（分析化学专业论文）蛋白质及抗坏血酸的络合吸附波法测定.pdf

中南民族大学硕士学位论文 i 摘摘 要要 蛋白质是重要的生命物质，同很多生命现象密切相关。蛋白质的定量测定是 生命科学中经常涉及的内容， 也是临床检验中诊断疾病和检验治疗效果的重要指 标。抗坏血酸是维持人体健康必需的维生素，缺乏它将导致坏血病和机体抗病能 力降低。因此抗坏血酸的定量分析在食品、医药等领域也是相当重要的。近年来 电化学分析方法在生物分析化学中得到了广泛的应用， 己成为生命科学研究中最 基础的手段之一。本论文利用单扫描极谱上的络合吸附波测定蛋白质和抗坏血 酸，共分为四章。 第一章概述了蛋白质和抗坏血酸的定量分析方法及极谱络合吸附波的理论 知识和研究应用。 第二章研究了血清白蛋白的络合吸附波法测定。在 ph 9.2 的 h3bo3naoh 缓冲溶液中，血清白蛋白使铅(ii)抗坏血酸络合物在 0.51 v (vs.sce)处的络合 吸附波还原峰峰电流降低，电流降低值与加入的牛血清白蛋白（bsa）或人血清 白蛋白（hsa）浓度在一定范围内呈线性关系。bsa 在 2 38 g/ml 范围内， hsa 在 2 35 g/ml 范围内呈线性关系，检出限均为 1 g/ml。应用该法测定了 人血清样品中蛋白质的含量，结果令人满意。 第三章利用铅(ii)抗坏血酸络合吸附波测定了抗坏血酸。抗坏血酸在 ph 8.8 的 pb2+、乙醇胺hcl 混合溶液中于 0.50 v (vs.sce)处有一极谱波，该波波 高与抗坏血酸浓度在 8.010-7 1.210-5 mol/l 范围呈线性关系，检出限为 4.0 10-7 mol/l。应用该法测定了 vc 片剂和维 c 银翘片中抗坏血酸的含量。 第四章探讨了铅(ii)氧化型抗坏血酸络合吸附波的形成机理。 关键词：单扫描极谱法；络合吸附波；铅(ii)抗坏血酸络合物；牛血清白蛋白； 人血清白蛋白；抗坏血酸； 氧化型抗坏血酸 蛋白质及抗坏血酸的络合吸附波法测定 ii abstract protein is a very important substance in life body. it participates in every reaction and activity of organism. the quantitative determination of protein is a considerable factor in biochemical and clinical assays. ascorbic acid is considered as one of the most important elements that keep a person healthy. in the event of being short of it, a person may catch scurvy or lower the resistance to disease. consequently it is quite significant to make quantitative analysis in the field of medicine and food. over recent years, electrochemical methods have been widely used in bioanalytical chemistry. this thesis studies the determination of protein and ascorbic acid by polarographic adsorptive complex wave. the thesis is divided into four chapters. chapter one summarizes some major quantitative analysis methods of proteins and ascorbic acid. furthermore, this chapter also summarizes the theory and researches of polarographic adsorptive complex wave on the dropping mercury electrode. in chapter two, the determination of serum albumin is studied by polarographic adsorptive complex wave. adding bsa/hsa into the pb(ii)-ascorbic acid solution causes the current decrease of the adsorptive peak of pb(ii)-ascorbic