（动物学专业论文）鸡胚不同组织细胞的体外培养及永生化.pdf

嬲嬲 原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师的指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。除本文已经注明引用的内容外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得内蒙古大学及其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中做了明确的说明并表示谢意。 ， 学位论文作者签名：崮这道 指导教师签名 e l 期：超! 差圈堡 日 期：边l 辇土出 在学期间研究成果使用承诺书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：内蒙古 大学有权将学位论文的全部内容或部分保留并向国家有关机构、部门送交学位 论文的复印件和磁盘，允许编入有关数据库进行检索，也可以采用影印、缩印 或其他复制手段保存、汇编学位论文。为保护学院和导师的知识产权，作者在 学期间取得的研究成果属于内蒙古大学。作者今后使用涉及在学期间主要研究 内容或研究成果，须征得内蒙古大学就读期间导师的同意；若用于发表论文， 版权单位必须署名为内蒙古大学方可投稿或公开发表。 学位论文作者签名：鲤么坦鹦， 指导教师签名： 日 期：蜘年上璋珍e l 期：j 幽l 乞蚣 内蒙古大学硕士学位论文 鸡胚不同组织细胞的体外培养及永生化 摘要 鸡胚永生化细胞系可用于病理学诊断、疫苗生产及其效力与安全性检测。鉴于目前国内 还没有该细胞系的建立，本研究通过体外培养鸡胚不同的组织细胞，对其基本生物特性进行 了测定，并采用物理、化学及细胞融合等方法，体外诱导鸡胚各组织细胞发生转化，建立鸡 胚永生化细胞系。 研究中取鸡胚躯体来源细胞( b o d yt i s s u ec e l l s ，b t c ) 、心脏来源细胞( h e a r tt i s s u ec e l l s ， h t c ) ，肺来源细胞( l u n g t i s s u ec e l l s ，l t c ) 进行体外培养及细胞冻存。对上述细胞的形态 学特点、生长曲线、分裂指数、染色体核型等指标进行了综合分析。 采用刮除法和相差消化法，从上述三种组织细胞中分离纯化了以上相应组织细胞。纯化的 细胞大小相近，形态相似，生长特性一致。用d a p i 染色对分离纯化得到的细胞进行进一步 的形态鉴定及支原体污染检测。用抗波形蛋白单克隆抗体、抗结蛋白单克隆抗体、抗角蛋白 1 9 单克隆抗体对b t c 、h t c 、l t c 细胞分别做了免疫组化鉴定，检测得出b t c 为成纤维细 胞、h t c 为成肌细胞、l t c 为上皮类细胞。 用m n n g 、叠氮钠及紫外线诱导鸡胚不同组织的三、四代细胞，计算半致死剂量。筛选 诱导后的细胞，并长期传代培养和冻存，其中有两株细胞( b t c 、h t c ) 分别传代到第3 6 代 和2 9 代。 探索不同分子量、不同浓度的p e g 作融合剂对诱导癌细胞与鸡胚体细胞融合的最适条件， 在h a t 选择培养基下筛选融合细胞，得到杂交瘤细胞。对其进行克隆和传代培养后，杂交细 胞生长速度明显提高。 、 关键词：原代及传代培养、生物学特性、免疫组化鉴定、永生化 鸡胚不同组织细胞的体外培养及永生化 t h ec e l lc u l t u r eo fd i f f e r e n tt i s s u e sf r o mc h i c k e ne m b r y o a n dt h ei m m o r t a l i z a t i o n a b s t r a c t t h ec h i c k e ne m b r y oc e l ll i n ew i t hi m m o r t a l i z a t i o nc a l lb eu s e di nt h ed i a g n o s i sa n dt e s t i n gi n t h ee t i o l o g ya n dp a t h o l o g yo fa v i a n ，t h ep r o d u c t i o no fb a c t e f i na n dt h et e s to fi t st i t e ra n ds a f e t y c o n s i d e r i n gn os u c hc e l ll i n er e c e n t l y , t h er e s e a r c hc u l t u r e dn u m b e r so ft i s s u e sf r o mc h i c k e n e m b r