（动物学专业论文）冬眠阵与达乌尔黄鼠冬眠期抗废用性肌萎缩机制的关系探讨.pdf

捅要 目的：观察达乌尔黄鼠( s p e r m o p h i l u sd a u r i c u s ) ( 简称黄鼠，下同) 冬眠阵发生规律； 研究黄鼠在冬眠阵中及大鼠在模拟冬眠阵中骨骼肌肌重体重比、酶活性及肌球蛋白重链 ( m h c ) 的表达水平，探讨冬眠阵与黄鼠冬眠期抗废用性肌萎缩机制的关系。方法：1 ) 采用锯末技术观察冬眠阵及阵间变化；运用半导体点温计测定黄鼠体温。2 ) 采用紫外 分光光度计测定骨骼肌柠檬酸合酶( c s ) 和乳酸脱氢酶( l d h ) 的活性。3 ) 通过聚丙烯酰胺 凝胶电泳( s d s p a g e ) 测定骨骼肌m h c 的表达水平。结果：1 ) 黄鼠体型大小与其经历 冬眠阵阵中时长成正比，与其经历冬眠阵数目成反比；冬眠阵激醒后，黄鼠体温呈“s 曲线上升。2 ) 经历不同数量冬眠阵后，黄鼠比目鱼肌( s o l ) 和趾长伸肌( e d l ) 肌 重及肌重体重比与冬眠前和出眠后相比均没有明显变化；黄鼠s o l 的m h c 类型发生 了由i i 向i 的转化，这种趋势在出眠时发生逆转；而e d l 的m h c 类型则无明显变化。 3 ) 冬眠阵刚激醒时，黄鼠s o l 肌重体重比显著小于阵间激醒后刚入眠时的肌重体重比 4 ) 冬眠黄鼠s o l 的c s 活性随着冬眠时间的增加而不断上升，直到出眠1 4 天仍维持在 较高水平，e d l 中c s 活性则无明显变化，直到出眠时突然下降；冬眠黄鼠s o l 和e d l 的l d h 活性均无明显变化。5 ) 模拟不同数目冬眠阵后，大鼠s o l 的m h c 类型由i 向 i i 的转化显著低于持续吊尾大鼠。结论：1 ) 经历不同数量冬眠阵的黄鼠，其肌重体重 比、s o l 的c s 活性及s o l 的m h c 的表达水平均未显示骨骼肌发生明显萎缩，表明冬眠 阵在黄鼠骨骼肌抗萎缩的过程中起了重要作用。2 ) 跟踪不同数目冬眠阵的大鼠，其s o l 的m h c 由i 向i i 的转化显著低于持续吊尾大鼠，这一结果为研究制定科学的抗废用性 肌萎缩物理治疗措施提供了有效思路。 关键词：黄鼠，冬眠阵，比目鱼肌，肌球蛋白重链，柠檬酸合酶 a b s t r a c t o b j e c t i v e ：t oo b s e r v et h er u l e so fh i b e r n a t i o nb o u to ft h eg r o u n ds q u i r r e l ( s p e r m o p h i l u s d a u r i c u s ) ；t os t u d yt h em u s c l ew e tw e i g h t ，t h er a t i o so ft h em u s c l ew e tw e i g h tt ob o d yw e i g h t ， t h ea c t i v i t yo fe n z y m ei ns k e l e t a lm u s c l ea n dt h ee x p r e s s i o nl e v e lo fm y o s i nh e a v yc h a i n ( m h c ) o fg r o u n ds q u i r r e li nt h eh i b e r n a t i o nb o u t ，a n do fr a ti nt h es i m u l a t e dh i b e r n a t i o nb o u t ； t or e s e a r c ht h er e l a t i o nb e t w e e nh i b e r n a t i o nb o u ta n dt h em e c h a n i s mo fa n t i - d i s u s ea t r o p h yi n g r o u n ds q u i r r e l m e t h o d s ：1 ) t h ec h a n g e so ft h eh i b e r n a t i o nb o u ta n di n t e r b o u tw e r e m o n i t o r e db yt h et r a d i t i o n a ls a w d u s tm e t h o d ；t h eb o d yt e m p e r a t u r ew a sm e a s u r e db yt h e s e m i c o n d u c t o rp o i n tt h e r m o m e t e r 2 ) t h ec sa n dl d ha c t i v i t yo fs o la n de d lw e r e d e t e r m i n e db yu vs p e c t r o p h o t o m e t e r 3 ) m h ce x p r e s s