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以细小色矛线虫为模型动物的环境雌激素活体筛选 学位论文完成日期： 指导教师签字： 答辩委员会成员签字： l ， ， - 。 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得( 洼； 垒旦没直甚他盂蔓挂剔直明的：奎拦互窒2 或其他教育机构的学位或证书使用过的 材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说 明并表示谢意。 学位论文作者签名：京番厕签字日期：洲9 年r 月刃日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，并同意以下 事项： l 、学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许 论文被查阅和借阅。 2 、学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权清华大学“中 国学术期刊( 光盘版) 电子杂志社”用于出版和编入嗍中国知识资源总库， 授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：薄永强 签字日期：洳i o 年5 月溜日 导师签字： 签字日期：溯睥f 月垴 选两大类，离体筛选快速、便捷；活体筛选更能反映环境雌激素对生物体的效应 及其机制，一般认为结果更可靠。因此活体动物模型筛选方法相比较而言具有更 大的实践意义。应用较广的活体筛选模型动物为鼠和鱼类，但其存在实验周期较 长，实验费用高等缺点，而选择自由生活海洋线虫作为模式生物便可以解决这一 问题。自由生活海洋线虫( f r e e 1 i v i n gm a r i n en e m a t o d e ) 是线虫动物门( n e m a t o d e ) 的一个重要组成部分，其种类繁多且分布广泛，从滨海潮间带的高潮线到深海大 洋的最深海沟，以及从寒冷的两极到深海脊上的高温热泉生境都有它们的分布。 细小色矛线虫( c h r o m a d o r i n ag e r m a n i c a ) 具有个体小、生活史短( 1 4 d ) 、雌雄异体、 行两性繁殖的特征，经本实验室自主开发培养，已在实验室进行单种连续培养 9 0 多代。 卵黄原蛋白( v i t e l l o g e n i n , v t g ) 是检测环境雌激素的重要生物标志物，其分 子水平上的指标雄性鱼类v t gm r n a 是一种灵敏度高、特异性好的生物标 志物。以v t gm r n a 为生物标志物的环境雌激素筛选方法主要包括实时定量 p c r 、n o r t h e r n 杂交、原位杂交等。其中，原位杂交沏s i t uh y b r i d i z a t i o n ) 是一种 使用标记的核酸探针来检测与其互补的靶核酸在细胞或组织中的位置的技术，不 但免除了从组织中提取r n a 的步骤，还可以准确地反映出v t gm r n a 在组织 甚至生物整体样本中的位置及状态，实验结果也更为直观。 久效磷农药是一种高效的有机磷杀虫剂，其使用残留对水生生物和人类健康 具有潜在的威胁。邴欣等研究表明久效磷农药能够诱导雄性金鱼合成和分泌卵黄 原蛋白，是一种环境雌激素。因此，本文拟通过使用原位杂交手段，检测在内源 性雌激素( e 2 ) 和环境雌激素( 久效磷农药) 的诱导下细小色矛线虫v t gm r n a 的 表达，初步探讨了选用细小色矛线虫为研究对象、v t gm r n a 为分子水平的生 物标志物构建环境雌激素活体筛选模型的可行性。 主要研究结果如下： 设计了扩增细小色矛线虫v t g 基因的兼并引物，通过p c r 和r t - p c r 的方 法，获得了长度为5 2 5b p 的一段核苷酸序列。通过在n b c i 网站上和生物软件 d n a m a n 里分析比对，初步认定这段核酸是细小色矛线虫v i t - 6 的部分序列。 根据所获得的细小色矛线虫v i t - 6 的部分序列，设计了针对细小色矛线虫 v t gm r n a 的寡核苷酸探针，并用地高辛标记，应用此探针进行原位杂交实验， 证明了探针可与线虫体内v t gm r n a 发生特异性结合。 在此寡核苷酸探针序列的基础上，合成了荧光素5 f a m 直接标记的探针， 进行了灵敏度更高的荧光原位杂交实验，不仅进一步验证了探针与v t gm r n a 的特异性结合力，还显示出雄虫体内v t gm r n a 的合成量随着环境雌激素暴露 浓度的加大有微弱的上升趋势。 综上，以克隆出的cg e r m a n i c av t g 基因片段为模板设计并制备寡核苷酸 探针，通过原位杂交的技术手段，能有效地检测出环境雌激素对雄性线虫v t g m r n a 的诱导。