（法医学专业论文）ministr复合扩增体系的研制与开发.pdf

中文摘要 m i n i s t r 复合扩增体系的研制与开发 摘要 目的：在法医d n a 检验中，s t r 技术已经广泛用于个人识别和亲权 鉴定方面。但是法医检案工作中，常常由于高温、潮湿、暴晒、微生物等 因素的影响，使检材中的d n a 分子被损坏，发生断裂，分子变小，大片 段丢失。在这些情况下应用s t r 技术不能成功地得出结论，经常会出现 “优势扩增”或者“无效扩增”，这就给正确的d n a 分型带来困难。重 新设计引物，减小扩增产物片段长度是目前解决d n a 高度降解检材检验 问题的一种新的方法。2 0 0 1 年9 1 1 恐怖事件时这种方法被应用于遇难者 的尸源认定，同时被正式命名为m i n i s t r 技术。目前，a b 公司已经开发 出针对c o d i s 系统以内8 个基因座的m i n i s t r 商品化试剂盒。但由于 c o d i s 系统内一些基因座侧翼序列不适合设计新的引物，或者等位基因 范围太大，使这些基因座的扩增片段长度难以缩短到理想长度( 1 2 5 b p ) ， 因而并非c o d i s 系统内所有的s t r 基因座都适用于设计成m i n i s t r 基因 座。为解决这个问题，增加系统效能，非常有必要寻找c o d i s 系统之外 的更多的m i n i s t r 基因座，并进行人群调查。因此，本实验的目的是在 数据库中筛选出适合中国汉族人群特征的m i n i s t r 基因座，然后将其构 建成新的m i n i s t r 荧光标记复合扩增体系；并按照美国d n a 分析方法技 术工作组( t w g d a m ) 的指导方案，对复合扩增系统的灵敏度，基因座 的种属特异性，案例应用，降解模型，陈旧样本等法医学应用进行初步研 究。最终构建成符合中国汉族人群特征的m i n i s t r 复合扩增体系，从而 推动法医d n a 试剂盒的国产化进程。 方法：参考c o b l e 等的引物，在中国河北汉族1 2 0 名无关个体中进 行2 6 个m i n i s t r 基因座p c r 扩增，获得河北汉族群体遗传学数据，根据 数据初步筛选出8 个多态性较高、片段较短的m i n i s t r 基因座；在中国 其他地区7 5 4 个无关个体中进行这8 个m i n i s t r 基因座p c r 扩增，扩增 产物使用聚丙烯酞胺凝胶电泳分离，银染法显色，获得8 个基因座的群体 遗传学数据和各基因座的常见等位基因。采用国产d n a 聚合酶构建这 8 个m i n i s t r 基因座的复合扩增体系，利用荧光复合扩增技术扩增，a b i 中文摘要 3 1 0 3 1 3 0 基因分析仪对产物进行检测，g e n e m a p p e r 3 2 软件分析结果；根 据不同引物浓度m 9 2 + 浓度、不同退火温度、不同循环次数下复合扩增的 效果对复合体系进行优化。根据群体遗传学研究的结果，应用分子克隆 技术构建各基因座等位基因标准分型物，并根据国际法医遗传学会 ( i n t e r n a t i o n a ls o c i e t yo f f o r e n s i cg e n e t i c s ，i s f g ) 推荐的命名原则对各等 位基因进行命名，同时根据检测数据进行统计分析编制出m i n i s t r 复合 扩增体系的基因分型模版。对该荧光标记复合扩增体系的灵敏度、种属 特异性、可重复性及对陈旧、腐败降解检材d n a 的检测能力进行了研究； 用实际案例进行验证，并与商品化试剂盒进行比较。 结果：成功构建了两个荧光标记m i n i s t r 复合扩增体系，其中复合 体系1 包含d 1 0 s 1 2 4 8 ，d 2 s 4 4 1 ，d 1 s 1 6 7 7 和d 9 s 2 1 5 7 四个基因座，复合 体系2 包含d 9 s 1 1 2 2 ，d 1 0 s 1 4 3 5 ，d 1 2 a t a 6 3 ，d 2 s 1 7 7 6 和a m e l o g e n i n 五 个基因座。应用该体系对3 0 0 份中国汉族无关个体样本进行检验分析，经 群体遗传学计算，该系统的累积个人识别率和非父排除率分别为 o 9 9 9 9 9 9 9 9 2 2 8 和0 9 8 5 4 7 1 3 0 7 3 2 。本实验构建的两个复合扩增体系条 件易于优化，采用国产t a q 酶进行扩增，即可得到满意的扩增产物和分型 结果。相对于国外昂贵的试剂盒，它是一种成本低廉但效率高的m i n i s t r 基因座复合扩增体系。应用分子克隆技术，对9 个基因座的6 4 个等位 基因进行克隆，经过调整各基因座等位基因的含量，构建出了两组复合体 系的等位基因标准对照体系。根据实验数据和测序的命名结果设置基因分 析命名参数指标，建立了两个荧光标记m i n i s t r 复合扩增体系的基因分 型命名模版，可以对样本准确分型。