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福建农林大学硕士学位论文蜂王浆中药物残留来源确定及在蜂群中消除规律研究 摘要 蜂产品药物残留一直是研究人员关注的一个热点问题之一，特别是欧盟对我 国实行绿色壁垒后，如何控制蜂产品药物残留，就是一个亟待解决的问题。本文 通过给蜂群饲喂四环素族抗生素中的土霉素和四环素，每隔1 0 天随机抽取王浆 样品、工蜂王浆腺和蜜蜂个体血淋巴，采用h p l c 方法分析其中的药物残留，在 6 0 天内对王浆、王浆腺和血淋巴中药物残留的消除规律进行分析和研究。并对 王浆中药物残留来源进行了初步的研究，实验结果表明，随着时间的推移王浆中 土霉素和四环素的残留量逐渐降低，饲喂四环素4 0 天后王浆中四环素的残留量 基本符合欧盟标准，饲喂土霉素5 0 天后完全符合欧盟标准。并且在饲喂药物1 0 天后，在王浆腺中也检测到了药物残留，而在蜜蜂工蜂血淋巴中没有检测到药物 残留。 l 王浆中药物残留 在喂药后每隔1 0 天取样，用肿l c 对样品进行检测发现：对蜂群饲喂四环 素4 0 天后残留量为0 0 5 3 2m g k g ，已经达到欧盟等国家的标准，在5 0 天后王浆 中药物残留量为0 0 3 9 1m g k g ，完全符合其他国家0 0 5m g k g 的标准。对蜂群饲 喂土霉素后我们检测发现，在5 0 天后药物残留量为0 0 5 9 7m g k g ，基本符合标 准要求，在6 0 天后进行检测，残留量降低到0 0 4 8 2m g k g ，完全符合标准。 2 王浆腺中药物残留 在对蜂群喂药1 0 天后，用h p l c 检测发现，王浆腺中也有药物残留，四环 素残留量达到0 0 6 7 8m g k g ，而土霉素残留量达到0 0 8 3 2m g k g 。6 0 天后检测发 现四环素残留减少到0 0 0 1 2m g k g ，土霉素残留减少到0 0 0 8 2m g k g ，可以忽略 不计，证明蜂王浆中药物残留有一部分来自王浆腺。 3 血淋巴中药物残留 我们在6 0 天内，每隔1 0 天随机提取喂药蜂群工蜂体内血淋巴，用h p l c 进 行检测，结果在蜜蜂血淋巴中没有检测到药物残留。 关键词：蜂王浆血淋巴王浆腺h p l c 抗生素药物残留 福建农林大学硕士学位论文蜂王浆中药物残留来源确定及在蜂群中消除规律研究 a b s t r a c t a n t i b i o t i cr e s i d u e si nb e ep r o d u c t si so n eo ft h ek e yp r o b l e m s ，i np a r t i c u l a rw h e n t h ee u r o p e a nu n i o ni m p l e m e n tt h eg r e e nb a r r i e r so nc h i n a i nb e ep r o d u c t sh o wt o c o n t r o la n t i b i o t i cr e s i d u e si sak e yp r o b l e mt os o l v e o u ra i mi st oe x p l o r e t e t r a c y c l i n ea n do x y t e t r a c y c l i n em e t a b o l i s mi n v i t r o ，a f t e rf e e d i n gt e t r a c y c l i n e a n do x y t e t r a c y c l i n et ob e ec o l o n y ，a n de v e r y10d a y s ，r o y a lj e l l y , w o r k e r h y p o p h a r y n g e a lg l a n da n dh e m o l y m p hw e r ep i c k e du p ，t h e na n a l y z e db yr p l c i n d i v i d u a l l yw i t h i n6 0d a y s t h er e s u l t ss h o wt h a tt h et e t r a c y c l i n ea n do x y t e t r a c y c l i n er e s i d u e si nr o y a l j e l l ya r eg r a d u a l l yd e c r e a s e d 、析t ht i m e t h et e t r a c y c l i n er e s i d u e si nr o y a lj e l l ya r e b a s i c a l l yt r u et oe u r o p e a nu n i o ns t a n d a r d s4 0d a y sl a t e r t h eo x y t e t r a c y c l i n e r e s i d u e sa r ec o m p l e t e l yc o m p l i a n c e 、析t he u r o p