acid complex in h3bo3naoh solution(ph 9.2). the ip is proportional to the protein concentration from 2 g/ml to 38 g/ml for bsa and from 2 g/ml to 35 g/ml for hsa. the detection limit is 1 g/ml both for bsa and for hsa. the method was used for determination of total proteins in human serum sample. the result is satisfactory. in chapter three, ascorbic acid is determined based on polarographic adsorptive wave of lead(ii)-ascorbic acid complex. there is a sensitive polarographic wave at 0.50 v (vs.sce) in ethanolamine-hydrochloric acid buffer solution when lead(ii) and ascorbic acid coexisted. the peak height is linearly proportional to the concentration of ascorbic acid over a range of 8.010-7 1.210-5 mol/l. the detection limit is 4.010-7 mol/l. this method was applied to the determination of ascorbic acid in 中南民族大学硕士学位论文 iii vitamine c tablet. chapter four discusses the behaviour and mechanism of the polarographic wave of lead(ii)-dehydroisoascorbic acid complex. key words: single sweep polarography; polarographic adsorptive complex wave; pb(ii)-ascorbic acid complex; bovine serum albumin; human serum albumin; ascorbic acid; dehydroisoascorbic acid 中南民族大学中南民族大学 学位论文原创性声明学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取 得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其 他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。 对本文的研究做出重要贡献的个 人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果 由本人承担。 作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 允许论文被查 阅和借阅。 本人授权中南民族大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入 有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本 学位论文。 本学位论文属于 1、保密，在_年解密后适用本授权书。 2、不保密。 （请在以上相应方框内打“” ） 作者签名： 日期： 年 月 日 导师签名： 日期： 年 月 日 中南民族大学硕士学位论文 - 1 - 第1章 绪论 第1章 绪论 蛋白质的定量在生命科学、临床医学、工业生产、生化研究、日常生活等方 面都有重要意义，人血清蛋白质的测定研究更是临床中诸如恶性肿瘤、糖尿病、 肾功能衰退、肝硬化、结核病、休克、烧伤、外科手术等许多疾病诊断所不可缺 少的内容，因此开展其分析测定方法及其临床应用方面的研究，有着现实与发展 意义。抗坏血酸是维持人体健康必需的维生素。在体内生物合成及物质代谢中发 挥重要作用。但人体不能自身合成，主要以食物中获取。抗坏血酸的缺乏可导致 坏血病和免疫力低下等多种疾病， 其含量高低常作为某些疾病诊断及营养分析的 重要指标，因此抗坏血酸的定量分析在食品、医药等领域相当重要。本论文利用 单扫描极谱上的络合吸附波测定蛋白质和抗坏血酸。 现就蛋白质和抗坏血酸的定 量分析方法及络合吸附波的理论知识作一综述。 