（特种经济动物饲养专业论文）家蚕来源肠球菌的RAPD分型及类肠球菌素的分离纯化.pdfVIP

中文摘要 肠球菌是家蚕消化道中的一种正常菌群。它直接参与了宿主的多种生理 代谢活动，是宿主正常生理活动不可缺少的重要组成部分。 同时肠球菌也是一种潜在性致病菌，健康家蚕对其具有足够的预防能 力，只有在宿主体质虚弱或环境不良的情况下才会发挥致病作用，是引起家 蚕细菌性肠道病的病原细菌，因此探讨该菌丛的生物学特性及生态变化，对 了解家蚕细菌性肠道病致病机理和肠球菌与其它病原微生物互作等方面都 具有重要意义。 传统的数值分类学的鉴定方法，工 乍量大、时间长。随机扩增d n a 多 态性分析( r a p d ) 技术是分子生物学中重要的研究手段之一。它能在d n a 水平反映不同样本之间的差别。本试验通过优化m 广浓度、d n a 模板加入 量、引物浓度、t a qd n a 聚合酶加入量、p c r 反应循环次数等建立了家蚕来 源肠球菌的r a p d - p c r 反应体系，并对从家蚕消化道中分离的表现为生理 生化特性多样性的1 4 个肠球菌分离菌株和3 个标准菌株进行了d n a 多态性 研究。确定了家蚕来源肠球菌r a p d 分析的反应体系：扩增反应总体积2 5 皿，反应液中含模板d n a 为5 0n g ；m 矿3 5m m o l l ；d n t p s2 0 0m m o l l ； r a qd n a 聚合酶3u ；引物浓度1 5p m o l l ；p c r 扩增程序为：9 4 预变| 生 3 r a i n ，9 4 变性4 0s ，3 5 退火4 08 ，7 2 延伸lr a i n ，4 5 次循环，最后 个循环7 2 延伸1 0 r a i n ，然后4 保存。应用筛选的8 条随机引物，共扩 增出6 2 5 个位点，其中9 9 7 为多态性位点，表明供试菌株具有丰富的d n a 多态性。对扩增结果进行聚类分析，供试菌株分为e n t f a e c i w n 、 e n t c a s s e l i f l a v u s 、e n t a v i u m 、e n t f a e c a i i s4 个类群。本试验r a p d 分型结果 与前期数值鉴定结果基本一致。 本研究室前期研究结果表明，家蚕来源肠球菌外分泌蛋白具有抑制n b 发芽的作用。本试验以家蚕来源肠球菌( e n t f a e c a t i sz 3 u ) 和家蚕微孢子虫 ( n o s e m ab o m 砂c i s ，简称n b ) 为材料，筛选了种适合e f z _ r v 生长和外 分泌蛋白含量高的培养基，并对抑制微孢子虫发芽的菌外分泌蛋白进行了初 步的分离纯化，以期为利用肠球菌开展蚕病的微生态防治挹洪参考。 培养基的筛选试验表明，进口m r s ( g ) 培养基所得透析液的底色较 浅，对用分光光度法测定微孢子虫的发芽抑制率影响最小。吐温添加量控制 v 在5 1 0 9 l ，在3 7 1 5 0r r a i n 条件下培养3 0 h 时e f z i u 的生长情况最好， 细菌繁殖达到最高峰，以后随着培养时间的延长，培养基中养分逐渐消耗， 细菌处在对数生长曲线后期，细菌数目逐渐减少。用b r a d f o r d 法测得其蛋白 含量最大可达3 3 2m g m l ，对家蚕微孢子的发芽抑制率在7 2 0 。 蛋白分离纯化试验结果表明，将蛋白粗提液过s e p h a d e xg - 7 5 柱，收 集其3 个吸收峰，用p e g 包埋法浓缩后进行微孢子虫发芽抑制试验。结果 峰i 、对微孢子的发芽相对抑制率在2 0 5 ，峰的相对抑制率在5 9 0 ，说明活性物质主要存在于峰i 中。 s d s p a g e 电泳结果表明峰i 、i i 没有蛋白条带，峰i 有三条主要的 蛋白带，分子量在5 0 8 0 k d 之间。说明主要的活性物质是分子量在5 0 8 0 k d 之间的一种或多种物质，其可能是多肽类物质，也可能是细菌毒素类 物质。 添食试验结果表明，e f z j o 外分泌蛋白在家蚕体内能抑制n b 发芽， 从而降低微孢子虫病的发生。 关键词：随机扩增d n a 多态性分析( r a p d ) ；肠球菌；外分泌蛋白；家 蚕微孢子虫；发芽抑制率 a b s t r a c t e n t e r o c o c c u sw a st h en a t t l r a lf l o r ac o m e sf r o me m e m no fs i l k w o r m w h i c h c o n c e r n e dw i t hm u l t i f o r mp h y s i o l o g i c a lm e t a b o l i s ma n dw a st h e i m p o r t a n t i n g r e d i e n t so f h o s t sp h y s i o l o g i c a la c t i v i t i e s e n t e r o c o c c u sw a sap o t e n t i a lp a t h o g e n t h eh e a l t h ys i l k w o r mh a de n o u g h p r e c a