（病原生物学专业论文）d2蛋白酶酶学生物活性研究及elisa方法建立.pdf

pr l u ly 17 3 3 4 岩5结论：成功构建了可定量检测d 2 蛋白酶的e l i s a 方法，为后期该蛋白酶酶学性质及菌株生物学研究奠定了基础；d 2 蛋白酶氨基酸序列证明其为一类新型碱性蛋白酶，具有良好的工业应用前景，有望成为一种新型的海洋微生物蛋白酶资源。硕士研究生苏洁( 病原生物学专业) 导师王斌教授关键词：纯化；酶学性质；氨基酸测序；多克隆抗体；e l i s a课题来源：国家“9 7 3 ”计划重大基础研究前期研究专项( 2 0 0 4 c c a 0 2 4 0 0 )山东省科技厅项目( 2 0 0 4 g g 2 2 0 5 1 3 6 )青岛市科技局项目( 0 5 - i - p - l o )e n z y m a t i cp r o p e r t i e so fd 2p r o t e a s ea n de s t a b l i s h m e n te l i s af o rd e t e c t i n gd 2a b s t r a c to b j e e t i v e ：1 t oi s o l a t ea n dp u r i f yt h es e r i n ea l k a l i n ep r o t e a s ef r o mt h ed 2f e r m e n t a t i o n 2 t oi n v e s t i g a t et h ee f f e c to fm e t a li o n sa n dl a u n d r yd e t e r g e n to nt h ee n z y m a t i cp r o p e r t i e sa n ds t a b i l i t yo fd 2p r o t e a s e 3 t oe s t a b l i s ht h ee l i s af o rq u a n t i t a t i v ea n a l y s i so fd 2p r o t e a s eb yp r e p a r i n gt h ep o l y c l o n a la n t i b o d y 4 t oi n v e s t i g a t et h ea m i n oa c i ds e q u e n c eo fd 2p r o t e a s e m e t h o d s ：1 t h ep r o t e a s ew a sp u r i f i e db yas t e p w i s ep r o c e d u r ei n c l u d i n gc e n t r i f u g a t i o n ，g e l s i c c a t i o na n ds i z e e x c l u s i o nc h r o m a t o g r a p h y , a n di d e n t i f i e db ys d s - p a g e 2 t h ep r o t e a s ea c t i v i t ya n ds t a b i l i t yw a si n v e s t i g a t e db ya d d i n gt h em e n t a li o n sc a 2 + ，c u 2 + ，m 9 2 + k + a n dc o m m e r c i a ld e t e r g e n t s 3 t h ed o u b l ea n t i b o d ys a n d w i c he l i s aa n di n d i r e c te l i s af o rq u a n t i t a t i v ea n a l y s i so fd 2p r o t e a s ew e r ee s t a b l i s h e db yt h ea n t i s e r aa g a i n s td 2p r o t e a s eo b t a i n e df r o mt h er a b b i t sa n dg u i n e ap i g s 4 b ym e a n so fe l e c t r o s p r a yi o n i z a t i o n q u a d r u