使用自由生活海洋线虫cg e r m a n i c a 作为环境雌激素快速、活体 筛选的模型动物是可行的，具有实际应用意义。 关键词：细小色矛线虫；环境雌激素；活体筛选；卵黄原蛋白；原位杂交 2 n 。 o fe n v i r o n m e n t a 。 usingin v l v os c r e e n i n l 乏o ie n v i r o n m e n t a le s t r o e e n su s l n c h r , ) m a d o r i n ag e r m a n i c aa sm o d e la n i m a l r o m a d o r i n an i a b s t r a c t c u r r e n t l y , t h em o s tm a t u r ee s t a b l i s h e dr a p i ds c r e e n i n gm e t h o dt od e t e c tp o t e n t i a l e n v i r o n m e n t a le s t r o g e n sc a r lb ed i v i d e di n t ot w oc a t e g o r i e s ，w h i c ha r ei nv i t r o s c r e e n i n ga n di nv i v os c r e e n i n g nv i t r os c r e e n i n gi sq u i c k e ra n de a s i e r ；w h i l e 加v i v o s c r e e n i n g r e f l e c t st h ee f f e c t sa n dm e c h a n i s m so nt h ew h o l e o r g a n i s m o f e n v i r o n m e n t a le s t r o g e n sb e t t e r , w h i c hi s g e n e r a l l yc o n s i d e r e dt ob em o r er e l i a b l e t h e r e f o r e ，s c r e e n i n gm e t h o d se m p l o y i n gw h o l ea n i m a l 伽v i v om o d e l si so fm o r e i m p o r t a n c ea n dp r a c t i c a ls i g n i f i c a n c e h o w e v e r , r o d e n ta n df i s kw h i c ha r ew i d e l y u s e df o r 加v i v os c r e e n i n g ，h a v ed i s a d v a n t a g e ss u c ha sl o n ge x p e r i m e n t a lp e r i o d sa n d h i g hc o s t si na p p l i c a t i o n f r e e - l i v i n gm a r i n en e m a t o d ec a nb ec h o s e na sam o d e l o r g a n i s mt o s o l v et h i s p r o b l e m f r e e - l i v i n gm a r i n en e m a t o d ei s a ne s s e n t i a l c o n s t i t u e n to fn e m a t o d e ，w h i c hd i s t r i b u t e se x t e n s i v e l y , r a n g ef r o mc o a s t a li n t e r t i d a l t i d el i n et ot h ed e e p e s td e e po c e a nt r e n c h , a n df r o mt h ec o l dp o l e st ot h ed e e p - s 鼹 r i d g e so fh i g h - t e m p e r a t u r e f r e e l i v i n gm a r i n en e m a t o d ec h r o m a d o r i n ag e r m a n i c ai s s m a l l ，g o n o c h o r i s mw i t hb i s e x u a lr e p r o d u c t i o n , a n