（外科学专业论文）血管瘤中血管内皮生长因子受体kdr基因异常甲基化的研究.pdf

fi y l t l l l l l l l l t t l l 8 r l l l t 8 t l l l l l 9 t l t i l o l l l l l l 3 l l i l l l 2 l t l t l l 血管瘤中血管内皮生长因子受体k d r 基因异常甲基化的研究 摘要 目的：本研究拟通过建立甲基化敏感性高分辨率溶解曲线法( m s h r m ) 检测血管内皮生长因子v e g f 受体k d r 基因启动子区域在不同时 期血管瘤、血管畸形及正常皮肤组织等中的甲基化状态，初步探讨基 因甲基化在血管瘤形成、增生、退化过程中的作用。 方法：选取不同时期血管瘤石蜡标本4 8 例、血管畸形石蜡标本 1 5 例、正常包皮皮肤组织标本8 例，分别提取d n a ，经亚硫酸氢盐甲 基化修饰、纯化、回收d n a ，以q i a g e n 公司的全基因组甲基化d n a 作为1 0 0 甲基化标准品，与1 0 0 非甲基化健康孕妇脐带血d n a 按 比例混合，稀释制成0 、5 、2 5 、5 0 、7 5 、1 0 0 系列浓度甲基 化d n a 标准品，将甲基化标准品经过p c r 扩增后进行m s h r m 溶解 曲线检测获得标准曲线，并进行重复性和灵敏度评价。然后用甲基化 敏感性高分辨率溶解曲线法( m s h r m ) 定量检测增生期血管瘤2 4 例、 消退期血管瘤2 4 例，血管畸形1 5 例，正常包皮皮肤组织8 例等标本 中血管内皮生长因子受体k d r 甲基化水平。 结果：成功制成的1 0 0 、7 5 、5 0 、2 5 、5 、o 甲基化标准曲 线依次从右往左排列，经过三次重复检测，曲线基本重叠一致；经 过m s h r m 检测，4 8 例血管瘤标本共检出3 2 例不同程度k d r 基因 启动子区域甲基化( 6 6 6 7 ) ，其中2 4 例增殖期血管瘤标本中检出 2 1 例( 2 1 2 4 ，8 7 5 0 ) 不同程度甲基化，1 例甲基化程度为0 5 ，1 1 例甲基化为2 5 5 0 ，5 例甲基化为7 5 ，4 例甲基化为 1 0 0 ；2 4 例消退期血管瘤标本中检出1 1 例( 1 1 2 4 ，4 5 8 3 ) 不同 程度甲基化，其中，1 例甲基化程度为7 5 ，8 例甲基化为2 5 5 0 ， 2 例甲基化为o 5 ，增殖期血管瘤与消退期血管瘤标本中k d r 的 甲基化程度比较差异显著，具有统计学意义( x 2 = 9 3 7 5 ，p o 0 5 ) ； 1 5 例血管畸形标本中仅检出甲基化程度为0 , - - - , 2 5 2 例( 2 1 5 ，1 3 3 3 ) ，8 例正常包皮皮肤组织中检测到1 例甲基化o 5 ( ! 8 ， 1 2 5 0 ) 。与血管瘤相比，差异均具有统计学意义( p o 0 5 ，f i s h e r 确切概率法) ；消退期血管瘤与血管畸形中k d r 的甲基化程度比较有 显著差异，具有统计学意义( p = 0 4 5 ，f i s h e r 确切概率法) 。 结论：血管瘤中血管内皮生长因子受体k d r 基因启动子序列c p g 岛存在异常甲基化，血管内皮生长因子受体k d r 基因异常甲基化可能 与血管瘤增生、退化等有关；m s h r m 技术定量检测血管瘤中k d r 甲基化程度的方法操作简单，灵敏度高，成本低，可重复性强，为 进一步研究血管瘤组织中基因异常甲基化建立了一种检测方法。 关键词：血管瘤；血管内皮生长因子受体；甲基化；甲基化敏感 性高分辨率溶解曲线法 注：本课题为四川省卫生厅资助项目：项目号：0 9 0 2 1 2 t h ea b n o r m a lm e t h y l a t i o no fv a s c u l a re n d o t h e l i a lc e l l g r o w t hf a c t o rr e c e p t o r - 2 ( k d r ) g e n ei ni n f a n c y h e m a n g i o m a a b s t r a c t o b j e c t i v e ：t o i n v e s t i g a t e t h e m e t h y l a t i o n s t a m so fv a s c u l a r e n d o t h e l i a lg r o w t hf a c t o rr e c e p t o r ( v e g f r , k d r ) g e n ei nh e m a n g i o m a ， v a s c u l a rm a l f o r m a t i o na n dn o r m a ls k i nt i s s u e s b ye s t a b l i s h i n g m e t h y l a t i o ns e n s i t i v i t yh i g hr e s o l u t i o nd i s s o l v ec u r v em e t