1.1 蛋白质定量分析方法概述1.1 蛋白质定量分析方法概述 近年来，蛋白质的定量分析技术发展迅速，不断有新方法报道。可分为: 浊 度法、分光光度法、荧光法、光散射技术、高效液相色谱法、毛细管电泳分析法、 电化学方法等。 1.1.1 浊度法 1.1.1 浊度法 磺基水杨酸和三氯化铁是常用的蛋白质沉淀剂， 利用沉淀剂与蛋白质相互作 用产生的浊度与标准溶液浊度相比，就可以定量检测未知蛋白质浓度。该法操作 简单、快速，为临床常规检查所用。但由于操作过程没有标准化，因此结果的准 确度和精密度较差。 1.1.2 分光光度法 1.1.2 分光光度法 以分子吸收光谱为基础的分光光度法因其具有设备简单， 准确精密等特点而 被广泛应用于生物化学和临床化学中蛋白质的测定。 测定蛋白质含量常用的分光 光度法包括经典的双缩脲法1、lowry2、4-喹啉甲酸法3、染料结合法、金属离 蛋白质及抗坏血酸的络合吸附波法测定 - 2 - 子染料结合法等。 染料结合法是用于蛋白质的检测最为广泛的分析方法之一， 现己应用于临床 医学及生命科学的研究中。该方法的基础是在溶液ph小于蛋白质的等电点时， 蛋白质键亚胺和n端氨基质子化成阳离子，若有阴离子染料存在时，蛋白质便与 染料结合成沉淀或改变结合染料的光吸收特性， 借助染料颜色的减退或变化的程 度来测定蛋白质的含量。从50年代开始，染料结合法测定蛋白质引起了人们的兴 趣。最早用于测定蛋白质的染料是甲基橙4，随后又发展到其它偶氮类试剂、三 苯甲烷类试剂以及卟啉类试剂。已报道的偶氮类染料除了甲基橙之外，还有氨基 黑10b5、锌试剂6、氯磺酚k7等。近年来张华山等人8研究了十几种变色酸偶 氮染料与蛋白质的作用及所引起的光谱性能变化，详细探讨了实验条件、染料结 构对其互相作用的影响。童沈阳等人9也研究了一系列有机染料与蛋白质的相互 作用如埃铬蓝se、酸性铬蓝k等，并取得了较好的成果。溴甲酚绿(bcg)10,11是 染料结合法中使用最早也最为广泛的三苯甲烷类染料， 是比较有代表性的一个试 剂。1976年，bradford12提出了考马斯亮蓝g-250 (cbb)法。随后溴甲酚紫10、 埃铬青r13、铬天青s14、罗丹明6g15等已见于报道。卟啉类染料， -四(对磺苯基)卟啉(tpps4)和，-四(对羧苯基)卟啉(tccp)可用 作蛋白质的吸光探针。其中tpps4是一个较考马斯亮蓝更为理想的染料探针。除 上述染料探针外，己见报道的其它试剂还有四碘荧光素16、酸性品红17、刚果 红18、水溶苯胺蓝19和固绿fcf20等。 金属离子和有机染料易于形成配合物体系， 这些体系在合适的条件下能和蛋 白质分子相结合形成新配合物大分子，从而改变了原体系的光谱特点，进而可用 于蛋白质的定量检测。1984年，fujita等发现利用邻苯二酚紫-mo(vi)体系在680 nm处可测定030 g/ml的蛋白质，加入表面活性剂聚乙烯醇用于临床尿样中总 蛋白的测定。此后，陆续报道了一系列此类体系，例如：铬天青s-fe(iii)21、二 溴羟基苯基荧光酮-mo(vi)22、 zn(ii)-锌试剂23、偶氮胂iii-镱(iii) 24、茜素红 s(ars) -al(iii)25等。 1.1.3 荧光法 1.1.3 荧光法 以荧光法测定蛋白质通常比光度法灵敏。 由于大多数蛋白质在280 nm紫外区 有强烈的光吸收而导致荧光。当其和某些具有荧光特性的染料结合后，能引起荧 中南民族大学硕士学位论文 - 3 - 光强度的增强或淬灭，并且在一定浓度范围内与蛋白质浓度成正比，因此可用于 蛋白质的测定。 现已报道的有曙红y26、 茜素红s 27、 靛蓝胭脂红28、 吖啶红29、 灿烂甲酚蓝二聚体30等。用于蛋白质的测定均有较好的结果，灵敏度较高，但仅 适用于具有荧光的体系，使应用范围受到了限制。 1.1.4 光散射技术 1.1.4 光散射技术 光散射是指一束光通过介质时， 在入射光方向以外的各方向观察到的一种光 辐射现象。光散射探针技术用于蛋白质定量分析具有很高的灵敏度31,32，一般可 比吸光光度法高数十倍到上百倍。 光散射探针分析的基础是试剂分子或络合物与 蛋白质结合， 导致体系的光散射信号明显增强。 有机染料是最常用的光散射探针， 此类探针除了文献31, 32引用的之外,还有偶氮磺33、 偶氮胂羧34、 栎皮黄素35、 桑色素36、 四磺基锰酞菁37、三溴偶氮胂38以及芦丁-cpb络合体系39等. 1.1.5 高效液相色谱法 1.1.5 高效液相色谱法 用高效液相色谱(high performance liquid chromatographic, hplc)法来分析 蛋白质是一种近年来发展较快的新型分析方法。 bietz在19831984年就第一次对 用反相(rp)和尺寸排阻(se)高效液相色谱法来分离小麦蛋白质和玉米蛋白质的 实验进行报导,由于高效液相色谱柱的改进和hplc技术的迅速发展, hplc法在 蛋白质分析研究中越趋成熟。