dh a sas h o r tl i f ec y c l e ( 1 4 d ) ， w h i c hh a sb e e ns i n g l e - s p e c i ec o n t i n u o u sc u l t u r e df o rm o r et h a n9 0g e n e r a t i o n si no u r l a b o r a t o r y v i t e l l o g e n i n ( v t g ) i sa ni m p o r t a n tb i o m a r k e ro fe n v i r o n m e n t a le s t r o g e n s s c r e e n i n g ，e s p e c i a l l ym a l ef i s hv t gm r n a ，w h i c hh a sh i 【g hs e n s i t i v i t y a n d s p e c i f i c i t y e n v i r o n m e n t a le s t r o g e n ss c r e e n i n gm e t h o d s ，丽mv t gm r n aa sa b i o m a r k e r , i n c l u d er e a l - t i m eq u a n t i t a t i v ep c r , n o r t h e r nb l o t , 加s t uh y b r i d i z a t i o n n s i t uh y b r i d i z a t i o ni sat e c h n o l o g yw h i c hu s e dt od e t e c tt a r g e tn u c l e i ca c i d 、析t l l c o m p l e m e n t a r yl a b e l e dn u c l e i ca c i dp r o b ei nc e l l so rt i s s u e s t l l i st e c h n i q u en o to n l y c o n v e n i e n t l ye x e m p t sf r o me x t r a c t i n gr n a f r o mt i s s u e s ，b u ta l s op r o v i d eaa c c u r a t e a n dd i r e c t v i e w i n gr e f l e c t i o no ft h el o c a t i o na n ds t a t u so fv t gm r n ai nb i o l o g i c a l s a m p l e s m o n o c r o t o p h o si sah i g h l ye f f e c t i v eo r g a n o p h o s p h o r u sp e s t i c i d e ，o fw h i c h r e s i d u e si ne n v i r o n m e n th a v et h r e a t e dt h eh e a l t ho fa q u a t i co r g a n i s m so re v e nh u m a n b i n gx i n ss t u d ys h o w e dt h a tm o n o c r o t o p h o si n d u c e ds y n t h e s i sa n ds e c r e t i o no f 3 v i t e l l o g e n i n i nm a l eg o l d f i s h , a n dt u m e do u tt ob ea ne n v i r o n m e n t a le s t r o g e n t h e r e f o r e ，t h i st h e s i sh a sb e e nd e s i g n e dt od e t e c ti n d u c e d - e x p r e s s i o no fv t gm r n a i nc g e r m a n i c ae x p o s u r e dt oe n d o g e n o u se s t r o g e n 他) a n de n v i r o n m e n t a le s t r o g e n ( m o n o e r o t o p h o s ) ，b yu s i n gi ns i t uh y b r i d i z a t i o n t h ef e a s i b i l i t yo fc o n s t r u