e a nu n i o ns t a n d a r d s5 0d a y sl a t e r i t w a sd i s c o v e r e dt h a tt h ew o r kh y p o p h a r y n g e a lg l a n da l s oh a v ea n t i b i o t i cr e s i d u e s ，a n d w ec e r t a i nt h a tp a r to fr e s i d u e sa r ef r o mh y p o p h a r y n g e a lg l a n d i nt h eh e m o l y m p ho f w o r k e rb o d ya l en o tf o u n dt h ea n t i b i o t i cr e s i d u e s 1a n t i b i o t i cr e s i d u e si nr o y a lj e l l y e v e r y10d a y sw es e l e c t e dt h es a m p l e sa f t e rf e e d i n ga n t i b i o t i c s ，a n du s eh p l c t oa n a l y z ew ef o u n dt h a tt e t r a c y c l i n er e s i d u ei s0 0 5 3 2 m g k ga f t e r4 0d a y s ，i ta l r e a d y a c h i e v et h es t a n d a r d so fe ua n do t h e rc o u n t r i e s 硼1 ea n t i b i o t i cr e s i d u ei s o 0 3 9 1 m g k ga f t e r5 0d a y s ，i ti sf u l l ya c c o r d 晰吐lo t h e rc o u n t r i e s0 0 5 m g k gs t a n d a r d f e e d i n gt h eo x y t e t r a c y c l i n et ot h eh o n e y b e ec o l o n y , w ef o u n dt h a tt h ea n t i b i o t i c r e s i d u e si s0 0 5 9 7 m g k g ，i nl i n ew i t hb a s i c0 0 5 m g k gs t a n d a r d a f t e r6 0d a y sw e d e t e c t e dt h a tt h er e s i d u e sr e d u c et o0 0 4 8 2 m g k g ，i ti sf u l lc o m p l i a n c e 谢t l ls t a n d a r d s 2a n t i b i o t i cr e s i d u e si nh y p o p h a l y n g e a lg l a n d t h eh y p o p h a r y n g e a lg l a n ds a m p l e df r o mt h ew o r k e ra f t e rf e e d i n ga n t i b i o t i c sf o r 10d a y s ，d e t e r r m i n e db yh p l c ，w ef o u n dt h a th y p o p h a r y n g e a lg l a n da l s oh a s a n t i b i o t i cr e s i d u e s ，t h er e s i d u eo ft e t r a c y c l i n ea c h i e v et o 0 0 6 7 8 m g k g ，a n d 福建农林大学硕士学位论文蜂王浆中药物残留来源确定及在蜂群中消除规律研究 o x y t e t r a c y c l i n er e s i d u er e a c h e dt o0 0 8 3 2 m g k g w ec o n c l u d et h a tp a r to fr e s i d u e s a r ef r o mw o r k e rh y p o p h a r y n g e a lg l a n d 3a n t i b i o t i cr e s i d u e si nh e m o l y m p h f e e d i n ga n t i b i o t i c st ob e e s ，w es a m p l e dt h eh e m o l y m p h , c o n d u c t e db yh p l c d e t e c t i o n , t h er e s i d u e sw a s n o tf o u n di nt h eh e m o l y m p ho f w o r k e r sb o d y c l e a r l