p o l e - t i m eo ff i g h t m a s ss p e c t r o m e t r y( e s i q - t o f m s ) ，a m i n oa c i ds e q u e n c eo fp u r i f i e dd 2p r o t e a s ew a sd e d u c e d r e s u l t s ：1 t h et h r e e s t e pp u r i f i c a t i o np r o t o c o lr e s u l t e di na3 0 - f o l dp u r i f i c a t i o nw i t h3 9 1 a c t i v i t yr e c o v e r y 2 e n z y m a t i ca c t i v i t yi se n h a n c e db yt l l ea d d i t i o no fm e n t a li o n ss u c ha sc a 2 + , c u 2 + , k + ，m g + n es t a b i l i t ya n da c t i v i t yo fd 2p r o t e a s eh a v eas i g n i f i c a n ta c t i v a t i o nw i t h5 m mc a c l 2 t h ep r o t e a s ec a r lb es t a b l ei nt h ec o m m e r c i a ld e t e r g e n t s 3 i nd o u b l ea n t i b o d ys a n d w i c he l i s a ，t h eo p t i m a lw o r k i n gc o n c e n t r a t i o n so fc o a t i n ga n dd e t e c t i o na n t i b o d i e sw e r el ：4 0 0 0a n dl ：5 0 0 0r e s p e c t i v e l y t h el i n e a rr a n g ea n dd e t e c t i o nl i m i tf o rd e t e r m i n a t i o no fd 2w e r e2 8 - 118 0p l ，4 6p lr e s p e c t i v e l y t h er e c o v e r yr a t e so fd 2r a n g e df r o m9 2 4 4 10 5 2 6 t h ed e v e l o p e dm e t h o ds h o w e dg o o dr e l a t i o n s h i pt ot h a tb yb r a d f o r dm e t h o d i ni n d i r e c te l i s a ，t l l el i n e a rd e t e c t i o nr a n g ew a sf r o m18t o116 0r t g l t h ec o i n c i d e n c er a t ew a s9 5 5 b e t w e e nt h i sm e t h o da n da g a rd i f f u s i o nr e a c t i o n 5 b ym e a n so fe s i q - t o f m s ，t h ea m i n oa c i ds e q u e n c eo fd 2w a sd e t e r m i n e da sq v a w a t g e t a a p k ，f a v q s t f k , l g y v s p p a l v l a d d na a ar ，q l n l n v t q l oc g v f s g k , a h g f l p l t k a p s a t g g s a l y p l e f v v g k 。