u t i o n a r ya b i l i t y , i t p l a y e dp a t h o g e n i cp a r to n l yw h e nt h eh o s tb e c o m ew e a ko r t l l e yw e r ei nb a dc o n d i t i o n ，a n di ta r o s e dt h ei n t e s t i n a lt r a c td i s e a s eo fs i l k w o r m s om a k i n gas t u d yo fe n t e r o c o c c a lb i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c sa n dt h ee c o l o g i c a l c h a n g e w a s i m p o r t a n t t o f i n d o u t t h e p e c c a n t m e c h a n i s m o f b a c t e r i a ll u t e s t i n a l w a c t d i s e a s ea n dt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e ne n t e r e c o c e u sa n do t h e rp a t h o g e n i cb a c t e r i u m 玎1 ct r a d i t i o n a lc r i t i c a lm e t h o do fn u m e r i c a lt a x o n o m yd e m a n d sag r e a td e a l o fw o r ka n dm u c hl i m e r a p dw a so n eo ft h ei m p o r t a n tm e a n si nm o l e c u l a r b i o l o g y i tc o u l dr e f l e c tt h ed i 雎r e n c eb e t w e e ns p e c i m e ni nd n a e v e w e f o u n d e da n do p t i m i z e dt h er e a c t i o ns y s t e ma n dc o n d i t i o no fe n t e r o c o c c u sb y a d j u s t i n gc o n c e n t r a t i o no fm g 乞q u a l i t yo fd n at e m p l a t e ，c o n c e n t r a t i o no f p r i m e r , q u a l i t y o f t a q d n a p o l y m e r a s e ，p c r c y c l e i n d e x o n t h i s b a s i c ，w es t u d i e d d n a p o l y m o r p h i s mo f1 4e n t e r o c o c c a ls t r a i n sa n d3r e e f e r a n c ec u l t u r e s ，i s o l a t e d f r o mt h ei n t e s t i n e so fs i l k w o r ma n dh a v i n gv a r i e t yo f p h y s i o l o g i c a lb i o c h e m i c a l c h a r a c t e r i s t i c t h e nw ea s c e r t a i n e dr a p dr e a c t i o n 町，s t 锄a n dp r o c e s s t h et o t a l v o l u m eo f m p l i 五e dr e a c t i o nw a s 2 5 止，i ti n c l u d e dd n a t e m p l a t e5 0n g ；m 9 2 + 3 5 r e t o o l l ；d n t p s2 0 0m m o l l ；t a qd n a p o l y m e r a s e3 u ；c o n c e n t r a t i o no fp r i m e r 1 5 p m o l l ；p c ra m p l i f i e d p r o c e s s ：p r d i m a 埘d e n a t u r a l i z a t i o n9 4 f 醯3r a i n ， d e n a t u r a l i z a t i o n9 4 f o r4 0s ；a n n e a l i n g3 5 f o r4 0s ，e x t e n d7 2 f o r1m i n ， c y c l e f o r 4 5 ，e x t e n d i n g t h e l a s tc i r c u l a t i o n 7 2 f o r1 0 m i l l ，t h e nc o n s e r v e d i n 4 w e g o t 6 2 5s i t e b yu s i n g 8 s t o c h a s t i c p r i m e r s ，t h e r e i n t o ，9 9 7 w a s p o l y m o r p h o u ss i t e i ti n d i c a t e dt h ed n ap o l y m o r p h i s mo ft h es t r a i n sw e r e a b u n d a n t 。