1 2 2 叶绿体的发育 在高等植物中，叶绿体由前质体( p r o p l a s t i d ) 发育而来。其主要存在于分生组 织细胞和有丝分裂后期细胞中( v o t h k n e c h ta n dw e s t h o f f , 2 0 0 1 ) 。是一种小而 无色的细胞器，它缺乏类囊体膜结构，仅由内膜和外膜构成，只含有淀粉粒、d n a 、 脂肪粒及一些未知的泡状结构。前质体在不同的环境和组织内分化形成不同的 质体，主要包括白化质体、有色体( c h r o m o p l a s t i d ) 、造粉体( a m y l p l a s t ) 和叶绿 体。 高等植物叶绿体的生物发生过程如下：分生组织中前质体先体积增大约1 0 0 倍；当前质体达到约l t m 左右时候，在光照条件下膜的内层内陷形成膜系统，这 些膜系统开始发育成基粒类囊体或者小的基质类囊体结构的层状结构。随后这些 小的层状结构开始组装形成类囊体结构，进一步发育基质类囊体或者基粒类囊 体，最终形成成熟的叶绿体。 o 一 甜o p l a 懿一斟啦哟9 a 奠 ! l 硪 0 - f 目 一- 户 ，两眵积 图2 ；叶绿体的发育途径( 引自c l i n e ，2 0 0 2 ) 叶绿体在不同的发育时期结构不同，其中类囊体的变化尤为明显。在叶绿体 发育早期，类囊体数量较少，几乎都是基质片层。当它们发育成熟后，类囊体中 不仅有大量的基质片层，且基粒增多，基粒垛叠变厚，形成排列整齐、结构清晰、 发育完善的类囊体系统。随着叶绿体的进一步发育，类囊体系统出现紊乱，进而 肿胀和泡状化。有些类囊体甚至衰老而逐渐解体，如结构模糊不清，数量减少。 2 海师范大学硕士学位论文 文献综述 在叶绿体发育过程中，基质内的淀粉粒的数量和大小直在改变( 韩着华2 0 0 1 ) 。 目前，人们已经从多种植物中分离出叶绿体发育和分化受阻的突变体这些 物种包括有水稻，k 米，大麦，烟草，马铃薯，金鱼草，拟南芥等这些突变体中叶 绿体的发育情况受到不同程度的影响，根据突变体中叶绿体的结构，我们可以分 为咀下几类：( 1 ) 突变体中的叶绿体含有未知内窖物，结构类似前质体，缺乏 内膜系统，不舍任何片层结构( 图3 a ) ，在拟南芥中，这类突变体包括有e d d l s l p ， a p 9 2 ，c l b 2 ，c l b 3 ，c l b 5 ，和c l a l ；在其他植物中也发现有类似的突变体( 2 ) 突变体 叶绿体中，膜系统开始形成，但没有观察到类囊体结构：不同的突变体中，膜系 统的多少有所不同，这类突变体包括有p a c , d c t , c i b l ，c l b 6 ，c l a l ，a l b 3 和c l b 4 ：( 图3 中b 和c ) ，( 3 ) 突变体的叶绿体有明显的类囊体结构，但是较野生型少( 图3 d ) ， 这类突变体例如p d 7 。 赫 繇一攥 满麟屯。： ， 窿 毒。壤 d 一i 图3 ：白化突变中叶绿体发育缺陷特征 a 叶绿体类似前质体结构：b 和c 叶绿体中有膜系统结构：0 叶绿体中含有明显的类囊体 结构，但是数董比较少 1 2 3 拟南芥叶色突变基因的克隆 近年来拟南芥突变体库的建立，多种方法开始用于筛选与叶绿体或光合作 用相关的突变体。筛选参数主要集中于突变体色素的改变以及突变体叶绿煮荧光 的改变等。多数与叶色的改变相关的基因编码叶绿体蛋白，这些蛋白质的功能涉 及到蛋白酶的水解，蛋白质的转运，酶的活性蛋白质的组装等。 多个参与叶色突变的基因已经被克隆，s u n d b e r g 等分离出了a l b l n 0 3 ： l e v i n 和他的同事筛选出多数这样的突变体，并从中分离出了c l a ip a c t a t c 等 上海师范大学硕士学位论文文献综述 基因。g u t i e r r e z n a v a 等筛选出9 9 个与叶色突变相关的突变体，其中9 个为白 化表型，对其中的六个突变基因进行了定位，分离出了其中的突变基因c l b 4 ， c l b 6 。