c t i n ga n o v e li nv i v or a p i ds c r e e n i n gm e t h o do fd e t e c t i n ge n v i r o n m e n t a le s t r o g e n s 谢t 1 1c g e r m a n i c a a sm o d e la n i m a la n dv t gm r n aa sm o l e c u l a rb i o m a r k e r 1 1 1 em a i no u t c o m e sa r ea sf o l l o w s ： d e g e n e r a t ep r i m e r sf o rc l o n i n gcg e r m a n i c av t gg e n eh a sb e e nd e s i g n e d ，a n d a5 2 5 b yl o n gn u c l e o t i d es e q u e n c eh a sb e e no b t a i n e db yp c r , r t - p c ra n ds oo n c o m p a r i s o nr e s u l t sb e t w e e nt h i sn u c l e i ca c i ds e q u e n c ea n dv t gg e n es e q u e n c e so f o t h e rn e m a t o d a so nn b c lw e b s i t ea n di nb i o l o g i c a la n a l y s i ss o f t w a r ed n a m a ns h o w t h a tt h i sn u c l e i ca c i df r a g m e n ti sa p a r to f c g e r m a n i c av i t - 6s e q u e n c e a c c o r d i n gt ot h ea v a i l a b l es e q u e n c eo fcg e r m a n i c av i t - 6g a i n e da b o v e ，c g e r m a n i c av t g m r n a o l i g o n u c l e o t i d ep r o b e sl a b e l e d 诵t 1 1d i gh a v eb e e nd e s i g n e d a n dp r e p a r e d a p p l i c a t i o no ft h e s ep r o b e si n i ns t uh y b r i d i z a t i o ne x p e r i m e n t s d e m o n s t r a t e st h a tt h e r ei ss p e c i f i c i t yh y b r i d i z a t i o nb e t w e e nt h ed i g - l a b e l e dp r o b e a n dv t gm r n ai nc g e r m a n i c a b a s e do nt h ed i g l a b e l e do l i g o n u c l e o t i d ep r o b e s ，m o r es e n s i t i v ep r o b e sl a b e l e d d i r e c t l y 、析t l lf l u o r e s c e i n5 一f a mh a sb e e ns y n t h e s i s e da n da p p l i e di nf l u o r e s c e n c ei n s t uh y b r i d i z a t i o n t h er e s u l t so fh y b r i d i z a t i o nn o to n l yh a v ef u r t h e rv e r i f i e d t h e s p e c i f i c i t yb e t w e e nt h eo l i g o n u c l e o t i d ep r o b e sa n dcg e r m a n i c av t gm r n a , b u t a l s os h o w sas l i g h tu p w a r dt r e n do fs y n t h e s i so fv t gm r n ai nm a l ec g e r m a n i c a w i t ht h ei n c r e a s eo ft h ec o n c e n t r a t