t oc l u s t e ra n a l y s i st h er e s u l t so f a m p l i f i c a t i o n ，t h et e s t i n gs t r a i n sw e r e d i v i d e di n t o4s o r t s ：e n t f a e c i u m ，e n t c a s s e l i f l a v u s ，e n ta v i u m 、e n t f a e c a l i s 拍e r e s u l to f r a p d t y p i n gh a dt h ea c c o r d a n tr e s u l ta st h en u m e r i c a la p p r a i s eb a s i c a l l y n l e f o r m e r s m d i e si n d i c a t e d t h a t t h e e x o c f i n e p r o t e i n o f e n t e r o c o c c f i s o f i g i n e d v i t f o r ms i 】b h a dt h ee f f e c tt or e s t r a i n n bg e r m i n a t i o n u s i n gt h em a t e r i a lo f e f z j ua n dn b ，w eg o tac u l t u r em e d i u mw h i c hw a ss u i tf o re f z j ua n dh a dah i 【g h c o n t e n to fe x o c r i n ep r o t e i n t h e 面a r ys e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o no fe x o c r i n e p r o t e i nw o u l da f f o r dr e f e r e n c ef o rb i o l o g i c a lc o n t r o lo f s i l k w o r m d i s e a s e t h eo p t i m i z a t i o no f c u l t u r em e d i u mi n d i c a t e dt h a tt h eg r o u n d i n go f d i a l y s a t e g o tf o r mi m p o r t e dm r s ( 一g ) w a sl i g h t e r , s ot h i sc u l t u r em e d i u mh a dt h el e a s t e f f e c tt os p e c t r o p h o t o m e t r yi nm e n s u r a t i n gr e l a t i v er e s t r a i n i n gr a t eo fn b t h e g r o w t ho fe f z j uw a sb e s ta n dt h eb a a e f i nr e p r o d u c t i o na r r i v ea tp e a k , w h e n c u l t i v a t e d3 0ha tt h ec o n d i t i o no ft w e e n 一8 05 - 1 0g 甩，3 7 ，1 5 0r m i n t h e nt h e n u t r i e n to fc u l t u r em e d i u mc o n s u m e dg r a d u a l l ya s 也ep r o l o n go fc u l t i v a t e dt i m e , t h eb a c t e r i u mw a sa tt h ea n a p h a s eo f l o g a r i t h m i cg r o w t h , t h en u m b e ro f b a c t e r i u m a r o p e do f fg r a d u a l l y t h ep r o t e i nc o n t e n ta r r i v e da t 3 3 2m g m lb ym e a n so f b r a d f o r d ，r e l a t i v ei n h i