法医应用性研究证明该体系具有良 好的种属特异性，除恒河猴在a m e l o g e n i n 出现色谱峰外，其余8 个基因 座在8 种常见动物中均无特异性产物峰出现；对同一个体的不同组织检测 结果一致；在0 1 2 5 n g d n a 模板量的情况下，可对9 个基因座进行正确分 型；通过对陈旧样本和降解模型的研究证明，该体系对降解检材有良好的 扩增效果，较常规大片段s t r 试剂盒扩增成功率高，可用于常规试剂盒 扩增失败的降解样本的分型；通过8 个实际案例证明，该体系能用于法医 学实践中，结果与鉴定结论一致。 结论：本实验成功的构建了适合中国汉族人群的两个荧光标记 m i n i s t r 复合扩增体系。该荧光标记复合扩增体系可应用于a b i3 1 0 3 1 3 0 中文摘要 检测平台，该体系扩增条件易于优化，成本低廉，分型结果稳定，种属特 异性好，灵敏度和准确度高，对降解检材扩增成功率高，可以应用于法医 学实际检案中，特别适合对陈旧检材和降解检材的d n a 检测。为国内法 医d n a 分析提供了一个成本低，性能好的荧光标记m i n i s t r 复合扩增检 验系统，具有重大的应用价值。 关键词：m i n i s t r ；n o n c o d i s 基因座；中国汉族人群；遗传多态性； 降解检材 英文摘要 t h e d e v e l o p m e n to fm i n i s t rm u l t i p l e xa m p l i f i c a t i o nk i t a b s t r a c t o b j e c t i v e ：t h ef o r e n s i cd n at y p i n go fn u c l e a rs t rl o c ih a sw i d e l y u s e di nt h ec a s e si n v o l v i n gf o r e n s i ci d e n t i f i c a t i o na n dk i n s h i pt e s t i n g w h i l ei n f o r e n s i cc a s e w o r k ，i ti sp o s s i b l ea n dq u i t el i k e l yt h a tt h ed n a s a m p l e sw i l lb e h i 曲l yd e g r a d e dd u et oe x p o s u r et o e n v i r o n m e n t a le l e m e n t so rn a t u r a l c o n t a m i n a n t st h a tc a r lr e s u l ti nl o s so fi n f o r m a t i o na th i g h e rm o l e c u l a rw e i g h t s t rl o c i t h i sl o s so fs i g n a lm a yb et h ec a u s i n gap a r t i a ld n ap r o f i l ew i t h a l l e l eo re v e nc o m p l e t el o c u sd r o po u t i tw i l lm a k et h ed i f f i c u l t yo fd n a t y p i n g r e d e s i g nt h ep r i m e r sa n dr e d u c i n gt h es i z e o ft h ep c rp r o d u c t s ( m i n i s t r ) i sa ne s t a b l i s h e da n dh i g h l ye f f e c t i v em e t h o df o ri m p r o v i n gt h e m o l e c u l a ra n a l y s i so fh i g h l yd e g r a d e dd n as a m p l e s t h i sm e t h o dw a su s e d t oa i di d e n t i f i c a t i o no fw o r l dt r a d ec e n t e rv i c t i m si n2 0 01a n dn a m e d m i n i s t r t e c h n i q u e a p p l i e db i o s y s t e m sh a sd e v e l o p e dam i n i s t r k i tc a p a b l e o fa m p l i f y i n g8c o r es t rl o c ia n da m e l o g e n i nw i t hr e d u c e dp c rp r o d u c t s i z e si nc o m b i n e dd n ai n d e xs y s t e m ( c o d i s ) b u ts e v e r a lo ft h ec o d i s c o r es t rl o c ih a v eal a r g en u m b e ro fr e p e a t so rw i d ea l l e l er a n g e so rt h el i m b s e q u e n c ei nt o