y oi nv i t r o ，a n dn l a k es o m es t u d yo ft h e i rb a s i cb i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c s s o m em e t h o d sa s p h y s i c a l ，c h e m i s t r i c a la n dc e l lf u s i o na r eu s e dt oi n d u c et h ed i f f e r e n tc e l l sf r o mc h i c k e ne m b r y o ， a i m i n ga ta c h i c k e ne m b r y oc e l ll i n ew i t hs t a b l ep h y s i o l o g i c a la n d g r o w t h t h er e s e a r c hc u l t u r e st h r e ek i n d so fc e l l si nv i t r o ，t h eb o d yt i s s u ec e l l s ( b t c ) ，t h eh e a r tt i s s u e c e l l s ( h t c ) a n dl u n gt i s s u ec e l l s ( l t c ) a n dk e 印t h ec e l l si nl i q u i dt r o g e n 勰c e l lr e s o u r c e t h e n ，w e d i ds o m ec o m p l e t ea n a l y s i so fb i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c so ft h o s ec e l l sa b o v e t h es y n t h e t i c a l a n a l y s i so fc e l l si n c l u d e st h e i rm o r p h o l o g i cs h a p e ，t h eg r o w t hc u r v e ，t h ed i v i s i o ni n d e xa n dt h e a n a l y s i s o f k a r y o t y p e w i t ht h em e t h o do fc u r e t t e m e n ta n ds e p a r a t i o nf o rp h a s ed i f f e r e n t , w eg o tc o r r e s p o n d i n gc e l l s f r o mt h r e et i s s u e sh e r e i n b e f o r e ，w i t l l ，s a m es i z e ，s h a p ea n dg r o w t hc h a r a c t e r i s t i c af t l r t h e ri d e n t i f y o ff o r ma n dt h ec h e e ko fp o l l u t i o nw i t hm y c o p l a s m aw e r ec o n d u c t e d 、析n lt h ed y e i n gm e t h o d so f d a p i u s i n gt h em o n o c l o n a la n t i b o d i e sa g a i n s tv t m e n t i n ，d e s m i n ，c y t o k e r a t i n - 19 ，t h ei d e n t i f yo f i m m u n o c y t o c h e m i s t r yw a sp r o c e e d e dw i ht h eb e d yt i s s u ec e l l s ( b t c ) ，t h eh e a nt i s s u ec e l l s ( h t c ) a n dl u n gt i s s u ec e l l s ( l t c ) ，a n db t ci sf i b r o b l a s tc e l l ，h t ci sm y o b l a s tc e l la n dl t ci se p i t h e l i a l c e l l t h er e s e a r c hu s dm n n gs o d i u ma z i d ea n du vt oi n d u c et h et l l i r