i o no fe n v i r o n m e n t a le s t r o g e n s i ns u m m a r y , i ns i t uh y b r i d i z a t i o n su s i n gs p e c i f i c i t yp r o b e sw h i c hh a v eb e e n d e s i g n e db a s e do nc l o n e dcg e r m a n i c av t gg e n ef r a g m e n t , h a v ee f f e c t i v e l y d e t e c t e dt h ei n d u c e d - e x p r e s s i o no fv t gm r n a b ye n v i r o n m e n t a le s t r o g e ni nm a l ec g e r m a n i c a u s i n gf r e e - l i v i n gm a r i n en e m a t o d e scg e r m a n i c a 硒m o d e la n i m a lt o c o n s t r u c tan o v e li nv i v or a p i ds c r e e n i n gm o d e lo fd e t e c t i n ge n v i r o n m e n t a le s t r o g e n s i sp r a c t i c a b l ea n do fa p p l i c a t i o nv a l u e k e y w o r d s ：c h r a m a d o r i n ag e r m a n c a ； s c r e e n i n g ；v i t e ii o g e n i n ； 4 e n vir o n m e n t ai e s t r o g e n s ；i nv i v o i ns i t uh y b r i d i z a t i o n 0 前 1 环 1 l 1 1 4 分子水平。7 1 4 1 免疫检测法( i m m u n o a s s a y s ) 。7 1 4 2 生物传感器检测法8 1 5 研究展望8 1 5 1 快速筛选技术的优劣势分析8 1 5 2 快速筛选模式生物的选择9 1 5 3 快速筛选技术的甄选1 0 1 5 4 快速筛选试剂盒的研制及应用方向1 0 2 细小色矛线虫卵黄原蛋白基因的克隆1 1 2 1 材料与方法1 l 2 1 1 实验动物来源与培养。l l 2 1 2 主要试剂1 1 2 1 3 主要仪器1 2 2 1 4 样品采集1 2 2 1 5i 之n a 提取1 2 2 1 6d n a 提取l3 2 1 7a m v - r t 反应体系。1 3 2 1 8 引物设计。1 4 2 1 9p c r 反应1 4 2 1 1 0p c r 扩增条带的凝胶回收1 5 2 1 1 1 扩增片段的克隆1 6 2 1 1 2 扩增核苷酸序列的特异性检测1 8 2 2 结果与分析。18 2 2 1 电泳检测r n a 质量。l8 2 2 2p c r 检测反转录e d n a 质量18 2 2 3 电泳检测基因组d n a 质量2 0 2 2 4 引物设计2 0 2 2 5c g e r m a n i c av t g 基因特异性序列的克隆2 l 2 2 6 所得cg e r m a n i c av t g 基因片段的特异性比对2 2 2 3 讨论2 4 2 3 1 线虫的v t g 基因家族2 4 2 3 2 基因克隆与序列比较分析2 6 3 利用原位杂交技术检测细小色矛线虫v t gm r n a 的表达2 8 3 1 材料与方法2 8 3 1 1 实验动物2 8 3 1 2 主要试剂2 8 3 1 3 主要器材2 9 3 1 4 久效磷农药和e 2 暴露实验2 9 3 1 5 原位杂交检测细小色矛线虫v t gm r n a 的表达3 0 3 2 结果与分析3 1 3 2 1 原位杂交寡核苷酸探针的设计3 1 3 2 2 原位杂交结果3 2 3 3 讨论3 5 3 3 1 原位杂交基础上的快速筛选方法的建立。3 5 3 3 2 提高寡核苷酸探针的杂交效率和准确率的讨论。3 6 3 3 3 原位杂交技术和细小色矛线虫在活体筛选中的应用。3 6 4 利用荧光原位杂交技术检测细小色矛线虫v t gm r n a 的表达。3 8 4 1 材料与方法3 8 4 1 1 实验动物3 8 4 1 2 主要试剂3 8 4 1 3 主要器材3 8 4 1 4 久效磷农药和e 2 暴露实验3 8 4 1 5f i s h 检测细小色矛线虫v t gm r n a 的表达。