《原核表达系统》PPT课件.ppt

基因原核表达系统,转录载体,翻译载体,LIC（连接非依赖的克隆）,图3.5SCMRP基因原核表达M：蛋白质分子量标准；泳道1：IPTG诱导BL21(DE3pET-32b)总蛋白；泳道24：IPTG诱导BL21(DE3pET-32bS)总蛋白。Fig.3.5ProkaryoticexpressionofgeneSCMRPM:ProteinMolecularWeightMarker;lane1:thewholecellproteinofBL21(DE3pET-32b)inducedbyIPTG;lane24:thewholecellproteinofBL21(DE3pET-32bS)inducedbyIPTG.,图3.6SCMRP融合蛋白大肠杆菌中表达的SDS-PAGE电泳图M：蛋白质分子量标准；1、4、7泳道分别是IPTG诱导pET32b表达2、4、6小时的DE3的总蛋白；2、5、8泳道分别是IPTG诱导重组质粒pET32bS表达2、4、6小时的DE3的总蛋白；3、6、9泳道分别是无IPTG诱导时，重组质粒pET32bS表达2、4、6小时的DE3的总蛋白。Fig.3.6SDS-PAGEresultofSCMRPrecombinantproteininE.colistrainDE3.TheresultsshowedthefusedproteinsareexpressedinE.colibyIPTGinduction.Thefusedproteinhasamolecularmassofabout20KD.Thesampleswerecollected2h,4h,6hafterinductionbyIPTGfrompET32b(lane1,4,7)andfrompET32b-SCMRP(lane2,5,8),respectively.Thesampleswerecollected2h,4h,6hfrompET32b-SCMRP(lane3,6,9),respectively.M：ProteinMolecularWeightMarker.,图3.7SCMRP基因原核表达产物溶解形式分析M：蛋白质分子量标准；泳道1、2：BL21(DE3pET-32bS)表达蛋白质的可溶组分；泳道3：BL21(DE3pET-32b)表达蛋白质的可溶组分；泳道5、6、7：BL21(DE3pET-32bS)表达蛋白质的不溶组分；泳道8：BL21(DE3pET-32b)表达蛋白质的不溶组分。Fig.3.7ThedissolvabilityanalysisofprokaryoticexpressionproductofthegeneSCMRPM:proteinmarker;lane1-2:dissolvablegroupoffusionproteinbyBL21(DE3pET-32bS);lane3:dissolvablegroupoffusionproteinbyBL21(DE3pET-32b);lane5-7:insolvablegroupoffusionproteinbyBL21(DE3pET-32bS);lane8:insolvablegroupoffusionproteinbyBL21(DE3pET-32b).,图3.8SCMRP原核表达产物Westernblot分析M：蛋白质分子量标准；泳道1：Ni-NTA纯化SCMRP；泳道2：IPTG诱导BL21(DE3pET-32b)总蛋白；泳道3：IPTG诱导BL21(DE3pET-32bS)总蛋白；泳道4：无IPTG诱导BL21(DE3pET-32bS)总蛋白。Fig.3.8WesternblotanalysisofprokaryoticexpressionproductofSCMRPM:proteinmarker;lane1:purificationproteinthroughNi-NTA;lane2:thewholecellproteinexpressedbyBL21(DE3pET-32b)inducedbyIPTG;lane3:thewholecellproteinexpressedbyBL21(DE3pET-32bS)inducedbyIPTG;lane4:thewholecellproteinexpressedbyBL21(DE3pET-32bS)withoutIPTGinduction.,蛋白质溶解方式调节,与溶解性高的蛋白质序列融合如GST、Trx（硫氧还蛋白）、NusA与催化二硫键形成的酶融合如Trx、DsbA、DsbC与信号肽融合DsbA、DsbC低温培养、诱导,凝血酶,肠激酶,原核表达宿主菌的选择,BL21（DE3）：为DE3溶原菌，其染色体上带有一拷贝由lacUV5启动子控制的T7RNA聚合酶基因。命名为pLysS和pLysE的宿主菌带有编码T7溶菌酶（为T7RNA聚合酶的天然抑制物）的pET相容性质粒。带有pLysS的细胞产生少量溶菌酶，而pLysE宿主菌产生更大量酶。这些菌株用于在诱导前抑制T7RNA聚合酶的基础表达，这样可以稳定编码影响细胞生长和活力的目标蛋白的pET重组体。,Rosetta（DE3）：Rosetta宿主菌从BL21衍生而来，可增强带有大肠