b i t o r yr a t ea r r i v e da t7 2 0 t h ea n t i - m i c r o s p o r i d i a n p r o t e i nw a sp u r i f i e db y a m m o n i u ms u l p h m e p r e c i p i t a t i o n , c o l u m nc h r o m a t o g r a p h y o i ls e p h a d e xg 一7 5 ，i ta p p e a r e dt h r e e a b s o r p t i o nm a x i f l m ，t h ep u r i f i e dp r o t e i n so fp e a kia n dp e a k ys h o w e daw e a k a c t i v i t ya g a i n s tt h eg e r m i n a t i o no f n o s e m ab o m b y c i ss p o r e s , t h ep u r i f i e dp r o t e i no f p e k i ns h o was t r o n ga c t i v i t ya g a i n s tt h eg e r m i n a t i o no f n o s e m ab o m b y c i ss p o r e s a n da r r i v e da t5 9 0 i ti n d i c a t e dt h a tt h ea c t i v i t yp r o t e i n sc o n s i s ti np e a l d l i m o s t l y i te s t i m a t e dt h a tp e a ki ，p e a k l i h a dr i op r o t e i nb a n d i n g ，p c a l d l ih a dm a i n t h r e e p r o t e i nb a n d i n g , w h i c h m o l e c u l a rw e i g h ta tb e t w e e n5 0 8 0k db y s d s - p a g e i ts h o w e dt h ea c t i v i t ys u b s t a n c ew a so n eo rm o r ep r o t e i n , w h i c h m a y b ep o l y p e p t i d e o rb a c t e r i a lt o x i n t h er e s u l t so ff a r m i n gi n d i c a t e dt h a tt h ee x o c r i n ep r o t e i no fe f z j uc o u l d r e s w a i nt h eg e r m i n a t i o no fn bi nt h eb o d yo fs i l k w o r m , s oi tc o u l dr e s t r a i n n o s e m ab o m b y c i sd i s e a s e k e y w o r d s ：r a n d o ma m p l i f i e d p o l y m o r p h i c d n a ( 1 l m l d ) ；e n t e r o c o e c u s ； e x o c r i n ep r o t e i n ；n o s e m ab o m b y c i ss p o r e s ；r e l a t i v ei n h i b i t o r yr a t e v 1 1 i 缩写 r a p d b s a r r a i n p c r m l n m g m l 悯 p h n b 中英文缩略词表 英文中文说明 r a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a 随机扩增d n a 多态性分析 b o v i n es e r u ma l b u m i n m t _ l e p e r m i n t u t e p o l y m e r a s e c h a i nr e a c t i o n m i n u t e m i l l i g r a m m i ij i i i t e r m a n n a - r o g o s a - s h a r p e h y d r o g e np o w d e r n o s e m ab o m b y c i ss p o r e s 牛血清白蛋白 转肚糙十 聚合酶链式反应 分钟 毫克 毫升 肉汤培养基 酸碱度 家蚕微孢子虫 s d s - p a g e s d s - p o l y a e r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s 变性凝胶电泳 c m c e n t i m e t e r o d e | z j u n d ( n h 4 h s 2 0 8 o p t i c a ld e n s i t y e n t f a e c a l i s , z j u h 0 u r d a y i x 厘米 过硫酸铵 紫外分光光度值 家蚕肠球菌 小时 穴 关于学位论文原创性和使用授权的声明 本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行稍 学研究所取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和 做出重要贡献的个人或集体，均在文中明确说明。