3 8 4 2 结果与分析3 9 4 2 1 荧光原位杂交寡核苷酸探针的设计3 9 4 2 2 荧光原位杂交结果3 9 4 3 讨论z 1 2 4 3 1 荧光素标记的探针与原位杂交方法的结合4 2 4 3 2 增强f i s h 中杂交信号的改进方法4 2 4 3 3 以细小色矛线虫为模型动物的荧光原位杂交活体筛选技术4 3 5 结论 参考文献 附录 致谢 2 4 4 4 5 5 3 5 9 以细小色矛线虫为模型动物的环境雌激素活体筛选 o 刖吾 随着我国工业化程度的不断提高，重大的水污染事件在我国也频繁发生。 2 0 0 8 年初的贵州都柳江水污染事件，2 0 0 9 年初的江苏省盐城水源污染事件， 2 0 0 9 年7 月和8 月的内蒙古赤峰恶性水污染事件以及陕西省风翔重金属水污染 事件等多起重大水环境污染事故，环保安全警钟长鸣。某些环境污染物经过食 物链浓缩会对人类产生潜在的危害，严重威胁着我国人民的健康。其中，环境 雌激素( e n v i r o n m e n t a le s t r o g e n s ) 是一类广泛存在于环境、食物以及消费品中的 可以对生物体内激素水平产生影响的物质( w h o d p c s ，2 0 0 2 ； d i a m a n t i k a n d a r a k i se t 她2 0 0 9 ) 。近年来，随着经济的发展和工业化程度的提高， 环境雌激素在自然界中的分布、含量及暴露途径也随之变广、增多( d e m kv h e f l e ya n dk e n n e t hs ，2 0 0 6 ；i a nr f f l c o n e re ta 1 ，2 0 0 6 ；m i e h e l l em t a b ba n d b r u c eb l u m b e r g ，2 0 0 6 ) 。因此，为了减少和避免环境雌激素对生物体及对人类的 危害，建立方便、有效、快捷的筛选方法从环境污染物中检测出具有干扰内分 泌系统的潜力的化学物质等已成为环境科学研究领域的当务之急( i a nr f f l c o n e re ta 1 ，2 0 0 6 ) 。 目前，已建立的较为成熟的环境雌激素的快速筛选和检测方法主要包括离 体筛选和活体筛选两大类，集中在动物模型整体水平、组织与器官水平、细胞 水平和分子水平四个不同的研究层面。离体筛选方法有着活体筛选方法所不可 比拟的简便和高效，但离体方法筛选出的某些化学物质，在活体中被证实并没 有表现雌激素活性；反之，某些离体模型未能检测出具有雌激素活性的化学物 质，在活体内发挥了干扰内分泌的作用。活体筛选能够反映出外来化学物质在 生物体内通过多种内分泌轴线进行的综合作用及其产生的影响。因此，若要达 到全面、准确地筛选环境雌激素的目的，经过在离体快速检测方法的初筛之后， 还必须进行活体检测，并以环境化学物质对生物体的效应为主要参考判断其是 否具有类雌激素性质。 在环境雌激素的活体筛选中，目前最常用的模型动物为鼠和鱼。而以这些 物种为研究对象对环境中的化学物质进行检测时，存在实验周期较长，实验费 用高等缺点。自由生活海洋线虫( f r e e 1 i f i n gm a r i n en e m a t o d e ) 是线虫动物门 ( n e m a t o d e ) 的一个重要组成部分，其种类繁多且分布广泛，从滨海潮间带的高 以细小色矛线虫为模型动物的环境雌激素活体筛选 潮线到深海大洋的最深海沟，以及从寒冷的两极到深海脊上的高温热泉生境都 有它们的分布。细小色矛线虫( c h r o m a d o r i n ag e r m a n i c a ) 具有个体小、生活史短 ( 1 4 d ) 、雌雄异体、行两性繁殖、通体半透明的特征，经本实验室自主开发培养， 已在实验室进行单种连续培养9 0 多代。作为一种生活周期短的成虫细胞定数生 物，自由生活海洋线虫若被应用于环境雌激素活体筛选中，既可以方便、快速 地对环境中的化学物质进行分析，又可以在生物体整体水平上检测出该化学物 质对自然界中的生物是否具有雌激素效应。目前国内外尚未见到使用海洋线虫 作为模型动物进行环境雌激素活体筛选的研究，整体水平上的研究更未有报道。 卵黄原蛋白( v i t e l l o g e n i n , v t g ) 是卵生脊椎动物和非脊椎动物卵黄蛋白 ( y o l kp r o t e i n ) 的前体，它是受雌性激素调控的一种大分子的糖磷脂蛋白。v t g 特异地存在于性成熟的卵生雌性动物体内，并不在雄性动物体内合成( 张士璀 等，2 0 0 2 ) 。但在外源雌激素的作用下，雄性卵生动物的v t g 基因也会被激活， 从而异常表达产生卵黄原蛋白。因此，雄性卵生动物的v t g 是检测环境雌激素 的重要生物标志物。 我国环境雌激素的生物筛选主要采用传统的群落学方法和生物化学检测 法，以v t g 为生物标志物来筛选环境雌激素的一般方法主要包括w e s t e r n b l o t ( 邴欣等，2 0 0 6 ) 、e l i s a ( 温茹淑等，2 0 0 7 ) 和放射免疫测定等。