运用正向遗传学也分离出a t p d ，p e t c ，t i c 基因( s u n d b e r ge ta 1 ，1 9 9 7 ； m a n d e le ta 1 ，1 9 9 6 ；m o t o h a s h ie ta 1 ，2 0 0 1 ；r e i t e re ta 1 ，1 9 9 4 ；g u t i e r r e z n a v ae t a 1 ，2 0 0 4 ；g u e v a r a - g a r c i ae ta 1 ，2 0 0 5 ) ( b u d z i s z e w s k ie ta 1 ，2 0 01 ) 。 这些基因的分离和功能研究使得人们对高等植物中叶绿体生物发生的有了较 深入的认识。按照基因功能不同，可分为以下几类： 蛋白质转运相关：叶绿体是半自主型细胞器，叶绿体中的多数蛋白质由核基 因组编码的，在细胞质中合成后转运到叶绿体中。突变体的分离和功能研究发现 有些重要的叶绿体蛋白质转运器的缺失直接影响了核编码的蛋白质转运到叶绿 体中，影响叶绿体内部类囊体结构的组装，进而影响叶绿体生物发生。如a l b 3 基因突变导致突变体中的叶绿体是空泡状结构，拟南芥叶片白化表型。基于a l b 3 基因参与光合作用复合物的组装，a l b 3 的缺失影响了光捕获复合物和p s i i 的组 装，进而影响到叶绿体类囊体膜结构的形成，从而阻碍了叶绿体的生物发生。 s t o c k 等分离了_ 个叶绿体生物发生的突变体p g y t o 控制该突变体表型的基因编 码一个t p r 结构域的蛋白质，该蛋白质参与了p s i 的组装，致使该突变体的叶绿 体中类囊体膜结构松散 类异戊二烯形成相关：植物中的类异戊二烯来源于2 分子的五碳糖前体一异 戊烯焦磷酸( i p p ) 和它的异构体二甲丙烯二磷酸( d m p p ) 。在植物中有两条途径 用来合成类异戊二烯在细胞质中，植物甾醇类，多萜醇等是通过甲羟戊酸途径 ( a ) 合成的。在质体中，跹p 途径用来合成异戊烯焦磷酸( i p p ) 和它的异构 体d m p p ，通过这些来合成质体醌，叶绿素，类胡萝卜素，激素等。基于这些特 殊的类异戊二烯，这些五碳糖经过一系列的化学合成途径产生许多重要的类异戊 二烯复合物迄今为止，随着拟南芥功能基因组学的研究的深入，人们已从拟南 芥中克隆到了参与类异戊二烯生物合成途径中的酶c l a l ，i s p g ，c l b 4 ， i s p d ， i s p e ，i s p h ，i s p f ，和c l b 6 等。突变的叶绿体中仅有少数扁平状的内膜结构或 者突变体的叶绿体呈现空泡化结构，无正常的类囊体膜类异戊二烯生物合成的 受阻影响了叶绿素，类胡萝卜素等这些色素的合成，从而影响了叶绿体的生物发 生 上海师范大学硕士学位论文文献综述 叶绿体基因的表达受核基因的控制，因而有些核基因的缺失影响了叶绿体的 基因在转录水平和翻译水平的表达，如r n r l ，c l b l 9 ，a t t a b 2 等。编码这些酶相 应的基因缺失，可能会导致了拟南芥叶绿体生物发生存在缺陷。 高等植物中的叶绿体生物发生是复杂的过程。在叶绿体中，进行着多种水平 的代谢。人们在细胞水平上对叶绿体的发育过程有了详细了解；但是在分子水平 上，人们对叶绿体的生物发生的了解还不足。人们通过克隆出参与叶绿体生物发 生的必需基因，进行功能研究，将在分子水平对叶绿体的生物发生有进一步的认 识。 1 2 4 叶色突变体的应用前景 基因突变可以直接或间接影响叶绿素的合成和降解，改变叶绿素含量，导致 光合作用效率下降，造成作物减产，严重时甚至导致植株死亡。目前，叶色突变 体己广泛应用于基础研究和生产实践。随着分子生物学、功能基因组学研究手段 的不断发展，植物生理学以及和生物信息学研究的不断深入，相信叶色突变体的 应用研究将不断取得新的突破。 1 3p p r ( p e n t a t r i c o p e p t i d er e p e a t ) 蛋白研究进 展 p p r 基因家族因与植物体中两个重要的细胞器线粒体和叶绿体有密切的联 系，受到了研究者的极大关注。在拟南芥基因组序列测序完成后，s m a l l 和 p e e t e r s ( 2 0 0 0 ) 在预测与线粒体和叶绿体功能相关的蛋白质并大规模筛选序 列时，发现这个新的基因家族。