（内科学专业论文）larginine对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞衰老的作用及机制研究.pdf

目 j 煳辫 、，二。：竺i l l i l l l 叭i l l l n 录 一、摘要1 中文论著摘要1 英文论著摘要5 二、英文缩略语1 0 三、论文1 1 论文一不同糖浓度对人脐静脉内皮细胞衰老的影响 前言。1 1日u 吾1 材料与方法1 2 实验结果1 9 讨论2 7 结论2 9 论文二l - a r g i n i n e 对内皮细胞衰老的作用及机制研究 第一部分 前言3 1 。月u 吾j 材料与方法3 3 实验结果3 7 讨论4 4 结论4 6 第二部分 前言4 。7日u 吾， 材料与方法一4 9 实验结果5 6 讨论6 7 结论7 1 四、本研究创新性的自我评价7 2 五、参考文献7 3 8 0 8 0 9 8 9 9 0 0 内皮细胞衰老的 性疾病，其血管并发症是 尿病人群中动脉粥样硬化 器同时受累较多。一些研 是动脉粥样硬化的早期病 发展有效阻断药物，是防 内皮细胞是糖尿病血管病变的关键靶组织。它不仅在抗凝血因子形成过程中 起着保护屏障作用，而且其自身可分泌因子调节血管管腔和保持内环境稳态的作 用。正常生理状态下，内皮细胞的更新率很低，分裂增殖能力有限，但因损伤( 如 高糖刺激) 导致细胞不断的分裂将引起端粒缩短，细胞进入衰老期，表现为s a d g a l 活性增强、细胞停滞在细胞周期的g o g 1 期、衰老相关的基因和蛋白表达阳性以及 端粒酶活性降低等；同时，血管内皮细胞衰老过程中，分泌的各种生物学活性因 子也在发生变化，如n o 的合成下降、炎性因子合成增加、粘附因子表达增多等。 这些变化都将造成内皮细胞功能障碍，最终导致动脉粥样硬化的发生。可见，衰 老与糖尿病相关的动脉粥样硬化存在密切关系。 端粒钟学说是衰老发生机制的学说之一。端粒是真核细胞染色体末端的d n a 序列，随着细胞的每次分裂，端粒不断缩短，当缩短到一个阈值时，便不能维持 染色体的稳定，使细胞失去分裂增殖能力而进入了衰老阶段。因此，端粒缩短被 认为是触发细胞衰老的分子钟，可作为衰老的生物标记。端粒酶是一种核糖核蛋 白逆转录酶，可以在缩短的端粒末端加上新的重复序列，保持端粒长度，在调节 寿命与细胞增殖方面扮演着重要的角色。端粒酶活性的调控是多因素的，p 1 3 k a k t 通路正是其中之一。对黑色素细胞瘤细胞系s k m e l 2 8 的研究发现，在无血清培 养2 4 d , 时后肿瘤细胞a k t 活性升高，端粒酶的活性增加2 倍，而端粒酶逆转录酶催 化亚基( h u m a nt e l o m e r a s e r e v e r s e t r a n s c r i p t a s es u b u n i t ，h t e r t ) 的两个 x x i m ( ) ( s 凇序列也相应出现了磷酸化；应用p 1 3 k 抑制剂可以降低肿瘤细胞端 粒酶的活性并抑制h t e r t 的磷酸化。因此，a k t 必然成为端粒酶十分重要的上游调 节点。 氧化应激的增加与n o 生物利用度的减少在细胞衰老中起着重要的作用。有研 究显示高糖可以增加细胞t 勾r o s 的产生，而后者可通过抑n s r c 家族激酶的活性而 缩短端粒的长度，加快衰老的进程。n o 能与过量的r o s 反应而减轻细胞氧化应激 的程度。n o 被认为是最主要的内皮源性自分泌因子，它可以调节血管管腔大小， 抑制血小板聚集、抗凋亡、抑制平滑肌细胞增殖和白细胞粘附，因而在抗动脉粥 样硬化过程中发挥着重要的作用。很多研究发现内皮型n o s ( e n o s ) 的表达和n o 的 合成随年龄的增加而下降，虽然其机制目前还不明确，但有研究表明p 1 3 k a k t 可 以介导e n o s 的磷酸化，亦有研究显示2 型糖尿病患者内皮功能紊乱与 p 1 3 眦t e n o s 通路受到抑制有关。因此，在内皮细胞中上调p 1 3 k a k t 信号系统应 是防治糖尿病大血管病变的一个重要靶点。 l a r g 是n o 合成的前体物质，在1 9 9 2 年c r e a g e r 和d u b o i s - r a r d e 两组学者首次 断定，补充e n o s 作用的底物l - a r g 是增加内皮产生生物活性n o 的一种方法。l - a r g 改善内皮细胞功能的机制相对多样化，尚未阐明，这种作用可能与增 3 1 n o 的合成 和e n o s 蛋白表达，减少r o s 的形成有关。 综上所述，本实验在体外模拟高糖状态，观察高血糖是否加速人脐静脉内皮 细胞衰老，其对n o 、e n o s 蛋白表达及转录水平的影响，以及与p 1 3 k a k t 信号通 路的关系，而l a r g 是否可以延缓高糖加速的内皮细胞衰老的进程，其作用机制是 否与p 1 3 k a k t 通路有关，为进一步探讨糖尿病大血管病变发病机制及其防治手段 提供实验依据。 材料与方法 2 1 、人脐静脉内皮细胞株培养，不同浓度的葡萄糖溶液孵育细胞、高糖( 3 3m m ) 和 或不同浓度l a r g i n i n e 共同孵育细胞，以及同一浓度孵育不同的时间，收集内皮 细胞及细胞培养液；分别用p 1 3 k a k t 特异性抑制剂l y 2 9 4 0 0 2 、e n o s 特异性抑 制剂l n a m e 进行预处理2h ，然后于上述因素孵育细胞，收集内皮细胞及细胞 培养液，用于指标检测。 2 、衰老相关的d 半乳糖苷酶活性检测是通过染色计算阳性细胞的百分比来确定， 后者是指1 0 0 0 个细胞中被染成蓝绿色细胞的百分比。 3 、采用p c r - e l i s a 法检测端粒酶的活性。 