近年来，随 着分子生物学的发展，多种以v t gm r n a 为生物标志物来筛选环境雌激素的 方法逐步建立起来，如实时定量p c r ( y a nte ta 1 ，2 0 0 4 ；t i a nh e ta 1 ，2 0 0 9 ) 、 n o r t h e r nb l o t 等。y a ht 等( 2 0 0 4 ) 用实时定量p c r 的方法检测1 7 1 3 雌二醇( e s t r a d i o l ， e 2 ) 对v t gr n r n a 的诱导作用，最低检测限为：斑马鱼1 耀几、青鳊0 1 熠几， 低于李康等( 2 0 0 3 ) 和温茹淑等( 2 0 0 7 ) 用间接酶联免疫吸附反应( e l i s m 检测雄鱼 体内的v t g 的检测限：7 8 嵋几，由此可见，分子生物学检测方法的灵敏度明 显优于免疫学检测方法。 然而，实时定量p c r 和n o r t h e r n 杂交方法均针对于从样品中分离提取出的 r n a 进行检测，步骤相对繁琐、实验周期长。原位杂交( ns t uh y b r i d i z a t i o n ) 是 一种将标记的d n a 或者r n a 探针与组织或细胞中的核酸进行杂交，使用核酸 探针来检测与其互补的另一条链在细菌或其他真核细胞中的位置的技术。原位 杂交不需要从生物样本中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏 2 以细小色矛线虫为模型动物的环境雌激素活体筛选 感性，并可完整地保护组织和细胞的形态，更能准确地反映出目的核酸链的位 置、组织细胞的相互关系及功能状态。使用原位杂交技术，可以从动物整体水 平上筛选环境雌激素，并可更为直观地显示出检测结果。 当前，从分子生物学的角度，在动物模型整体水平上，对环境雌激素进行 筛选的报道较少。本文在国家自然科学基金( 编号：3 0 6 7 1 6 1 8 ) 的支持下，选取 细小色矛线虫为研究对象，v t gm r n a 为分子生物学标志物，通过原位杂交手 段，检测环境雌激素对细小色矛线虫的雌激素效应，旨在建立一个创新的快速 环境雌激素活体筛选模型。 3 以细小色矛线虫为模型动物的环境雌激素活体筛选 l 环境雌激素快速筛选方法研究进展 1 1 模型动物筛选法 1 1 1 大鼠子宫增重法 大鼠子宫增重法( t h er o d e n tu t e r o t r o p h i ca s s a y ) 选用未成熟的雌幼鼠或摘除 卵巢的雌成鼠为研究对象，以口服或皮下注射的方式，将实验动物连续3 - 4 天 暴露于待测化学物质( k a n ge ta 1 ，2 0 0 0 ；m a r k e ye ta 1 ，2 0 0 1 ) ，然后剥离受试对象的 子宫并测定对照组与实验组的子宫的脂肪、干重或湿重与体重的比值( b r a n h a me t a 1 ，1 9 8 8 ) ，进而评价待测化学物质是否具有促进子宫生长的作用，判断其是否具 有雌激素效应。 大鼠子宫增重法步骤固定，筛选程序简单，是最为成熟的筛选检测环境雌激 素的体内实验方法之一( e v a n s e t a l ，1 9 4 1 ；g e l l e r t e t a l ，1 9 7 7 ) ，可以方便地检测壬 基酚、双酚a 、甲氧滴滴涕、染料木黄铜、雌二醇、己烯雌酚、乙炔雌二醇等7 种雌激素的混合物的性质( t i n w e l la n da s h b y , 2 0 0 4 ) 。在动物模型和暴露途径的选 择上，对未成熟的雌幼鼠进行皮下暴露待测物是最敏感的实验方法( k a n ge ta 1 ， 2 0 0 0 ) ，比采用摘除卵巢的雌成鼠口服暴露的检出限低，可用以检测小剂量( 1 0 0 m g k g d ) 的弱雌激素活性的p _ 壬基酚。 随着实际应用的进展，m a r k e y 等( 2 0 0 1 ) 观察到子宫内膜上皮细胞的厚度和阴 道开v l ( v a g i n a lo p e n i n g ，v o ) 等指标，比子宫湿重更为敏感，因此建议在传统子宫 增重试验的基础上增设其他敏感的指标。同时，试验中所得的血液及其他器官， 也可以被合理利用来检测急性暴露对生殖轴线上其他内分泌腺体的作用，或者作 为其他检测雌激素的离体方法的实验对象。 1 1 2 水生生物形态学变化观察法 除了选用哺乳动物为模型生物，食蚊鱼( g a m b u s i aa f f i n i sh o l b r o o k 0 的形态特 征的改变也可用于筛选具有雌激素活性( b a t t ya n dl 氓1 9 9 9 ) 及雄激素活性 ( l e u s c he ta 1 ，2 0 0 5 a ) 的化学物质的指标。