oc o m p l e xt or e d e s i g nt h ep r i m e r st h a t a r en o to p t i m a lf o r g e n e r a t i n gs m a l la m p l i c o n s i no r d e rt os o l v et h i sd i f f i c u l t ya n di m p r o v et h e e f f i c i e n c y o ft h es y s t e m ，i ti s v e r yi m p o r t a n tt of i n ds o m em i n i s t rl o c i b e s i d e st h ec o d i sl o c i s o ，t h ep u r p o s eo ft h i sp r o j e c ti st oc h o o s es o m el o c i w h i c ha r es u i t a b l ef o rt h ec h a r a c t e ro fc h i n e s eh a np o p u l a t i o na n de s t a b l i s ha n e wf l u o r e s c e n t m u l t i p l e x m i n i s t rs y s t e m as e r i e so fv a l i d a t i o n e x p e r i m e n t s ，s u c ha st h es e n s i t i v i t y ，a c c u r a c ya n ds p e c i e ss p e c i f i c i t y ，w e r e p e r f o r m e d f o rt h em i n i s t r m u l t i p l e xs y s t e m sa c c o r d i n g t ot h e r e c o m m e n d a t i o no ft h et e c h n i c a lw o r kg r o u pd n aa n a l y s i sm e t h o d s ( t w g d a m ) a tl a s t ，w ee s t a b l i s h e dt w om i n i s t rm u l t i p l e xs y s t e m sw h i c h w e r es u i t a b l ef o rt h ec h i n e s eh a np o p u l a t i o na n di tw o u l di m p u l s et h e d e v e l o p m e n to f t h eh o m e - m a d ef o r e n s i cd n at e s tk i t 4 英文摘要 m e t h o d s ： u s i n gt h ep r i m e r ss e tf r o mc o b l e s ，at o t a lo f12 0s a m p l e s f r o mu n r e l a t e di n d i v i d u a l si nh e b e ih a np o p u l a t i o nw a st e s t e dw i t ht h e2 6 m i n i s t rl o c i a c c o r d i n gt h eo b t a i n e dg e n e t i cd a t a ，w ec h o o s e8l o c iw h i c h h a v eh i g h l yp o l y m o r p h i s ma n ds h o r tf r a g m e n tl e n g t ht oi n v e s t i g a t ei nt h e o t h e ra r e a s p c rp r o d u c t sw e r ea n a l y z e dw i t hg e l e l e c t r o p h o r e s i s a n d v i s u a l i z e db ys i l v e rs t a i n i n g t h eg e n e t i cd a t a sa n da l l e l e so f e a c hl o c u sw e r e o b t a i n e d w ec o n s t r u c tt h em i n i s t rm u l t i p l e xs y s t e m su s i n gd o m e s t i ct a q d n ap o l y m e r a s ea n dd e t e c tt h er e s u l t sb ya b i310 3130g e n e t i ca n a l y z e r f r a g m e n ts i z ed e t e r m i n a t i o na n dg e n o t y 7 p i n gw e r ed o n