4 、应用流式细胞术检测活性氧及分析细胞周期。 5 、应用r t - p c r 技术检测p 1 3 k 、a k t 、e n o sm r n a 的表达。 6 、采用w e s t e m b l o t 法检测人脐静脉内皮细胞p - a k t ( s e r - 4 7 3 ) 、a k t 、p - e n o s f s e r - 11 7 7 ) 、e n o s 蛋白的表达。 7 、采用硝酸盐还原酶还原硝酸盐为亚硝酸盐，然后通过经典的g r i e s sr e a g e n t 检 测亚硝酸盐，从而测定出总一氧化氮。 睦田 皇日7r 1 、随着糖浓度的增加( 即5 5 、1 1 、2 2 、3 3m m o l l ) s ap g a l 活性逐渐增强( p 0 0 1 ) ， 端粒酶活性逐渐减弱( p 0 0 1 ) ，g 0 g l 期细胞不断增j j h ( p o 0 1 ) ，s 期细胞不断减少 ( p 0 0 1 ) 。 2 、随着糖浓度的不断增加，细胞内r o s 逐渐增多( p 0 0 1 ) ，而n o 的产量逐渐减 少f p 0 0 0 1 ) 。 3 、与正常对照组相比，3 3 m m o l l 糖浓度组7 2hp 1 3 k 、a k t 、e n o sm r n a 的表达 明显下降( p o 0 5 ) 。 4 、与正常对照组相比，3 3 m m o l l 糖浓度组4 8hp - a k t ( s e r - 4 7 3 ) a k t 、p - e n o s ( s e r - 1 1 7 7 ) e n o s 蛋白表达量的比值明显减写i j ( p o 0 1 ) 。 5 、应用不同浓度l a r g i n i n e ( 0 4 、o 8 、1 6 m m o l l ) 与高糖( 3 3m m o l l ) 共同干预 细胞，不同程度地减弱了s ap g a l 活性( 与高糖组比较，p 0 0 1 ) ，增强了端粒酶 的活性( p 0 0 1 ) ，g o g l 期细胞较高糖组明显减少( p 0 0 1 ) ，s 期细胞明显增多 ( p o 0 1 ) 。而3 2 m m o l l 的l - a r g i n i n e 出现相反作用，各指标与高糖组比较无统计 学差异。 6 、与高糖组比较，l - a r g i n i n e ( 0 4 、0 8 、1 6 m m o l l ) 明显减少细胞内的r o s 水平 ( p 0 0 0 1 ) ，明显增多n o 的合成( p 0 0 0 1 ) 。 7 、与高糖组比较，l a r g i n i n e ( 0 8m m o l l ) 作用内皮细胞7 2h 使p 1 3 k 、a k t 、e n o s m r n a 的表达明显增强( p o 0 1 ) 。 8 、与高糖组比较，l - a r g i n i n e ( 0 4 、0 8 、1 6 m m o l l ) 明显增加了p - a k t ( s e r - 4 7 3 ) a k t 、 p - e n o s ( s e r - 1 1 7 7 ) e n o s 蛋白的表达量的比值( p 0 0 1 ) 。 9 、p 1 3 k a k t 特异性抑制剂l y 2 9 4 0 0 2 及e n o s 特异性抑制剂l - n a m e 可以抑制 l a r g i n i n e 的抗衰老作用。 结论匀目，匕 1 、高糖可以明显加快内皮细胞衰老的进程，这种作用呈现糖浓度依赖性及时间依 赖性。 2 、l - a r g i n i n e 可以明显延缓高糖加速的内皮细胞衰老进程。 3 、l - a r g i n i n e 可能通过上调p 1 3 k a k t 路径，增强端粒酶及e n o s 的活性，从而发 挥抗内皮细胞衰老的作用。 关键词 高糖；内皮细胞；衰老；p 1 3 k a k t ；e n o s ；n o ；l - a r g i n i n e ；端粒酶 4 h i g h e r , a g eo fi n c i d e n c ei sy o u n g e ra n dd e v e l o p m e n to fi l l n e s si sf a s ti np a t i e n t sw i t h d i a b e t e s s o m es t u d i e sh a v es h o w nt h a th i g hg l u c o s ea c c e l e r a t e sc e l ls e n e s c e n c ea n d v a s c u l a ra g i n g ，t h e r e b ya c c e l e r a t e st h ep r o c e s so fa t h e r o s c l e r o s i s t h e r e f o r e ，i ti s t h e r a p e u t i ca g e n tf o rp r e v e n t i o na n dt r e a t m e n to fd i a b e t i cv a s c u l a rc o m p l i c a t i o n st h a t s t u d ym e c h a n i s mo fh i g hg l u c o s e i n d u c e dc e l ls e n e s c e n c ea n dt h e r e b yd e v e l o p m e n to f e f f e c t i v eb l o c k i n gd r u g e n d o t h