本论文简要介绍一下p p r 基因家族的研究进展。 1 3 1 p p r 基因的分布 自p p r 基因家族发现以来，它在不同生物体内的分布以及同生物体内不同染 色体上的分布，也成为一个研究的热点。 1 4 上海师范大学硕士学位论文文献综述 1 3 1 1在染色体上的分布 p p r 基因在拟南芥中均匀地分布在5 条染色体上，很少明显地成簇。例外的是， 在第1 条染色体的长臂约1 兆范围内，有1 9 个p p r 基因与几个可能的p p r 拟基因，这 是p p r 基因最密集的地方。而且这些成簇分布的p p r 基因在功能上很相近。 1 3 1 2不同物种中的分布 l u r i n 等对p p r 基因在不同物种中的分布进行了鉴定：在所有真核生物基因组序 列中都发现p p r 基因，但动物中p p r 基因的数目却非常少，而在植物中存在大量的 p p r 基因。例如在拟南芥和水稻的基因组中有几百个p p r 基因，而在人类和果蝇的 基因组中p p r 基因的数目分别为6 个和2 个。p p r 基因很少在原核生物、藻类、原生 生物中分布，而在真核植物中大量存在，这可能表明p p r 基因起源于某种古老的陆 生植物。关于p p r 基因的具体起源，目前仍不清楚。p p r 基因的表达量少或许多基 因并没有表达，所以这个基因家族最近才被发现。 1 3 2p p r 基因家族的结构特征 p p r 基因编码一种以3 5 个简并氨基酸为重复单位排列组成的蛋白质，称为p p r 蛋白。这些重复出现的氨基酸简称为p p r ( p e n t a t r i c o p e p t i d er e p e a t s ) 基序，在 这些基序中具有非常保守的氨基酸残基，如酪氨酸、赖氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸 等。 l u r i n ( 2 0 0 4 ) 对拟南芥基因组中的p p r 基因进行了全面分析，发现两个与p p r 基序密切相关的结构域：一种编码3 5 或3 6 个氨基酸，被命名为p p r 类l 基序，简称l 基序：另一种编码3 1 个氨基酸，被命名为p p r 类s 基序，简称s 基序。因此，p p r 基因家 族除了以原来p p r 基序( 简称p 基序) 为重复单位的p p r 基因( 简称p 亚族) 外，还有以 p 、k 、s 这3 种基序为重复单位的p p r 基因，简称为p l s 亚族e 对p p r 蛋白的n 端和c 端的氨基酸序列进行研究，发现大多数p p r 蛋白的n 端氨 基酸序列很少有同源性，但具有对细胞器进行定位的信号肽。而c 端也不具有与 p p r 基序相似的氨基酸序列，但具有高度的保守性。l u r i n 对全部拟南芥p p r 基因的 c 端氨基酸序列进行分析，发现此区间含有3 个保守的结构域，分别为e ，e + 和d y m 1 5 上海师范大学硕士学位论文文献综述 结构，在拟南芥中具有这3 种p p r 蛋白的数目分别有1 9 1 、1 4 5 、8 7 。尽管这些结构 的序列与p p r 基序的序列不具有同源性，但是这三种结构只出现在p p r 基因家族 中。在拟南芥a t l 9 4 7 5 8 0 序列中发现一个单独的d y w 结构，是一个例外。进一步分 析发现，这3 种结构遵循如下原则：在同一个蛋白质中一个结构仅出现一次，且具 有一定的顺序，在c 端的顺序依次为：e 、e + 并f l d y w ；具有e + 结构的蛋白质肯定有e 结构，具有d y w 结构的蛋白肯定有e 和e + 结构；且只在p l s 亚族中出现。 综上所述，整个p p r 基因家族可被分成2 个亚族，为p 亚族和p l s 亚族。在p l s 亚 族中又分为4 个群：不具有e 、e + 和d y m 结构，称为p l s 群：只具有e 结构，不具有e + 和 d y m 结构，称为e 群：具有e s h e + 结构，不具有d y m 结构，称为e + 群：3 种e 、e + 和d y m 结构 都具有，称为d y w 群。 