y , a n t i b i o t i cr e s i d u e si nr o y a lj e l l yp r i m a r i l yf o r mw o r k e rh y p o p h a r y n g e a l g l a n da n dc o m b s w ef o u n dt h a ta f t e r5 0d a y sr o y a lj e l l yi si nl i n e 晡mp e s t i c i d e r e s i d u e ss t a n d a r d s k e yw o r d s ：b e e ；r o y a lj e l l y ；h e m o l y m p h ；h y p o p h a r y n g e a lg l a n d ；h p l c ； a n t i b i o t i c s m 独创性声明 本人声明，所呈交的学位( 毕业) 论文，是本人在指导教师的指导下独立完 成的研究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已作 了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本 研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯 他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名：夕2 日期：郴、夕) j 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名： 72 l 日期：郴、夕) 论文使用授权的说明 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位( 毕业) 论文的规定，即学 校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或 部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 保密，在年后解密可适用本授权书。 不保密，本论文属于不保密。 口 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名：歹己巩人 日期：一省f ，7 多 指导教师亲笔签名： ，1 ， j 囊日期：矿棚4 ) 福建农林大学硕士学位论文蜂王浆中药物残留来源确定及在蜂群中消除规律研究 第一部分文献综述 1 蜂产品药物残留论述 1 1引论 众所周知，我国是世界上最大的蜂产品生产国和出口国。目前，全国约有蜂 群7 0 0 万群，年产蜂蜜2 0 余万吨，蜂王浆2 2 0 0 余吨，蜂花粉3 0 0 0 余吨，蜂胶3 0 0 余吨。其中，每年大约有5 0 的蜂蜜、5 5 的蜂王浆、6 5 的蜂花粉和6 0 的蜂 胶用于出口，每年为我国赚取上亿美元的外汇，是我国畜产品中最有竞争力的创 汇产品之一【l 】。遗憾的是，面对来势凶猛的中国产品，欧美日等地区和国家纷纷 对我国蜂产品采取各种限制措施，设置非关税壁垒，提出许多相当苛刻的蜂产品 药物残留标准。例如，欧盟在2 0 0 2 年提出从中国进口的蜂蜜中的氯霉素检出量每 千克不得超过0 1 lm g k g ，即1 0 万吨蜂蜜中氯霉素含量不得超过1g 。由于欧盟提 出的这一不切实际的标准限制，造成我国蜂产品出口量锐减。据统计，仅2 0 0 2 年上半年我国蜂产品出口量就减少了4 4 - 3 ，收入减少3 5 1 ，使我国蜂农及蜂 产品加工和出口企业损失惨重，严重地损害了我国蜂业利益，影响了养蜂生产的 健康发展。 1 9 8 9 年农业部颁布了批准使用的饲料药物添加剂品种及使用规定，1 9 9 4 年又发布了动物性食品中兽药最高残留限量标准。这两个规定，后来都做过 两次修订。尽管如此，滥用药物造成残留超标的事件仍时有发生。1 9 9 0 年，发 生了出口西德的蜂蜜中脒残留超标，出口日本的鸡肉中氯羟吡啶残留超标遭拒绝 事件。我国是畜禽产品生产大国，加入w t o 使我国畜产品在国际贸易中面临更 加激烈的竞争，而药物残留往往是引发国际贸易中非贸易性技术壁垒障碍的导火 线。这不仅给我国造成巨大经济损失，更重要的是损害了我国畜产品在国际上的 声誉【1 1 。目前，联合国f a o w t o ( 联合国粮农组织世界卫生组织) 组织及发达 国家对食品中抗生素的限制越来越严，并特别规定人用抗生素不得用于动物2 1 。 动物产品中的药物残留在发达国家很早就己被关注。早在1 9 9 8 年，欧盟就已禁 止螺旋霉素、泰乐菌素、维及尼霉素和锌杆菌肽等一系列人畜共用的抗生素被 用作饲料添加剂。2 0 0 2 年3 月底，欧洲委员会提议“欧盟将全面禁止在饲料中 使用生长素类抗生素作为饲料促生长添加剂。而目前被批准使用而仅存的4 种 福建农林大学硕士学位论文蜂王浆中药物残留来源确定及在蜂群中消除规律研究 饲料促生长添加剂，也在2 0 0 6 年1 月前已经逐步退出，这就说明了促生长抗生 素在欧盟寿终正寝。瑞典政府自1 9 8 6 年禁止在供肉食的动物饲料中添加各种抗 生素，至今已有1 7 年历史。