i o nl e v e lo fs o la n de d lw e r e d e t e r m i n e db yt h es d s - p a g e r e s u l t s ：1 ) d u r i n gh i b e r n a t i o n ，t h eb o d ys i z eo fg r o u n d s q u i r r e lh a sap o s i t i v ec o r r e l a t i o n 晰t 1 1t h eh i b e r n a t i o nt o r p o r st i m e ，a n dh a san e g a t i v e c o r r e l a t i o nt ot h en u m b e ro fh i b e r n a t i o nb o u t s t h eb o d yt e m p e r a t u r eo fg r o u n ds q u i r r e lh a s r i s e da ss i g m o i dc u r v e 2 ) t h em u s c l ew e tw e i g h t ( b w ) a n dt h er a t i o so fm u s c l ew e tw e i g h tt o b o d yw e i g h t ( m w w b w ) o fs o la n de d lo fg r o u n ds q u i r r e lw h i c hu n d e r w e n td i f f e r e n t n u m b e r so fh i b e r n a t i o nb o u th a v en o ts h o wd i f f e r e n c ec o m p a r e dw i t hp r e h i b e r n a t i o na n d a f t e rh i b e r n a t i o n ；t h em h c t y p eo fs o lt r a n s f o r m e df r o mt h ei it oi ，w h i l et h em h ct y p eo f e d lr e m a i nu n c h a n g e d 3 ) t h er a t i o so fm w w b wi ni n t e r b o u ta r o u s a lh a v es h o w ne v i d e n t d e c r e a s ec o m p a r e d 丽t ht h ee n t r a n c eo fh i b e r n a t i o na f t e ri n t e r b o u ta r o u s a l ( p o 0 5 ) ，b u tt h ee x t e n to ft h e c o n v e r s i o nw a sr e m a r k a b l el o w e rt h a nt h et a i l - s u s p e n s i o nr a t ( p 0 0 5 ) c o n c l u s i o n ：1 ) t h e r a t i o so fm u s c l ew e tw e i g h tt ob o d yw e i g h t ( m w w b w ) o fs o la n de d l ，t h ea c t i v i t yo fc s a n dt h ep e r c e n t a g eo fw h i c hu n d e r w e n td i f f e r e n tn u m b e r so fh i b e r n a t i o nb o u td i d n ts h o w d i f f e r e n c e i ti n d i c a t e st h a th i b e r n a t i o nb o u t ，e s p e c i a l l yt h es t a g eo fi n t e r b o u ta r o u s a l ，i so n e o ft h em e c h a n i s m so fa n t i d i s u s ea t r o p h yi ng r o u n ds q u i r r e l 2 ) t h em h co fs o lo fr a t w h i c hu n d e r w e n td i f f e r e n tn u m b e r so fs i m u l a t i n gh i b e m a t i o nb o u th a ds l i g h tt r a n s f o r m a t i o n f r o mt h eit oi ic o m p a r e d 晰mt h et a i l - s u s p e n s i o nr a t i tc a np r o v i d es o m et h o u g h t sf o rt h e p h y s i c a lt h e r a p yo fa n t i - d i s u s ea t r o p h y k e yw o r d s ：g r o u n ds q u i r r e l ，h i b e r n a t i o nb o u t ，s o l ，m h c ，c s i i 西北大学学位论文知识产权声明书 本人完全了解西北大学关于收集、保存、使用学位论文的规定。