d ，f o u r t hp a s s a g ec e l l sf r o m d i f f e r e n tt i s s u e s ，l d s 0c a l c u l a t e d , t h e ns e l e c tt h ec e l l sa f t e ri n d u c e m e n t ，s u b c u l t u r eo v e ral o n g p e r i o do f t i m e a n dt w ol i n e s ( b t c 、h t c ) s u b c u l t u r et ot h e3 6 t ha n d 2 9 t h ，n l er e s e a r c hs e e k st h eb e s tc o n d i t i o no fc e l lf u s i o nb e t w e e nt h ec a n c e rc e l l s ( s p 2 oa n dh e p g 2 - ) a n dt h ec e l lf r o mc h i c k e ne m b r y o , u s i n gp e ga sf u s o g e n i ca g e n t t h ef u s i o nc e l l sw e r es e l e c t e di n 内蒙古大学硕士学位论文 t h es e l e c t i v em e d i u mo fh a t , a n dw eg o tc e l l so fh y b r i d o m a a f t e rc e l lc l o n ea n ds u b c u l t u r e ，t h e s p e e do fh y b r i d o m ac e l l sa c c e l e r a t e sa p p a r e n t l y k e y w a r d s ：p r i m a r yc u l t u r ea n ds e r i a ls u b c u t i v a t i o n ，b i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c s ， i m m u n o c y t o c h e m i s t r y ，i m m o r t a l i z a t i o n b i 鸡胚不同组织细胞的体外培养及永生化 第一部分研究论文 目录 引言1 参考文献2 第一章鸡胚不同组织细胞的体外培养及各类细胞的生物学特性分析3 1 材料4 1 1 主要试剂4 1 - 2 主要器材4 1 3 实验动物和细胞4 2 方法4 2 1 培养用品的清洗4 2 2 实验器具的消毒灭菌4 2 3 鸡胚细胞的原代培养5 2 4 细胞的冻存与解冻6 2 5 绘制生长曲线7 2 6 分裂指数测定7 2 7 核型分析7 3 结果9 3 1 鸡胚细胞的形态9 3 2 鸡胚细胞生长曲线的绘制9 3 3 鸡胚细胞分裂指数测定1 0 3 4 鸡胚细胞核型分析1 0 3 5 鸡胚细胞的长期传代培养1 1 4 讨论1 3 参考文献1 5 第二章：鸡胚不同组织细胞的纯化与免疫组化鉴定1 7 1 材料1 9 1 1 主要试剂1 9 1 2 主要器材1 9 2 方法1 9 2 1 鸡胚不同组织细胞的纯化1 9 2 1 2 时相差消化法：1 9 2 2d a p i 染色。2 0 2 3 免疫化学细胞鉴定2 0 3 结果2 2 3 1 鸡胚不同组织细胞的纯化2 2 3 2d a p i 染色2 2 3 3 免疫化学细胞鉴定2 3 i v 内蒙古大学硕士学位论文 4 讨论2 5 参考文献2 6 第三章、鸡胚不同组织细胞永生化的初步研究2 7 1 材料2 8 1 1 主要试剂2 8 1 2 主要器材2 8 1 3 实验细胞2 8 2 方：法2 8 2 1 紫外线诱导鸡胚不同组织细胞永生化2 8 2 2 叠氮化钠诱导鸡胚不同组织细胞永生化2 9 2 3 删n g 诱导鸡胚不同组织细胞永生化2 9 2 4 鸡胚体细胞与癌细胞的融合3 0 3 结果3 3 3 1 紫外线诱导鸡胚不同组织细胞永生化3 3 3 2 叠氮化钠诱导鸡胚不同组织细胞永生化3 3 3 3 m n n g 诱导鸡胚不同组织细胞永生化j 3 3 3 4 细胞融合3 4 4 讨论3 8 参考文献：3 9 结论4 0 附录4 l 第二部分文献综述 永生化细胞系的建立4 7 一、永生化4 9 二、细胞永生化的机制4 9 1 、端粒、端粒酶相关机制j 4 9 2 、p 5 3 蛋白与p 珏蛋白及相关机制5 1 3 、细胞衰老基因相关机制5 2 三、促使细胞永生化的方法5 3 1 、物理化学方法一5 3 2 、生物学方法5 3 四、永生化细胞的监测方法5 6 五、目前存在的问题及发展前景5 6 参考文献5 8 致谢5 8 在读硕士期间已发表和待发表的论文6 2 v 内蒙古大学硕士学位论文 第一部分研究论文 引言 随着真核生物细胞研究的深入，体外培养细胞永生化技术已成为不可或缺的 细胞工程技术。