其通过改善卫生条件达到动物防病目的的“瑞典模 式 更为各国所称道。加拿大科学家日前呼吁，要更加严格控制农牧场对牲畜使 用抗生素，以抑制对人类造成危害的耐药性超级病菌。另外，在1 9 9 7 年f a o ( 粮 农组织) 就要求停止或禁止使用抗生素促生长剂。1 9 9 8 年1 2 月又提议在l o 年 内淘汰抗生素饲料添加剂。 近几年，欧盟进口蜂产品除了不得含有氯霉素、链霉素、四环素外，新增加 禁用药物磺胺、硝基呋喃、甲硝唑等。我国蜂产品出口欧盟等国必须与国际标准 接轨，如何杜绝蜂产品中蜂药残留已成为我国当前蜂业界首要任务。蜂产品作为 一种天然、营养和保健食品备受欢迎。2 0 世纪9 0 年代以来，国外对蜂蜜食品的质 量、卫生和安全的要求越来越严格，对蜂蜜中农药残留的分析也有严格的技术标 型1 埘。 控制药物残留关系到我国养蜂业的生存与发展，但是，解决蜂产品药物残留 超标问题是一项系统工程，不是单靠哪一个部门和单位就可以做到的，也不是单 靠发几份文件或做几项规定就可以解决的，它需要政府、企业、养蜂户以及出入 境检验检疫部门认真对待，共同努力，密切配合，把控制药物残留作为确保蜂产 品质量的重中之重，切实做好每一个环节控制药物残留的工作。抗生素含量超标 是中国动物源产品包括蜂产品受国外封杀的主要原因。 1 2 蜂产品中药物残留来源【3 4 】 1 2 1 蜂药污染 蜂产品中蜂药残留是蜂农在防治蜂病过程中喂饲蜂药污染蜂产品造成，有的 是蜂农盲目用药的恶果，这也是最主要最直接的途径和因素。目前治疗蜜蜂疾病 的药物中使用纯中药的还不多，大多数为西药，即合成抗生素，价格便宜，其中 大都含有以上所说的抗生素。 1 2 2 农药污染 为防治病虫害，向蜜源植物喷农药。这一点影响较小，因为蜜蜂对农药很敏 感，一是会引起蜜蜂中毒，二是蜜蜂也不愿采集受污染的花，但不能绝对排除。 2 福建农林大学硕士学位论文蜂王浆中药物残留来源确定及在蜂群中消除规律研究 1 2 3 土壤污染 由于具有生理毒性的物质或过量的植物营养元素进入土壤而导致土壤性质 恶化和植物生理功能失调的现象。土壤处于陆地生态系统中的无机界和生物界的 中心，不仅在本系统内进行着能量和物质的循环，而且与水域、大气和生物之间 也不断进行物质交换，一旦发生污染，三者之间就会有污染物质的相互传递。作物 从土壤中吸收和积累的污染物常通过食物链传递而影响人体健康。 1 2 4 大气污染 虽然现代化的高度发展有好的一面，但也造成了有害废气的大量排放，对附 近植物、环境造成污染，会使蜂蜜中的铅，有害有机物如氮、氯、磷等超标。 1 3 蜂蜜中药物残留 据中国古代早期昆虫学研究作者周尧教授考证，早在三四千年前的殷商 甲骨文中就已有“蜜和蜂”的字样记载，汉代问世的神农本草经中将蜂蜜 列为药中上品，这说明我们的祖先在远古就已有了对蜜蜂活动的认识和参与，并 对蜂产品在医疗、保健、治疗方面有了初步的研究和记载。随着物种的进化、历 史的演变和人类科学文化的进步，如今养蜂业已成为一项独立产业，也因蜂产品 集纯天然、高营养、保健、治疗于一体的独特性而被人类所广泛认可、应用及推 崇。在中国，无论蜂蜜、蜂王浆、蜂花粉，还是近几年兴起的蜂胶产品，都是广 大人民所喜爱的具有广泛功能的保健食品，部分入药；特别是对中老年消费群体， 由于年龄的增长，体质的自然衰落，更需要这样的功能营养性保健食品的补充与 调节。6 0 、7 0 年代，我国蜂产品的规模和产量就在不断扩大，特别是8 0 年代初， 蜂业发展更是日新月异，现已成为世界上生产、出口蜂产品第一大国。同时，由 于科技的进步及众多蜂业同仁的共同努力，已开发出许多科技含量较高、新颖的 蜂产品和蜂制品，正热销于市场。但也随着蜂产品近几年被人们认知程度的大幅 提高，越来越多的人认为有利可图，随之各种形式的蜂业生产者、公司等如雨后 春笋般涌现，形成了产品及品牌的多样性，甚至出现质量、价格及服务等方面的 无序竞争，导致蜂产品市场十分混乱【3 1 。当然，这也是市场经济的必然现象。 蜜蜂疾病是蜂业发展的大敌，是影响蜂产品产量和质量的严重障碍，也是蜂 产品药物残留的主要来源。建国以来，我国科技工作者对蜜蜂疾病的研究做了大 3 福建农林大学硕士学位论文蜂王浆中药物残留来源确定及在蜂群中消除规律研究 量卓有成效的工作，对提高蜂产品的产量和质量起到了积极作用、但是随着形势 的发展，科技水平不断提高和进步，特别是我国加人w t o 之后同世界各国的交 往贸易增多；随着人们生活水平的不断提高，对蜂产品的需求增大，人们对蜂产 品质量的要求也越来越高。然而就目前我国蜂产品质量现状来看还有许多问题需 要解决。目前我国对蜜蜂疾病的防治仍以药物防治为主，尤其是对蜂螨的防治。 药物防治见效快，使用比较方便，但是所带来的问题是容易造成蜂产品的污染。 因蜂农对蜜蜂疾病的诊断及防治基础知识较缺乏，对一些蜂病不能作出正确 诊断，而盲用药。如对“爬蜂病 的防治认为抗生素是万能药，而超量地使用 抗生素如四环素、链霉素治疗，造成抗生素残留量严重超标。欧盟对抗生素的要 求很高，不合格者不能入境。如德国对蜂蜜中链霉素的残留量要求由原来的2 0 1 0 击提高到2 0 1 0 母，秦皇岛出人境检验检疫局对出口蜂蜜样品检测结果为，按 2 0 x l o 母以下为合格，1 9 9 9 年5 4 合格，2 0 0 0 年4 2 合格。