本声明的 法律责任由本人承担。 本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的 规定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论 文纸质本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东 农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据 库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文 和汇编本学位论文。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名： 导师签名：丝 山东农业大学硕士学位论文 1r a p i ) 技术及其应用 1 1r a p d 技术研究进展 肠球菌( e n t e r o c o c c i ) 是家蚕消化道中的高频微生物( 鲁兴萌，2 0 0 3 ) 因 此探讨肠球菌在家蚕消化道中的分布、菌种结构和动态变化具有重要意义。 传统的数值分类学的鉴定方法，工作量大、时间长。现代分子生物学实验技 术的发展，为分类学、系统学研究提供了许多新型的鉴别技术，包括同工酶 电泳、蛋白质序列分析、核酸序列分析、斑点杂交法、限制性内切酶分析、 r r n a 探针、r f l p 等。但操作繁琐，花费时间长，杂交还要求有探针。 随机扩增d n a 多态性分析( r a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i ed n a ，简称 r a p d ) 技术，是1 9 9 0 年由w i l l i a m s ( 1 9 9 0 ) 两个研究小组同时发展起来的 一项基于p c r 技术的d n a 分子水平上的大分子多态性检测技术。其基本原 理是：不同物种的基因组中与引物相匹配的碱基序列的空间位置和数目都有 可能不同，所以，扩增产物的大小和数量也有可能不同，这些差异可通过凝 胶电泳显示出来。这种扩增产物的多态性本身可以用于分类研究和系统进化 推测，也可以和其他分子生物学技术( 如d n a 指纹、d n a 杂交等) 相结合 ( 鲁亮等，2 0 0 2 ) 。基于该理论，w i l l i a m s 将p c r 扩增中使用的两个特定序 列引物改为单一的由1 0 b p 个特定碱基构成的随机序列引物，并运用大量不同 序列的引物进行扩增，经琼脂糖凝胶电泳，产生类似于条形码的图形，称为 r a p d “指纹图谱”。不同细菌或其它生物体的d n a 指纹图谱不同，以此可 以鉴定相同菌种而来源不同或近缘细菌( 赵蕊，王军等，2 0 0 2 ) 。r a p d 技术 能在d n a 水平反映不同样本之间的差别。通过对不同类群细菌及其种、致 病变种群体的p c r 扩增，获得的多态性资料进行聚类分析，可以了解它们彼 此之间的同源程度，从而确定它们之间的亲缘关系和进化地位。由于它的简 便、快捷、对材料要求不高、取材少、成本低、所需的样本较少且没有严格 的时间和地点限制，被迅速用于基因的多态性分析上。并在许多领域得到运 用。w e l s h ( 1 9 9 1 ) 用三个引物对白鼠的8 个品系进行d n a 多态性分析，构 建了8 个品系的指纹图谱用于不同品系的鉴别和分析。s h u i c h i 等研究了水稻 1 1 个品系的r a p d 扩增片断的多态性，并得出了11 个品系的相对遗传距离； 宋连花：家蚕来源肠球菌r a p d 分型及娄肠球菌素的分离纯化 h a l w a r d 等( 1 9 9 2 ) 用r a p d 技术研究了花生各品系之间在进化上的关系； 鲍哓明等用r a p d 技术鉴定了两个抗锈病的小冰麦易位系。在广泛运用的同 时，有关r a p d 技术反应机制的研究也很多( 杨树青等，1 9 9 2 ；c a e t a n o - a n o l l e s ， e t 以1 9 9 2 ) 。这一系列的运用研究表明，r a p d 技术这一新兴的分子生物学方 法在生物分类和系统演化研究中，特别在小的分类单位内是可以广泛运用的。 1 2r a p d 技术在分类和系统演化研究中的运用 r a p d 技术运用于分类和系统演化研究，具有如下优点：第一，r a i d 技术可以在对物种没有任何分子生物学研究的情况下，对物种的基因组进行 d n a 片段多态性分析，并结合其他方法，通过统计分析，确定其在系统演化和 分类中的地位。第二，r a p d 技术是一种对材料要求低、操作简便、成本相 对较低的分子生物学方法。