e l i a lc e l li st h ek e yt a r g e tt i s s u et od i a b e t i cv a s c u l a rd i s e a s e i tn o to n l y p l a y sap r o t e c t i v ef u n c t i o ni nt h ef o r m a t i o no fa n t i c o a g u l a t i o nf a c t o r , b u ta l s oi tc a n s e c r e ts o m ec e l l u l a rf a c t o rt o r e g u l a t eb l o o dv e s s e ll u m e na n dm a i n t a i ni n t e r n a l e n v i r o n m e n t i nn o r m a lp h y s i o l o g i c a ls t a t e ，t h eu p d a t er a t eo fe n d o t h e l i a lc e l l si sv e r y l o w , a n dc o n s t a n tc e l l sc l e a v a g ei n d u c e db yi n ju r y ( f o re x a m p l eh i g hg l u c o s e ) w i l ll e a d t ot e l o m e r es h o r t e n i n g s ot h ec e l l se n t e rg r o w t ha r r e s tp e r i o d ，w h i c hi sa g i n g p e r i o d i n s e n e s c e n ts t a t e ，t h ec e l l ss h o w e ds o m ec h a r a c t e r i s t i c s , f o re x a m p l e ，i n c r e a s e ds a - 1 3 - g a l a c t i v i t y , t h ec e l l ss t u c ki nt h ec e l lc y c l eg o g lp h a s e ，a g i n g r e l a t e dg e n ea n dp r o t e i n o v e r e x p r e s s i o n ，a sw e l la st e l o m e r es h o r t e n i n g ，d e c r e a s e dt e l o m e r a s ea c t i v i t ya n ds oo n s i m u l t a n e o u s l y , i nv a s c u l a re n d o t h e l i a lc e l ls e n e s c e n c ep r o c e s s ，av a r i e t yo fs e c r e t i o n 5 b i o l o g i c a l l ya c t i v ef a c t o r sa r ea l s oc h a n g i n g ，s u c ha sd e c r e a s e dt h ef o r m a t i o no f e n d o t h e l i u m - d e p e n d e n tv a s c u l a rr e l a x i n gf a c t o r , i n c r e a s e ds y n t h e s i so fi n f l a m m a t o r y f a c t o r sa n da d h e s i o nm o l e c u l ee x p r e s s i o n t h e s ec h a n g e sw i l lr e s u l ti ne n d o t h e l i a lc e l l d y s f u n c t i o n ，a n de v e n t u a l l yl e a dt ot h eo c c u r r e n c eo fa t h e r o s c l e r o s i s t h e r e f o r e ，t h e r e w a sac l o s er e l a t i o n s h i pb e t w e e na g i n ga n dd i a b e t e s a s s o c i a t e da t h e r o s c l e r o s i s ，n a m e l y d i a b e t i cm a c r o v a s c u l a rd i s e a s e t e l o m e r ec l o c kt h e o r yi so n eo ft h ed o c t r i n em e c h a n i s m so f a g i n g t e l o m e r ei st h e d n a s e q u e n c eo fc h r o m o s o m ee n d si ne u k a r y o t i cc e l l s t e l o m e r es h o r t e n sw i t he a c h c e l lc l e a v a g e b u tc h r o m o s o m es t a b i l i t yc a n tb em a i n t a i n e dw h