1 3 3p p r 基序与t p r 基序的异同 t p r ( t h et e t r a t r i p e p t i d er e p e a t ) 基序是在研究细胞分裂周期时首先被发现 的。该基序以3 4 个简并的氨基酸为单位，在t p r 蛋白质中重复出现。每个t p r 基序 由一对反向平行的双螺旋组成，相邻的基序以相互平行的组配在一起。这些连续 排列的t p r 基序组成含有沟的超螺旋，这种沟可能是蛋白质的结合位点。t p r 蛋白， 有3 1 6 个t p r 基序，单个或成簇地分布在整个蛋白质的氨基酸序列中。 p p r 和t p r 在氨基酸序列上有相似性，p p r 基序也具有一对反向的双螺旋：参与 t p r 基序问组装保守的酪氨酸，在p p r 基序中也存在，因此连续排列的p p r 基序也可 能形成具有沟的超螺旋。尽管p p r 基序与t p r 基序在序列相似，但用m o t i fs e a r c h 软件分析发现，几乎没有同时具有p p r 和t p r 基序的蛋白质，说明它们具有不同的 特征。在p p r 蛋白中，超螺旋沟内的残基几乎全部是亲水的，带有正电荷。这意味 着全部或部分p p r 基序是r n a 结合位点，而不是蛋白质结合位点。而在t p r 基序中， 延伸到中间沟的氨基酸残基在不同的t p r 蛋白中是可变的，这反映配体结合的可 变性，说明可能是蛋白质结合位点。 1 3 4p p r 基因的生物学功能 p p r 基因大多定位在细胞器叶绿体或线粒体中，调节细胞器基因表达。尽管已 经知道p p r 基因在植物中大量存在，但目前为止，仅对极少数不同生物的p p r 基因 1 6 上海师范大学硕士学位论文文献综述 进行了功能分析。 1 3 4 1 对叶绿体基因的调节 叶绿体是半自主性细胞器，具有自己的d n a ，能进行自我复制、转录和翻译。 叶绿体是植物进行光合作用的关键细胞器，在能量代谢和物质代谢中起着非常重 要的作用。但大多数叶绿体基因的初始转录产物需经过加工才能成为成熟的r n a 。 d a n i e l 等通过反向遗传学和发育的方法，发现一些p p r 基因在发育过程中起 着重要作用，在植物胚胎发育的初期是不可缺少的，否则将影响胚的形态发育。 拟南芥e b 1 7 5 是第一个被证实具有p p r 基序的发育突变体基因，该蛋白定位于叶 绿体上，同叶绿体基因相互作用，影响细胞器的生物合成。e m b l 7 5 突变基因证实， 在植物具有光合能力之前，质体对保持生物体具有生命力是至关重要的。 通过改变幼苗着色的突变体或具有较高叶绿素荧光的突变体进行功能分析， 发现大多数p p r 基因对于光合作用有关的质体转录本的加工或翻译有着重要作 用。玉米c r p l 蛋白，定位在叶绿体的基质上，具有1 3 个p p r 基序，参与叶绿体基因 p e t d s d p e t a 转录本的翻译以及p e t d 初始转录本加工。对质体转录本有类似作用 的p p r 基因也相继在不同植物中被报道。拟南芥中的c r r 2 蛋白，具有9 个p p r 结构， 参与叶绿体多顺反子r p s 与n d h b 基因间切开，作为调控n d h b 基因表达的分子开关， 控$ | j n d h b 基因翻译。拟南芥h c f l 5 2 蛋白，具有1 2 个p p r 结构，是叶绿体r n a 加工和剪 接因子，参与p s b b ，p s b t ，p s b h ，p e t b ，p e t d 转录本的正确加工。该h c f l 5 2 蛋白作为 一个结合蛋白，结合在p s b h 和p e t b 转录本的中间，p e t b 内含子和外显子的连接处， 间接或直接导致p e t b 剪接产物的累积。拟南芥c r r 4 蛋白，具有1 1 - 个p p r 基序，直接 影响r n a 的编辑过程，但也发现r n a 编辑的效率并不仅仅局限于c r r 4 基因的表达。 这说明c r r 4 蛋白只是r n a 编辑复合体的一部分，它可能只是与目标r n a 相互作用， 来执行其编辑功能。这些基序的不同区域具有不同的功能，它至少能识别两种截 然不同的目标r n a ，对它们的稳定性和翻译起作用。除参与r n a 的剪接、翻译，提 高其稳定性外，也发现p p r 基因参与r n a 编辑。 