另外，r a p d 技术能利用前人采集的标本进行 d n a 分子多态性分析( k a m b h a m p a f i ，1 9 9 2 ) ，这样可以极大的扩展分类和系 统演化的分子生物学研究范围，有助于建立正确和完善的分类体系、推测正 确的系统演化树。第三，r a id 技术所需要的材料很少，便于对大量的小型 昆虫进行研究。在昆虫纲中，昆虫的体型变化很大，大到几十厘米小到不足 一毫米。大型的昆虫，无论是做分类还是做其它分子生物学技术分析都比较 便利。而很小的昆虫，则都不容易。但对于m 蟠d 技术，几个细胞的d n a 量就绰绰有余。b l a c k i v 在他的文章中着重介绍了r a p d 技术的这个优点， 同时他对蚜虫体内寄生蜂的检测和鉴定很好地说明了这一点。第四，使用大 量的r a p d 引物，将使d n a 分子多态性分析非常灵敏。由于r a p d 技术可 以对整个基因组作地毯式的多态分析，两个基因组间的微小差异也能被反应 出来，所以其灵敏程度可以与d n a 序列分析和d n a 指纹媲美。其可分析的 领域可扩展到种内不同种群、不同生物型、不同品系、不同家系之间的关系。 同时r a p d 技术还可以和其它d n a 分子技术相结合，进行其它方法的检测。 这样就大大扩展了分子生物学技术的应用范围，对形态分类和系统演化推测 将产生很大的促进作用。r a p d 技术所用的引物可大规模生产，还大大降低 了分子生物学的研究成本。第五，采用r a p d 技术对不同种群、不同生物型、 不同品系的个体进行广泛的多态性扩增，通过统计分析，从大量的引物中找 出关键的引物，从不同的电泳谱带中我出关键的谱带，可以建立一套检索系 统。对于一个不知道分类地位的标本，可以用关键的引物进行p c r 反应，根 山东农业大学硕士学位论文 据得到的电泳图谱再进行统计分析，就可以基本准确的计算出这个标本的分 类地位( 主要在较小的分类单位内) 。当然，希望得出的结果和统计方法是有 密切关系的，比如，检查一个标本的种间地位和种内地位所用的统计方法是 不一样的。b l a c k1 v 等在研究按蚊两个亚种间1 1 个不同品系间的r a p d 扩增 产物电泳图谱以后，建立了一个数据库，然后用四种统计方法计算一些标本 的分类地位，得出的结果很令人满意，运用判别分析，种间计算正确率达1 0 0 ，亚种间计算正确率达8 2 。用相似性指数分析，可以判断到种群水平 ( b a l l i n g e r - c r a b t r e e ，1 9 9 2 ) 。由此可见，r a p d 技术不仅可以快速的检测d n a 的多态性，还能够通过统计分析建立一套灵敏准确的检索系统。这个特点尤 其适合于种类繁多的昆虫的研究。 l _ 3r a p d p c r 技术在昆虫研究中的应用 b l a c ki v 等首先将r a p d 技术用于4 种蚜虫的鉴别比较。他们用了l o 个碱基的随机引物对4 种蚜虫进行了r a p d 反应，检测它们扩增产物的多态 性。结果表明，根据电泳图谱能明确地区分4 个种。同时，他们还检测了种内 不同生物型间以及同一生物型内不同个体扩增产物的多态性、种群内不同个 体间扩增产物的多态性。另外，他们还用r a p d 技术检测和鉴定了蚜虫体内 的两种寄生蜂。k a m b h a m p a f i ( 1 9 9 2 ) 等将r a p d 技术用于鉴定和区别蚊子 的亚种和种群上。g u i r a o ( 1 9 9 4 ) 把r a p d p c r 技术用于粉虱 ( h o m o p t e r a , a l e y r o d i d a e ) 的分类，k a m p e n ( 1 9 9 5 ) 等对采集自喀麦隆的按蚊进 行分类研究，对照比较了p c r 和染色体形态分类法。w i l k e r s o n ( 1 9 9 5 ) 等用 p c r 方法对采自巴拉圭、阿根廷、巴西的4 个存在混淆的按蚊种进行分析。 s t e v e n s 等用r a p d - p c r 技术在丝光绿蝇l u c i l i a s e r i c a t a 的种群遗传多样性研 究中的应用。s o n v i c o 等选用l o b p 长的随机引物识别2 个阿根廷的实蝇种群， 结果表明，不论是幼虫还是成虫阶段，每组检验只需1 只试虫既可快速而准确 地鉴别出地中海实蝇c e r a t i t i s c a p i t a t a 和a n a s t r e p h a j f a t e r c u l u s 间的差异。用 2 个引物就可以明确地辨别出幼虫个体的种群起源。 陈乃中( 1 9 9 7 ) 等以花斑皮蠹、古斑皮蠹、黑毛皮蠹、印度皮蠹4 种仓 储害虫的幼虫为材料，借用小麦d n a 提取方法提取了虫体的d n a ，用e 1 2 、 e 1 5 、e 1 8 、g i o 、g 1 4 等5 种引物进行r a p d 扩增。电泳检测结果显示，5 种 引物均产生可用以区分这4 种仓虫的扩增谱带。从d n a 提取到获得结果只 宋连花：家蚕来源肠球菌r a p d 分型j 及类肠球菌素的分离纯化 须4 8h 。