c o n c i u s i o n ：t h ee l i s at e c h n i q u ew a se s t a b l i s h e ds u c c e s s f u l l y , i th a sl a i e dt h ef o u n d a t i o nf o rt h es t u d yo fe n z y m o l o g ya n db i o l o g y t h ec o n f i r m a t i o no fd 2nt e r m i n a ls e q u e n c ep r o v i d et h e o r e t i c a le v i d e n c ef o r t h ef o l l o w - u ps t u d yo fd 2g e n es t r u c t u r ea n dp r i m a r ya m i n oa c i ds t r u c t u r e p o s t g r a d u a t ej i es u ( p a t h o g e n i cm i c r o b i o l o g y ) d i r e c t e db yp r o f b i nw a n gk e yw o r d s ：p u r i f i c a t i o n ；c h a r a c t e r i z a t i o n ；a m i n oa c i ds e q u e n c e ；p o l y c l o n a la n t i b o d y ；e l i s af o u n d a t i o ni t e m ：n a t i o n a lb a s i cr e s e a r c ho fc h i n a ( 2 0 0 4 c c a 0 2 4 0 0 )m t t a is c h o l a rc o n s t r u c t i o ne n g i n e e r i n gf o u n d a d o n ( 2 0 0 4 g g 2 2 0 513 6 )s c i e n t i f i ca n dt e c h n o l o g i c a lp r o j e c t si nq i n g d a o ( 0 5 - 1 - p - 1 0 )目录引言1第一章材料与方法31 1 菌株31 2 培养基3i 3 试剂和仪器3i 4d 2 蛋白酶纯化及酶学活性研究51 5d 2 蛋白酶的质谱仪q - t o f 2 氨基酸序列测定71 6d 2 蛋白酶多克隆抗体的制备及鉴定81 7e l i s a 方法的建立及其应用9第二章结果1 32 1d 2 蛋白酶纯化及酶学性质的研究1 32 2d 2 蛋白酶q - t o f 氨基酸序列测定1 72 3d 2 蛋白酶多克隆抗体的制备及鉴定1 72 4 间接e l i s a 与双抗体夹心e l i s a 方法的建立及其应用1 8第三章讨论2 53 id 2 蛋白酶的分离纯化2 53 2d 2 蛋白酶的酶学生物活性2 53 3d 2 蛋白酶的序列分析2 63 4 多克隆抗体应用2 63 5 间接和双抗体夹心e l i s a 方法的建立2 7第四章结论和展望2 8参考文献2 9综述3 1参考文献4 0攻读学位期间的研究成果4 3致谢4 4学位论文独创性声明4 5学位论文知识产权权属声明4 5青岛人学硕士学位论文d 2 蛋白酶酶学生物活性研究及el is a 方法建立引言碱性蛋白酶( a l k a l i n ep r o t e a s e ) 是一类适宜于在碱性条件( p h9 1 0 左右)下水解蛋白质肽键的酶类，其作用最适p h 为9 5 1 0 5 ，在p h5 1 0 时较稳定，酶分子中缺少半胱氨酸形成的二硫键，其活性中心为丝氨酸，能被二异丙基氟磷酸及苯甲基黄酰氯所抑制。碱性蛋白酶最早发现与猪胰脏中，1 9 1 3 年r o h m 首先将胰蛋白酶作为洗涤浸泡剂使用乜1 。我国碱性蛋白酶年产量为1 1 万吨，约占酶制剂量的1 2 9 ，为第二大酶种b 1 。碱性蛋白酶在食品、洗涤及制革等行业中有着广泛的用途1 。由于微生物蛋白酶均为胞外酶，与动、植物源蛋白酶相比具有下游技术处理相对简单、价格低廉、来源广、菌体易于培养、产量高、高产菌株选育简单、快速、具有动植物蛋白酶所具有的全部特性，且碱性蛋白酶相对中性蛋白酶具有更强的水解能力和耐碱力，有较大耐热性且有一定的酯酶活力，易于实现工业化生产，因此，碱性蛋白酶研究日益成为蛋白酶研究的热点口吲。目前，用于蛋白酶工业生产最主要的菌株及最重要的研发对象都是芽孢杆菌( 地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌等) n 例。