1 7 上海师范大学硕士学位沦文文献综述 1 3 4 2 对线粒体基因的调节 线粒体具有核染色体之外的遗传物质，能编码提供自身生物发生和各项生 命功能所需的部分遗传信息。线粒体的初始转录产物必须经过核蛋白因子的加工 才能成为成熟的r n a ，这同大多数叶绿体基因一样。类似于参与叶绿体r n a 加工过 程，p p r 蛋白在线粒体r n a 的加工过程也有重要作用。酵母( s a c c h a r o m y c e s c e r e v m i a e ) p e t 3 0 9 蛋白和粗糙脉孢菌( n e u r o s p o r ac r a s s a ) c y a 2 5 蛋白都定位在线 粒体上，这2 个蛋白对保持内含子线粒体基因c o x l 初始转录物的稳定性和成熟 m r n a 翻译起到了重要作用。进一步的实验证据来自近期从萝卜( r a d i s h ) 、矮牵牛 ( p e n t u n i a ) 、水稻( o r y z as a t i v a ) 克隆的核恢复基因都是p p r 基因，说明p p r 基因 参与线粒体基因初始转录产物的加工，对细胞质雄性不育核恢复起到重要作用。 萝卜恢复基因r f o ( r f k l ) ，有1 6 个p p r 基序，影响线粒体基因o r f l 2 5 翻译或翻译后 加工：矮牵牛恢复基因r f p p r 5 9 2 ，有1 4 个p p r 基序，影响线粒体基因p c f 转录本表 达量，从而极大减少了p c f 蛋白的含量：水稻b t 型恢复基因r f 2 1 ，有1 6 个p p r 基序， 对线粒体基因a t p 6 转录本的表达水平进行修饰。可见，编码p p r 蛋白的恢复基因能 改变与胞质不育有关基因的表达水平。尽管这些p p r 基因的作用机制不很清楚， 但它们却阻止相应线粒体诱导基因编码蛋白质的表达，在恢复花粉的育性中扮演 重要的角色。 1 3 4 3 对其他基因表达的调节 果蝇( d r o s o p h i l a ) b s f 蛋白，是一种p p r 蛋白，对果蝇早期胚胎发育模式的形成 起作用。它特异地结合在b i c o i dm r n a3 端非翻译区，提高b i c o i dm r n a 的稳定性。 证明p p r 基因不仅对细胞器基因进行调节，而且对细胞器外一些基因的表达也起 作用。另一个证据是关于l r p l 3 0 蛋白，具有9 个p p r 基序，定位在细胞核和细胞质中， 结合在染色体富含c 碱基的单链区域，影响富含g 重复序列位点的稳定性。同时， l r p l 3 0 蛋白也是一个r n a 结合蛋白，大部分l r p l 3 0 蛋白都定位在线粒体上，直接跟 多聚腺苷酸r n a 结合。因此，l r p l 3 0 蛋白是一种新型的r n a 结合蛋白，它在细胞核和 线粒体m r n a 之间起联系作用，是协调细胞核和线粒体基因表达的一个候选基因。 综上所述，虽然没有p p r 蛋白直接结合r n a 的证据，但p p r 基因突变体的研究已暗示 上海师范大学硕士学位论文文献综述 着p p r 蛋白可能直接或间接与r n a 结合，调节细胞器基因或其他基因的表达。目前 对p p r 基因功能的了解还是非常有限的，需要更多的试验样本来确证其相关功能。 1 3 5 展望 从发现p p r 基因家族以来，它在线粒体和叶绿体基因表达调控起重要作用，因 此成为当前研究的一个热点。但当前面临许多问题，对p p r 基因的克隆和功能分析， 几乎全部来源于这些基因的突变体，由于许多突变体是致死的，或者在表型上没 有明显的差异，突变体的筛选和获得非常不易。并且，对这些基因的功能分析也 只停留在初级阶段，与这些基因相互作用的底物，及相互作用模式，目前都不十分 清楚。相信随着不同生物基因组测序工作的结束和生物信息学的发展，可以为p p r 基因遗传和功能的深入研究提供很好的技术平台。 1 4r n a 编辑 分子生物学向纵深发展，使人们对中心法则的修改和补充一直持续不断，最近 一次挑战来自r n a 编辑现象的发现。转录后的r n a 编辑改变了特定转录本的编码 能力，并产生多态性的基因表达产物，这使得通过线粒体d n a 序列直接预测氨基 酸序列成为历史。