hplc分析蛋白质不仅简便快捷，而且选择性好， 分离效率高，检测灵敏度高。hplc的分离模式与检测方法多种多样，可以根据 样品的构成与性质来选择合适的色谱条件(色谱柱、洗脱液、检测器等)。根据分 离机理，蛋白质的hplc可以分成尺寸排阻色谱(sec)、反相高效液相色谱(rp- hplc)和凝胶渗透色谱(gpc)三大类。其中，sec和rp- hplc两种色谱分离模 式构成了蛋白质分析的主流40。 1.1.6 毛细管电泳法 1.1.6 毛细管电泳法 毛细管电泳(capillary electrophoresis, ce)法是近十几年来发展起来的一种分 离分析技术，兼有普通电泳和色谱的双重优点，以其高效、快速、运行成本低、 信息量大和易于自动化等特点倍受生物化学和临床药物等领域的专业人士的青 睐，被认为是上世纪九十年代最重要的分离分析手段之一。最近几年人们开始把 蛋白质及抗坏血酸的络合吸附波法测定 - 4 - ce应用于包括蛋白质在内的各种临床指标的检测，它很有可能成为未来临床实 验室的一种不可缺少的分析技术。在多种不同的毛细管电泳(ce)中，毛细管区 带电泳(cze)， 亲和毛细管电泳(ace)和毛细管等电聚集(cief)常用于蛋白质的 定量测定41。如张宁等人42研究了一种用于临床检测血清蛋白的毛细管区带电 泳方法，可分辨正常人和病患者血清类别与含量差别。 1.1.7 电化学分析法 1.1.7 电化学分析法 电化学分析法具有较高的灵敏度和选择性， 近年来在生命科学领域得到广泛 应用，已成为生命科学研究中基础的手段之一。电化学分析法能够作为其它方法 的有益补充，同时能够获得其它方法得不到的信息。 1971年kuwana43首次在染料修饰的石墨电极上得到血红蛋白的电催化反 应，为研究蛋白质大分子在电极表面的电子传递反应作了开创性工作，也提供了 有效的研究途径。林琳等44对血红蛋白（hb）在四甲基氯化铵促进下于裸银电 极上的直接电化学行为进行研究。焦奎等45发现一种邻氨基酚（oap）-过氧化 氢-辣根过氧化物酶（hrp）伏安酶联免疫分析法测定人血清甲胎蛋白的方法。 李南强等46研究了9， 10-蒽醌与血红蛋白作用可形成一种具有电活性的超分子化 合物，并制备了化学修饰玻碳电极，可用于血红蛋白的检测。huangxian ju等47 用中孔全硅分子筛(hms)修饰玻碳电极研究了血红蛋白的直接电化学行为。 蛋白质的极谱研究主要基于以下几个方面：一类是蛋白质自身的氧化、还原 波。这类极谱波主要产生于分子内的双硫键或巯基。cecil等48对胰岛素等多种 含双硫键的蛋白质的极谱还原波进行了研究；stankovich等49对胱氨酸，胰岛素 和牛血清白蛋白等物质中双键还原的机理作了进一步的探讨； 过玮等50报道了在 kio3存在下蛋白质的新型极谱催化波， 对人血清白蛋白和溶菌酶的极谱行为进行 了研究和应用；hertl等51用差分脉冲极谱法、flores等52用吸附溶出伏安法直接 测定人血清白蛋白；胡绪英等53通过调节人血清或牛清白蛋白在ph = 10并在4 左右放置30 h，诱导出重复性良好的极谱峰来进行蛋白质的极谱测定；此外， brabec等54报道了牛血清白蛋白、 溶菌酶和牛胰核糖核酸酶在石墨电极上的氧化 行为；张正奇等55研究了bsa在b-r缓冲溶液中当有kcl存在时的极谱特性。罗 登柏等56用单扫描极谱法测定了含sh 和ss的蛋白质。 中南民族大学硕士学位论文 - 5 - 另一类是蛋白质的催化氢波，又分为两大类：其一为蛋白质自身的“钠前催 化氢波” ，其二为金属离子存在时蛋白质的催化氢波。heyrovsky 等57证明在 氨缓冲溶液中，蛋白质产生钠前催化氢波；自从 brdicka58观察到在加入 co 盐 的氨性底液中的催化氢波后，在该底液中微量蛋白质或半胱氨酸、胱氨酸所呈现 的催化双峰一直是人们研究的对象。palecek 等人59用脉冲极谱法在该体系中检 测出 0.05 g/ml 的牛血清白蛋白；而 kolthoff 等人60在 brdicka 溶液中，用悬汞 电极电解沉积活性钴，随既阳极化和阴极化扫描产生一催化电流，利用该催化电 流可检测低至 10 -12 mol/l 的牛血清白蛋白；此外，brdicka 等人61通过比较正常 和变性蛋白质催化氢双波的区别，用于临床诊断分析，具有很大的实际意义。近 期，palecek 等62用计时电位溶出技术研究蛋白质的“钠氢波”获得了很大的成 功。 近年来，蛋白质与有机试剂、金属离子相互作用的极谱研究报道颇多。蛋白 质与有机试剂结合引起有机试剂峰峰电流降低或升高， 其降低或升高值可用于蛋 白质含量的测定。焦奎等用线扫伏安法研究了茜素红 s63、酸性铬蓝 k64、溴甲 酚紫65、茜素黄 r66 、溴甲酚绿67等有机染料与蛋白质的相互作用；罗登柏等 研究了血清蛋白-荧光素68、刚果红-血清白蛋白复合物69等的单扫极谱波。