ew i t hg e n e m a p p e r v 3 2 o p t i m i z et h em u l t i p l e xa m p l i f i c a t i o nc o n d i t i o n sa c c o r d i n g t ot h e o u t c o m e so ft h ed i f f e r e n tm 9 2 + c o n c e n t r a t i o n ，d i f f e r e n ta n n e a lt e m p e r a t u r e a n dd i f f e r e n t c y c l et i m e s u s i n g m o l e c u l a rc l o n ea n d s e q u e n c i n g t e c h n i q u e st oc o n s t r u c tt h es t a n d a r da l l e l i cl a d d e r sa n dn a m i n gt h ea l l e l i c l a d d e r sa c c o r d i n gt ot h ep r i n c i p l e so ft h ei n t e m a t i o n a ls o c i e t yo ff o r e n s i c h a e m o g e n e t i c s ( i s f g ) c o m p i l e t h e a u t o t y p i n gt e m p l a t ea c c o r d i n gt o t h e s t a t i s t i cr e s u l t s as e r i e so fv a l i d a t i o ne x p e r i m e n t s ，s u c ha st h es e n s i t i v i t y ， a c c u r a c y ，s p e c i e ss p e c i f i c i t y ，s t a l eb l o o ds p o ta n dd e g r a d e dd n as a m p l e si n t h ec a s e sw e r e p e r f o r m e d f o r t h em i n i s t rm u l t i p l e xs y s t e m sa n dt h e c o m m e r c i a lk i t s r e s u l t s ：w eh a v es u c c e s s f u l l yc o n s t r u c t e dt w of l u o r e s c e n tm u l t i p l e x m i n i s t rs y s t e m so fg r o u p1a n dg r o u p2 t h eg r o u p1 s y s t e mi n c l u d e s d 1 0 s 1 2 4 8 ，d 2 s 4 4 1 ，d 1 s 1 6 7 7a n dd 9 s 2 1 5 7f o u rl o c i t h eg r o u p2s y s t e m i n c l u d e sd 9 s 11 2 2 ，d 1 0 s 1 4 3 5 ，d 1 2 a t a 6 3 ，d 2 s 1 7 7 6a n da m e l o g e n i nf i v e l o c i a l l e l ef r e q u e n c i e sa n df o r e n s i cp a r a m e t e r so ft h ee i g h tm i n i s t rl o c i w e r ei n v e s t i g a t e db yt h et w os y s t e m si n30 0c h i n e s eh a np o p u l a t i o n s t h e a c c u m u l a t e dp o w e ro fd i s c r i m i n a t i o na n dp o w e ro fe x c l u s i o nf o rt h ee i g h tl o c i w e r eo 9 9 9 9 9 9 9 9 2 2 8a n d0 9 8 5 4 713 0 7 3 2 ，r e s p e c t i v e l y t h et w os y s t e m s w e r e e a s y t o o p t i m i z e a n d u s i n g d o m e s t i c t a q c a no b t a i ns a t i s f i e d a m p l i f i c a t i o nr e s u l t s t h e ya r el o w c o s t b u te f f i c i e n t s y s t e m s u s i n g m o l e c u l a rc l o n et e c h n i q u ec o n s t