e nt e l o m e r er e d u c e dt o at h r e s h o l dv a l u e s oi tw i l ll e a dt oc e l l sl o s et h e i rp r o l i f e r a t i v ea b i l i t ya n dc e l l se n t e r i n t ot h ea g i n gp h a s e t h u s ，t e l o m e r es h o r t e n i n gi sc o n s i d e r e da sb i o m a r k e r so fc e l l s e n e s c e n c ea n di te n a b l et h em o l e c u l a rc l o c kt os t a r t t e l o m e r a s ei sa r i b o n u c l e o p r o t e i n r e v e r s et r a n s c f i p t a s e ，c a na d dn e w r e p e a ts e q u e n c e st os h o r t e n e dt e l o m e r ee n d ss ot h a t m a i n t a i nt e l o m e r el e n g t h i tp l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei nt h er e g u l a t i o no fl i f ea n dc e l l p r o l i f e r a t i o n i sam u l t i f a c t o r , p 1 3 k a k tp a t h w a yi so n eo f t h em u l t i f a c t o r si nr e g u l a t i n g t e l o m e r a s ea c t i v i t y s t u d yf o u n dt h a ta k tc a ne n h a n c et e l o m e r a s ea c t i v i t y o nt h em e l a n o m ac e l ll i n e s k - m e l 2 8s t u d yf o u n dt h a ta k ta c t i v i t yi nt u m o ri n c r e a s e da f t e ri n c u b a t i o nw i t ht h e a b s e n c eo fs e r u mf o r2 4l l ，a n dt e l o m e r a s ea c t i v i t yi n c r e a s e d2 - f o l d t w os e q u e n c e s x x r x r x x s x xo fh u m a nt e l o m e r a s er e v e r s et r a n s c r i p t a s e ( h t e r t ) c o r r e s p o n d i n g l y e m e r g e dp h o s p h o r y l a t i o n a p p l i c a t i o no fp 1 3 ki n h i b i t o rr e d u c e dt e l o m e r a s ea c t i v i t yi n t u m o rc e l l sa n di n h i b i t e dt h eh t e r tp h o s p h o r y l a t i o n t h u s ，a k ti sb e c o m eav e r y i m p o r t a n tu p s t r e a mr e g u l a t o ro ft e l o m e r a s e i n c r e a s e do x i d a t i v es t r e s sa n dr e d u c e d n ob i o a v a i l a b i l i t yp l a ya ni m p o r t a n tr o l e i nc e l ls e n e s c e n c e s t u d i e ss h o w e dt h a th i g hg l u c o s ec a ni n c r e a s er o sa n dl a t t e rm a y s h o r t e nt e l o m e r el e n g t ht h r o u g hi n h i b i t e ds r cf a m i l yk i n a s ea c t i v i t yt oa c c e l e r a t ec e l l s e n e s c e n c ep r o c e s s n oa n de x c e s sr o sg e n e r a t e d r e s p o n s es o t h a ta t t e n u a t e d o x i d a t i v es t r e s si nc e l l n oi sc o n s i d e r e da st h em o s ti m p o r t a n te n d o t h e l i u m - d e r i v e d 6 a o t o c r i n ef a c t o rw h i c hl a r g i