我国碱性蛋白酶的工业生产菌株有地衣芽孢杆菌2 7 0 9 、c 1 2 1 3 、嗜碱性短小芽孢杆菌b 4 等。国内蛋白酶研究近二十年来虽然发展很快，但与国外相比，仍存在微生物资源开发不足、蛋白酶种类较少、酶制剂品种单一、价格昂贵、应用面还不够广等诸多问题。因此，在尊重生物多样性的基础上，寻找和发现新的品质优良的微生物蛋白酶资源仍是当务之急。以往人们多从土壤、温泉中采集筛选产蛋白酶微生物，近年来，海洋微生物资源开发引起科研工作者的重视，海洋微生物酶资源的研究与开发任重而道远。研究表明，海洋中各种各样的嗜冷、嗜热、嗜不同p h 的极端微生物有望成为一种新型的酶资源n 羽。璩竹玲n 3 1 等人从一株海洋假单胞菌中分离制备出一种具有纤溶活性的酶海洋假单胞菌碱性蛋白酶( m p a p ) ，结果在纤维蛋白平板上，m p a p 显示出清晰的溶圈，表明m p a p 具有溶解纤维蛋白的作用。目前报道的海洋产蛋白酶菌株主要包括嗜冷假单胞菌n 引、弧菌5 1 和黄杆菌n 6 1 等。青岛地处山东半岛东南部，东、南濒临黄海，由于黄海暖流和黄海沿岸流的基本流向终年比较稳定，因此青岛拥有着丰富的海洋资源，例如各种贝类、鱼类、藻类以及软体动物双齿围沙蚕( p e r i n e r e i sa i b u h i t e n s i sg r u b e ) 。沙蚕俗称海虫、海蜈蚣、海蚂蝗，属于环节动物门( a n n e l i d a ) 、多毛纲( p o l y c h a e t a ) 、游走目( e r r a n t i a ) 、沙蚕科( n e r e i d i a e ) 、围沙蚕属( p e r i n e r e i s ) ，喜栖息于有淡水流入的沿海滩涂、潮间带中区到潮下带的沙泥中，幼虫食浮游生物，成虫以腐植质为食。全年以秋季产量最大，营穴居或浮游生活。青岛双齿围沙蚕除被本地渔民用做钓饵外，别无它用，造成海洋资源的极大浪费。2 0 0 6 年我们从沙蚕消化道中分离出产蛋白酶菌株d 2 ，经微生物学鉴定和基因学归属后证实属寡养单胞菌( s t e n o t r o p h o m o n a s ) 。2 0 0 0 年法国学者d u n n ec e l g j 等研究发现该属细菌w 8 1 株分泌的胞外酶有抗真菌作用；近年来，巴西学者d et o n ic h 、日本学者t m i y a j i 乜玎分别从降解羽毛的和土壤中分离出能产生碱性蛋白酶的寡养单胞菌，其蛋白酶在碱性、高热环境中显示了良好的稳定性，可见该菌有可能成为继芽孢杆菌之后又一类具有研究开发潜力的蛋白酶生产菌株。本研究旨在通过对d 2 菌株所产的蛋白酶进行纯化及性质研究，寻找并发现新的微生物蛋白酶资源，并进一步进行抗体制备和蛋白测序的研究，以期对这种新型微生物蛋白酶的一级及二级结构有更进一步的了解，为后期探索最佳发酵产酶条件做好准备，从而为d 2 蛋白酶的规模化发酵和工业化生产做好铺垫。2青岛人学硕士学位论文第一章材料与方法_ 1 1 菌株d 2 菌株由本室分离并保存。该菌株已送中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心( c h i n ag e n e r a lm i c r o b i o l o g i c a lc u l t u r ec o l l e c t i o nc e n t e r ，c g m c c )保藏，保藏号：c g m c cn o 1 8 6 8 ，其相关发明专利正在申请中，中华人民共和国知识产权局专利申请号：2 0 0 7 1 0 0 0 5 0 5 5 1 。1 2 培养基1 2 1 脱脂奶粉平板在t s ( 5 0m m o l lt r i s h c i 、1 5 0m m o l ln a c l ，p h8 0 ) 中加入1 琼脂糖和1 脱脂奶粉( 完达山) ，0 0 6m p a 高压灭菌1 0m i n ，待温后倾注平板。1 2 2 肉膏蛋白胨培养基0 3 牛肉膏，1 o 蛋白胨，0 5 n a c l ，p h7 5 。