r u c t e d6 4c l o n eo ft h e9l o c i a f t e ra d j u s t i n g t h ec o n c e n t r a t i o no f e a c hl o c u s ，w ee s t a b l i s h e dt h et w os y s t e m s t h es t a n d a r d 5 英文摘要 a l l e l i c l a d d e r s a c c o r d i n g t ot h e e x p e r i m e n t a l d a t aa n dr e s u l t so ft h e s e q u e n c i n gs e tt h ea u t o m a t i ca n a l y s i sn a m i n gp a r a m e t e r sa n de s t a b l i s h e dt h e a u t o m a t i cc l a s s i f i c a t i o nn a m e dt e m p l a t eo ft h et w of l u o r e s c e n tm u l t i p l e x m i n i s t ra m p l i f i c a t i o ns y s t e m s t h e yc a nt y p et h es a m p l e sa c c u r a t e l y f o r e n s i c a p p l i e d r e s e a r c h p r o v e d t h a tt h e s y s t e m s h a v ea g o o d s p e c i e s - s p e c i f i c i na d d i t i o n t ot h ee m e r g e n c eo fr h e s u sm o n k e y si nt h e a m e l o g e n i np e a k ，t h er e m a i n i n g8l o c ii n8c o m m o na n i m a l sw a sn os p e c i f i c p e a k sa p p e a r t h er e s u l t so f t h es a m ei n d i v i d u a l si nd i f f e r e n to r g a n i z a t i o n sa r e c o n s i s t e n t t h es e n s i t i v i t yo ft h es y s t e m sw a so 12 5 n gt e m p l a t ed n a a f t e r t e s t i n gt h ea g e ds a m p l e sa n dt h ed e g r a d e dd n am o d e ，i tw a sd e m o n s t r a t e d t h a tt h e s em i n i s t rs y s t e m sh a dah i g hs u c c e s sf o ra n a l y s i so fd e g r a d e d s a m p l e s t h e yc a nb eu s e dt oa n a l y s i st h es a m p l e sw h i c ht h ec o n v e n t i o n a l a m p l i f i c a t i o nk i tf a i l u r et ot y p i n g t h es y s t e m sp r o v e dt ob eu s e di nf o r e n s i c i d e n t i f i c a t i o na n dp a t e m i t yt e s tt h r o u g ht h ea c t u a lc a s e s t h er e s u l t sa r es a m e t ot h ei d e n t i f i c a t i o nc o n c l u s i o n s c o n c l u s i o n s ：o u rr e s e a r c hs u c c e s s f u l l yc o n s t r u c t e dt w of l u o r e s c e n t m u l t i p l e xm i n i s t ra m p l i f i c a t i o ns y s t e m s s u i t a b l ef o rt h ec h i n e s eh a n p o p u l a t i o n t h e s es y s t e m sc a nb es u c c e s s f u l l y u s e di nt h ea b i310 313 0 d e t e c t i o np l a t f o r mt og e tt h er e l i a b l ed a t a t h er e