h o d ( m s _ _ - h r m ) t h er o l eo fg e n e t i cm e t h y l a t i o ni np r o l i f e r a t i n ga n dr e g r e s s i n g h e m a n g i o m a sa l s ow i l lb ed i s c u s s e d m e t h o d s ：4 8d i f f e r e n tp e r i o dh e m a n g i o m as a m p l e s ，15v a s c u l a r a b n o r m a l i t ys a m p l e s ，a n d8n o r m a ls k i nt i s s u es a m p l e sw e r et e s t e d r e s p e c t i v e l y t h ed n ao fs a m p l e sw e r ee x t r a c t e d ，m o d i f i c a t e dw i t h s u l p h i t em e t h y l a t i o n t h e n ，t h ed n ao fs a m p l e sw a sp u r i f i c a t e da n d r e c y c l e d a n d p r e p a r e d f o rt e s t g e n o m e w i d e m e t h y l a t i o n d n a ( q i a g e nc o m p a n y , u s a ) w a su s e da s 10 0 m e t h y l a t i o ns t a n d a r d s a m p l e i tw a sm i x e dw i t hlo o o fn o nm e t h y l a t e dd n ao fh e a l t h y p r e g n a n tw o m e n u m b i l i c a lc o r db l o o da n dd i l u t e dt oo ，5 ，2 5 ，5 0 ， 7 5 ，a n d10 0 m e t h y l a t i o nd n a s o l u t i o n s a f t e rp c rc y c l ea n dm s h r md i s s o l v ec u r v ed e t e c t i o n ，t h es t a n d a r dc u r v eo fm e t h y l a t i o nd n a w a sd r a w no u t a tt h es a m et i m e ，t h er e p e a t a b i l i t ya n ds e n s i t i v i t yo fi t w e r ee v a l u a t e d t h em e t h y l a t i o nl e v e l so fk d ri na l ls a m p l e sw e r et e s t e d b yt h em e t h y l a t i o ns e n s i t i v i t yh i g hr e s o l u t i o nd i s s o l v e c u r v em e t h o d ( m s h r m ) r e s u l t s ：10 0 ，7 5 ，5 0 ，2 5 ，5 ，o m e t h y l a t i o ns t a n d a r d c u r v e sw e r em a d es u c c e s s f u l l y , f r o mr i g h tt ol e f t a r r a n g e m e n t t h r e e r e p l i c a t e dd e t e c t i o n sw e r ed o n e k d rg e n em e t h y l a t i o nw e r ed e t e c t e d p o s i t i v e l y i n3 2 h e m a n g i o m as p e c i m e n s ( 6 6 6 7 ) ，i n c l u d i n g 21 3 p r o l i f e r a t eh e m a n g i o m a ss a m p l e s ( 21 2 4 ，8 7 5 0 ) a n d11i n v o l u t i n g h e m a n g i o m a s ( 11 2 4 ，4 5 8 3 ) i np r o l i f e r a t eh e m a n g i o m a s ，d i f f e r e n td e g r e e m e t h y l a t i o nw e r es h o w n 1c a s er a n g e df r o m0 