1 3 试剂和仪器1 3 1 主要试剂改良b r a d f o r d 蛋白定量试剂盒及牛血清白蛋白标准品( 上海生工) ；低分子量蛋白m a r k e r ( 分子量1 4 4 - 9 7 4k d a ，上海生化所) ；d a b 显色液( 武汉博士德)牛肉膏( 北京奥博星生物技术有限公司)蛋白胨( 中国杭州微生物试剂有限公司)福林酚试剂( s i g m a )蛋白酶k ( s i g m a )l 一酪氨酸( s i g m a )酪蛋白( s i g m a )h r p - 羊抗兔i g g ( 武汉博士德)h r p 一兔抗鼠i g g ( 武汉博士德)山羊血清( 杭州四季青工程材料有限公司)胎牛血清( 杭州四季青工程材料有限公司)牛血清白蛋白( r o c h e )碱性蛋白酶( w o l s o n )e l i s a 酶标板( 上海精睿生物)3e l i s a 碳酸盐包板液( o 0 5m o l lp h9 6 )e l i s a 封闭液( 1 0m l lb s a ，p b s )e l i s a 洗板液( 含o 5m l lt w e e n 2 0 的1m o l lp h 7 4p b s )t m b 显色液( p r o m e g a )2m o l lh ：s o , 终止液p h5 0 1 3 0 缓冲液( 5 0m m o l l ) n7 1 ：自配，枸橼酸盐缓冲液( p h5 o ) ，磷酸盐缓冲液( p h6 0 - - - 7 0 ) ，t r i s h c i 缓冲液( p h8 0 9 0 ) ，硼酸盐缓冲液( p h1 0 0 1 1 o ) ，k c i n a o h 缓冲液( p h1 2 0 - - 一1 3 0 )1 3 2 主要仪器m i n i v e 垂直电泳仪及蛋白质电转印仪( 德国，h o e f e r 公司) ；m i l l i - q 超纯水净化系统( 美国，m i l l i p o r e ) ；h z 一8 2 0 1 k 型台式恒温振荡器( 中国，江苏太仓) ；d h z c 大容量恒温振荡器( 中国，江苏太仓) ；c e n t r i f u g e5 1 4 7 r 低温高速离心机( 德国，e p p e n d o r f ) ；低温冷冻高速离心机( 日本，日立) ；酶标仪( 瑞士，t e c a n )1 5 m l 超滤管( 美国，m i1 li p o r e ，c u t o f f1 00 0 0 d a ) ；透析袋( 美国，m i l l i p o r e ，c u t o f f1 00 0 0 d a ) ：0 2 2 啪滤菌器( 美国，m i l l i p o r e )f d 5 5 0 5 s 型冷冻干燥机( 美国，s i m ) ；a k t af p l cw 层析纯化系统( 瑞典，a m e r s h a mb i o s c i e n c e ) ；h i l o a d 憎1 6 6 0s e p h a d e xg t m 7 5p r e p g r a d e 凝胶排阻层析预装柱( 瑞典，a m e r s h a mb i o s c i e n c e ) ；7 2 2 型可见分光光度计( 中国，上海精密) ；4青岛大学硕士学位论文1 4d 2 蛋白酶纯化及酶学活性研究1 4 1d 2 蛋白酶的分离纯化1 4 1 1 菌株的培养菌株本室分离并保存，其中d 2 菌株已送中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心( c g m c c ) 保藏，保藏号c g m c cn o 1 8 6 8 。从冻存的d 2 菌株甘油管中用无菌接种环取一环菌液点种于脱脂奶粉培养基，2 5 c 培养4 8 h 。1 4 1 2 摇瓶发酵经4 8 h 培养后，从奶粉平板上挑单个菌落，接种于5m l 牛肉膏培养基当中，2 5 。c 恒温摇床1 5 0r r a i n 震荡培养1 6 h 后，调节o d 鲫为2 0 ，做为种子液，从种子液中按1 的接种量接种于2 0 0m l 的牛肉膏培养基中，2 5 。c 恒温摇床1 5 0r m i n 震荡培养4 8 h 。将菌液经1 00 0 0r m i n2 0 m i n 离心，取上清。1 4 1 3 冻干机冷冻干燥沉淀取d 2 菌株的发酵液上清1 0 0 m l ，经f d 5 5 0 5 s 型冷冻干燥机过夜冷冻干燥呈固体状，重悬于2i i l l2 0m m o l lt r i s c 1 缓冲液中( p h8 o ) ，同样缓冲液透析1 6 h ，4 保存备用。