对于 金属离子-蛋白质（或蛋白质衍生物）配合物的极谱行为，罗登柏等作了大量的 研究70-74。 其中， 在盐酸胍存在下 co(ii)与蛋白质相互作用产生一灵敏的吸附波， 可检测到 0.005 mg/l 的血清白蛋白。 1.2 抗坏血酸定量分析方法概述1.2 抗坏血酸定量分析方法概述 目前测定抗坏血酸的方法很多， 包括药典中的标准方法-碘量法75、 比色法 76、紫外分光光度法77和高效液相色谱法78等，这些方法一般要求的实验条件 和操作技术较高，而且步骤繁琐，不利于快速分析；而电化学分析方法具有分析 速度快，操作简便易行，成本低及试剂用量少，检测灵敏度高等优点，是抗坏血 酸含量测定的不可缺少的有力手段。 本文对各种电化学分析方法在抗坏血酸含量 测定中的研究及应用进行了综述。 1.2.1 伏安法 1.2.1 伏安法 蛋白质及抗坏血酸的络合吸附波法测定 - 6 - 化学修饰电极是当前电化学、电分析化学方面十分活跃的研究领域。(1)化 学修饰电极是将具有优良化学性质的超分子，有机物，无机物，聚合物及生物物 质等设计固定在电极表面，使电极具有某种特定的电化学性质。(2)化学修饰电 极用于定量分析是一种把分离、富集、测定三者合并为一的理想体系，在提高选 择性和灵敏度方面具有独特优势。(3)尤其将电极表面的化学修饰与酶生物反应 相结合， 以 “全化学” 方法制作酶电极， 为生物传感器的研制开辟了一个新方向。 利用不同的化学修饰电极的伏安分析法已经被用来测定药物、果蔬、食品中抗坏 血酸的含量。表1.1列举了一些测定抗坏血酸的化学修饰电极伏安分析法。 表 1.1 某些测定抗坏血酸的化学修饰电极伏安分析法 表 1.1 某些测定抗坏血酸的化学修饰电极伏安分析法 电 极 底 液 线性范围 参考 及其性质 （mol/l） 文献 四氰基醌二甲烷（tcnq）修饰 pbs (ph 6.5) 1.410-37.910-2 79 碳糊电极 3,4-dihydroxybenzaldehyde modified pbs (ph 7.4) 7.010-71.010-3 80 glassy carbon electrode poly(glutamic acid) chemically pbs (ph 5.0) 1.210-72.510-4 81 modified electrode 硫堇衍生化自组装膜修饰金电极 pbs (ph 7.7) 1.010-64.010-3 82 掺磷钼杂多酸聚吡咯修饰铂微电极 b-r (ph 2.5) 5.010-71.010-4 83 poly(neutral red) modified glassy hac-naac (ph 4.6) 2.510-51.010-1 84 carbon electrode 聚吡咯碳糊电极 0.1 mol/l kno3 1.010-119.010-9 85 二茂铁修饰青椒籽碳糊电极 pbs (ph 6.9) 7.210-57.210-3 86 polypyrrole/4-hydroxy-6-methyl-2- mercaptopyrimidine comodified 0.1 mol/l nacl 5.010-61.010-3 87 gold electrode (ph 3.0) screen-printing ruthenium dioxide pbs (ph 7.4) 0410-4 88 electrode *注：b-r指britton-robinson缓冲溶液，pbs指磷酸盐缓冲溶液 中南民族大学硕士学位论文 - 7 - 续表1.1 续表1.1 电 极 底 液 线性范围 参考 及其性质 （mol/l） 文献 ru(iii) diphenyldithiocarbamate- 0.1 mol/l kno3 modified carbon paste electrode (ph 3) 1.410-67.110-4 89 lanthanum dichlorophenolindophenol chemically modified screen pbs (ph 7.25) 1.010-51.010-3 90 printed electrodes w2o18/npa 修饰电极 na2so4 (ph 3) 1.010-51.010-2 91 ferricyanide-doped tosflex- pbs (ph 5.0) 05.010-5 92 modified electrode iron(ii) phthalocyanine-modified pbs (ph 6.0) 1.010-61.010-2 93 carbon paste electrode 吡啶-dawson 型磷钼杂多酸超分子 0.3 mol/l h2so4 3.510-55.010-3 94 薄膜修饰电极 carbon paste electrode spiked with