它在分子遗传学、免疫学、病毒学及细胞工程学等领域都有重要 应用。本课题体外培养鸡胚的若干组织细胞，并试图建立鸡胚永生化细胞系。永 生化细胞系可用于禽类病毒培养，禽病病原学和病理学的诊断和检测，疫苗生产 及其效力与安全性检测，甚至可用于疫苗的工业化批量生产。一个稳定的细胞株 的用途更广泛，可作为干细胞培养的饲养层，癌细胞发病机理的研究，以及细胞 衰老和凋亡的研究【l 】。 如今，国内外得到的极为有限的禽类永生化细胞系几乎都是通过侵染病毒 或导入外源基因建成的，如转染e b ，s v 4 0 病毒，导入p 5 3 基因，或激活端粒酶活 性等【2 。5 1 。现已有很多哺乳动物用此类方法建立细胞系的报道，然而，这种细胞 系的稳定性和安全性要比自然永生化细胞系差。在此类细胞系中，整合的病毒基 因或体外导入的外源基因的稳定性一直是无法避免的问题。而且，很大程度上影 响了它的实际中应用，大大的降低其价值。由于导入的外源基因位置的不固定性 和本身整合的不稳定性无法保证此类细胞系本身的生理稳定性，甚至在传代培养 中可能失去其永久分裂能力而衰老死亡，从而无法应用于实际的检测工作中。病 毒侵染而得到的细胞系的安全性更是无法保证，无法用于免疫疫苗等的生产。而 自然永生化的细胞不会有上述问题的存在，生长增殖和生理特性都非常稳定，几 乎不存在安全性问题。但是，正常细胞的自发突变的机会非常小，只有l o 。5 1 0 r 6 的几率，建立一个自发形成的永生化细胞系非常困难，然而在我们研究工作中非 常需要此类永生化的细胞系。 在我国，现已建立的禽类自然永生化细胞系更是少之又少，能应用于实际 工作中的几乎没有。投入工业化生产应用更是无从谈起。所以建立永生化鸡胚细 胞系非常必要。 鸡胚不同组织细胞的体外培养及永生化 参考文献 【1 】杨娜娜，王娟，杜立新细胞永生化的研究进展 j 中国畜牧兽医，2 0 0 4 ，3 2 ( 1 ) ；3 7 3 9 2 s a n d y , z a j c h o w s k i d ，k u l e s a v , e t a l h u m a np a p i l l o m av i r u sd n a si m m o r t a l i z e n o r m a lh u m a nm a m m a r ye p i t h e l i a lc e l l sa n dr e d u c et h e i r g r o w t hf a c t o r r e q u i r e m e n t s j p r o e n a t la c a ds e iu s a ，19 9 0 ，8 7 ( 1 ) ：4 6 3 - 4 6 7 3 m a r u os ，y a n gl ，t a k a d ak r o l e so fe p s t e i n2 b a r rv i r u sg l y c o p r o t e i n s 印3 5 0a n d g p 2 5i n t h ei n f e c t i o no fh u m a ne p i t h e l i a lc e l l s 【j 】g e nv i r o l ，2 0 0 1 ；8 2 ( 1 0 ) ：2 3 7 3 2 3 8 3 【4 】t o b i a sm ，d a g m a rwh a n s j o r gh ，e t a l a n s c r i p t i o na l ly r e g u l a t e di m m o r t a l i z a t i o n o v e re o m e s s i d eo ff e e t so ft e e mp e r a t u r es e n s i t i v es v 4 0l a r g et a n t i g e n 叨b i o e h e m a n db i o p h y s ir e sc o m r n u n i ，2 0 0 5 ，2 7 ( 3 ) ：7 3 4 7 4 1 【5 b a r b a nt i b r o d a n o qs a b b i o n i s ，m a r t i n iee t a l s i m i a nv i r e s 4 0i n f e c t i o ni nh u m a n s a n da s s o c i a t i o n 诵mh u m a nd i s e a s e s ：r e s u l t sa n dh y p o t h e s e s j v i r o l o g ， 2 0 0 4 ，3 3 2 ( 2 0 ) ：21 8 - 2 2 8 2 内蒙古大学硕士学位论文 第一章鸡胚不同组织细胞的体外培养及各类细胞的生物学 特性分析 鸡胚细胞是一类重要的禽类细胞，广泛应用于病毒增殖研烈1 1 、疫苗研发生 产【2 。