甲壳类动物m o l l u s kg e n i t a l i a 也被用于 污水中环境雌激素的检测，且其形态改变指标的敏感性要较食蚊鱼更优( b l a i s ee t a 1 ，2 0 0 2 ) 。相比而言，形态学指标能更直接表征污染物对生物体的影响，然而不 如细胞或分子水平上的指标精确度高。 4 以细小色矛线虫为模型动物的环境雌激素活体筛选 1 2 组织与器官筛选法 雌激素受体结合法( c o m p e t i t i v ee s t r o g e nr e c e p t o rb i n d i n ga s s a y s ) 具有雌激素效应的内分泌干扰物可以在特定器官内( 如肝脏) 与雌激素受体 结合，启动信号传导途径，诱导产生细胞应答( s t e p h e n s e ne ta 1 ，1 9 9 8 ) ，并最终表 现为卵黄原蛋白等终端产物的生成。利用这一性质，既可以通过测量受体结合力 ( l e u s c he ta 1 ，2 0 0 5 b ) ，亦可以通过检测终端产物的产量( s t e p h e n s e ne ta 1 ，1 9 9 8 ； k o e r n e re ta 1 。1 9 9 9 ) ，从而较为灵敏地检测出待测物对生物体造成的内分泌干扰 影响。 美国环境保护局( t h ee n v i r o n m e n t a lp r o t e c t i o na g e n c y , e p a ) f a , 将这种简便 方法广泛应用于环境雌激素的前期快速筛选( h i g ht h r o u g h p u t ir e - s c r e e n i n g ， h t p s ) 步骤中( a n l d e ye ta 1 ，1 9 9 7 ) 。e p a 选取了几种不同的人乳腺癌细胞系，构 建了可以产生雌激素受体的t 4 7 d 细胞系、可以产生雄激素受体的m d a 4 5 3 细 胞系，和可以产生甲状腺激素受体的h e l a 细胞系，使它们产生反应受体并应用 于快速筛选( g i b s o n , 2 0 0 3 ) ，可以省时省力地进行大量样品的初步检测。这种筛选 方法不仅简单易行，还有一个其他方法所不具备的突出的优点：由于受体应答反 应的差异，可以有效区分开激素激动剂和激素拮抗剂( i a nr f a l c o n e re ta 1 ，2 0 0 6 ) 。 1 3 细胞筛选法 1 3 1 细胞培养检测法 除了能够通过特定器官内的细胞应答诱导生成生物标志物以外，环境雌激素 还可以对含有雌激素受体( l i p p m a na n db o l a n , 1 9 7 5 ；h o r w i t ze ta 1 ，1 9 7 8 ) 的人乳 腺癌细胞系产生细胞应答( k o e m e re ta 1 ，1 9 9 9 ) 。 其中应用最广泛的即为m c f 7 细胞增殖实验( m c f 7c e l lp r o l i f e r a t i o n b i o a s s a y ) ，在低浓度( 2 5 ) 下也能接受到e 2 、活性炭葡聚糖处理胎牛血清 ( c d f b s ) 、活性炭葡聚糖处理的女人血清( c d f h s ) 等物质的类抗雌激素刺激信 号并大量生长增殖( s o u l ea n dm c g r a t h ，1 9 8 0 ；s o t oa n ds o r m e n s c h e i n ，1 9 8 5 ) 。s o t o 等( 1 9 9 5 ) 利用m c f 7 细胞的这个性质设计了e - s c r e e n 实验。该实验被应用到 处理后污水中烷基酚、邻苯二甲酸盐、多氯联苯及多种杀虫剂等类雌激素的含量 检f l f f l e u s c he ta 1 ，2 0 0 5 b ) ，检出限可低至p g l 数量级( s o t oe ta 1 ，1 9 9 5 ) 。 2 0 0 2 年，r a s m u s s e n 和n i e l s e n 又对e s c r e e n 实验进行了优化，对m c f 7 以细小色矛线虫为模型动物的环境雌激素活体筛选 细胞的生长条件、初始密度、培养基以及环境雌激素的助溶剂等一系列参数进行 了规范和界定，使暴露后的m c f 7 细胞的增殖量由原来的2 倍一- 1 0 倍不等提高 到了1 1 倍，同时提出了通过细胞计数或m t t 荧光染色法测定相对增殖力的改良 方案。 1 3 2 酵母雌激素筛选测试法( y e a s te s t r o g e ns e r e e l l ，y e s ) r o u t l e d g e 和s u m p t e r ( 1 9 9 6 ) 使用基因重组技术，在酵母细胞中构建了可以表 达人雌激素受体的酵母表达载体和由e r e 调控的