n i n e ( l - a r g ) i sc a t a l y z e d b yn i t r i co x i d es y n t h a s e ( n o s ) t h ee f f e c to fn oi se x t r e m e l yb r o a d ，w h i c hc a na d j u s tv a s c u l a rt u b ec a v i t ys i z e ， i n h i b i tp l a t e l e ta g g r e g a t i o n ，a n t i a p o p t o s i s ，i n h i b i ts m o o t hm u s c l ec e l lp r o l i f e r a t i o na n d l e u k o c y t ea d h e s i o n ，w h i c hp l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei nt h ea n t i - a t h e r o s c l e r o s i s m a n y s t u d i e sf o u n dt h a te n d o t h e l i a ln o s ( e n o s ) e x p r e s s i o na n dn op r o d u c t i o nd e c r e a s e w i t ha g e ，a l t h o u g ht h em e c h a n i s mi sn o t y e tc l e a r , s t u d i e sh a v es h o w nt h a t p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l3 - k i n a s e ( p 1 3 k ) a k tm a ym e d i a t et h ep h o s p h o r y l a t i o no fe n o s s o m es t u d i e sh a v es h o w nt h a t e n t o t h e l i a l d y s f u n c t i o n i sr e l a t e dt oi n h i b i t p 1 3 k a k t e n o s p a t h w a y i n p a t i e n t s w i t h t y p e 2 d i a b e t e s t h u s ，u p r e g u l a t i o n p 1 3 k a k t e n o s s i g n a l i n gs y s t e ms h o u l db ea ni m p o r t a n tt a r g e tf o rp r e v e n t i o na n d t r e a t m e n to fd i a b e t i cv a s c u l a rd i s e a s ei ne n d o t h e l i a lc e l l s l - a r g i st h ep r e c u r s o ro fn os y n t h e s i s i n19 9 2 ，c r e a g e ra n dd u b o i s r a r d e ，f o r t h ef i r s tt i m e ，c o n c l u d e dt h a tc o m p l e m e n t a r yr o l eo fl - a r gw h i c hi st h es u b s t r a t eo f e n o s ，i st oi n c r e a s eb i o l o g i c a la c t i v i t yo fe n d o t h e l i u m - g e n e r a t e dn o l - a r gt o i m p r o v et h em e c h a n i s mo fe n d o t h e l i a lc e l lf u n c t i o ni sr e l a t i v e l yd i v e r s i f i e d t h i se f f e c t m a yb er e l a t et oi n c r e a s en os y n t h e s i sa n de n o sp r o t e i ne x p r e s s i o n ，r e d u c i n gr e a c t i v e o x y g e ns p e c i e s ( r o s ) f o r m a t i o n i ns u m m a r y , t h i se x p e r i m e n t , u n d e rh i g hg l u c o s ei nv i t r o ，a i m e dt os t u d yw h e t h e r h i g hg l u c o s em a ya c c e l e r a t eh u m a nu m b i l i c a lv e i ne n d o t h e l i a lc e l ls e n e s c e n c ea n di t s e f f e c to nn o ，e n o sp r o t e i n e x p r e s s i o na n dt r a n s c r i p t i o nl e v e l ，a sw e l la st h