6 1 和疾病相关基因的表达及检测 7 , 8 1 。在细胞培养中，除哺乳动物细胞外，鸡 胚细胞是早期用于原代细胞培养的主要细胞，现在它被用来生产各种鸡的疫苗， 如法氏囊、马立克、新城疫苗等，也被用来表达一些基因工程产物【9 】。 目前，人们正尝试通过病毒侵染鸡胚细胞，来建立相关的生物模型1 0 1 ，进 而为病毒研究提供实验材料和数据。因此，对鸡胚细胞的生物学特性有必要进行 研究和分析，为选取适当的组织细胞提供参考。现在，国内外的文献大都只对鸡 胚躯体来源的成纤维细胞进行分析和研究，未能对其它组织来源的细胞进行体外 培养的分析和比较。随着禽类细胞研究的深入，鸡胚不同组织体外培养的细胞必 将广泛使用，因而对鸡胚不同组织来源的细胞进行特性分析十分必要。 为此，本实验对第六代的鸡胚躯体来源细胞( b o d yt i s s u ec e l l s ，b t c ) 、心 来源细胞( h e a r tt i s s u ec e l l s ，h t c ) ，肺来源细胞( l u n gt i s s u ec e l l s ，l 1 c ) 的 生物特性进行研究，通过原代培养、传代培养、细胞冻存等技术，综合分析其形 态学特点、生长曲线、分裂指数、染色体核型等指标，阐明不同组织细胞间的差 异，为实验室研究、疫苗生产和病毒增殖模型的建立提供借鉴。 鸡胚不同组织细胞的体外培养及永生化 1 材料 1 1 主要试剂 m 1 9 9 培养基( g i b e o ) ；h e p e s ( s i g m a ) 、n a h c 0 3 ( s i g m a ) ；胎牛血清和 新生牛血清( 杭州四季青) ，胰蛋白酶( a m r e s c o ) ，二甲基亚砜( d m s o ，s i g m a ) ， 1 0 0 u m l 青霉素( 国产) ，i o o u m l 链霉素( 国产) 。 1 2 主要器材 倒置荧光相差显微镜( n i k o n ) ；c 0 2 培养箱( r s b i o t e e h ) ；2 4 孔细胞培养板 及培养皿( c o m i n g ) ；p h 计( s a r t o f i u s ) 超净工作台( 苏州净化设备厂) ，超纯水 仪( m a x i m as c i e n t i f i c ，e l g a ) 立式自控电热压力蒸汽灭菌器( l z d x - 4 0 s b i 型，上 海申安医疗器械厂) 。 1 3 实验动物和细胞 孵化9 1 4 日龄种鸡蛋，购自内蒙古宏鑫种禽有限责任公司。 2 方法 2 1 培养用品的清洗 ( 1 ) 玻璃用品的清洗：在细胞培养中，清洗后的玻璃器皿不仅要求干净透 明、无油迹，而且不能残留任何物质。某些化学物质仅百万分之一毫克。玻璃器 皿的清洗必须严格按照，浸泡、刷洗、浸酸和冲洗四个步骤程序进行。 ( 2 ) 橡胶用品的清洗：胶塞类橡胶用品，每次用后先用蒸馏水浸泡，然后 用2 n a o h 溶液煮沸1 5 2 0 m i n ，用自来水冲洗干净，再用1 稀盐酸溶液浸泡 3 0 m i n ，再用自来水冲洗、蒸馏水洗3 次，最后用四蒸水漂洗1 次，烤干后备用。 ( 3 ) 金属器械的清洗：新的解剖器械应先用纱布擦去防锈油后，再用洗涤 剂煮沸刷洗，然后用自来水、蒸馏水四蒸馏水冲洗，焙干备用。 2 2 实验器具的消毒灭菌 ( 1 ) 湿热灭菌：布类、胶塞、金属器械、玻璃器皿进行1 2 1 ，高压湿热 灭菌3 0 m i n 。 ( 2 ) 滤过除菌：培养用液，如人工合成培养液，血清、酶溶液等采用孔径 为0 2 2 1 m a 的滤膜滤过法除菌。 ( 3 ) 紫外线消毒：操作表面和一些不能用其他方法消毒的物品用距紫外灯 2 5 m 范围内直接照射2 0 r a i n 。 4 内蒙古大学硕士学位论文 ( 4 ) 超净工作台的消毒：工作面先用新吉尔灭擦拭一遍后，打开紫外线灯 灭菌；用3 0w 紫外线灯管直接照射2 0 3 0m i n 。 2 - 3 鸡胚细胞的原代培养 2 3 1 单细胞培养 ( 1 ) 取材：取胚蛋，用7 5 酒精棉球擦拭表面，携入超净工作台内，置于消 毒培养皿中，破壳取胚，放入另一个培养皿中解剖取组织。 ( 2 ) 消化与分散组织块：把组织块移入无菌青霉素瓶中，用眼科剪将组织块 剪成l m m 3 大小的小块再用h a n k s 液洗涤2 3 次，至液体澄清方可。弃去h a n k s 液，加入5 1 0 倍体积的0 2 5 胰蛋白酶溶液( p h 7 4 7 8 ) ，盖好橡皮塞，置3 7 1 2 水浴中消化2 0 3 0 m i n ，消化时每隔5 m i n 摇动一次，使组织块散开。