学校 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版。本人允许 论文被查阅和借阅。本人授权西北大学可以将本学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存 和汇编本学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所等机构将本学位论 文收录到中国学位论文全文数据库或其它相关数据库。 保密论文待解密后适用本声明。 学位论文作者签名：窆正盟缢指导教师签名： 沙l o 年f 月jf 日 年月 e l 西北大学学位论文独创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，本 论文不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西北大 学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对 本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 西北大学硕士学位论文 己i 吉 jl乍j 骨骼肌的废用性萎缩，一直是航天医学、临床医学、运动医学及康复医学较为关注 的疾病之一。国际上众多学者已经运用解剖学，生物化学，免疫组织化学，蛋白质组学 以及细胞生物学等方法对废用性肌萎缩做了广泛而深入的研究，取得了一系列重要成 果，对阐明其机制奠定了基础。但如何能够有效地遏制废用条件下的肌肉萎缩即抗废用 性肌萎缩的研究报道不多。航天事业的蓬勃发展，使的该疾病的治疗与防护摆在了更加 突出的位置，因为这不仅关系到航天事业的继续向前发展，更关系到航天员的生命与健 康。 达乌尔黄鼠( s p e r m o p h i l u s d a u r i c u s ) 作为一种典型的小型冬眠动物，在长达数月 的冬眠过程中，其骨骼肌无疑处于废用状态，但令人不解的是，黄鼠在出眠时并未发生 明显的诸如四肢乏力，行动缓慢等骨骼肌萎缩的常见症状。显然，黄鼠体内存在抗废用 性肌萎缩的机制。对黄鼠冬眠期抗肌萎缩机制的研究，不仅可以为冬眠动物的肌肉生理 学研究提供新的基础资料，还可为预防和治疗废用性肌萎缩尤其是航天失重所导致的肌 萎缩提供新的思路。 1 骨骼肌废用对非冬眠动物的影响 废用性肌萎缩在形态学上最直接的变化就是肌肉重量减轻、肌纤维横截面积缩小， 骨骼肌纤维与肌梭的超微结构均发生明显的退行性改变；骨骼肌的收缩张力明显降低， 收缩时程明显缩短，疲劳性增加。大量的临床资料和动物实验表明，废用状态下，肌梭 传入减少、骨骼肌血氧供应下降、蛋白质分解代谢增强与胞浆钙超载等因素均与废用性 肌萎缩的发生密切相关 a l iu ，2 0 0 9 ；p a y n em w ，2 0 0 7 ；s h e n k m a nb s ，2 0 0 8 。目前有关废 用性肌肉萎缩的预防与治疗，主要采用运动或机械性刺激，如间歇性牵拉、叩打刺激等 b e l a v yd l ，2 0 0 9 。但这些措施在制动( 如骨折固定) 及肌肉拉伤等条件下难以实施。 在航天飞行等条件下，即便每天有固定时间进行锻炼，仍只能减缓而不能防止废用失重 性肌萎缩的发生。有关废用性肌萎缩的药物防护，目前尚无相应药物可供选用。因此， 对废用性肌萎缩发病机理进行研究，寻找治疗这种疾病的有效手段是急需研究和亟待解 决的重要课题之一。 1 1 鉴定肌萎缩的常用方法 1 1 1 病理学检测 1 引言 该法主要是通过a t p a s e 酶组织或者h e 染色，检测组织肌纤维类型以及肌纤维横截 面积的变化，来鉴定肌肉萎缩的程度。 1 1 2 肌肉容积测量 现阶段，该法主要采用c t 、核磁共振等进行肌肉的肌纤维横截面积或者肌肉密度的 检测。 1 1 3 肌力测定 该法主要有手动检查和器械检查两类，手动检查简单、方便，但只能表明肌力的大 小，不能表明肌肉收缩耐力，且其测量易受人为因素影响，准确度差；器械检查常用仪 器有握力计、拉力计、等长收缩测力器、c y b e x 等速肌力测试系统等，可靠性高，误差 小 郄淑燕，2 0 0 3 。 