从这一结果看，我国 蜂蜜中链霉素残留量超标严重，是急需解决的问题【5 - 7 1 自从2 0 世纪9 0 年代，我国科技工作者将新型杀螨剂一螨扑( 原料为氟胺氰菊 酯) 引进以来，将蜂螨的防治水平提高到了一个新阶段，控制了蜂螨危害，而且 提高了蜂蜜的质量，解决了出口蜂蜜由于杀螨剂污染而退货索赔的问题。值得注 意的是，由于螨扑已使用多年，蜂螨对氟氨氰菊酯已经产生了抗药性，这个问题 不仅国内是这样，国外也是如此，许多蜂农反映，以前螨扑杀螨效果非常好，最 近几年就差多了，原因就在于此。当然也不排除个别蜂药厂乘机应用一些农药作 原料生产假药和劣质杀螨药物，不落螨且伤蜂，同时造成蜂蜜的污染；另一个动 向是由于螨扑杀螨效果不满意而又回到了使用水剂 如速杀螨、杀螨剂一号( 原 料为双甲脒) 】喷雾治螨，这类药物要求在非生产季节使用， 而一些蜂农不分 时间、季节，有螨就用药，从而增加了蜂蜜的污染几率。欧盟1 9 9 7 年通过的畜牧 与畜产品法中规定，禁止在任何食用的畜产品中添加任何未经许可的药物和含量 超标的药物。欧盟要求在蜂蜜中不得检出氟氨氰菊酯( f l u v a l i n a t e ) ，在蜂蜜中， 双甲脒( 蛳l l 钇又名t a c t i c ) 最大残留量不得超过2 0 1 0 西，蝇毒磷( p e f i z i n ) 在奥地 利和德国可以合法使用，在德国和意大利要求最大残留量为1 0 1 0 巧，而荷兰为 5 0 x 1 0 4 嘲。 随着中国2 0 0 1 年1 1 月顺利加入w t o ，国人还在欢庆长达1 5 年艰难谈判历程终 4 福建农林大学硕士学位论文蜂王浆中药物残留来源确定及在蜂群中消除规律研究 于有了美满结局的时刻，国外就已瞄准中国实施非关税壁垒障碍。如美国对中国 钢材的限制，日本对中国食盐实施配额制度，进而发展到对我们蜜蜂行业的限制。 2 0 0 2 年，对中国大宗蜂产品抗生素超标，实行绿色、技术壁垒，阻碍中国蜂产品 的出口，制定非常低的残留限量：0 1 lm g k g ，基本上就是“零标准 。这无非 是发达国家为保护本国的经济发展和人员就业，针对中国的绿色、技术壁垒。据 统计，仅2 0 0 2 年上半年，我国蜂产品出口量就减少4 4 3 ，出口收入减少3 8 1 ， 使我国蜂农及蜂产品加工、出口企业损失惨重【4 别。 其实，“零标准 本身是不科学的，绝对的极端，不符合辩证法。诚然，我 们也认为人的健康是最重要的，也应致力于减少各种抗生素的污染，但对待抗生 素的问题应采取现实的态度，建立在科学的基础上，并且需要公平性和一致性。 不可能设想蜜蜂生存在一个超纯度的假想王国中，也不可能设想能有超纯度的蜜 蜂产品存在。事实上，不要说中国，就是发达国家本身，无论是在检测仪器上， 还是在产品本身上都还达不到这样的技术、质量要求，而一味地强调中国，本身 就存在不公平。例如，意大利向奥地利出口冻虾，氯霉素检出量高达6 。5 9 k g ；其 成员国荷兰政府则干脆立法规定其出口小牛肉的氯霉素检测标准高达1 0 9 k g 。与 此同时，欧盟却要求中国及其他发展中国家的动物源产品中氯霉素检测限不得超 过0 1l m g k g ，这岂不是典型的贸易壁垒【7 】? 据报道，由于欧盟以“零标准”封杀中国蜂蜜，造成蜂蜜严重缺货，其价位 上涨了一倍，达到30 0 0 美元吨。为此，英国食品标准局不得不通过新闻媒体宣 布中国蜂蜜所含氯霉素极其微少，对人的健康不构成危害，可忽略不计，可以继 续食用。说明其禁止进口中国蜂蜜的措施超过了为保护人民健康所需要的程度， 所以说，欧盟是出于贸易保护主义目的而限制中国产品。另据欧盟进口商普遍反 映，欧盟自己也没有完全配备“零标准 氯霉素的检测手段和控制设备，也没有 建立一个完整的系统来保护实施“零标准”，更没有官方的实验室被授权进行氯 霉素检测。任何人都不敢保证1 0 0 无问题。欧盟的“零标准”氯霉素规定也给 中国出口商和欧盟进口商造成了巨大负担。试想，欧盟要求中国在一夜之间就具 有执行“零标准 氯霉素的能力，培训出足够的技术人员，配备足够的设施和完 善的生产条件，是绝对不可能的，显然是想通过这些障碍来限制中国蜂产品的出 口。 5 福建农林大学硕士学位论文蜂王浆中药物残留来源确定及在蜂群中消除规律研究 我国虽然蜂业资源丰富，产量巨大，但产品科技含量不高，主要以原料形式 出口，这也正是发达国家所利用的经济资源，即所谓的“资源大转移”，无形中 使我们处于一种弱势地位。反思我国蜂产品，主要有抗生素超标方面的问题引起 的，这正是中国蜂产品遭封杀的主要原因，也是国外提出实施绿色壁垒的依据。 诚然，蜜蜂也是一种动物，和人一样，同样具有生老病死，有了病就得用药 治疗。由于以前科技的不发达，人们对健康、抗生素的认知不够，没有出现这个 问题，但随着科技的迅猛发展和当今人们对健康的注重程度，这一问题日显突出， 最终出现现在的结局。目前对蜂产品的抗生素检测主要有：氯霉素、链霉素、四 环素、磺胺类物质。这些物质对人的健康确有伤害之处，且在体内形成积累，不 能随新陈代谢而排出体外，如氯霉素，会导致再生障碍性贫血，造成不治之症； 四环素会破坏牙釉质，造成“四环素牙 ；所有这些的确应引起我们的重视，确 保蜂产品的安全性。 