视组织块变 得疏松、颜色略变自时，从水浴中取出，在超净工作台中用吸管轻轻吸去消化液， 加入2 - 3 m l 培养液，以终止消化。然后用吸管反复吹打，使大部分组织块分散成 细胞团或单个细胞状态，静置片刻，让未被消化完的组织自然下沉，然后将上层 细胞悬液移入无菌离心管中备用。 ( 3 ) 离心和计数：离心管平衡后1 0 0 0r m i n 离心5 m i n ，弃去上清液，加入适 量培养液，用吸管轻轻吹打混匀后取样计数。根据计数结果用培养液调整细胞浓 度为5 1 0 5 m l 细胞悬液。 ( 4 ) 接种培养：每2 5 m l 培养瓶接种l m l 细胞悬液，再添加3 m l 培养液，轻轻 混匀后盖瓶盖，标上细胞名称、组号和接种日期等，置3 8 5 c 恒温培养箱中培养。 也可以接种在2 4 孔培养板或螺旋口培养瓶内，置c 0 2 培养箱中开放培养。 ( 5 ) 观察：接种后每天要对培养的细胞做常规观察，注意有无污染、p h 变化 ( 培养液颜色变化) 、细胞贴壁和生长情况。 2 3 2 组织快培养法 ( 1 ) 取材：从动物体内取材方法与单层细胞培养取材相同。将取出的组织移 入无菌的培养皿中，用h a n k s 液冲洗，去除血污。然后移入无菌青霉素小瓶或表 面皿中，用眼科剪将组织反复剪成0 5 1 m m 3 的小块，再用吸管加2 3 滴细胞培 养液，用吸管轻轻吹打，使组织块悬浮在培养液中。 ( 2 ) 接种：用吸管分次吸取组织块悬液，将其均匀排在培养瓶底壁上，翻转 培养瓶，加入2 - 3 m l 培养液，盖好瓶盖，做好标记置于3 7 恒温培养箱中2 3 h 后，待组织块能牢固贴于瓶壁上，再缓慢地将培养瓶翻转，使培养液浸泡组织块， 鸡胚不同组织细胞的体外培养及永生化 继续静止培养。 ( 3 ) 观察：组织块静止培养2 3 d 后，每天小心取出培养瓶置于倒置相差显微 镜下进行观察。尽量少晃动培养液，以防组织块脱落。 2 3 3 传代培养细胞 ( 1 ) 清洗细胞：取已长成或接近长成致密单层的细胞，倒去培养液，加入 2 - 3 m lh a n k s 液轻轻振荡清洗细胞，以去除残留的血清和衰老脱落的细胞及其 碎片。 ( 2 ) 消化：加入适量0 2 5 胰蛋白酶溶液，3 8 5 消化2 - 3 m i n 后，倒置相差 显微镜下观察细胞单层，待细胞成片地收缩，出现许多空隙时即可倒去消化液。 再加h a n k s 液轻轻洗一遍后倾出或直接进行下一步操作。如在酶消化过程中，见 细胞大片脱落，表明消化过头，则不能倒去消化液( 以免丢失细胞) ，需加入等 量的培养液吹打、收集细胞，8 0 0 r r a i n 离心5 m i n 后弃上清液后再进入下一步。 ( 3 ) 接种；在培养瓶中加入3 m l 培养液，以终止消化。用吸管反复吹打瓶壁 上的细胞层，直至全部细胞被冲下。轻轻吹打混匀，制成单细胞悬液，按1 ：2 分配，接种到2 个培养皿内，再向各皿补加培养液到5 m l 。 ( 4 ) 观察：细胞传代后，每天应对培养细胞进行观察，注意有无污染、培养 液的颜色变化、细胞贴壁生长情况等。 2 4 细胞的冻存与解冻 2 4 1 细胞冻存 ( 1 ) 取生长旺盛的细胞( 对数生长期) 倾弃培养液，加入适量经3 7 c 预温的 0 2 5 胰蛋白酶溶液，消化分散细胞。 ( 2 ) 弃消化液，加入2 - 4 m l 含2 0 血清的培养液，中止胰蛋白酶的消化作用。 ( 3 ) 吹打分散细胞，移入离心管中、平衡后1 0 0 0 r m i n 离心5 m i n ，弃上清液。 ( 4 ) 加入5 m l 培养液，重新悬浮细胞并计数，计算细胞浓度，将细胞浓度调 整到2 - 5 x 1 0 6 i i l l ，放置冰浴中。 ( 5 ) 制备含1 0 d m s 0 的血清冷冻保护液，放置冰浴中。 ( 6 ) 1 0 0 0 r r a i n 离心细胞悬液5 m i n ，弃上清，缓慢滴加冷冻保护液。细胞最 终浓度为l - 2 x 1 0 6 i i l l 。 ( 7 ) 将细胞悬液分别移到冷冻管中，每管1 s m l 。管上标明细胞名称、日期、 浓度，旋紧管盖，封口。 内蒙古大学硕士学位论文 ( 8 ) 将冷冻管先置于4 。c 冰箱4 h 再移至8 0 ( 2 低温冰箱1 - 2 4 h ，然后立即投入 液氮 ( - 1 9 6 。c ) 。 ( 9 ) 提桶柄上标记小牌，注明细胞名称、冻存日期、浓度等，以便查找。 2 4 2 细胞复苏方法 ( 1 ) 将冷冻管取出，立即投入3 8 。c 温水中，并充分摇动，使其迅速融化。 ( 2 ) 在超净工作台内，将细胞悬液移至含5 m l 培养液的离心管内，1 0 0 0 1 m i n 离心5 r a i n ，弃上清，加入5 m l 培养液，吸管轻轻吹打悬浮细胞。 ( 3 ) 将细胞悬液移入培养瓶内，置3 7 。c 温箱培养。次日更换一次培养液后， 再继续培养。 2 5 绘制生长曲线 ( 1 ) 取对数生长期的细胞，采用般传代方法，制成细胞悬液。 ( 2 ) 在2 4 孔培养板内准确接种相同数目的细胞。接种密度为l x l 0 5 个细胞 m l 。 ( 3 ) 每天取三孔计数，测出每孔中的细胞总数，求出每组平均值，持续计 数7 d 。 ( 4 ) 绘制生长曲线。 2 6 分裂指数测定 ( 1 ) 取对数生长期的细胞，采用一般传代方法，制成细胞悬液。 ( 2 ) 根据细胞贴壁能力，按适宜浓度，接种于内有无菌小盖玻片的小皿内 ( 最好与绘制生长曲线时细胞浓度相一致) 。 ( 3 ) 每2 4 h 选取皿，h a n k s 液洗涤，3 ：1 甲醇：冰醋酸固定液固定2 0 m i n 。 ( 4 ) g i e m s a 染液染色2 0 m i n ，自然风干。 ( 5 ) 显微镜下选取疏、中、密三个区域，计数视野内分裂细胞数目和细胞 总数。 ( 6 ) 并按公式：分裂指数= 分裂细胞数细胞总数1 0 0 计算分裂指数并 绘制曲线1 3 1 。 2 7 核型分析 ( 1 ) 取对数生长期的细胞，将其置入4 c 过夜。 ( 2 ) 第二天，将细胞重新放至3 8 培养箱培养4 h 。 ( 3 ) 倒置显微镜下观察细胞是否有较多的圆型细胞。 7 鸡胚不同组织细胞的体外培养及永生化 ( 4 ) 采用一般传代方法，制成细胞悬液。 ( 5 ) 1 0 0 0 r m i n 离心细胞悬液，弃上清。加入1 ：2 的培养液、纯水，室 温放置1 0 m i n 。 ( 6 ) 用3 ：1 甲醇：冰醋酸固定液固定1 0 m i n 。 ( 7 ) 1 0 0 0 r r a i n 离心去上清，重复固定1 0 m i n 。 ( 8 ) 1 0 0 0 r m i n 离心去上清，留下细胞悬液0 5 m l 。 ( 9 ) 冷片滴片，过火固定，自然风干。 ( 1 0 ) g i e m s a 染液染色2 0 m i n ，自然风干。 ( 1 1 ) 显微镜观察，查片，照相。 8 内蒙古大学硕士学位论文 3 结果 3 1 鸡胚细胞的形态 对鸡胚细胞进行原代、传代培养，显微镜下观察表明：b t c ( 图1 1 ) 和 h t c ( 图1 2 ) 为成纤维型，细胞体呈梭形、不规则三角形或多角形，中央有卵 圆形核，胞质向外伸出2 个以上长短不同的突起。细胞在生长时多呈放射状或旋 涡状走行。而l t c ( 图1 3 ) 为上皮型，生长后多呈现扁平状，细胞边缘不规则， 中央有圆形细胞核，细胞紧密相连成单层膜。单层膜边缘的细胞多与膜内细胞紧 密相连，很少脱离细胞群单独活动。 图l1 胚体来源细胞( 1 0 0 x ) f i 9 1 1 t h ec e l l sf r o mt h e t i s s u eo fe m b r y o b o d y 图1 2 心来源细m ( t o o x ) 1 2t h ec e l l sf r o mt h e t s s u eo fh e a r t ( 1 0 0 x ) 图1 3 肺来源细胞( 1 0 0 x ) f i 9 1 3t h ec e l l s f r o mt h e t i s s u eo fl u n g ( 1 0 0 x ) 3 2 鸡胚细胞生长曲线的绘制 b t c 、h t c 、l t c 连续计数8 天，结果见表1 1 并根据该数据绘制生长曲线 ( 图1 4 ) ，计算细胞倍增时间。结果表明以上三种组织细胞的倍增时间分别为 2 0 h 、4 6 h 和4 8 h 。 表1 1 鸡胚不同组织细胞计数结果 t a b l e l 1c o u n t i n gr e s u l t so fd i f f e r e n tc h i c k e ne m b r y oc e l l s 9 鸡胚不同组织细胞的体外培养及永生化 图1 4 鸡胚不同组织细胞生长曲线 + 躯体来源细胞 ( s o d yt i s s u e c e l l s ) + 心来源细胞 ( h e a r tt i s s u e e e l l s ) + 肺来源细胞( l u n gt i s s u e e e l l s ) f i 9 1 4t h eg r o w t hc u r v e so fd i f f e r e n tc h i c k e ne m b r y ot i s s u ec e l l s 3 3 鸡胚细胞分裂指数测定 对b t c 、h t c 、l t c 分裂相细胞计数8 天( 表2 ) ，绘制细胞分裂指数曲线( 图 1 5 ) ，发现b t c 分裂第4 天达到最大值，而h t c 、l t c 分别于第6 天、第5 天 达到峰值。 