s e a r c ho ff o r e n s i cg e n e t i c s i m p l i e st h a tt h e ya r ee a s i l y r e g u l a t e d ，l o wc o s tm u l t i p l e xs y s t e m s w i t hs t a b l e o u t c o m e ，h i g hs e n s i t i v i t ya n dg o o ds p e c i e ss p e c i f i c i t y b a s e d o nt h e s e a d v a n t a g e s ，t h e yc o u l db er e c o m m e n d e dt ot h ep r a c t i c eo ff o r e n s i cg e n e t i c s e s p e c i a l l yt h e yc a nb eu s e di nt h ea n a l y s i so fd e g r a d e dd n as a m p l e s t h e y h a v eg r e a tv a l u ef o rp r o v i d el o wc o s t ，g o o dp e r f o r m a n c ef l u o r e s c e n tm i n i s t r m u l t i p l e xs y s t e m st ot h ed o m e s t i cf o r e n s i cd n aa n a l y s i s k e y w o r d s ：m i n i s t r ；n o n - c o d i sl o c i ；c h i n e s eh a np o p u l a t i o n ； g e n e t i cp o l y m o r p h i s m ；d e g r a d e dd n a 6 河北医科大学 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 本学位论文在导师( 或指导小组) 的指导下，由本人独立完成。本学位论 文研究所获的研究成果，其知识产权归河北医科大学所有。河北医科大学有权 对本学位论文进行交流、公开和使用。凡发表与学位论文主要内容相关的论文， 第一署名单位为河北医科大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权 均归河北医科大学所有。否则，承担相应的法律责任。 研究生签名：臼驾 导师签章：膨5 弋二级学院领导签章： 硼o ? 年6 其 河北医科大学 研究生学位论文独创性声明 本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，除了文中特别 加以标注和致谢等内容外，文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，指 导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写，文责自负。 研究生签名：臼驾 导师签章： 够 砂 潲年6 窍 目 研究论文 m i n i s t r 复合扩增体系的研制与开发 法庭生物学涉及多种边缘学科。目前法庭生物物证鉴定已由常量检测 发展到微量及超微量检测，由蛋白质水平检测发展到分子水平检测，由做 出否定结论发展到做出肯定结论，发生了质的飞跃。但是对于超微量生物 检材，尤其是高度降解检材应用常规d n a 提取及目前商品化的s t r 检测 经常会出现大片段等位基因丢失的现象，难以得到正确的d n a 分型。而 通过将引物设计得更接近s t r 基因座的重复区域而使p c r 产物片段缩小 ( 即m i n i s t r ) ，可明显提高对于降解检材d n a 分型的成功率。美国国 家标准及技术研究院( n i s t ) 的c o b l e 和b u t l e r 首次在2 0 0 5 年报道了6 个c o d i s 系统以外的m i n i s t r 基因座，日本、新加坡等相继报道了该6 个基因座的本国人群数据。2 0 0 5 年欧洲d n a 分型工作组( e d n a p ) 委 托9 个欧洲实验室和1 个美国实验室专门对降解检材d n a 进行分析，比 较了f s s 提供的s n pm u l t i p l e xk i t 和n i s t 提供的m i n i s t rk i t 的分型成 功率，综合1 0 个实验室的结果认为，m i n i s t r 的分型成功率更高、更有 效。e d n a p 建议将n c 0 1 的3 个m i n i s t r 基因座增加入欧洲d n a 数据 库中，既可提高对高度降解检材或混有污染物检材d n a 的分型成功率， 还可增加系统的个人识别能力。m i n i s t r 基因座被e d n a p 定义为继s t r 之后的新一代遗传标记。但对于解决严重降解检材d n a 的分型问题，还 需要更多的m i n i s t r 基因座来增加系统效能。