t o5 ；11 c a s e sr a n g e d f r o m2 5 t o5 0 ；5c a s e sw e r e7 5 ；4c a s e sw e r e10 0 i ni n v o l u t i n g h e m a n g i o m a s ，t h em e t h y l a t i o nd e g r e e a l s ow a sd i f f e r e n t 1c a s ew a s 7 5 ；8 c a s e sr a n g e df r o m2 5 t o5 0 ；2c a s e sr a n g e df r o mo t o 5 t h e r ew a ss i g n i f i c a n td i f f e r e n c eb e t w e e np r o l i f e r a t eh e m a n g i o m a s a n d n v o l u t i n gh e m a n g i nk d rm e t h y l a t i o n ( zz=9375pand i n v o l u t i n gh e m a n g l o m a sm e t n y l a u o n ( x = ， 气 0 0 5 ) t h em e t h y l a t i o np o s i t i v e r a t eo fv a s c u l a rm a l f o r m a t i o ns a m p l e s w a s1 3 3 3 ( 2 15 ，r a n g e df r o mo t o2 5 ) t h em e t h y l a t i o np o s i t i v er a t e o fn o r m a lw r a p p i n gs k i nt i s s u e sw a s1 2 5 0 ( 1 8 ，r a n g e df r o mo t o 5 ) t h em e t h y l a t i o np o s i t i v er a t ei nh e m a n g i o m aw a ss i g n i f i c a n th i g h e r t h a nt h a ti nv a s c u l a rm a l f o r m a t i o no rn o r m a lw r a p p i n gs k i nt i s s u e ( p o 0 5 ) c o n c l u t i o n s ：a b n o r m a lm e t h y l a t i o no fk d re x p r e s s e d i n h e m a n g i o m aw h i c hm a yb ea s s o c i a t e d w i t hh e m a n g i o m af o r m a t i o n ， h y p e r p l a s i aa n dd e g r a d a t i o n ；m s - h r mi s am e t h o dt od e t e c tk d r m e t h y l a t i o ni nh e m a n g i o m a w i t hs i m p l eo p e r a t i o n ，h i g hs e n s i t i v i t y , l o w c o s t ，s t r o n gr e p e a t a b i l i t y , a n de s t a b l i s h e dad e t e c t i o nm e t h o df o rf u r t h e r r e s e a r c ht h ea b n o r m a lm e t h y l a t i o no fg e n ei nh e m a n g i o m a s k e yw o r d s ：h e m a n g i o m a s ；v a s c u l a r e n d o t h e l i a lg r o w t hf a c t o r r e c e p t o r ：m e t h y l a t i o n ；m e t h y l a t i o ns e n s i t i v i t yh i g hr e s o l u t i o nd i s s o l v e c u r v em e t h o d ( m s - h r m ) n o t e ：t h es u b j e c tf u n d e db ys i c h u a np r o v i n c i a lh e a l t hd e p a r t m e n t p r o j e c t ：p r o j e c tn o 0 9 0 2 12 4 i - 一 刖吾 血管瘤( h e m a n g i o m a s ，h a ) 是婴幼儿常见的血管良性肿瘤，发 病率约为1 - - - - 2 ，好发于颜面、四肢等部位【1 1 。