pbs (ph 5.0) 3.510-54.910-4 95 ferrocene carboxylic acid prussian blue film-modified electrode 1.0 mol/l kcl 5.010-61.010-3 96 (ph 3.7) 2-氨基吡啶修饰电极 b-r (ph 5.7) 4.010-61.010-3 97 巯基钴卟啉自组装膜修饰金电极 pbs (ph 6.4) 7.810-51.010-2 98 -cyclodextrin incorporated carbon pbs (ph 7.4) 2.510-61.010-3 99 nanotubes-coated electrode 聚中性红膜修饰电极 0.8 mol/l hcl 1.010-52.510-2 100 壳聚糖修饰玻碳电极 pbs (ph 6.0) 3.010-65.010-3 101 4-巯基吡啶自组装修饰金电极 hcl-邻苯二甲酸氢钾 4.010-61.010-3 102 (ph 7.0) sol-gel composite electrode 0.1 mol/l kno3 (ph 7.4) 1.610-55.010-3 103 *注：b-r指britton-robinson缓冲溶液，pbs指磷酸盐缓冲溶液 蛋白质及抗坏血酸的络合吸附波法测定 - 8 - 续表1.1 续表1.1 电 极 底 液 线性范围 参考 及其性质 （mol/l） 文献 methylene blue modified carbon 0.5 mol/l kcl 2.010-58.010-4 104 paste electrode (ph 6.0) poly(phenosafranine) modified pbs (ph 7.1) 5.010-51.010-3 105 electrode 碳纳米管修饰电极 pbs (ph 7.4) 8.010-53.710-3 106 聚甲苯胺蓝膜修饰的玻碳电极 pbs (ph 6.6) 2.010-71.210-3 107 聚烯丙胺基二茂铁化学修饰电极 pbs (ph 2.5) 06.510-4 108 polypyrrole/ferrocyanide films modified pbs (ph 7.0) 4.510-49.610-3 109 carbon paste electrode co(ii) -4-methylsalophen modified hac-naac (ph 5.0) 1.010-61.010-4 110 carbon-paste electrode ferrocene-l-cysteine self-assembled b-r (ph 5.8) 1.010-65.010-4 111 supramolecular film modified electrode novel choline and acetylcholine modified pbs (ph 4.0) 7.010-69.010-5 112 glassy carbon electrodes 二茂铁修饰碳黑微电极 pbs (ph 4.5) 6.010-61.010-3 113 l-半胱氨酸自组装膜修饰金电极 hac-naac (ph 5.0) 4.010-61.010-3 114 highly oxidized electrodes pbs (ph 7.0) 5.010-47.010-3 115 tetrabromo-p-benzoquinone modified carbon paste electrode pbs (ph 7.0) 直接测样 116 *注：b-r指britton-robinson缓冲溶液，pbs指磷酸盐缓冲溶液 1.2.2 库仑滴定法 1.2.2 库仑滴定法 库仑滴定法是电化学分析法的一个重要分支，具有较高的灵敏度、精密度和 准确性，适用于微量甚至痕量物质的准确测定。用库仑滴定法测定抗坏血酸含量 可以达到药典测其含量的相同精度，可以省去标定碘溶液等繁琐的操作过程。沈 中南民族大学硕士学位论文 - 9 - 友昌等117用恒电流库仑滴定法，用强度一定的电流通过电解池，由电极反应使 电解液碘化钾产生滴定剂i2，与被测抗坏血酸发生定量反应。王玉贤等118以0.5 mol/l kbr - l mol/l kno3 - l mol/l hac (1:1:1)混合溶液在阳极发生br2与抗坏血 酸分子中的c=c不饱和双键发生加成反应来测定样品中抗坏血酸含量。 antonio campiglio119用硫酸铜对抗坏血酸进行恒压微量库仑滴定，缓冲溶液含 10 mmol /l cu2+，在scn-存在下，在氮气中滴定，终点指示由一个cu2+选择电极 和单向参比电极来完成的，用于药物中抗坏血酸的测定。