c o d i s 系统之内的部分s t r 基因座本身片段较长，无法通过重新设计引物缩短扩增片段，因此非常有 必要寻找c o d i s 系统之外的更多的m i n i s t r 基因座，并进行人群调查。 目前，国内m i n i s t r 的研究较少，且尚未开发出m i n i s t r 商品化试剂盒。 因此，我们将从g d b 数据库中筛选一批m i n i s t r 基因座，并进行中国人 群的群体遗传学调查，构建五色荧光分析体系来建立m i n i s t r 基因座 d n a 分型技术体系，按照美国d n a 分析方法技术工作组( t w g d a m ) 的指导方案【l 】，对复合扩增系统的灵敏度，基因座的种属特异性，案例应 用，降解模型，陈旧样本等法医学应用进行初步研究。本实验的研究内容 将推动法医d n a 试剂盒国产化的进程。 研究论文 第一部分 m i n i s t r 基因座的研究与优选 - j 一 刚舌 短串联重复序列( s h o r tt a n d e mr e p e a t s ，s t r ) 是继限制性长度多态性 ( r e s t r i c t i o nf r a g m e n g l e n g t hp o l y m o r p h i s m ，r e l p ) 之后，被发现的又一个 人类遗传性标记，因其在人类基因组中分布极为广泛并大多具有高度多态 性而成为目前最常用的第二代遗传标记系统，是当前法庭科学中物证鉴定 中的主流技术。运用p c r 技术对s t r 基因座进行复合扩增可以得到微量 d n a 检材的基因分型。但法医d n a 检材主要来源于现场，由于所处环 境因素的作用，尤其是高温、潮湿、微生物酶解等多种因素的作用，常常 导致检材中d n a 受到破坏，d n a 链发生断裂、分子变小而出现d n a 降 解1 2 1 。在大型灾难事件中( 例如在美国9 1 1 事件和印度洋海啸灾难等) ， d n a 检材更容易发生高度降解，导致d n a 严重破坏。使用商业化s t r 复合扩增试剂盒检测时，常常无法得到有效的扩增，表现为扩增效率随着 片段增大而显著降低、等位基因缺失或者完全丢失，只得到部分s t r 分 型结果【3 巧】，会造成个人识别能力低以及错误的判断。d n a 降解检材的同 一认定和亲权鉴定，成为现阶段法医d n a 检验的难题，也制约了许多重 要物证的价值。近年来，很多学者试着重新设计引物、减小扩增片段【6 7 】 来解决高度降解d n a 检材检验问题，这种方法被称为m i n i s t r 。目前已 经建立了一些m i n i s t r 检测系统，证实了m i n i s t r 不仅可以显著提高高 度降解d n a 检材的检出率，还具有高灵敏度、与现有的d n a 数据库相 兼容等的特点可应用于d n a 实际检案中。m i n i s t r 技术是目前检测降解 d n a 的一个新的发展方向。 如何从有限的样本中得到更多的信息量，一直是法医d n a 检验技术 所追求的目标之一。增加检验基因座数量和优选多态性更高的基因座可以 实现这一目标。由于在不同区域、不同种族和不同民族之间遗传标记存在 遗传差异性，因此本部分实验旨在筛选出适用于中国汉族人群遗传学特性 的基因座，构建出适合中国汉族人群的m i n i s t r 复合扩增体系。根据以 研究论文 上目的，本实验从文献【8 母】和遗传学数据库( g e n e t i cd a t ab a n k ，g d b ) 中初步筛选出2 6 个m i n i s t r 基因座，逐个合成引物，建立检验方法，对 其在中国汉族人群中的遗传多态性展开调查。按照法医学d n a 检验对 s t r 基因座的要求，对上述基因座的相关遗传学统计指标进行了系统的 研究评价，最后筛选出d 1 0 s 1 4 8 2 ，d 2 s 4 4 1 ，d 1s 1 6 7 7 ，d 9 s 2 1 5 7 ，d 9 s 11 2 2 ， d 1 0 s 1 4 3 5 ，d 1 2 a t a 6 3 和d 2 s 1 7 7 68 个基因座进行第二部分的实验。 1 材料 1 1 主要仪器 8 0 m d f 3 8 2 e 型超低温冰箱 微量移液器 t g l 1 6 g 台式高速离心机 3 k1 8 型低温超速离心机 t d a 8 0 0 2 型电热恒温水浴箱 i v i e s 3 0 2 0 型高压消毒锅 x w - 8 0 a 旋涡混合器 7 9 1 磁力加热搅拌器 d y v i i i 水平电泳槽 d y c z 一2 4 a 型电泳槽 u v 型紫外分析仪 黑马凝胶成像系统 核酸定量仪n d l 0 0 m i l l i qs y n t h e s i s 超纯水仪 p t c 2 0 0p c r 扩增仪 a b i9 7 0 0p c r 扩增仪 a b ip 耐s m3 1 0 基因分析仪 a b i3 1 3 0 基因分析仪 g e n e m a p p e r3 2 软件 1 2 主要试剂 材料与方法 日本s a n y o 公司 法国g i l s o n 公司 上海医用分析仪器厂 美国s i g m a 公司 天津市泰斯特仪器有限公司 日本s a n y o 公司 上海医科大学仪器厂 上海浦东物理光学仪厂 