e r e l a t i o n s h i pb e t w e e ni ta n dt h ep 1 3 k a k ts i g n a l i n gp a t h w a y t os t u d yw h e t h e rl - a r g m a yd e l a yh i g hg l u c o s e i n d u c e dc e l ls e n e s c e n c ep r o c e s sa n di t sm e c h a n i s mi sr e l a t e d t oi n h i b i tp 1 3 k a k t e n o s p a t h w a yd u e t o p r o v i d ee x p e r i m e n t a le v i d e n c ef o r p a t h o g e n e s i sm e c h a n i s m ，p r e v e n t i o na n dt r e a t m e n tf o rd i a b e t i cm a c r o a n g i o p a t h y m a t e r i a l sa n dm e t h o d s 1 w ec u l t u r e dh u m a nu m b i l i c a lv e i ne n d o t h e l i a lc e l lw i t hd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o no f g l u c o s es o l u t i o n , a n dh i g hg l u c o s e ( 3 3 m m o l l ) a n d o rd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o no f 7 l a r g i n i n ec o - i n c u b a t e dc e l l s ，a sw e l la st h es a m ec o n c e n t r a t i o ni n c u b a t e di n d i f f e r e n tt i m ep o i n t ，t h e nw ec o l l e c t e dc e l l sa n dc e l lc u l t u r em e d i u m r e s p e c t i v e l y w i t hp 1 3 k a k ti n h i b i t o rl y 2 9 4 0 0 2o re n o si n h i b i t o rl - n a m e p r e t r e a t e df o r2h ， t h e ni n c u b a t e dc e l l sw i t ht h ea b o v e - m e n t i o n e df a c t o r s ，a n dc o l l e c t e dc e l l sa n dc e l l c u l t u r em e d i u mt ou s e df o rt a r g e td e t e c t i o n 2 s e n e s c e n c e a s s o c i a t e d1 3 - g a l a c t o s i d a s e ( s ap g a l ) a c t i v i t yw a sd e t e r m i n e db yt h e p e r c e n t a g eo fs a3 - g a ls t a i n i n gp o s i t i v ec e l l s t h el a t t e rw a sd e t e r m i n e db y c o u n t i n g ，t h en u m b e ro fb l u e - g r e e nc e l l sw i t h i nas a m p l eo f10 0 0c e l l s 3 w eu s e dp c r - e l i s a a s s a yt od e t e c tt h et e l o m e r a s ea c t i v i t y 4 r o sa n da n a l y s i so ft h ec e l lc y c l ew e r ed e t e r m i n e db yf l o wc y t o m e t r ya s s a y 5 a p p l i e dr t - p c rt od e t e c tt h em r n ae x p r e s s i o no fp 1 3 k ，a k ta n de n o s 6 u s e dw e s t e m b l o tt od e t e c tt h ep a j ( t ( s e r - 4 7 3 ) ，a k t ，p - e n o s ( s e r - 117 7 ) a n de n o s p r o t e i ne x p r e s s i o ni nh u v e c 7 r e s t o r e dt h en i t r a t et on i t r i t eb yn i t r a t er e d u c t a s e ，a n dt h e nd e t e c t e dt h en i t r i t e t h r o u g ht h ec l a s s i cg r i e s sr e a g e n t ，w h i c hm e a