1 2 废用性肌萎缩的相关动物实验模型 一般情况下，构建废用肌萎缩实验动物模型的方法是将实验动物尾部悬吊 b i g a r d a x ，1 9 8 8 ；c l a r k em s ，1 9 9 8 ；陈杰，1 9 9 3 或者石膏固定制动 h a r u t o s h is ，2 0 0 4 ；l e i v oi ， 1 9 9 8 ；刘光远，1 9 9 3 ；r i l e yd a ，1 9 9 2 ；m u s a e c i ax j ，1 9 9 0 。常见的废用性肌萎缩动物 实验模型主要有下面几种。 1 2 1 去负荷模型 去负荷模型也就是尾部悬吊法，该法具有创伤小，应激程度轻，与动物自然生理状 态接近，可自由取食和饮水等特点，后经陈杰等人改良后的去负荷模型，对动物几乎没 有损伤 c h e nj ，1 9 9 3 ，模拟“废用”效果更显著，因此该模型被大量地应用于肌肉去负 荷、运动减退及模拟失重等引起的废用性肌萎缩的研究中，常见的如大鼠尾部悬吊模型 m o r e y h o l t o ne r , 2 0 0 2 ；k n o xm ，2 0 0 4 。 1 2 2 制动模型 该模型主要包括肌膜切除与后肢固定两种方法。前者对动物损伤较大，主要用于模 拟临床上肌健损伤与重新构建修复病人的研究 r a n t a n e nj ，1 9 9 9 。后者是用石膏将实验 动物待检部位包裹，使该部位的肌肉制动，形成废用性萎缩症状 f i t t sr h ，19 8 6 ；b o o t hf w 1 9 8 7 ，该法已被广泛地应用于废用性肌肉萎缩的研究。我们先前的研究发现，大鼠后 肢制动7 天即可发生明显的肌肉萎缩症状，而尾部悬吊需1 4 天才可发生明显的症状 杜 2 西北大学硕士学位论文 育峰，2 0 0 6 。 1 2 3 运动减退模型 该方法要旨是尽量减少实验动物活动空间，使其被检测部位不能运动或者运动很 少，即使其处于低动力状态。也有学者运用冬眠动物( 如蝙蝠) 作为肌肉废用( 运动减 退) 模型进行研究。这类造模方法简单，成本较低，但“废用”效果很容易受到外界条件 的影响，不易控制与评价。 1 3 废用状态下骨骼肌形态结构的变化 废用状态下肌肉形态结构尤其是骨骼肌最直接的变化是肌肉萎缩，表现为肌肉重量 和体积减少，而且随着时间的延长，肌肉萎缩的状况会更加明显 m a r c ol d ，2 0 0 4 ；马永烈， 1 9 9 7 。在研究中，一般通过检测肌肉湿重、肌肉容积、肌纤维横截面积、肌纤维类型 转化等来衡量肌肉萎缩的严重程度。 1 3 1 肌肉湿重和肌肉体积的变化 肌肉湿重减少，体积变小是动物骨骼肌尤其是抗重力肌如s o l 在废用状态最明显的 特征。有研究表明，随c o s m o s l 6 6 7 卫星在太空上旅行7 天的大鼠，其s o l 、腓肠肌和 肱二头肌的湿重分别减少2 2 7 、1 0 7 和1 2 3 ，而肌纤维横截面积减少了三分之一 m a r t i nt p , 1 9 8 8 。 下肢围径和下肢容积在废用时也都明显减少。研究发现，卧床休息3 周，患者膝伸 肌体积减少了5 1 8 0 ，膝屈肌的体积减少了9 4 1 0 3 a k i m ah ，1 9 9 7 ；另据报道， 航天员飞行时间越长，其小腿容积减少的比例就越大。 在废用初期，肌肉湿重和肌肉容积的减少明显，之后逐渐减缓；初期肌肉容积的减 小主要是由于血液的转移和体液的丢失，而之后的减少则是由肌肉萎缩造成的 p r e g e up ， 2 0 0 2 ；k o z l o v s - k a y a , 19 81 。 1 3 2 肌纤维横截面积的变化 肌肉萎缩最直观的指标是肌纤维横截面积的减小，肌纤维横截面积会随着废用时间 的延长进行性减小，肌纤维密度会相应增大。研究发现，大鼠尾部悬吊2 周后，其s o l 的i 型肌纤维横截面积较正常大鼠明显减少( p o 0 1 ) ，肌纤维呈三角形或多边形，肌 束之间间隙增大 高云芳，2 0 0 6 。家兔后肢制动4 周，其s o l 的i 型肌纤维横截面积 3 引言 减少2 7 ，腓肠肌i 型和i i 型肌纤维横截面积分别减少了3 5 和4 0 n ig x ，2 0 0 0 ；卧 床1 4 天，人的膝伸直肌i 型和i i 型肌纤维横截面积分别减少了1 5 和1 7 b a m m a n m m ， 1 9 9 8 。 1 3 3 肌纤维类型的分类及转化 哺乳动物的骨骼肌纤维可分为慢缩性肌纤维( i 型为主) 和快缩性肌纤维( i i 型为主) 两类，比如肌球蛋白重链( m h c ) 分为为i 和i l 两种类型，而i i 型又可分为i i a 、i i x 和l i b 三种，其中i i a 为氧化型，i i x 为混合型，i i b 为酵解型。废用状态下肌纤维类型会发生i 型 向i i 型的转化，表现为i 型肌纤维数量减少，i i 型肌纤维数量增加，但总的肌纤维不变。 研究显示吊尾3 0 d 大鼠，其s o l 的i 型肌纤维比例下降了4 5 4 4 ，腓肠肌i i 型肌纤维比例 增加了3 2 4 6 沈羡云等，1 9 9 9 。尾部悬吊使肌纤维糖酵解能力增强，有氧代谢能力降 低，这是由于收缩蛋白向快缩肌纤维转化的缘故 r o yr r , 1 9 9 6 。 