19 8 2 年，m u l l i k e n 和g l o w a c k i 等2 1 根据血管内皮细胞生物学特性、病理组织学演变特 点和临床表现将“先天性血管病变( c o n g e n i t a lv a s c u l a rl e s i o n s ) 分为 血管瘤( h e m a n g i o m a s ) 和血管畸形( v a s c u l a rm a l f o r m a t i o n s ，v m ) 两类。根据血管瘤典型的病程变化，大致可分为三期3 】：增殖期 ( p r o l i f e r a t i n gp h a s e ) ，为o 1 岁阶段，该期病变生长迅速；消退期 ( i n v o l u t i n gp h a s e ) ，1 岁5 岁阶段，该期部分病变进入自然消退阶 段；消退完成期( i n v o l u t e dp h a s e ) ，5 1 2 岁阶段，病灶缓慢消退。 血管瘤增生与退化的发病机制仍不十分清楚。近年来，国内外学者 们从细胞、细胞因子、基因、蛋白酶及其抑制剂等多方面对血管瘤 ： 进行了深入的研究，表明血管瘤的增生、发展及消退与多种因素有 关。 现己知道有两条调节途径参与了血管生成过程：一条为血管内 皮细胞生长因子( v a s c u l a re n d o t h e l i a lg r o w t hf a c t o r ，v e g f ) 及其受 体k d r ( k i n a s ei n s e td o m a i nr e c e p t o r ) 调节途径，另一条为促血管 生成素a n g t i e 2 调节途径。v e g f 作用于血管形成早期，促进原始 血管网形成。a n g 一1 能激活t i e 2 对血管形成后期进行改建、塑形， 促进形成成熟及有空间结构的血管网，保持血管稳定；两条调节途径 在血管瘤增生退化中可能起协同作用。v e g f 是唯一直接作用于内 皮细胞的特异性有丝分裂原，是最重要的血管形成促进因子之一， 其生物学功能主要有【4 】：增加微血管通透性，引起血浆蛋白( 包括 纤维蛋白原) 的外渗，是目前已知最强的血管通透剂；促进内皮 细胞增殖和血管形成；抑制内皮细胞凋亡。目前至少发现v e g f 受体有3 种，即f l t l ( f m s - l i k et y r o s i n e k i n a s e - - l ，v e g f r 1 ) ，k d r f l k l ( k i n a s ei n s e td o m a i nr e c e p t o r f e t a ll i v e rk i n a s e - - 1 ，v e g f r - 2 ) ，f l t - - 4 ( f m s - - l i k et y r o s i n ek i n a s e - - 4 ，v e g f r - - 3 ) ，其中f 1 t l 和k d r 是两种对v e g f 有高度亲和力的酪氨酸受体，人的v e g f 只有通过与其特异性受体k d r 结合形成二聚体，经磷脂酰肌醇3 激 酶信号传导途径最终作用于与细胞增殖相关的基因，才能发挥生物 学功能，引发一系列生物学作用 5 1 。k d r 具有明显的化学趋化和促 分裂活性，增殖中的血管内皮细胞、胚胎和出生时的脑血管细胞有 丰富的k d r 表达，但成年后明显减少。v e g f 基因显性隐性研究表 明，k d r 与血管岛、血管形成和造血有关，提示k d r 是血管生成 的主要调控因子，k d r 的阻断将导致血管生成障碍。众多研究显示 v e g f 及其受体k d r 在增殖期血管瘤中高表达，在消退期血管瘤、 血管畸形及含血管的正常皮肤中低表达，说明了v e g f 及其受体 k d r 的改变与血管瘤的血管增生有着密切关系。 近年来，随着对肿瘤的深入研究，发现肿瘤的发生与d n a 异常甲 基化紧密相关，因而d n a 甲基化被认为是致癌物既往暴露和癌症发病 风险中新兴的、具有前景的标志物，已成为肿瘤发生机制的研究热点 之一。d n a 甲基化是表观遗传修饰现象重要组成部分之一，是可遗传 的、可逆性的、没有d n a 序列的改变或不能用d n a 序列变化来解释 的基因表达调节。d n a 甲基化可通过影响基因的转录和染色体的构型 来调控基因的功能。d n a 甲基化一般与基因沉默相关联，非甲基化一 般与基因的活化相关联，而去甲基化往往会与一个沉默基因的重新激 活相关联。血管瘤的发生与发展是细胞、细胞因子、基因、信号传导 途径等多种因素发生改变导致的结果。我们有理由怀疑血管瘤组织中 某些基因可能发生了甲基化变异而非d n a 序列改变，使得某些促血管 生成功能相关基因的部分功能失活，最终导致正常血管生成障碍，形 成血管瘤。因此，从d n a 异常甲基化的角度研究血管瘤对进一步探明 其增生与退化机制可能具有重要意义。 近年来，随着对甲基化研究的不断深入，各种各样的甲基化检测 方法被开发出来以满足各种类型研究的需要。