夏庆友( 1 9 9 8 ) 等用m 婶d 技术，在d n a 分子水平上对不同系统、 化性和眠性共6 类5 9 个家蚕品种及野蚕b o m b y x m a n d a r i n a 间的遗传差异性 进行了研究。在3 4 个随机引物中有1 2 个( 3 5 2 9 ) 引物出现稳定的扩增带， 扩增带总数为1 0 3 条，其中8 6 条具多态性，占8 3 5 0 ，平均每个引物7 2 条。 利用单匹配相似系数和u p g m a 聚类法对结果进行分析，发现其r a p d 不但 具有品种特异性，而且具有系统特异性。孙珊等( 2 0 0 0 ) 采用r a p d 技术，研究 了我国5 个地区亚洲玉米螟种群分化。利用u p g m a 方法构建系统聚类图。 结果表明中国亚洲玉米螟的遗传分化是和地理隔离有很大关系的，因为地理 位置上的差异而阻隔了各种群问的基因交流，从而导致了遗传分化。 综上所述，r a p d - p c r 技术在动植物分类、系统进化等研究中有广泛的 瘟用前景，且随着该技术和统计方法的完善，它的应用前景将更加广阔。 2 家蚕微孢子虫与家蚕肠球菌 2 1 家蚕微孢子虫病研究概述 蚕业生产是我国的传统特色农业产业之一，历史上曾谱写了“丝绸之 路”的辉煌篇章，现今仍是我国出口创汇、解决农村劳动力就业和增加农民 收入的重要渠道( 顾国达，2 0 0 1 ) 。但是家蚕进化低等，缺乏完善的免疫系统， 容易受外界环境的影响和病原微生物的侵袭，从而使得蚕业生产的蚕病防治 技术成为制约蚕茧产质量的关键因子。 家蚕微孢子虫病也称微粒子病，是蚕业生产的毁灭性疫病。法国等欧洲 国家曾因该病的暴发而导致蚕丝业的毁灭，我国近几年每年因微粒子病而淘 汰的各级原种1 0 0 3 0 0 万张之多。该病害的流行不但会给蚕种生产单位造成严 重的经济损失，而且极易导致丝茧育蚕茧质量的下降和蚕农的欠收，甚至因 蚕种供应紧张而给社会带来不稳定因素。因此，家蚕微粒子病始终是蚕丝业 国家蚕病防治的重点。 防治家蚕微粒子病发生和流行的根本思路就是切断家蚕微孢子虫 ( n o s e m ab o m b y c 虹简称n b ) 从中肠上皮细胞侵染的途径，这可以通过两种 方式来实现，一是加强养蚕环境消毒，尽量减少蚕体接触残存于环境中的n b 孢予的机会。目前生产上实施的桑园治虫、蚕室蚕具和叶面消毒等常规“防 微”措施的目的就是减少环境中的活性n b 孢子，但由于消毒的相对性以及 病原物种存在的广泛性，环境中的活性n b 孢子仍不可避免地随取食进入家 山东农业大学硕士学位论文 蚕中肠。肠球菌属( e n t e r o c o c c u s ) 细菌是家蚕中肠内的高频分布菌 ( t a k i z a w a , 1 9 6 8 ；i f z h i k a , 1 9 7 0 ) ，所以探明家蚕消化道的微环境，在继续贯彻前 述常规“防微”措施的前提下，辅佐以第二种方式，即基于改善家蚕消化道 微生态来进行生物防治，有可能成为家蚕微粒子病防治的发展方向。 2 2 家蚕微孢子虫的侵染机理 关于微孢子虫发芽的机理，u n d e e n 等人所提出的这一解释目前为大多数 学者所接受：微孢子虫孢子所在的碱性环境改变了孢子原生质膜的选择透性， 加大了孢子壁对离子( 尤其是k 十、n 矿、c 1 ) 等发芽刺激因子的通透性，使 外界刺激因子通过被动或主动方式更容易地进入孢子，与原先存在于孢子内 部膜结构上起骨架支撑作用的c a 2 十争夺结合位点。随着外界刺激因子在孢子 内的积累，在与c a 2 十的竞争中逐渐占据优势，最终将c 2 + 置换下来，引起孢 子膜结构的损伤和机械紊乱。海藻糖与海藻糖酶由于膜间隔的打破而相互接 触，在合适的温度、酸碱度、渗透压等条件下，海藻糖酶活性被激发并进一 步提高，催化海藻糖水解为葡萄糖或果糖使孢子内渗透质浓度上升，外界水 分在渗透势差的作用下大量进入孢子，极膜层和后极泡吸水膨胀，压迫极丝 解螺旋，并从弱化了的极帽处弹出形成极管，完成发芽过程( u n d e e n , 1 9 9 0 ) 。 2 3 肠球菌及其细菌素的研究概述 2 3 1 肠球菌概况 肠球菌是人和动物肠道中的正常菌群，广泛分布于自然界中它也是一 种重要的乳酸菌，参与宿主的多种生理功能，如参与营养代谢及对过路菌具 有生物拮抗作用，因此具有很重要的微生态学意义。 自1 9 0 6 年，a n d r e w s 和h o r d e r 第一次描述并命名从人类粪便中分离到的 革兰氏阳性球菌为粪链球菌后，肠球菌被划分为上册c 咖e l d d 群，归属于链球 菌属( s t r e p t o c o c c u s ) 。近年来随着核酸杂交技术、细胞脂肪酸分析和细胞壁 结构分析技术应用于细菌分类，s c h l e i f e r 和k i l p p e r 等1 9 8 4 年首次提出肠球菌 不同于链球菌，将其从链球菌属中脱离开来，形成一个新的肠球菌菌属 ( e n t e r o c o c u s ) ，第九版伯杰细菌鉴定手册将l a n c e f i e l dd 群的粪链球菌和 屎链球菌归为肠球菌属。按化学分类现又将几个其它d 群链球菌放置此属。 c o l l i n s 近年又陆续报道几个新种，到目前肠球菌属内已有1 6 个种。