1 4 1 4 凝胶过滤层析s e p h a d e xg 一7 5 柱( 1 6 c m 6 0 c m ) 预先用2 0m m o l lp h8 0 的t r i s - h c l 缓冲液平衡，将冻干浓缩溶液上柱后用相同缓冲液洗脱，收集合并活性部分，超滤管浓缩除盐后冷冻干燥。1 4 1 5 蛋白酶活性的检测( 一)标准曲线的绘制1 ) 按照下表配n l 一酪氨酸标准溶液。表1 1l - 酪氨酸标准溶液t a b l e1 1s t a n d a r d so fl t y r o s i n es o l u t i o n2 ) 分别别取上述溶液各1 0m l ，各加0 4m o l l 碳酸钠溶液5 0m l 。福林试剂应用液1 0m l ，置于4 0 4 - 0 2 c 水浴中显色2 0 m i n ，取出用7 2 2 型可见分光光度计于波长6 8 0n m 比色，用不含酪氨酸的o 管为空白调零，测定吸光度值。5筮二童挝挝曼直达以吸光度值为纵坐标，酪氨酸的浓度为横坐标，绘制标准曲线( 此线应通过零点) 或计算回归方程。根据作图或用回归方程，计算出当o d 为1 时的酪氨酸的量( 腿) ，即为吸光常数k 值。其k 值应在9 5 - - 1 0 0 范围内。( 二)蛋白酶样品的活力测定1 ) 将酪素溶液放入4 0 0 2 恒温水浴中预热5 m i n ；2 ) 取4 支试管，各加入1i i l l 酶液( 菌液) ；3 ) 取1 支作为空白管，加2m l 三氯乙酸，其他3 管作为测试管，各加入1m l 酪素，混匀，4 0 保温l o m i n ；4 ) 取出试管，3 支测试管中各加入2l t i l 三氯乙酸，空白管中加1m l 酪素；5 ) 静置l o m i n ，过滤去除沉淀；6 ) 各取1m l 滤液分别加0 4m o l l 的n a ：c 0 35m l ，福林试剂lm l 。7 ) 4 0 c 显色2 0 m i n ，用空白管调零，6 8 0r i m 波长测o d 值，计算平行样品o d 值的均值。8 ) 计算酶的活性单位依据以下公式：蛋白酶的活力u g ( m l ) = a k 4 1 0 n卜( 1 )a ：样品平行试验的平均0 d 值；k ：吸光常数；r l ：蛋白酶液的稀释倍数4 0 c 条件下每分钟水解酪素产生相当于1 腿酪氨酸所需的蛋白酶量规定为1 个蛋白酶活力单位( u ) 。1 4 1 6 蛋白定量采用b r a d f o r d 法进行( 上海生工试剂盒) ，以牛血清白蛋白为标准蛋白。1 ) 蛋白定量标准曲线绘制参照下表加样，每个浓度做2 个平行孔。试剂l23456782 0 0p g m l 牛血清清蛋白( ul )o124681 01 5牛血清白蛋白( 1 1g )00 20 40 81 21 623p b s ( i ll )2 01 91 81 61 41 21 05b r a d f o r dr e a g e n t ( 1 l )2 0 02 0 02 0 02 0 02 0 02 0 02 0 02 0 0混匀后，室温放置5 m i n ，以a 的。吸光值为横坐标，牛血清清蛋白的腿数为纵坐标绘制标准曲线或计算回归方程。回归方程：y = 0 4 3 5 2 x 一0 2 2 3 3 ，铲= 0 9 9 3 76青岛大学硕士学位论文2 ) 加适当体积样品到9 6 孔板的样品孔中，力h p b s 至2 0ul ，每个样品做2 个复孔。3 ) 各孔加入2 0 0i llb r a d f o r dr e a g e n t ，混匀，室温放置5 m i n ，测a 5 9 5 。4 ) 用测得的a 。值从标准曲线上查得相当于牛血清清蛋白的腿数，计算出待测蛋白质的含量。1 4 2 纯化后d 2 蛋白酶酶学活性研究1 4 2 1 各种金属离子对d 2 蛋白酶活性的影响在底物溶液中加入不同浓度( o 1 0m m ) 的c a c l 。、c u c l 。、g g c l 。和k c l ，在4 0 下与纯化后d 2 蛋白酶反应，测其剩余酶活性。以不含离子的酶活为1 0 0 。1 4 2 2c a 2 + 对酶活性及其稳定性影响很多文献船2 ，2 3 1 报道c a 2 + 能够影响碱性蛋白酶的活性及其稳定性。为了研究c a 2 + 是否也对d 2 蛋白酶有影响，在底物中分别加入0 1 0f i l m 不同浓度的c a c l 。