此外，mihaeia cheregi 等120在酸性介质中，以抗坏血酸氧化成脱氢抗坏血酸为基础，用碘-碘化物作为 可逆电对，在氧化还原反应中，碘的消耗量由双电流测定法测定，该法具有较好 的选择性和较快的测定速度。宋俊峰121首次将流动注射双安培法用于抗坏血酸 的测定。 目前文献中用库仑滴定法测抗坏血酸含量的报道数量不多而且样品测定 范围不广。 1.2.3 极谱法 1.2.3 极谱法 极谱法创建于 1922 年，至今除经典的普通极谱法外，已形成了一系列的近 代极谱方法和技术，成为一种常用的分析方法和研究手段。用极谱法对抗坏血酸 的含量的测定已有报道。 ruitz 等122用极谱法详细研究了抗坏血酸的氧化还原特 性。 ratzkowski123用快速交流极谱分辨出的不同氧化峰， 实现了水果中 l 型及 d 型抗坏血酸的分别测定。王长法等124用示波极谱法研究了硅钼杂多酸与抗坏血 酸反应，发现其配合物可在+ 1.12 v (vs. sce )产生一灵敏的吸附氧化峰，检测下 限为 510-8 mol/l，本法用于针剂，片剂，及柑橘中抗坏血酸的测定，得到满意 结果。韩树波等125将工作电极直接插入大蒜瓣中，采用半微分伏安法研究测定 了抗坏血酸。孙卢东等126利用 cu2+与抗坏血酸的氧化还原反应，建立了一种间 接测定抗坏血酸的方波极谱法：在 nh3 -nh4cl 缓冲溶液中，cu2+在 0.24 v (vs. sce)处出现一个可逆的还原峰，加入抗坏血酸后 cu2+被还原，其还原峰高下降， 根据 cu2+还原峰的峰高降低量与抗坏血酸加入量之间定量关系， 间接测定了抗坏 血酸的含量。丁建文等127用间接示波极谱法测定抗坏血酸含量，利用 a, a - 联 吡啶与 fe3+在乙酸盐缓冲溶液中有一良好的络合吸附峰，当有抗坏血酸存在时 fe3+被还原为 fe2+， 吸附峰降低且产物显红色， 根据此反应间接测定了抗坏血酸， 本法最低检测限为 l g/ml。 蛋白质及抗坏血酸的络合吸附波法测定 - 10 - 1.3 络合吸附波简介 1.3 络合吸附波简介 络合吸附波是在我国发展较快，具有我国特色的极谱分析方法。关于络合吸 附波的研究，国外的电分析化学工作者作了不少的工作，但多偏重于机理的探讨 和理论方面的研究， 实际应用较少。 我国的极谱络合吸附波研究始于60年代初期， 70年代后我国电分析化学工作者做了大量的工作，提出了许多灵敏的体系。这些 体系在地质、矿山、冶金、环境保护、生物化学、食品、医药等方面的分析测试 工作中得到了广泛的应用， 而且随着科学技术的发展， 应用范围还在不断的扩大。 对此，高晓霞128、孟凡昌129、张志龙 130、kalvoda r. 131、汪尔康132、张月 霞133、莫金垣134、李启隆135、刘道杰136等均先后发表过专著或评述。 络合吸附波是某些金属络合物吸附于电极表面而产生的灵敏度较高的极谱 波。它不同于一般的络合物波和单纯的吸附波，一般具有三性137： (1)络合性，即金属离子在溶液中或电极表面上与具有吸附性的配位体形成 较稳定的电活性络合物。 (2)吸附性，即形成的络合物能吸附在电极表面，起富集作用。 (3)电活性，即吸附在电极表面上的络合物中的金属离子或配位体能在电极 上还原或氧化，产生灵敏的极谱电流。 当有吸附发生时，电极过程可表示为129： (1.1) 或 (1.2) 式(1.1)为氧化态发生吸附时的电极过程，式(1.2)为还原态发生吸附时的电极过 程。 李启隆曾将络合吸附波分为了四类138，它既可以应用于具有电活性的某些 物质的直接测定，也可用于间接测定某些非电活性质。 近年来，用单扫描极谱法测有机物、药物和生命物质的报道日趋增多，如果 能使用络合吸附波的原理，引入无机离子与上述被测定的有机物形成络合物，从 而提高选择性和灵敏度，改善测量指标，是一项有意义的工作129。 1.4 本论文研究的主要内容 1.4 本论文研究的主要内容 中南民族大学硕士学位论文 - 11 - 铅(ii)抗坏血酸络合吸附波已成功用于痕量铅的测定139。本论文在此基础 上，(1)利用铅(ii)抗坏血酸络合吸附波间接测定了血清白蛋白；(2)利用同一 体系反过来测定了配体抗坏血酸，并对其机理进行了探讨。 1.4.1 血清白蛋白的络合吸附波法测定 1.4.1 血清白蛋白的络合吸附波法测定 在 ph 9.2 的 h3bo3naoh 缓冲溶液中，血清白蛋白使铅(ii)抗坏血酸络 合物在 0.51 v (vs.sce)处的络合吸附波还原峰峰电流降低，电流降低值与加入 的牛血清白蛋白 （bsa） 或人血清白蛋白 （hsa） 浓度在一定范围内呈线性关系。 bsa 在 2 38 g/ml 范围内，hsa 在 2 35 g/ml 范围内呈线性关系，检出限 均为 1 g/ml。应用该法测定了人血清样品中蛋白质的含量，结果令人满意。 