目前主要的检测方法 有：a 甲基化敏感性限制性内切酶法；b 亚硫酸氢盐修饰法；c 芯 片技术等。其中亚硫酸氢盐法是目前运用最为广泛的方法，将d n a 分子中未甲基化的胞嘧啶c 转化为尿嘧啶u ，然后进行p c r 扩增，尿 嘧啶u 将与腺嘌呤a 配对产生胸腺嘧啶t ，而甲基化的胞嘧啶c 则不会 被亚硫酸氢盐修饰而保持不变，这样d n a 包含的甲基化信息就可转化 具有差异的d n a 序列。在此基础上目前发展了多种检测方法：包括如 甲基化特异。 生p c r 法( m e t h y r l a t i o ns p e c i f i cp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ， m s p ) 、d n a 甲基化荧光定量p c r 检测、亚硫酸氢盐处理结合酶解分 析法、甲基化敏感性高分辨率溶解曲线法等。 本研究采用甲基化敏感性高分辨率溶解曲线法( m e t h y l a t i o n s e n s i t i v eh i g hr e s o l u t i o nm e l t i n gc u r v ea n a l y s i s ，m s - - h r m ) 来检狈, u 4 8 例不同时期血管瘤及1 5 例血管畸形和8 例正常包皮皮肤组织d n a 中 v e g f 受体k d r 基因启动子区域c p g 岛的甲基化状态，通过对目前研 究较多的v e g f 及其受体k d r 这条血管生成途径的甲基化状况的检 测来进行血管瘤组织中基因异常甲基化的初步研究。查阅国内外相关 文献，尚未见报道。 材料与方法 1 实验材料与仪器 1 1 实验研究对象 选取泸州医学院附属医院病理科2 0 0 6 - - 2 0 1 0 年血管瘤等石蜡标 本4 8 例，其中男2 0 例，女2 8 例，手术年龄2 月1 0 岁，按m u l l i k e n 等 6 】标准进行复检及免疫组化测定细胞增殖核抗原( a n t i g e ni d e n t i f i e d b ym o n o c l o n a la n t i b o d y , k i 6 7 ) 的结果分类吲，其中增殖期血管瘤2 4 例，消退期血管瘤2 4 例，最小年龄2 月，最大1 0 岁，另取血管畸形 1 5 例，男性6 例，女性9 例，年龄最小2 岁，最大为1 3 岁，正常包 皮皮肤组织8 例作对照。 1 2 主要实验试剂及耗材 试剂名称生产厂家货号规格 小鼠抗人单克隆抗体 b i o w o r l d e1 4 5 40 1 m l k i 6 7 热启动酶q i a g e n2 0 3 6 0 32 5 0 唧p ( 1 0 m m ) t a k a r a2 5 0 u l 荧光染料e v a g r e e n b i o t i u ml m l 全基因组甲基化d n a q i a g e n 5 9 6 6 5l o o 全基因组非甲基化d n a 脐带血d n a ( 自己制备) 甲基化修饰试剂盒 q i a g e n 5 9 1 0 44 8 石蜡d n a 提取试剂盒q i a g e n 5 6 4 0 45 0 9 6 孔板 b i o p l a s t i c b 6 1 1 0 92 5 9 6 孔板封膜 b i o p l a s t i c 1 5 7 3 0 01 0 0 引物合成北京金唯智生物科技 1 3 主要实验仪器 仪器名称生产厂家型号 奥林巴斯生物显微镜日本b x 5 0 l i g h t c y c l e r 4 8 0 r o c h e l i g h t c y c l e r 4 8 0 二代 荧光定量仪 n a n o d r o p10 0 0 t h e r m o n a n o d r o p 10 0 0n d 一10 0 0 定量仪 e p p e n d o r f 离心机 e9 e n d o r f e p p e n d o r t5 4 1 5r 水平离心机 x i a n g y i l 5 3 0 2 实验方法 2 1d n a 提取 ( 1 ) 切取l o i _ t m 厚切片4 , - - 5 片，放入收集组织的离心管中，加入 l m l 二甲苯振荡混匀，以充分溶解组织周围石蜡，1 4 0 0 0 r p m 离 心2 m i n 吸去上清去除石蜡，如果石蜡过多，可以用二甲苯再 洗一次。 ( 2 ) 加入无水乙醇l m l ( 去除二甲苯) ，1 4 0 0 0 r p m 离心2 m i n 吸尽 上清后开盖直至残余乙醇全部挥发( 大约1 0 m i n ) 。 ( 3 ) 加入1 8 0 p l a t l 和2 0 1 x l 蛋白酶k ，震荡混匀。 ( 4 ) 5 6 l h ( 期间可以适当摇晃颠倒样品，使之混匀裂解充分) 。 ( 5 ) 9 0 l h ( 注意管盖，由于9 0 0 高温可能会导致开盖，以致液体 被蒸发；时间不要太长1 小时足够；一个水浴锅时，5 6 到9 0 之间应该将样本置于室温中) 。 ( 6 ) 短暂离心使液体聚于管底，加入2 0 0 p i a l ，震荡混匀，然后加 入2 0 0 p 1 无水乙醇，震荡混匀。 ( 7 ) 短暂离心使液体聚于管底，将整个液体全部移入收集柱中，然 中。 ( 8 ) 加入5 0 0 1 x l a w l 漂洗液，离心8 0 0 0 r p m ，lm i n ，丢弃收集管后 将收集柱至于新的收集管中；加入5 0 0 1 x l a w 2 漂洗液，离心 8 0 0 0 r p m ，l m i n ，丢弃收集管后将收集柱至于新的收集管中。 ( 9 ) 离心1 4 0 0 0 r p m ，3 m i n ，以去除收集柱中的残余液体。 ( 1 0 ) 开盖后放置5 1 0 m i n ，以去除残余乙醇。 ( 1 1 ) 加入洗脱液2 0 t x l ，然后室温静置5 m i n ( 1 2 ) 离心1 4 0 0 0 r p m ，l m i n ，收集洗脱液。 ( 1 3 ) 用n a n od r o p l 0 0 0 测定d n a 浓度 2 2d n a 甲基化修饰及纯化回收 2 2 1 亚硫酸氢盐修饰d n a ( 1 ) 溶解修饰所需的d n a ；准备亚硫酸氢盐混合溶液，每管亚硫酸 氢盐混合物用8 0 0 微升无r n a 酶的水溶解，漩涡震荡至亚硫酸 氢盐混合物完全溶解，这一步需要5 分钟。( 注：可以将溶有亚 硫酸氢盐混合物的水溶液加热到6 0 摄氏度，再漩涡震荡混匀。 不要将已溶解的亚硫酸氢盐溶液放到冰上。) ( 2 ) 向2 0 0 微升p c r 管中加入表1 列出的各种成分。 c o m p o n e n t v o l u m ep e rr e a c t i o n ( 1 x 1 ) d n a s o l u t i o n ( 1n g 一2 1 x g )v a r i a b l e 木( m a x i m u m2 0 r t l ) r n a s e f r e ew a t e rv a d a b l e * b i s u l f i t em i x ( d i s s o l v e d ) ，s e es t e pl8 5 d n ap r o t e c tb u f f e r3 5 t o t a lv o l u m e14 0 宰d n a 溶解液和无r n a 酶水混合溶液的体积总共要达到2 0 t 1 ( 3 ) 盖上p c r 管的管盖，充分混匀，管子放在室温( 1 5 - - - 2 0 摄氏 度) 。( 注：d n a 保护缓冲液加入混合溶液后由绿变蓝，说明溶 液混合均匀，且混合溶液的p h 满足亚硫酸氢盐修饰反应的要 求。) ( 4 ) 按照表2 对混合液进行热循环，整个循环过程需要5 个小时。 注：如果加热仪器规定的最大体积达不到要求( 小于1 4 0 微升) ， 设置为仪器允许的最大体积。】 s t e p t i m e t e m p e r a t u r e d e n a t u r a t i o n5 m i n9 5 i n c u b a t i o n2 5 m i n6 0 d e n a t u r a t i o n5 m i n9 5 i n c u b a t i o n 8 5 m i n ( 1 h2 5m i n ) 6 0 d e n a t u r a t i o n5 m i n9 5 i n c u b a t i o n17 5 m i n ( 2 h5 5m i n ) 6 0 。c h o l di n d e f i t e *2 0 毒修饰完的d n a 可以在热循环仪中过夜保存而产率不会降低。 ( 5 ) 将加有亚硫酸氢盐修饰混合液的p c r 管放入热循环仪中，并 开始反应。( 注：用于热循环的仪器需要有热盖。) 2 2 2 纯化回收经亚硫酸氢盐修饰过的d n a ( 6 ) 修饰过程结束后，将含有反应液的p c r 管短暂离心，然后将 管中的混合溶液转移到新的1 5 毫升离心管中。( 注：如果将溶 液中的沉淀物转移到了1 5 毫升离心管中，不会对结果产生影 响。) ( 7 ) 向每个1 5 毫升离心管中加入3 1 0 微升现配的缓冲液b l ( 含 1 0 u g m lc a r r i e rr n a ) ，震荡混匀，短暂离心。 ( 8 ) 向每管中加入2 5 0 微升乙醇( 9 6 ，一- 1 0 0 ) ，漩涡震荡混匀1 5 秒，短暂离心。 ( 9 ) 准备所需的吸附柱和收集管，将步骤8 中的混合液转移到相 应的吸附柱中。 ( 1 0 ) 全速离心1 分钟，倒掉流出液，将吸附柱重新放入收集管中。 ( 1 1 ) 向吸附柱中加入5 0 0 微升缓冲液b w ( 洗脱缓冲液) ，全速 离心1 分钟，倒掉流出液，将吸附柱重新放入收集管中。 ( 1 2 ) 向吸附柱中加入5 0 0 微升缓冲液b d ( 脱磺酸基的缓冲液) ， 室温孵育1 5 分钟。( 注：如果缓冲液b d 中有沉淀物，注意 不要将其加到吸附柱中。缓冲液b d 用完后，要立即盖上 盖子，防止被空气中的二氧化碳酸化。吸附柱加完缓冲液 b d 后，也要立即盖上盖子。) ( 1 3 ) 全速离心1 分钟，倒掉流出液，将吸附柱重新放入收集管中。 ( 1 4 ) 向吸附柱中加入5 0 0 微升缓冲液b w ，全速离心1 分钟，倒 掉流出液，将吸附柱重新放入收集管中。 ( 1 5 ) 重复步骤1 4 一次。 ( 1 6 ) 将吸附柱放入一个新的收集管中，全速离心1 分钟，以出去 残留的溶液。 ( 1 7 ) 将吸附柱放到一个新的1 5 毫升离心管中，加2 0 微升缓冲液 e b 到吸附柱中间的薄膜上，1 5 0 0 0 x g ( 1 2 0 0 0r p m ) 离心1 分钟，洗脱已纯化的d n a ( 注：为了提高洗脱液中d n a 的含量，必须将缓冲液e b 加到薄膜的中间，可以全速离心 1 分钟。) 修饰纯化后的d n a 保存在2 0 摄氏度冰箱备用。 2 3 引物设计 从g e n b a n k 库中找出人k d r 基因序列，g e n e l d ：3 7 9 1 ，n c b i r e f e r e n c es e q u e n c e ：n m0 0 2 2 5 3 2 ，将其启动子区基因序列置入甲基 化引物设计软件p r i m e rp r e m i e r5 0 预测c p g 岛及c p g 位点，参考 相关文献【8 1 设计引物。本实验引物由苏州为真生物技术有限公司设 计，北京金维智生物科技有限公司合成。 修饰前启动子序列： g t t t c c t c t g c c t ( i c i g g c a t c a c t t g i i ( ：c a g a a a g t c m t c t g g c a g c c t g ：t c | 戳翟裟徽黑轰銎基黜瓢舀c b 苫喾；c a 翟c c i 思a g 熙a i 轰2 c 警c c t g 嚣c a g 瓞g t t c t g g g c a t t l - c c i i c c c t g t g g c t c t ( j_ 1 、 经修饰后启动子序列( 经亚硫酸盐修饰后c 转变为t ) ： g g t a t q | t a t g g t t ；g a g a ( a g a a g 1 掣 注：红色下划线为上游引物序列，绿色下划线为下游引物序列 表1 人k d r 甲基化敏感性高分辨率溶解曲线法甲基化引物及参数： s e n s e ：吖汀t a g t 册a 1 【i i - t t g t a t t g a g t t t c g p , a u n os e q n ol e n g i h t mg c a 6 a c o v l i yd e g e n - k yt a o l a p c i和d q明p c l s d f l d s e 1 1 52 5 22 74 7 s3 2 j1 a n t i e n e，31 4 42 55 33 2 3 t 31 i ，| o d u c t51 “3 7 74 0 5 h 曲 d k l n 啊f a l ec i t d e p f k l a n o d k n n 瞄 s 帅 l n o n ei i n o n e ll n o n ei if o u n dl j l m l 4 j - 9 4 1 1 n 培 i n o n ei if o u n dii n o n ei 回 2 4p c r 及h r m 反应 ( 1 ) 将修饰好的d n a 用n a n o d r o p10 0 0 定量仪定量至 5 n g 此。 ( 2 ) 构建标准品：以q i a g e n 公司的全基因组甲基化d n a 作 为1 0 0 甲基化标准品，与1 0 0 t 乍甲基化健康孕妇脐带血 d n a 按比例混合，稀释制成o 、5 、2 5 、5 0 、7 5 、 l o o 系列浓度甲基化d n a ，将标准品经过p c r 扩增后进 行m s - - h r m 溶解曲线检测，重复检测三次获得标准曲 线。按待测标本在标准曲线上的位置确定其甲基化程度。 1 e ( 3 ) p c r 反应及h r m 反应体系 p c r 反应体系： 反应体系组分( 2 5 止)加入的体积( 止) 10 x p c r b u f f e r ( 15m mm g c l 2 ) 2 5 m g c l 2 ( 2 5m m ) o 5 d m ( 1 0m m )o 5 2 0 e v a g r e e n 饱和染料 1 o 1 0 岬p r i m e r s 1 9 + 1 9 t e m p l a t e ( 5 n g l x l ) 1 o t a q 酶( s u o l ) o 2 d d h 2 0 1 5 5 p c r 和h r m 反应条件： 过程温度时间 循环数c y c l e s 预变性 9 5 5 m i n1 p c r9 5 l o s 6 0 3 0 s 5 0 7 2 1 0 s h r m9 5 l m i n 4 0 l m i n l 6 5 1 s 9 5 每秒检测荧光4 0 次 冷却 4 0 1 0 s 1 ( 4 ) 运行l i g h t c y c l e r4 8 0g e n es c a n n i n g 程序，得到分 型图谱，判断样本曲线与标准曲线的位置，得到样本 甲基化程度数据。 