大量废用研究表明，正常状态下大鼠s o l 的m h c 主要由i 型和i i a 型肌纤维组成 z h ib i ny ue ta l ，2 0 0 7 ；t a l m a d g er j ，1 9 9 9 ；但关于废用后i i 型肌纤维亚型的表达有一定 的分歧：有研究认为尾部悬吊骨骼肌m h c 表达为i 型、i i a 、i i x 和l i b 四种 b a l d w i nk m ， 2 0 0 1 ；t a l m a d g er j ，1 9 9 3 。相反的报道认为，尾部悬吊后s o l 纤维类型表达为i 型i i a 和i k 型三种，没有i i b 型的表达 t a l m a d g er j ，1 9 9 6 。多数研究认为i i 型肌纤维含量的 增加主要是由i i x 和i i b 型增加，i i a 型减少造成的 z h ib i ny ue ta l ，2 0 0 7 ；c a i o z z ov j ， 1 9 9 6 。总的来说，肌球蛋白重链表达的变化引起了肌肉收缩蛋白在质和量上的变化， 从而导致肌纤维类型间的转化。 1 4 废用状态下骨骼肌蛋白质合成与分解速率的变化 骨骼肌蛋白质的合成过程包括d n a 的转录、m r n a 的表达以及多肽链的装配修饰， 相关的研究表明，失重早期肌肉蛋白质的减少主要是合成速率减小造成的，而后期则主 要是由蛋白质分解速率增强造成的 n a i t oh ，2 0 0 0 。大鼠模拟失重1 8 d 时后，s o l 中核 糖体的体积明显增大，这可能是因为模拟失重影响了多肽链的延伸，多肽链包裹核糖体 使其体积增大，多肽链的延伸受阻影响了蛋白质的翻译，从而使蛋白质的合成速率下降 k u ，1 9 9 4 。后肢制动大鼠在6 小时后就出现肌肉蛋白质合成速率的显著降低，表明蛋白 质合成的减少可能在肌肉萎缩的起始阶段起了重要作用 b o o h te w ，1 9 8 7 。 1 5 废用状态下肌肉酶活性的变化 4 西北大学硕士学位论文 废用条件下，由于身体活动的减少和下肢肌肉血流量的减少，以及物质和能量代谢 的变化，肌肉中酶学的特性也发生了相应变化。环境和活动状态的改变使肌肉中酵解酶 的活力升高。研究显示，磷酸果糖激酶、磷酸甘油脱氢酶和乳酸脱氢酶在s o l 中的活 力都明显升高，但腓肠肌中快酵解纤维及快氧化酵解纤维的l d h 活性不变，这表明废 用主要对慢肌纤维酶活性起作用。后来的研究发现，厌氧条件下，由于肌肉或肌纤维的 不同而产生了不同的反应，s o l 中慢缩肌和快氧化酵解肌的厌氧能力增加，而腓肠肌快 缩肌纤维不受影响，这可能是由于后者主要靠氧化通路提供能量，而慢肌纤维却依赖乳 酸脱氢酶。研究表明，大鼠s o l 慢肌纤维柠檬酸合酶活性增加、琥珀酸脱氢酶活性不变， 而快肌纤维琥珀酸脱氢酶活性却增加 t h o m a s o nd b e ta l ，19 9 0 。因此，快肌纤维氧化量 的增加导致肌肉呼吸容量的增加。另外，丙酮酸脱氢酶、醛缩酶和n a d h 脱氢酶等的 活性都可能下降。 1 6 废用状态下肌肉萎缩的防治 1 6 1 人工重力对抗 从理论上讲，人工重力是机体对抗微重力最有效的方法，即通过旋转产生人工重力 环境，对抗骨骼肌废用。人工重力对抗模拟失重大鼠的研究表明，间断性人工重力是一 种对抗抗重力骨骼肌萎缩的较好措施，尤以1g 人工重力对抗效果为好 孙标，2 0 0 0 。 单一人工重力只能部分对抗s o l 和腓肠肌萎缩，另外，人工重力装置设计复杂，人体 在旋转时会产生不适感，诱发空间运动疾病，因此限制了它在实际中的应用。 1 6 2 功能性对抗训练 常见的功能性训练有耐力训练、被动运动及抗阻运动等。耐力训练及阻力训练均可 通过促进肌纤维类型发生转化而增强肌力，对抗肌萎缩或者促进肌肉萎缩的恢复。研究 显示，阻力训练可以治疗因卧床而引起的肌肉萎缩疾病 b a m m a nm m ，1 9 9 8 ，加大负荷 训练可以恢复由尾部悬吊而引起的肌肉萎缩症状 h e r b e r tm e ，1 9 8 8 ，肌肉力量的增加 主要是由于阻力训练后神经传递和肌纤维容量增大的原因 k r a e m e r ，1 9 9 6 。有研究证 实，对大鼠进行模拟骑车耐力训练，发现其s o l 的湿重和肌纤维横截面积均显著增加 t a k a n a s h ig1 9 9 2 ；被动运动是利用物理装置或人工方法对骨骼肌进行被动的牵张运 动，以恢复发生萎缩骨骼肌的形态及功能。固定大鼠下肢并对其s o l 进行叩击式被动牵 张训练2 周，发现训练组大鼠s o l 湿重、肌纤维横截面积以及i 型肌纤维比例较对照组有 了显著提高 山崎俊明，1 9 9 3 。 5 引言 1 6 3 物理治疗 物理治疗也是促进萎缩肌肉功能的恢复的一种重要手段，常用的理疗方法有电刺 激、热疗法等。对尾部悬吊大鼠给予同步电刺激治疗1 周，发现悬吊组大鼠骨骼肌氧化 能力及最大收缩张力和电刺激组相比都显著减少，因此认为电刺激可以对抗由骨骼肌萎 缩引起的氧化能力和收缩功能的降低 y o s h i d an ，2 0 0 3 。