北京六一仪器厂 北京六一仪器厂 珠海黑马医学仪器有限公司 珠海黑马医学仪器有限公司 美国g e n e 有限公司 美国m i l i p o r e 公司 美国m j 公司 美国a b 公司 美国a b 公司 美国a b 公司 美国a b 公司 研究论文 血液基因组d n a 提取试剂盒 c h e l e x 1 0 0 蛋白酶k 9 9 4 7 ad n a p c r 扩增引物 d n t p 1 0 p c r 反应缓冲液 m g c l 2 t a q d n a 聚合酶 6 l o a d i n g b u f f e r 硝酸银分析纯 d n am a r k e r e b 显色液1 0 m g m l 去离子甲酰胺 g s 5 0 0 l i z 电极缓冲液 p o p 4 液体胶 t i a n g e n 生化科技有限公司 美国s i g m a 公司 美国p r o m e g a 公司 美国p r o m e g a 公司 上海生物工程技术有限公司 上海生物工程技术有限公司 上海生物工程技术有限公司 上海生物工程技术有限公司 上海生物工程技术有限公司 大连宝生物公司 北京益利精细化学品有限公司 大连宝生物公司 北京天为时代生物公司 美国a b 公司 美国a b 公司 美国a b 公司 美国a b 公司 1 3 主要试剂的制备 1 3 15 c h e l e x 1 0 0 储备液( 室温保存) 试剂名称加入量 c h e l e x 一10 0 颗粒 灭菌去离子水 1 mn a o h 5 9 1 0 0 m l 调节p h 值至9 11 1 3 25 t b e 1 3 33 0 a p ( 1 9 ：1 ) 研究论文 试剂名称加入量 丙烯酰胺 双叉丙烯酰胺 2 8 5 7g 1 5 9 双蒸水至1 0 0m l 1 3 52 变性上样b u f f e r 1 4 样本来源 研究论文 12 0 份河北汉族无关健康个体抗凝血，7 5 4 份中国汉族无关个体血痕 样本，来自东北、西北、西南、中南、华东5 个地区汉族人群。 2 实验方法 2 1 1 血液样本d n a 的提取 1 2 0 份河北汉族无关健康个体抗凝血样采用天根血液基因组d n a 提 取试剂盒提取： 1 ) 取2 0 0 9 l 抗凝血放入1 5 m le p p e n d o r f 管中，加入2 0 9 l 蛋白酶k 溶液， 混匀，加入2 0 0 9 l 缓冲液g b 充分颠倒混匀，5 6 。c 水浴1 0 m i n ，其间 颠倒混匀数次，溶液变清亮 2 ) 加入2 0 0 9 l 无水乙醇，充分颠倒混匀，将e p p e n d o r f 管中所有溶液都 加入一个吸附柱中，将吸附柱放入收集管中，1 2 0 0 0 r p m 离心3 0 s ，倒 掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中 3 ) 向吸附柱中加入5 0 0 i r t l 缓冲液g d ，1 2 0 0 0 r p m 离心3 0 s ，倒掉收集管 中的废液，将吸附柱放回收集管中 4 ) 向吸附柱中加入7 0 0 t l 漂洗液p w ，1 2 0 0 0 r p m 离心3 0 s ，倒掉收集管 中的废液，将吸附柱放回收集管中 5 ) 向吸附柱中加入5 0 0 i - t l 漂洗液p w ，1 2 0 0 0 r p m 离心3 0 s ，倒掉收集管 中的废液，将吸附柱放回收集管中，1 2 0 0 0 r p m 离心2 m i n ，倒掉废液， 将吸附柱室温放置4 m i n ，彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液，将吸附 柱转入一个干净的离心管中 6 ) 向吸附膜中间位置悬空滴加1 0 0 9 l 洗脱液t b ，室温放置4 m i n ， 1 2 0 0 0 r p m 离心2 m i n ，将溶液收集到离心管中，既为基因组d n a ，8 0 保存 2 1 2f t a 卡血痕样本d n a 的提取 7 5 4 份中国汉族无关个体血样参考文献【l0 】采用c h e l e x 1 0 0 法提取： 1 ) 将f t a 卡上血痕剪下3 3 m m 大小，放入5 0 0 l al 无菌蒸馏水中室温 浸泡2 0 m i n ，其间震荡数次，1 2 0 0 0 r p m 离心3 0 s ，弃上清 2 ) 加入1 0 0l al5 c h e l e x 1 0 0 的悬浮液悬浮细胞核，5 6 保温3 0 m i n ， 震荡1 0 s 3 ) 1 0 0 。c 煮沸8 m i n ，震荡1 0 s ，1 2 0 0 0 r p m 离心l m i n ，除去与金属离子结 合的c h e l e x 1 0 0 颗粒和其他非d n a 成分，取含有d n a 的上清液直接 研究论文 进行p c r 或于2 0 保存备用 2 2 引物 参照文献 8 1 获得2 6 个基因座的引物序列，各基因座相关信息见t a b l e 1 1 。引物均由上海生工生物技术有限公司合成。 2 3d n a 含量测定 用美国g e n e 公司的n d 1 0 0 核酸定量仪对所提d n a 定量。操作步骤 如下： 1 )