土霉素( o x y t e t r a c y c l i n e ，o t c ) 、四环素( t e t r a c y c l i n e ，t c ) 、金霉素 ( c o h l o r t e t r a c y e l i n e ，c t c ) 是防治蜂群幼虫腐臭病的常用抗生素，使用不当或过 量使用会导致蜂产品中抗生素残留，对人类健康构成威胁，为此，世界各国规定 了严格的残留限量，食品中四环素族抗生素残留检测的方法有微生物分析法、薄 层色谱法、化学发光法、液相色谱法等，其中最传统的方法是微生物分析法，方 法原理是四环素族抗生素抑制蜡样芽孢杆菌生长，在样品溶液周围产生抑茵圈， 抑菌圈的大小与溶液中抗生素浓度成正比，相关国家标准和检验检疫行业标准就 是以此作为定量基础的。该方法测定的是四环素族抗生素总量，无法确定抗生素 的种类和各种抗生素的残留量，该法特异性不强、灵敏度较低，精密度也有一定 问题1 1 & 1 u 。 1 4 蜂王浆中抗生素残留 蜂王浆是5 - 1 0 日龄工蜂舌腺和上颚腺所分泌的乳白色或淡黄色乳状液体。 它是蜂王幼虫整个发育期和雄蜂幼虫前期的唯一食物，类似于哺乳动物的乳 汁又称为蜂皇浆、王浆、蜂乳【1 2 , 1 3 。蜂王浆略带花蜜香和辛辣气，微粘，光泽 明显【1 4 】，蜂王浆被科学家指定为可供人类服用的纯天然胎儿级食品，对人类有极 强的营养保健功能和医疗作用。现代营养学和医学研究表明：蜂王浆具有增加机 6 福建农林大学硕士学位论文蜂王浆中药物残留来源确定及在蜂群中消除规律研究 体免疫功能、延缓衰老、防癌抗癌、降血糖、降血压、抗疲劳等保健功能和疗效， 所有这些功能，都是以蜂王浆极其复杂的化学成分为物质基础的【1 4 1 6 1 。蜂王浆保 质期可达l 2 年，且品质不会有大的变化【1 7 2 4 】。 据海关统计，2 0 0 4 年1 - - ，11 月，全国共出口鲜蜂王浆和蜂王浆冻干粉8 2 6 t ； 创17 1 6 2 5 万美元，比2 0 0 3 年同期出口量增长9 ，创汇额增长1 6 。上述出口 产品中，鲜蜂王浆6 4 4 0 8 t ，比上年增长8 8 0 ，鲜王浆创汇9 4 5 3 6 万美元，比上 年同期增长1 7 7 ；鲜王浆冻干粉出e 1 1 8 2 0 6 t ，比上年同期增长8 6 6 ，创汇7 7 0 8 0 万美元，增力 1 1 5 0 2 。按照1 1 1 月出口数量，其中蜂王浆冻干粉折合鲜蜂王浆 为5 4 6 1 8t ，总计蜂王浆量达11 9 0 2 6 t ，月出口平均首次突破1 0 0t 。据介绍，2 0 0 4 年的鲜蜂王浆出口价平均约1 4 6 8 美元千克，蜂王浆冻十粉平均约4 2 3 4 美元 千克。各项指标均比2 0 0 3 年同期上升刘张林先生还介绍，2 0 0 4 年1 - - 一1 1 月，中国 蜂王浆的主要出口地仍然是日本。日本从中国进口约7 7 3t ，占中国总出口量的 7 0 5 9 ；日本进口量较上年增加8 1 。中国蜂王浆的第二大买主是美同和澳大 利亚，占中国总出口量的1 0 ；南美( 拉美_ ) 市场成为新的增长点共进e l l 3 2 t ，比 上年增长8 7 1 。对欧盟市场仍在恢复之中，2 0 0 4 年1 - 1 1 月仅为2 0 6 t ，占中国 出口份额的3 1 1 2 卯。 对我国蜂产品企业来说，2 0 0 6 年是自欧盟禁止进口中国动物源性食品以来最 困难的一年，蜂王浆出口量与2 0 0 5 年同期相比，呈直线下降趋势。据中国医保 商会统计，2 0 0 6 年6 9 月，我国蜂王浆共出口3 6 6 7 t ，同比减少1 1 7 7 t ，其中， 对日本蜂王浆出口减少9 3 6 t ，占同期出口减少总量的8 0 。出现这一情况的根 本原因是受到了2 0 0 6 年5 月2 9 日日本实施食品中残留农业化学品肯定列表制 度的影响【1 0 , 1 1 1 。 我国是蜂王浆产品的主要生产国，每年有大量蜂王浆产品出口，其中日本是 我国蜂王浆产品的最大进口国。根据日本全国蜂王浆公正贸易协会( t h ej a p a n r o y a lj e l l yf a i r t r a d ec o u n c i l ) 的统计，2 0 0 3 年和2 0 0 4 年日本共进口蜂王浆约6 3 6 吨和6 4 5 吨，其中从中国进口为5 9 4 吨和6 0 5 吨，占全部进口量的9 3 以上。但由 于两国在蜂王浆产品的进出口渠道和品质管理方面存在的问题，最近几年日本从 我国进口的蜂王浆产品，发现含有抗生素残留的情况时有发生，这一问题已引起 了日本厚生劳动省的密切关注，如果从我国进口的蜂王浆产品检出抗生素残留的 7 福建农林大学硕士学位论文蜂王浆中药物残留来源确定及在蜂群中消除规律研究 批数超过一定比率，日本政府将有可能在一定期间内禁止从中国进口蜂王浆产 品。如果出现这一结果，将对我国的蜂王浆产品生产企业造成巨大损失。目前， 对蜂王浆产品中抗生素残留物质的检测，日本政府并没有规定统一的检测方法， 由于各企业和检测机构采用的检测方法不同，检测结果也就不完全相同，这也给 我国蜂王浆产品生产和出口企业的品质管理带来了困难。为此，日本全国蜂王 浆公正贸易协会组织蜂王浆产品输入和销售的主要相关企业，在日本食品分析中 心的协力下，对蜂王浆产品中抗生素残留物质的检测方法进行了探讨，目的是为 了制定合理、统一的检测方法，为两国对蜂王浆产品的品质管理提供合理依据， 避免由于抗生素残留问题而引起的贸易纠纷和摩擦。