研究人员认为耳后电流刺激可 以通过外侧前庭脊髓束和脊髓运动神经元影响后肢肌肉，进一步对抗肌肉萎缩 t a h a r at ， 1 9 9 4 ；每天对后肢悬吊大鼠的肌腱进行短时振动的研究发现，其s o l 肌重和肌纤维横 截面积下降的趋势减缓，肌肉收缩力的减小也有所放缓 f a l e m p i nm ，1 9 9 9 。热疗法是 通过提高骨骼肌质量和蛋白含量来治疗废用性肌萎缩。其原理是通过热疗来提高机体温 度或局部骨骼肌温度进而诱导热休克蛋白表达量的增加。有研究表明，对大鼠先进行6 小时的热疗，然后尾部悬吊8 天，发现其骨骼肌的萎缩得到明显缓解，同时肌蛋白及热 休克蛋白7 2 等的含量都有了明显增加 n a i t oh ，2 0 0 0 。 1 6 4 药物治疗 肌肉蛋白质的合成代谢率下降，分解代谢率增加是导致废用性肌萎缩的主要原因。 因此，某些能够促进蛋白质合成代谢的激素类药物( 如生长激素、甲状腺素、类固醇) 在治疗或对抗肌萎缩的措施研究中也得到了应用。有报道称用基因工程方法合成的人工 生物肌肉，移植于小鼠后肢皮下，能持续分泌生理剂量的生长激素，从而降低了s o l 的萎缩程度 v a n d e n b u r g hh ，1 9 9 8 ；也有研究认为维生素以及钙等可对抗肌萎缩的发生 e n d oi ，2 0 0 3 。 中药是我国的民族魁宝，其应用已有几千年的历史，在治疗废用性肌萎缩方面也有 独特的疗效。比如一些活血化瘀类药物如黄芪、丹参、川芎、当归等，已应用于肌肉萎 缩的治疗 曹晋，2 0 0 9 ；高云芳，2 0 0 5 ；沈羡云，2 0 0 2 。中药资源丰富，价格便宜，毒 副作用小，便于推广。因此，中药对废用性肌萎缩的对抗与治疗有着广阔的发展前景。 2 骨骼肌废用对冬眠动物的影响 2 1 冬眠状态下骨骼肌形态结构的变化 冬眠作为一种自然状态下的废用，其骨骼肌形态结构发生了怎样的变化呢? 研究表 明，动物在冬眠状态下其快慢缩肌重量均发生了不同程度的减轻。冬眠近半年的黄鼠其 腓肠肌湿重较冬眠前减少1 4 ，半腱肌较冬眠前减少4 2 w i c k l e rs j ，1 9 9 1 。有人认 6 西北大学硕士学位论文 为冬眠期间黑熊的腓肠肌与股二头肌c s a 没有变化 t i n k e rd b ，1 9 9 8 。但也有学者的 研究显示冬眠6 个月的黄鼠腓肠肌c s a 减少了1 5 2 0 s t e f f e ne ta l ，1 9 9 1 ；低温诱导后 的仓鼠，其胫骨前肌肌纤维c s a 明显减少，并且认为这种变化主要是由于i i 型肌纤维 的减少，而i 型肌纤维不变造成的 d e v e c id ，2 0 0 2 ；e g g i n t o ns ，2 0 0 1 。 对于冬眠期间骨骼肌纤维类型转化的研究表明，冬眠后的金背黄鼠( s p e r m o p h i l u s l a t e r a l i s ) 其慢肌( 主要由i 型肌纤维组成) 无明显萎缩，i 型和i i 型肌纤维比例亦无明 显变化；快肌( 主要由i i 型肌纤维组成) 中的半腱肌、腰肌与腓肠肌出现不同程度的萎 缩，且腓肠肌与跖肌中的i 型肌纤维轻度升高 z u i k o v ao v2 0 0 5 ；r o u r k eb c ，2 0 0 4 。冬 眠中的黑熊，其腓肠肌肌纤维比例无明显变化，股二头肌中i 型肌纤维则轻度降低 t i n k e r d b ，1 9 9 8 ；r o u r k eb c ，2 0 0 6 ，这一变化与金背黄鼠刚好相反。 总之，从仅有的研究来看，一般认为冬眠动物历经数月冬眠，其慢肌无明显萎缩， 快肌有轻度或较明显萎缩，或无萎缩 t i n k e rd b ，1 9 9 8 ，慢肌中i 型、i i 型肌纤维比例 无明显变化，远不像非冬眠动物如人或大鼠那样出现严重的废用性肌萎缩，且i 型肌纤 维比例明显升高，出现明显的慢肌向快肌的转化。 2 2 冬眠状态下冬眠阵的研究进展 冬眠是动物对低温环境，食物短缺等外界不良环境条件而采取的生存策略。动物的 整个冬眠过程是由多个入眠、深冬眠、激醒所组成的冬眠阵( h i b e r n a t i o nb o u t ) 构成的 s a l l m e n t , 2 0 0 3 ；刁颖，2 0 0 6 。冬眠阵是构成冬眠过程的一个基本单位，对于冬眠研究 的意义不言而喻。 1 ) 冬h 民阵中动物体温的变化 冬眠动物的体温在冬眠过程中随着冬眠阵的变化而呈现出一定的规律。其体温变化 主要有两个特点：( 1 ) 深冬眠时动物体温一般为2 1 0 。c h a n n a hv c ，2 0 0 3 ，最低可降到 3 c b a r n e sb m ，1 9 8 9 ；( 2 ) 在阵间激醒时体温又可以在2 - 3 h 内迅速回升到3 4 3 6 。这 些变化是动物主动体温调节的结果，也是其对恶劣环境的一种适应。这样超强的耐低体 温和大幅度地体温调节幅度是非冬眠动物所不能的 h e l l e rh c ，1 9 7 4 。 