所谓r n a 编辑( e d i t i n g ) ，是在r n a 水平上改变遗传信息的加工 过程，导致成熟的r n a 编码序列和它的转录模板d n a 序列之间的不相匹配。 1 4 1 r n a 编辑的发现与类型 1 9 8 6 年，荷兰b e n n e 首次报道了这一重要的真核基因转录后加工的特殊方式。 他们发现原生动物锥体虫线粒体的细胞色素c 氧化酶的第二个亚基( c o xi i ) 经转 录后插入了4 个非编码的尿嘧啶，他们将这种r n a 加工的现象定义为r n a 编辑。随 后的研究表明r n a 编辑发生在转录后的r n a 中，其编辑区出现碱基的插入、删除或 替换等变化，使转录产物不能忠实地反映模板d n a 的一级序列。截止目前，已在所 有陆生植物和3 种苔藓植物线粒体中检测到了r n a 编辑。r n a 编辑是线粒体基因转 录本成熟化的过程之一，依据其特性分为二种，一种是插入或缺失编辑，即碱基加 入到或从转录本中移走，这种方式主要存在于四膜虫线粒体中：第二种是替代( 修 1 9 上海师范大学硕士学位论文文献综述 饰) 编辑，即种碱基转变成另外一种。在高等植物中r n a 编辑的方式普遍是c - u 的转变，该方式是通过对基因组编码的c 残基进行脱氨基来完成的，胞嘧啶脱氨基 酶的同源基因已在线粒体基因组中发现。 1 4 2 r n a 编辑改变遗传信息 高等植物线粒体r n a 编辑优先作用于蛋白质基因的编码区，且主要发生在密码 子的第一和第二位点上，所以常常导致编码的氨基酸种类发生变化。r n a 编辑的发 现能够合理解释线粒体中存在的与标准密码使用规律不一致的现象。c g g 在标准 密码中编码精氨酸，但在线粒体中则成为色氨酸的密码子，这是借助c - u 的r n a 编 辑造成c g g 在r n a 水平转变为u g g 的结果。 叶绿体中大约有2 1 一- 3 1 个编辑位点。拟南芥线粒体中已知有4 5 6 个编辑位点， 且均为c - u 的编辑，其中4 4 1 个位于蛋白质编码区，其余1 5 个位于非编码区，包括内 含子和5 、3 非翻译区。 目前已知在高等植物线粒体大部分编码蛋白质的基因的转录本都受到编辑， 但不同基因转录本的编辑程度不同。有的基因( 如a t p a ) 有4 个编辑位点，导致0 4 的氨基酸改变，而n a d 3 基因却有2 1 个编辑位点，改变了1 5 的氨基酸。此外，同一 基因在不同物种中的编辑位点也不相同，比较d n a 序列后发现，部分编辑位点的消 失是由于c - t 残基。高等植物线粒体中r n a 编辑不仅局限于蛋白质编码区，还作用 于转录本的5 和3 非翻译区、内含子、r r n a 和t r n a 基因的转录本；一般情况下， 蛋白质编码区的编辑位点远远多于非编码区的。r n a 编辑已成为线粒体基因产生 功能蛋白所必需的加工步骤，同时也成为细胞核调控线粒体基因表达的重要方式 之一。 1 4 3 r n a 编辑的机制 r n a 编辑有多种机制，不同生物的编辑需要不同的r n a 编辑酶，目前详细阐明的 主要是以下几种。 上海师范大学硕士学位论文 文献综述 1 4 1 1 原生动物t r n a 的r n a 编辑： 阿米巴虫线粒体基因组序列中发现，在线粒体d n a 中编码的t i n a ，有很多在 形成经典的三叶草结构时在氨基酸接受茎上的碱基都有错配现象。这种错配特异 的发生在第1 - 3 个碱基对，涉及5 端1 - 3 位的核苷和与其互补的3 端7 0 - 7 2 位核苷 的变化。这些碱基对在所有的t r n a 中都存在，它们对t r n a 空间结构的折叠及功能 发挥有重要作用，有的甚至对氨酰化是必不可少的。这种类型的编辑，就是碱基 替代。在这个过程中有两种必要的酶是：一种是t r n a 特异性的5 一3 核酸外切 酶，另一个是3 一5 核苷酸转移酶。 1 4 1 2 锥体虫细胞质中的r n a 编辑： 1 9 8 6 年发现锥体虫线粒体中的r n a 编辑现象，即细胞色素c 氧化酶亚基中有4 个尿嘧啶在线粒体基因组中是不被编码的。在锥体虫线粒体和叶绿体某些成熟的 m r n a 序