它们分别 是：粪肠球菌( e e r o c o c c u sf a c a l i s ) ，屎肠球菌( e f o e c i u m ) 、坚韧肠球菌 宋连花：家蚕来源肠球菌r a p d 分型及类肠球菌素的分离纯化 ( e d u r a n s ) 、鸟肠球菌( e a v i u m ) 、肠肠球菌( e h i r a e ) 、鸡肠球菌 ( e g a l l i n a r u m ) 、黄色肠球菌( e s e l i f i a v u s ) 、臭气肠球菌( e m a l o d o r a t u s ) 、 孟德肠球菌( e m u n d t i i ) 、假鸟肠球菌( e p s e u d o a v i u m ) 、异肠球菌( e d i s p a r ) 、 盲肠肠球菌( e c e c o r u m ) 、棉子糖肠球菌( e r a f f i n o s u s ) 、鱼病肠球菌 ( e s e r i o l i c i d a ) 、单生肠球菌( e s o l i t a r i u s ) 、解糖肠球菌( e s a c c h a r o l y t i c u s ) 。 2 3 2 肠球菌的生物学特性 肠球菌在血琼脂或营养琼脂表面形成圆形、完整的、光滑的菌落，大多 数菌株不产生溶血反应，少数产生n 或b 溶血反应。具有硎c e f i e m d 群抗原， 大多数肠球菌不产生色素，极少数产黄色色素。细胞为卵圆形，单个、成对 或成短链排列。细胞常在成链方向延长。 多数为g + 菌，不形成内芽孢，可有动力。兼性厌氧，最适生长温度为3 5 ，在1 0 和4 5 均可生长，在6 5 n a c i 、p h 9 6 、和4 0 胆汁中能生长， 水解吡咯烷基一0 萘胺。化能异养菌，能量产生主要是同型发酵乳酸途径， 发酵葡萄糖主要末端产物是l - 乳酸。所有肠球菌菌株在发酵条件下它们生长 于液体培养基中其最终p h 值都低于4 - 2 5 。 2 3 3 肠球菌素的研究概述 近十年来，人们从许多细菌中分离纯化了对其它微生物具有拮抗活性的 蛋白质( 多肽) ，并研究了其活性、结构和遗传特性等。这些细菌来源的蛋 白质能够拮抗细菌、真菌和病毒等其它微生物，某些蛋白质还能溶解哺乳动 物的细胞，称其为细菌素。细菌素是由某些细菌通过核糖体合成机制产生的， 在细菌代谢过程中合成，并分泌到环境中的一类对同种的或亲缘关系较近的 种具有抑菌生物活性的多肽、蛋白质、不同蛋白质的复合物或者蛋白与糖或 脂的复合物( a r m e d _ m a r c i n e z - c u e s t a , 2 0 0 2 ) 。它一般能拮抗与其产生菌有近缘 关系的其它细菌的生长。某些乳酸菌来源的细菌素能抑制在食品加工贮藏过 程中产生的病原微生物和腐败微生物，因此引起了食品卫生学研究方面专家 的广泛关注。 国外一些有关肠球菌的研究报道称，不同来源的许多肠球菌都具有外分 泌拮抗近缘细菌生长的活性蛋白质的能力，并将这类活性蛋白质称为肠球菌 素( e n t e r o c i n s ) ，归于细菌素i i 类。肠球菌素抑制l i s t e r i a 属菌等某些食品来 源的革兰氏阳性致病菌或腐败菌，以及拮抗病毒( 疱疹病毒) 增殖等方面的 山东农业大学硕士学位论文 研究已有诸多报道( k a t o ，y , m a t s u d a , 1 9 9 4 ；a r e n t e ，1 9 9 2 ) 。早在1 9 7 5 年，b r a n d i s 等就报道了一种由e f a e c i u m 产生的能拮抗l i s t e r i as p p 的肠球菌素e n t e r o c i n e i a 。最近的许多研究资料显示，肠球菌的许多菌种都具有抑制l i s t e r i a m o n o c y t o g e n e s 的能力。 2 4 肠球菌外分泌蛋白对家蚕微孢子虫的拮抗 鲁兴萌等对家蚕肠球菌体外抑制家蚕微孢子虫发芽的动力学研究的报 道，证明了细菌( 肠球菌) 外分泌蛋白能拮抗原生动物( 微孢子虫) 。此肠球 菌被鉴定为粪肠球菌( e n t e r o c o c c u s f a e c a l 西z j u ) ，此研究首开肠球菌细菌素 与原生动物相互拮抗关系研究的先河。家蚕中肠来源肠球菌外分泌蛋白抑制 家蚕微粒子虫孢子发芽这一现象，将为家蚕等经济昆虫、鱼类甚至人体的微 孢子虫病害的防治提供新的思路和开辟新的途径。 为了探索家蚕肠球菌的分子生物学分类方法及进一步揭示其外分泌蛋 白的功能，所以开展了本项目的研究。同时，对家蚕肠球菌外分泌蛋白分子 特性及其抑制微孢子虫孢子发芽的研究，可以为以家蚕微粒子病为代表的动 物( 昆虫) 微孢子虫的微生态生物防治提供理论和实践依据，为肠球菌资源 的开发利用提供一条新的途径。 宋连花：家蚕来源肠球菌r a p d 分型及娄肠球菌素的分离纯化 第一章家蚕来源肠球菌d n a 多态性的r a p ) 分析 近年来，随机扩增d n a 多态性分析( r a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i c d n a ，r a p d ) 技术在细菌、真菌、支原体、螺旋体等微生物分型中得到了广 泛应用。s k j o l d 等( 1 9 8 7 ) 首先运用染色体d n a 酶切图谱分析了从人和动物中 分离到的链球菌