2 ) 冬眠动物冬眠阵的长短 不同冬眠动物冬眠阵的长短是不同的，同一种冬眠动物在整个冬眠过程中也因其 性别、年龄等的差异而表现出不同的冬h 民阵变化。吴宇英等( 1 9 9 2 ) 观察到达乌尔黄 7 引言 鼠冬h 民阵最长为2 2 0 h ，最短为3 6 h 。杨果杰等( 1 9 9 9 ) 通过实验观察指出达乌尔黄鼠冬 眠阵以1 3 d 为多，占总冬眠天数3 2 4 d 的4 5 ，最长的冬眠阵天数为1 6 d 。而最近的研 究却表明：雌性达乌尔黄鼠平均冬眠阵为5 6 士0 5 天，最长冬眠阵为9 6 士0 4 3 天，平均 阵间为1 4 士0 2 2 ，冬目民阵占到总冬眠天数的8 1 2 5 ；而雄性黄鼠平均冬眠阵为6 2 - l 0 3 2 天，最长冬眠阵为1 1 6 士1 1 2 天，平均阵间为1 2 _ q ：0 1 3 ，冬眠阵占到总冬眠天数的8 4 7 1 ， 二者并无差异。 3 ) 冬眠阵在冬眠过程中的作用 动物的冬眠是为了适应食物缺乏及恶劣的自然环境而采取的生存策略。冬眠的过程 是由一个个冬眠阵组成的，哪么冬眠阵在动物冬眠的过程中起了什么样的作用呢? 研究 者们的看法并不一致。b a m e s 指出冬眠中周期性觉醒的功能即冬眠阵的激醒是为了补偿 对睡眠需要的假说，他提出“冬眠动物周期性激醒是为了睡眠”，其理由是冬眠动物的脑 电图中缺少正常的睡眠波，冬眠过程中睡眠机制被抑制，动物周期性转入正常体温，是 为了恢复睡眠，保证体内的平衡机制。h e l l e r 也认同上述观点，其理由是具有较低体温 的动物的冬眠阵长度相比较大型冬眠动物来说更长，说明其睡眠债累积较缓慢 h e l l e r h c ，1 9 7 4 。也有学者对上述观点持不同意见，他们认为中枢神经系统的神经化学物质 的波动才是造成周期性激醒的真正原因。并且认为是中枢神经系统中高浓度的5 羟色胺 和阿片样物质诱导了动物的冬眠，当这些物质的浓度减小到不能够抑制机体代谢时，动 物激醒；此时这些物质又重新合成，来诱导动物的入眠，即进入了下一个冬眠阵。在此 基础上m a r t i n 等提出，动物入眠及维持入眠所需要的化学物质是由器官产生的，并且认 为有一个广谱蛋白酶抑制剂在冬眠中显著增加，其作用可能维持了冬眠中动物的内环境 稳定。据此推测，可能有一组基因，它们的产物只能在激醒的条件下合成，而在冬眠中 才被充分表达。有学者对金毛地鼠周期性复苏机制研究表明：动物周期性激醒是为了强 化其免疫系统，抵御各种细菌侵染。认为激醒过程中，产热和耗氧量均迅速增加。总之， 对冬眠阵的发生机理虽然各执一词，但冬眠阵在冬眠中有重要作用是毋庸置疑的。 2 3 冬眠阵与肌萎缩的可能关系 前已述及，动物历经数月冬眠，其慢肌无明显萎缩，快肌有轻度或较明显萎缩，或 无萎缩。这表明在冬眠动物体内一定有一种机制来抵抗骨骼肌的萎缩。冬眠阵作为冬眠 过程中的一个基本单位，自然就成了我们解开冬眠动物这种特有机制的最好钥匙。 8 西北大学硕士学位论文 国内外学者对冬眠阵的研究主要集中在对冬眠阵各个阶段生理生化指标的测定以 及冬眠阵发生机理的研究。最近的研究却表明： 榛睡鼠在冬眠期间保留了其肌肉结构和功能的完整性。它可能通过了以下两种方 式来实现：第一，冬眠期间较低的细胞核和线粒体活性可能补偿了肌纤维的损失；第二， 冬眠期间周期性的激醒，即肌肉强烈的震颤可能是对身体锻炼的模拟。这两方面的因素 可能也是其它冬眠动物对抗废用性肌肉萎缩的机制之一 m a l a t e s t am ，p e r d o n if ， b a t t i s t e u is ，e ta l ，2 0 0 9 。 3 本研究的目的与意义 前面已经提到，对于废用性肌肉萎缩的程度一般通过检测肌肉湿重、肌纤维横截面 积、肌纤维类型转化及肌纤维超微结构的变化等来衡量。 本课题组的早期研究已经表明：冬眠一个月、两个月达乌尔黄鼠后肢s o l 肌重体重 比较冬h 民前黄鼠分别减少了1 7 0 9 和2 2 2 2 ，但刚出眠黄鼠其肌重体重比较冬眠前黄 鼠无明显变化，其s o l 的i 型肌肌纤维比例没有发生显著性变化，但较冬眠前有上升趋 势，且这种趋势被出h 民所逆转 薛玮，2 0 0 9 ；e d l 肌肉湿重基本保持不变，肌纤维横截 面积增大，但在其出眠后基本恢复正常，肌纤维类型发生了明显的由i i 向i 型的转化， 而且比较稳定，在出眠后未恢复到冬眠前状态，而是接近夏季肌纤维比例 冯斑，2 0 0 8 。 综上所述，达乌尔黄鼠在漫长的冬眠过程中，其后肢s o l 和e d l 并没有明显的肌 肉萎缩症状，表现出了较强的抗肌萎缩特性。冬眠阵作为组成整个冬眠过程的一个重要 单元，研究其与冬眠期抗废用性萎缩机制的可能关系是本论文的基本思路。 本研究对冬眠前黄鼠、经历不同冬眠阵数目的黄鼠、以及出眠2 天，出眠1 4 天黄 鼠的体重、快慢缩肌湿重及肌重体重比、肌纤维类型和氧化与酵解酶活性的变化进行了 比较研究，同时用吊尾大鼠改进模型跟踪冬眠阵黄鼠，以期能够揭示冬h 民阵与冬眠动物 抗肌萎缩机制的关系，为废用性肌萎缩的治疗提供借鉴与思路1 9 西北大学硕士学位论文 第一章：黄鼠冬眠过程中冬眠阵发生规律的初步研究 1 1 前言 我们课题组先前的研究发现，冬眠期达乌尔黄鼠的后肢s o l 和e d l 并没有发生萎 缩 薛伟，2 0 0 9 ；冯斑，2 0 0 8 。