2 5 统计学分析： 采用s p s s1 3 0 软件进行统计分析。不同组织间k d r 甲基化率的 比较采用) c 2 检验或f i s h e r s 确切概率法分析，以p o 0 5 视为差异有显著 统计学意义。 结果 1m s 一职m 标准曲线及重复性结果 o 、5 、2 5 、5 0 、7 5 和1 0 0 系列浓度甲基化标准品d n a ， 经过p c r 扩增后进行m s - - h r m 溶解曲线检测，并经过三次重复检测 获得标准曲线( 图1 ) 。在熔解曲线图中，曲线从左往右依次分开排列， 能精确地划分标本甲基化程度。待测样本在系列浓度标准曲线中的相 应位置与其甲基化程度的高低相对应，因此能根据待测样本在保准曲 线中的位置推测其甲基化程度。三次检测结果显示其曲线基本重叠一 致。 图1m s hr m 法标准曲线图： i 曲曩j 注：横轴为溶解温度t m 值，随甲基化程度的升高而升高，纵轴为 荧光强度，曲线从右向左分别代表了标准品经过扩增后经m s h r m 检测后的不同甲基化程度。 2 m s - - h r m 检测不同组织中k d r 基因甲基化程度结果： 经过m s - - h r m 检测，4 8 例血管瘤标本共检出3 2 例不同程度 k d r 基因甲基化( 6 6 6 7 ) ，其中2 4 例增殖期血管瘤标本中检出2 1 例( 2 1 2 4 ，8 7 5 0 ) 不同程度甲基化( 见图2 ) ，l 例甲基化程度为 0 5 ，1 1 例甲基化为2 5 5 0 ，5 例甲基化为7 5 ，4 例甲基 化为1 0 0 ；2 4 例消退期血管瘤标本中检出1 1 例( 1 1 2 4 ，4 5 8 3 ) 不同程度甲基化( 见图3 ) ，其中，l 例甲基化程度为7 5 ，8 例甲基 化为2 5 5 0 ，2 例甲基化为o 5 ，增殖期血管瘤与消退期血 管瘤标本中k d r 的甲基化程度比较差异显著，具有统计学意义 ( f = 9 3 7 5 ，p 0 0 5 ) ；1 5 例血管畸形标本中仅检出甲基化程度为 o 2 5 2 例( 2 1 5 ，1 3 3 3 ) ，8 例正常包皮皮肤组织中检测到1 例甲基化0 - - 一5 ( 1 8 ，1 2 5 0 ) 。与血管瘤相比，差异均具有统 计学意义( p o 0 5 ，f i s h e r 确切概率法) ；消退期血管瘤与血管畸形 中k d r 的甲基化程度比较有显著差异，具有统计学意义 ( p = o 4 5 ，f i s h e r 确切概率法) 。( 见表2 ) 。 表2k d r 在不同时期血管瘤、血管畸形和正常皮肤中甲基化情况 注：表中f 值为增殖期血管瘤分别与消退期血管瘤、血管畸形及正常包皮皮肤组 织比较结果。 1 0 0 甲基化 5 0 。7 5 甲基化 始7 5 甲基化 5 2 5 甲基化 图2 ：a 、b 、c 、d 分别为增殖期血管瘤标本中k d r 基因不同程度甲基化。 7 5 甲基化5 0 甲基化 2 5 甲基化5 甲基化 - _ - 图3 ：e 、f 、g 、h 分别为消退期血管瘤标本中k d r 基因不同程度甲基化。 讨论 1d n a 甲基化及生物学功能 d n a 甲基化是最早发现的基因表观遗传修饰方式之一，可通过 不改变基因序列而引起基因表达失活，是肿瘤形成过程中基因沉默 的重要机制之一【9 1 。它是在d n a 甲基转移酶( d n am e t h y l t r a n s f e r a s e ， d n m t ) 的催化作用下将甲基供体s 一腺苷甲硫氨酸( s a m ) 分子 中的甲基化基团添加到d n a 分子中的碱基上，最常见的是加在胞嘧 啶上的第5 位c 原子上，形成5 一甲基胞嘧啶( 5 一 m e t h y l c y t o s i n e ，m 5 c ) 1 0 】。甲基化发生的主要位点是在c p g 二核苷酸。 胞嘧啶一磷酸一鸟嘌呤( c p g ) 二核苷酸在人类基因组中占1 0 ， 主要以两种形式存在：一种是散在分布于d n a 序列中的c p g ，其 中7 0 - 8 0 呈甲基化状态存在 1 1 】，可称为甲基化c p g 位点；另一 种c p g 是高度聚集于一小段d n a 序列中，正常状态下一般是以非 甲基化形式存在的，这些非甲基化的c p g 二核苷酸仅占基因组的 1 2 ，且分布不均匀，而是呈现局部聚集倾向，以较大密度呈串 簇状分布于基因5 端，形成一些g c 含量较高、c p g 双核苷酸相对 聚集的区域，即称为c p g 剐1 2 】。c p g 岛一般长为o 5 一 - 2 k b ，通常位 于基因的5 端启动区，也可延伸至基因的外显子区【1 3 】。据统计，多 于5 0 的基因的启动子区含有c p g 岛【1 4 】，启动子区域的c p g 岛一 般是非甲基化状态的，其非甲基化状态对相关基因的转录是必须的。 因此，早期人们认为c p g 岛都是非甲基化的，随着研究的深入，人 们发现在印迹基因、失活的染色体、甚至是正常的体细胞中都存在 甲基化的c p g 剐1 5 1 。因此，正常的甲基化反应