中日双方的相关人员还就这 一问题进行了多次交流与协商【2 5 】。 氯霉素( c h l o r a m p h e n i c o l ，c a p ) 是一种高效广谱的抗生素，对各种好氧和厌 氧微生物都有活性。它曾被用于家畜和家禽疾病的预防和治疗，它在动物性食品 中残留的潜在危害就是对人骨髓造血功能造成严重损害，从而引起人的粒细胞缺 乏病，再生障碍性贫血和溶血性贫血，严重者可致死。f a o w a o 规定食品中氯 霉素的残留量不得检出，欧盟( e e c ) 9 6 2 3 指令中把c a p 列入禁用药，并规定氯霉 素m r p l ( m i n i m u mr e q u i r e dp e r f o r m a n c el i m i t s ) 值为0 3k g 。随着科学技术的进步， 欧盟对进口动物源产品中的氯霉素的检出限量不断降低，甚至禁止中国的某些动 物源产品的进口，同时蜂产品中氯霉素残留的检测又是动物源产品检测中的难 点，因此蜂产品中氯霉素的检测变得尤为重要。文献报道用气相色谱( g c ) 、气相 色谱质谱( g c - m s ) 测定动物源产品中c a p ，这些方法应用于蜂产品中氯霉素的检 测，存在检出限难以达到要求、背景干扰或样品净化不完全以及衍生化难等问题。 e l i s a 作为筛选方法，在蜂产品中氯霉素残留的最低检出限达到o 1k g ，但是对 于阳性样品需要与之相对应的确证方法。胡大晰、刘宜孜等报道关于蜂蜜中氯霉 素残留量的检测方法，分别采用高效液相色谱( h p l c ) 和g c m s ，尚未有蜂王浆 中氯霉素残留量检测方法的报道。随着g c m s 技术发展的日趋成熟，该方法被 越来越多的应用于测定和确证动物源产品中氯霉素的残留量【1 1 】。 四环素族( t e t r a c y c l i n e s ) 抗生素是一类人工合成或从链霉菌属微生物代谢产 物中提取的具有广谱抗菌活性的化合物，常用的药物有土霉素四环素、金霉素、 强力霉素等，主要在畜禽生产中被广泛用作药物和饲料添加剂。在养蜂过程中， 8 福建农林大学硕士学位论文蜂王浆中药物残留来源确定及在蜂群中消除规律研究 蜂农常用它防治蜜蜂幼虫感染的腐臭病，因此可能会导致蜂产品中四环素族抗生 素残留。由于四环素族抗生素会在人体内富集，从而危害身体健康。为此，世界 上许多国家对蜂产品中的四环素残留均作了限量要求，其中德国、日本等国要求 四环素族抗生素残留总量小于0 0 5 m g k g 1 1 1 。 9 福建农林大学硕士学位论文 蜂王浆中药物残留来源确定及在蜂群中消除规律研究 2h p l c 法在蜂产品药物残留检测上的研究进展 2 1m l c 法概述 高效液相色谱法是继气相色谱之后，7 0 年代初期发展起来的一种以液体做流 动相的新色谱技术。高效液相色谱是在气相色谱和经典色谱的基础上发展起来 的。现代液相色谱和经典液相色谱没有本质的区别。不同点仅仅是现代液相色谱 比经典液相色谱有较高的效率和实现了自动化操作。经典的液相色谱法，流动相 在常压下输送，所用的固定相柱效低，分析周期长。而现代液相色谱法引用了气 相色谱的理论，流动相改为高压输送( 最高输送压力可达4 9 x 1 0 7 p a ) ；色谱柱 是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱 ( 每米塔板数可达几万或几十万) ；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出 物进行连续检测。因此，高效液相色谱具有分析速度快、分离效能高、自动化等 特点。所以人们称它为高压、高速、高效或现代液相色谱法。 2 1 1 液相色谱分离原理及分类 和气相色谱一样，液相色谱分离系统也由两相一固定相和流动相组成。液相 色谱的固定相可以是吸附剂、化学键合固定相( 或在惰性载体表面涂上一层液 膜) 、离子交换树脂或多孔性凝胶；流动相是各种溶剂。被分离混合物由流动相 液体推动进入色谱柱。根据各组分在固定相及流动相中的吸附能力、分配系数、 离子交换作用或分子尺寸大小的差异进行分离。色谱分离的实质是样品分子( 以 下称溶质) 与溶剂( 即流动相或洗脱液) 以及固定相分子间的作用，作用力的大 小，决定色谱过程的保留行为。 根据分离机制不同，液相色谱可分为：液固吸附色谱、液液分配色谱、化合 键合色谱、离子交换色谱以及分子排阻色谱等类型。 高效液相色谱法具有高柱效、高选择性、分析速度快、灵敏度高、重复性好、 应用范围广等优点。该法已成为现代分析技术的重要手段之一，目前在化学、化 工、医药、生化、环保、农业等科学领域获得广泛的应用。 四环素族抗生素用于防治蜂群幼虫腐臭病效果十分显著，但过量使用或使用 不当会导致蜂产品中抗生素残留，对人类健康构成威胁。四环素族抗生素残留量 的传统检测方法是微生物分析法【2 引，其原理是抗生素抑制细菌生长，抑菌圈大 小与抗生素浓度成正比。该方法灵敏度低，精密度差，特异性不理想，正逐渐被 1 0 摇建鼗彝犬攀骚士攀链论文媾王装枣势魏残器隶瀑确定及在鳞群孛瀵狳耀霉赣窕 h p l c 法替代 2 9 * 3 n 。h p l c 法在灵敏度、选择性等方面均优予微生物法。 2 。l 。