1.4.2 抗坏血酸的络合吸附波法测定 1.4.2 抗坏血酸的络合吸附波法测定 抗坏血酸在 ph 8.8 的 pb2+、 乙醇胺hcl 混合溶液中于 0.50 v(vs.sce)处有 一极谱波，该波波高与抗坏血酸浓度在 8.010-7 1.210-5 mol/l 范围呈线性关 系，检出限为 4.010-7 mol/l。应用该法测定了 vc 片剂和维 c 银翘片中抗坏血 酸的含量。 1.4.3 铅 1.4.3 铅(ii) 抗坏血酸络合吸附波机理初探 抗坏血酸络合吸附波机理初探 初步探讨了抗坏血酸在 ph 8.8 的 pb2+、乙醇胺hcl 混合溶液中极谱波的性 质，发现该波是氧化型抗坏血酸与 pb2+作用形成的极谱波。 蛋白质及抗坏血酸的络合吸附波法测定 - 12 - 第 2 章 血清白蛋白的铅 第 2 章 血清白蛋白的铅(ii)抗坏血酸 络合吸附波法测定 抗坏血酸 络合吸附波法测定 2.1 引言 2.1 引言 蛋白质含量的测定是许多部门的常规分析项目。分光光度法在蛋白质的分析 测定中得到了广泛的应用，较重要的是一些基于蛋白质染色反应的方法。单扫描 极谱法也常用来研究有机试剂与蛋白质的相互作用， 蛋白质与有机试剂结合引起 有机试剂峰峰电流降低或升高63, 68，其降低或升高值可用于蛋白质含量的测定。 近期，palecek 等62用计时电位溶出技术研究蛋白质的“钠氢波”获得了很大的 成功。本文利用单扫描极谱上的络合吸附波间接测定蛋白质。在 h3bo3naoh 缓冲溶液中，bsa/hsa 使铅（ii）抗坏血酸络合物在 0.51 v (vs.sce)处的络 合吸附波139还原峰电流降低，电流降低值与加入的 bsa/hsa 浓度在一定范围 内呈线性关系。机理研究表明，当向铅（ii）抗坏血酸络合吸附波体系加入一 定量 bsa/hsa 时，bsa/hsa 定量地夺取了络合物中的铅（ii）离子，生成一种 在汞电极上吸附性较弱的 pb (ii)bsa/hsa 络合物，相当于从溶液中定量地移 走了铅（ii）离子。该法用于蛋白质含量测定简便快速。 2.2 实验部分 2.2 实验部分 2.2.1 仪器和试剂 2.2.1 仪器和试剂 jp303、jp2 型极谱分析仪（成都仪器厂） ，三电极系统：滴汞电极为工 作电极，饱和甘汞电极（sce）为参比电极，铂丝电极为对电极。 pb(no3)2溶液：1.510-5 mol/l；抗坏血酸溶液：1%；h3bo3溶液：0.5 mol/l； naoh 溶液： 0.5 mol/l； bsa （sigma 公司） ， hsa （b.m.公司） ， 均配成 1 mg/ml、 100 g/ml 水溶液，4冰箱保存；所用试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏 水。 中南民族大学硕士学位论文 - 13 - 2.2.2 实验方法 2.2.2 实验方法 在 10 ml 小烧杯中，加入 2.0 ml h3bo3溶液，1.0 ml naoh 溶液，0.8 ml 抗坏血酸溶液，1.0 ml pb(no3)2溶液和一定量 bsa 或 hsa 溶液，用水稀释至 10 ml。 以未加bsa或hsa的溶液作空白， 起始电位 0.20 v (vs.sce)， 测定 0.51 v 处单扫导数波高，计算hp。 2.3 结果与讨论 2.3 结果与讨论 2.3.1 单扫极谱波 2.3.1 单扫极谱波 在 ph 9.2 的 h3bo3naoh 缓冲溶液中， 铅 （ii） 抗坏血酸络合物于 0.51 v (vs.sce)产生一灵敏的络合吸附波139（图 2.1 曲线 1） 。当溶液中加入 bsa 后， 络合吸附还原波高明显降低（图 2.1 曲线 2） ，波高降低值与所加入的 bsa 的量 在一定范围内呈线性关系，可用于 bsa 的测定。 图 2.1 单扫极谱波 图 2.1 单扫极谱波 fig.2.1 derivative single sweep polarograms 1. 0.05 mol/l h3bo3naoh (ph 9.2) + 0.08%ascorbic acid + 1.510-6 mol/l pb(no3)2 2. 1 + 10 g/ml bsa 蛋白质及抗坏血酸的络合吸附波法测定 - 14 - 2.3.2 底液条件的选择 2.3.2 底液条件的选择 考察了乙醇胺hcl、h3bo3naoh、nh3nh4cl、trishcl、氨基乙酸 naoh 等缓冲溶液，结果表明在 h3bo3naoh 缓冲溶液中hp值最大，本文 选用 h3bo3naoh 缓冲溶液；溶液 ph 在 9.1 10.2 范围内hp值最大，本文 选用 ph 值为 9.2； 缓冲溶液用量在 0.07 mol/l 0.15 mol/l 范围内hp基本不变， 本文选用 0.1 mol/l；抗坏血酸用量在 0.01% 0.12%范围内，铅的浓度在 1.210-6 mol/l 2.510-6 mol/l 范围内hp基本稳定，本文选用抗坏血酸用量为 0.08%， 铅的浓度为 1.510-6 mol/l。 2.