表1 2 鸡胚不同组织细胞分裂指数记录( ) t a b l e l 2d i v i s i o n a li n d e xd a t ao fd i f f e r e n tc h i c k e ne m b r y ot i s s u ec e l l s ( ) 3 4 鸡胚细胞核型分析 选取分散度好、图像清晰的染色体拍照，按照核型分析要求，观察染色体形 态、配对同源染色体。如图1 6 所示，鸡胚细胞染色体数目为7 8 条，其中有z w 染色体各一条。 1 0 的蛎弱衢加坫加0 o _【昌寸。一vio营jc【hou h迥奄一v皿黎基导 图1 6 鸡胚细胞的中期分裂相和核型图 f i 9 1 6m e t a p h a s ea n di d e o g r a mo fc h i c k e ne m b r y oc e l l 3 5 鸡胚细胞的长期传代培养 对鸡胚各器官组织来源的细胞进行组织块培养发现，各组织细胞从第4 5 天 才开始从组织周围生长出来，约1 0 天可铺满瓶底。b t c 可传代培养1 8 代，1 8 代以后生长停滞，退化凋亡。b t c 传到7 8 代有明显的生长瓶颈，生长速度有明 显的下降，甚至有细胞生长形态变形。h t c 传代培养期间也有明显的生长瓶颈 但比b t c 要晚2 3 代。并可传代2 3 代。l t c 传代培养期间没有明显的生长瓶颈， 鸡胚不同组织细胞的体外培养及永生化 但生长期间细胞自身分泌的东西比较多。本实验室可传代培养1 5 代。之后有明 显的退化，凋亡现象。 内蒙古大学硕士学位论文 4 讨论 实验发现9 天的胚蛋比较适合b t c 的培养，而1 4 天的胚蛋适合h t c 、l t c 等内脏细胞培养，因而获取不同的组织需恰当地挑选不同孵化时间的胚蛋。其次， 原代培养要十分注意组织块贴壁时间和培养液添加方式，尤其组织块大小直接影 响贴壁时间长短，一般1 - 2 m m 3 大小组织块需贴4 5 6 5 m i n ，随组织块增大，贴壁 时间应适当延长：添加培养液，要将培养瓶倒置添加，待细胞贴壁牢固，从侧面 缓慢翻转1 8 0 0 即可。细胞传代中发现，不同组织细胞的贴壁状况不同，l t c 最 为牢固，h t c 、b t c 次之，但对胰蛋白酶的敏感程度则是b t c 、h t c 、l t c 依 次减弱。此外，对鸡胚细胞的冻存表明：d m s o 浓度和渗透量会直接影响细胞 在降温时受到损伤的程度，为此，控制好冻存保护剂用量的同时，要缓慢滴加并 快速震荡以利于细胞的吸收，才能使复苏后的细胞达到较高活率。 显微镜下观察发现：b t c 为成纤维型细胞，大多呈梭形，细胞核占细胞比重 较另两种细胞而言最小，细胞生长间距小，生长能力强，当细胞出现接触时会相 互连接，但并不立即抑制生长，待细胞生长空间完全占用后，细胞形态发生改变、 细胞核变暗，个别细胞会出现空泡；h t c 也呈成纤维型，但与b t c 相比较，大 多为不规则三角形，细胞核占细胞比重较大，细胞生长间距大，且当细胞出现接 触时，也不会相互连接，细胞留有一定间距生长；l t c 为明显的上皮型细胞，具 有扁平不规则多角形，与上述两种细胞相比，细胞核占细胞比重大，细胞之间生 长距离最小，紧密相连进行生长，生长过程中有“拉网刀现象存在【1 5 】。 生长曲线和分裂指数能更好的研究不同组织细胞间的差异，实验表明，鸡胚 b t c 生长情况最好，较h t c 和l t c 调整适应期短，且细胞数量增加快。细胞的 分裂指数也可看出，b t c 的分裂指数峰值要高于另两种细胞，且到达分裂最高 点时间最短，由此可推断，b t c 和内脏细胞在生长周期上可能存在很大不同， 尤其对于体外条件下该现象明显。随后的细胞核型表明，实验所得细胞染色体数 目为7 8 条，与正常体细胞一致【1 6 j 。 b t c 、h t c 和l t c 的长期传代培养发现，前两者有明显的第一瓶颈期，传 到7 - 9 代细胞生长及倍增速度明显下降，细胞形态有一定的改变。遗憾的是本实 验未能发现突破第二瓶颈期的细胞。但l t c 培养中未发现生长瓶颈。鸡胚细胞 1 3 鸡胚不同组织细胞的体外培养及永生化 的长期传代培养还发现细胞之间的接触对细胞生长增值影响很大。其传代浓度要 比哺乳动物体外培养的大一些，传代次数越多，越明显，且有“抱团生长”现象， 细胞浓度大的位置生长很快，浓度低的位置生长十分缓慢。l t c 的培养中此现象 越发明显。细胞退化以后细胞突触明显增多折光性增强。 面对不同实验要求，选取不同类型细胞可缩短实验周期、增加实验效率，对 研究有着至关重要的影响，为此，对选取的细胞进行生物学特性分析就十分必要。 本实验对鸡胚不同组织体外培养条件下的细胞进行生物学特性分析，得出了鸡胚 b t c 和以h t c 、l t c 为代表的内脏细胞间的差异，为以鸡胚细胞为实验材料的 研究提供了