这表明黄鼠体内有一种抗肌萎缩机制。前已述及，冬眠 阵是构成动物冬眠过程的一个基本单位，在冬眠研究尤其是冬眠发生机理的研究中占据 重要地位。可见，对冬眠阵发生规律的研究，不仅可以积累冬眠生理学基础资料，为冬 眠发生机理的研究提供数据，而且对于揭示冬眠动物抗肌萎缩机制具有很重要的指导意 义。 1 2 材料与方法 1 2 1 实验动物 实验黄鼠于2 0 0 8 年9 月中旬自陕西省渭南地区采集。带回实验室笼养，供应大鼠颗 粒饲料及凉开水，提供棉絮，锯末作为巢材和垫料。适应性饲养2 周后选取合适体重的 黄鼠作为对照组( c o n ) 进行实验。在1 1 月初，将黄鼠移入冬眠屋，无光照，温度保持 在5 c 1 0 ，湿度保持在5 0 - 6 0 ，选取合适体重的黄鼠作为冬眠组( h b g ) 进行 冬眠阵实验。 1 2 2 主要仪器 t h 。8 0 型互换半导体点温计上海精华仪器厂 w d h 型恒温控制台西光医疗器械公司 1 2 3 实验步骤 1 冬眠阵的观察记录 对入眠实验黄鼠采用传统的锯末技术 j u ny a ne ta l ，2 0 0 8 记录黄鼠冬h 民阵阵中睡 眠时长及阵间激醒时长，具体方法是将锯末置于黄鼠背部，每天早晚各观察一次，根据 黄鼠背部锯末的存在与否，来判断动物是否曾激醒，据此来记录冬日民阵及阵间激醒的时 长。 2 体温测定 1 ) 每天早上8 ：0 0 - - 一9 ：0 0 对实验黄鼠进行肛温测定，具体操作步骤为，打开半导 1 1 第一章黄鼠冬眠过程中冬眠阵发生规律初步研究 体点温计开关进行调零和量程调节，然后取下半导体点温计传感器帽，将点温计传感器 缓缓插入黄鼠直肠内3 5 c m ，并与尾部固定。待温度恒定后记录数据，将黄鼠放回原处。 为减少体温测定对黄鼠冬眠阵的影响，测量时动作要尽量轻微。 2 ) 激醒过程体温的测定：将处于深冬眠状态中的黄鼠移到室温为2 0 2 5 c ，相对湿 度为5 0 6 0 的动物实验室内，将半导体点温计的温度传感器缓缓插入黄鼠直肠内3 5 c m ， 并与尾部固定。每隔5 m i n 记录一次体温变化，直至黄鼠激醒并且体温保持稳定时停止记 录。 3 实验数据分析 实验数据采用s p s s l 6 0 软件中单因素方差分析法( o n e w a ya n o v a ) 进行分析。 首先用k s 法和f 值检验实验数据是否符合正态分布以及其方差的齐性。在满足正态分布 的条件下，如果数据满足方差齐性，用a n o v a l s d 法进行统计分析；如果不满足方差齐 性，则用a n o v a d u n n e t t s t 3 进行组间比较。实验结果以均数x s 表示，取p 0 0 5 ) 但是通过图2 2 可以清晰地看到黄鼠进入冬眠期后其s o l 肌重及肌重 体重比均呈下降趋势，出眠后呈上升趋势，在出眠1 4 天后基本达到冬眠前期水平。 通过跟踪冬眠阵的观察，我们取得了不同冬眠阵的黄鼠s o l 样本，并且对其肌重 体重比进行了比较研究，结果表明：与冬眠前肌重体重比相比，8 7 5 的冬眠阵黄鼠s o l 1 9 o o 0 0 0 0 0 o 0 弱 筋 加 佰 竹 5 第二章冬眠阵对黄鼠s o l 和e d l 肌肉湿重和肌重体重比的影响 肌重比均出现了不同程度的下降。而且发现随着冬眠阵个数的增加，肌重比下降幅度先 增大后放缓( 表2 3 ) 。 表2 2 冬眠阵对黄鼠s o l 湿重及肌重体重比的影响( x s ) t a b2 - 2e f f e c t so f h i b e r n a t i o nb o u to nt h ew e tw e i g h ts o l e u sm u s c l ea n dt h er a t i o so fm u s c l e w e t w e i g h t t o b o d y ( x s ) 0 1 0 0 0 8 0 0 2 0 0 0 二 s o lm w w ( g ) 盈缓溯s o。m w w ( g ) b w w ( 10 0 9 ) t t 西北大学硕士学位论文 体重比均呈上升趋势，出眠后呈下降趋势，在出眠1 4 天后仍高于冬眠前水平。 表2 - 3 冬眠阵数目对黄鼠s o l 肌重体重比的影响 t a b2 - 3e f f e c t so f h i b e r n a t i o nb o u tn u m b e r so ns o l e u sm w w b wo fg r o u n ds q u i r r e l 表2 4 冬眠阵对黄鼠e d l 肌肌重及肌重体重比的影响( x s ) t a b2 - 4e f f e c t so fh i b e r n a t i o nb o u to ne x t e n s o rd i g i t o r u mi o n g u sw e tw e i