2 凇毛e 法在蝰产熬药物羧鏊梭测土兹耩究进震 近年来，嵩效渡稠色谱法在瑟环素族抗生豢残餐检测方磷的感雳发展很快， 尤其是在蜂蜜药物残留的测定中，罄相萃取技术在样品净化方蘑的瘦用进一步提 高了方法的灵敏度和稳定性。m a c n e i l 建立了用c l s s p e 挂净化样品，h p l c 法分 橱动物缀织中霉素、蹰环素、金霉素残留薰酶a o a c 标准方法酬。庞蓬芳及其 研究小缱建交了焉0 磷搀s p e 柱和羧酸型黼离子交换柱净纯样晶，h p l c 法分析 蜂蜜孛主霉紊、霹环素、金霉紊抗生素残鹜曩瓣测定方法戳及其他方法和翔毛e 结舍测定其链药物残留的方法1 3 3 - 3 懿。 冬蓬避食熬串熬抗生素残餐量都有严格规定。在镪养蜜蜂熬过糕中，入稍缝 常健用帮有抗生素鹃饲料，这对蜜蜂疾病的防治具京良好的效果，同时也造成了 蜂蜜中抗生紊的残留。爨院，捡测蜂蜜孛抗生素豹含量是控裁蜂蜜豢量髓一个重 要指标。蜂蜜孛圆环素类抗生紊残窝量麓检溅大多采用微生耪杯碟法，操俸繁谈 且耗时。 j i m e n e z 等鞴震f l o r i s i l 硅藻洚纯、气裙色谱簿e ) 斡选择性检测器分褥了蜂 蜜串3 鑫种农药羧餐溯。并礤究了匿穗徽萃取法在蜂蜜串多种农药残餐分辑懿嶷 用 4 0 , 4 ”。r i s s a t o 等剩用超临界流体摹取，笈墩子捕获检测器( e c d ) 分析了蜂蜜中 有枫氯、有枫磷、氨基绎羧醺弱拟除虫黎蘸等农药麴残留【4 2 1 。b e a t r i z 镧j 用嗣相 萃取- g c 。质谱( m s ) 分析了蜂蜜中5 1 种农药残留辫】。 a l b e 等鞴用基质嗣相分散-分撼了蜂蜜中肖梳氯、有税磷釉攘除虫 g c - e c d 菊醚类等1 5 释农药残留湖。隧蓠，我国关于蜂蜜中农药残蟹静标准分析方法大 多楚萃类弱单静，鲡氟胺鬣菊蘸农蓊残餐翡分橇。金珍、裤嚣光等赭霜气辐色谱 撮谱法分析7 蜂蜜孛2 3 孛农药我壤t 4 5 j ，并探讨7 蜂蜜试样翁处遴条件的优纯与 选择，2 3 中农药的检溺袋量都夺予1 0 g k g 。汤瑶，糍牮等利用固稠萃取- h p l c 法 测定了蜂蜜中l o e e 磺胺类药物残窜嗍。 霹前蜂蜜中器环素族抗生豢残餐测定方法已经成熟，主要有裔效液糖色谱 法、薄屡色谱法、微生物法、酶联免疫法和液耀色谱质谱联耀法。由于蜂王浆 孛基凄复杂，蛋宣禽量高，两薅环素类抗生紊在生物样菇孛爨与蛋鑫质缝含，逮 增加了蜂壬浆中题舔素族抗生素残鬣测定豹难度。雹蠹努有关蜂王浆孛露繇素族 福建农林大学硕士学位论文蜂王浆中药物残留来源确定及在蜂群中消除规律研究 抗生素残留的测定方法很少，主要是微生物测定法和高效液相色谱法，但这两种 方法的灵敏度( 前者检出限为5 0n g g ；后者检出限为5 0 0n g g ) 和稳定性均较差， 且微生物法测定步骤繁琐、周期长，只能检测蜂王浆中四环素族抗生素的总残留 量，不能确定污染物的种类。这两种方法的检测灵敏度均不能满足对四环素族抗 生素残留的要求。为了满足日本、欧盟等进口国对蜂王浆中四环素族抗生素残留 限量的要求，消除绿色技术壁垒，并将残留超标的蜂王浆产品控制在市场之外， 薛晓锋等【4 7 】在h i s a oo k a ，m i t s u om a t s u k 等 4 8 , 4 9 】的研究基础上用o a s i sh l b 固相萃 取柱净化，建立了高效液相色谱一质谱联用法测定蜂王浆中痕量土霉素、四环素、 金霉素、强力霉素残留的方法。该方法检测回收率稳定，对土霉素、四环素的检 出限小于1 0n g g ，对金霉素、强力霉素的检出限小于2 0n g g 。 食品中氯霉素残留的检测方法报道很多，如放射免疫测定法、气相色谱法、 高压液相色谱法、气质联用法( g c m s ) 和液相质联用法( l c m s ) 等，但有关蜂 王浆产品中氯霉素残留的检测方法却报道得很少。迟玉明、赵唏瑛等用p h l c 对 蜂王浆中的氯霉素测定进行了初步的探讨，建立了氯霉素残留的h p l c 定量检测 方法【5 0 】，为蜂王浆中氯霉素残留的检测提供了依据。虽然l c m s 法灵敏度高、 检出限低，但考虑到蜂王浆产品生产和销售企业的具体条件，日本全国蜂王浆 公正贸易协会决定制定灵敏度相对较高、检测结果比较稳定可靠的h p l c 检测方 法【5 0 l 。目前国内对蜂蜜中药物残留的h p l c 检测方法已经取得了比较成功的经 验，我国各方面的学者作了大量的试验f 5 1 枷】，并且取得了不错的检测效果，并且有 关国家标准 6 1 , 6 2 1 以及检验检疫行业标准【6 3 】也制定了了蜂蜜中药物残留的标准检 测方法，此方法也是建立在h p l c 基础上的。在对蜂胶以及蜂王浆药物残留的检 测上，目前所做的试验很少。大多数都是对蜂较和蜂王浆中成分的测定 6 4 - 6 7 1 。赵 静用h p l c 法测定了蜂毒中蜂毒肽的含量研究等【6 引。但对其中残留的药物要就 却报道的很少。谢文等利用高效液相素朴串联质谱测定了蜂蜜和蜂王浆中氯霉素 的残留，此方法对不同基质样品的加标回收率达到9 1 1 0 7 ，相对偏差小于 1 0 ，对蜂蜜和蜂王浆的检出限分别为o 1g g k g 和0 2l a g k g t 6 9 1 。薄海波等利用 固相萃取提取、高效液相色谱一紫外检测法同时测定了蜂王浆中