s u r e dat o t a ln i t r i co x i d e r e s u l t s 1 w i t ht h eg l u c o s ec o n c e n t r a t i o ni n c r e a s i n g ，t h a ti s5 5 ，1 1 ，2 2 ，3 3m m o l l ，s a l 3 一g a l a c t i v i t yg r a d u a l l yi n c r e a s e d ( p 0 01 ) ，t e l o m e r a s ea c t i v i t yg r a d u a l l yd e c r e a s e d ( p 0 01 ) ，t h ep e r c e n t a g eo fg 0 g 1 p h a s ec e l l si n c r e a s e d ( 0 01 ) ，sp h a s ec e l l s d e c r e a s e d ( p 0 01 ) a n dc e l lp r o l i f e r a t i o na b i l i t yg r a d u a l l yw e a k e n e d 2 w i t ht h eg l u c o s ec o n c e n t r a t i o ni n c r e a s i n g ，i n t r a c e l l u l a rr o sg r a d u a l l yi n c r e a s e d ( p 0 o o1 ) ，w h e r e a sn op r o d u c t i o ng r a d u a l l yr e d u c e d ( p 0 o o1 ) 3 c o m p a r e dw i t hn o r m a lc o n t r o lg r o u p ，t h em r n ae x p r e s s i o no fp 1 3 k ，a k ta n d e n o sw a ss i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e di n3 3m m o l lg l u c o s ec o n c e n t r a t i o ng r o u pa t7 2 h ( p o 0 5 ) 4 c o m p a r e dw i t hn o r m a lc o n t r o lg r o u p ，t h er a t i oo fp - a k t ( s e r - 4 7 3 ) t oa k ta n d p - e n o s ( s e r - 1 17 7 ) t oe n o sp r o t e i ne x p r e s s i o nw e r e s i g n i f i c a n t l y r e d u c e d 8 ( p 0 0 1 ) 5 c o i n c u b a t i o nw i t hd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o no fl a r g i n i n e ( 0 4m m o l l ，0 8m m o l l , 1 6 m m o l l ) a n dh i g hg l u c o s e ( 3 3m m o l l ) i nh u v e c ，s a3 - g a la c t i v i t yw e a k e n e d i nv a r y i n gd e g r e e s ( c o m p a r e dw i t hh i g hg l u c o s eg r o u p ，p 0 o1 ) ，a n dt e l o m e r a s e a c t i v i t yo b v i o u s l yi n c r e a s e d ( c o m p a r e dw i t hh i g hg l u c o s eg r o u p ，p 0 o1 ) ，a n d g 0 g 1 p h a s e c e l l s s i g n i f i c a n t l yr e d u c e d ，h o w e v e r , sp h a s e c e l l si n c r e a s e d ( c o m p a r e dw i t hh i g hg l u c o s eg r o u p ，p 0 01 ) ，s oc e l lp r o l i f e r a t i o nw a si m p r o v e d b u ti n c r e a s i n g l - a r g i n i n et o3 2m m o l le x e r t e dt h eo p p o s i t ee f f e c t ，i tw a sn o s t a t i s t i c a ld i f f e r e n c ec o m p a r e dw i t hh i g hg l u c o s eg r o u p 6 l - a r g i n i n e ( 0 4m m o l l ，0 8m m o l l ，1 6 m m o l l ) r e d u c e di n t r a c e l l u l a rr o s ( p 0 0 01 ) ，a n di n c r e a s e dn of o r m a t i o n ( p 0 o o1 ) 7 c o m p a r e dw i t hh i g hg l u c o