，与纯化的d 2 蛋白酶进行反应，按照前述测定酶活的方法测定酶活，以不含c a c l ：的蛋白酶活性为1 0 0 。室温放置不同时间后测其酶活性。1 4 2 3c a 2 + 对d 2 蛋白酶最适温度和热稳定性的影响在底物中加入5m mc a c l 。分别在2 0 - 8 0 与纯化的d 2 蛋白酶反应，测定其酶活，以不含c a c l ：的蛋白酶活性为1 0 0 。将含5m mc a c l ：与不含c a c l ：的纯化d 2 蛋白酶分别在5 0 、6 0 、7 0 下反应，取其不同时间段测定酶活。1 4 2 4c a 2 + 对d 2 蛋白酶最适p h 和p h 稳定性的影响在底物溶液中( 分别用p h8 1 5 的5 种不同p h 缓冲液系统配制) j j n 入5m mc a c l ：，4 0 反应l o m i n ，测定酶活力，以不含c a c l ：的蛋白酶活性为1 0 0 。d 2 蛋白酶用不同p h 值( p h5 o 1 3 0 ) 的缓冲液溶解，室温放置3 h 后测定剩余酶活力。1 4 2 5 各种洗衣粉对d 2 蛋白酶活性的影响在纯化后蛋白酶溶液中加入1 ( w v ) 的各种不同牌子的洗衣粉：碧浪、奇强、雕牌、汰渍、立白、纳爱斯和奥妙。3 7 。c 温育不同时间测其酶活，以不含洗衣粉的蛋白酶活性为1 0 0 。1 5d 2 蛋白酶的质谱仪q t o f 2 氨基酸序列测定q - - t o f 序列测定主要根据测量分析物飞过固定的路径所需时间鉴别不同蛋白质序列，q - - t o f 澳t 序钠升电喷雾四级杆飞行时间质谱 n a n o l c - q - - t o f 2 序列分析仪上完成。d 2 蛋白酶测定样品制备过程如下：( 1 ) 按照说明书安装玻璃板，在e r l e n m e y e r - 一- - 角瓶中按所需丙烯酰胺浓度配置分离胶溶液。( 2 ) 将丙烯酰胺溶液灌制两块玻璃板之间的间隙中，给积层胶留出足够空间。用巴氏吸管在丙烯酰胺溶液上覆盖一层去离子水，将凝胶垂直放置于室温下。7箍= 童挝整皇壅鲨( 3 ) 待聚合完成( 3 0 r a i n ) ，倒掉覆盖层，用去离子水清洗凝胶顶部以去除残留的未聚合丙烯酰胺，再用纸巾的边吸净残留的水。( 4 ) 在一次性塑料试管中配置适当体积的积层胶，将积层胶溶液直接灌至聚合好的分离胶上，立即在其中插入一块干净的t e f l o n 梳子，将凝胶垂直放置于室温下。( 5 ) 积层胶聚合完成后( 3 0 m i n ) ，拔下t e f l o n 梳子，用去离子水洗涤加样槽，以去除未聚合的丙烯酰胺。( 6 ) 制各样品，每个样品空加样2 0ul 。将电泳装置与电源连接，在凝胶上加8v c m电压，待染料前沿进入分离胶后将电压提高n 1 5v c m 继续电泳，直至溴酚蓝到达分离胶的底部，然后关闭电源。( 7 ) 电泳完成后将凝胶浸泡在至少5 倍体积的考马斯亮蓝染色液中，置摇床上室温染色l h 。( 8 ) 移出染液留作以后使用，将凝胶浸泡于没有染料的甲醇：乙酸溶液中进行脱色4 h ，其问更换脱色液三到四次。( 9 ) 脱色后用高压灭菌的刀片将含有目的条带的凝胶小心切下，装入无菌的e p 管中，加入少量去离子水，防止凝胶干燥，及时邮寄至军事医学科学院国家生物医学分析中心进行序列测定。1 6d 2 蛋白酶多克隆抗体的制备及鉴定1 6 1 抗原制备按照前述方法对蛋白酶进行纯化收集透析，再经冷冻干燥机冷冻干燥后，将活性部分用e p 管收集，4 。c 保存及时邮寄至中国科学院遗传与发育所动物中心进行兔及鼠多克隆抗体制备。1 6 2 兔多克隆抗体制备步骤简述：1 ) 取体重为2 0 0 0 - 2 5 0 0 克新西兰白兔1 只，观察3 5 天，身体状态无异常备用。2 ) 家兔耳缘静脉取l m l 血，4 过夜，离心分离血清作为阴性对照。3 ) 第一次免疫( 第0 天) 取小于1m 1 抗原( 约lm g 蛋白) 和等体积弗氏完全佐剂( s i g m a ) 乳化至混合物在水中不扩散。家兔背部皮下4 - - - 6 点，双后脚皮下免疫。4 ) 第二次免疫( 第2 l 天) 取0 5m 1 抗原( 约5 0 0u g 蛋白) 和等体积弗氏不完全佐剂( s i g m a ) 乳化至混合物在水中不扩散，家兔背部皮下4 - - 6 点免疫。5 ) 第三次免疫( 第3 5 天) 取0 5m l 抗原( 约5 0 0u g 蛋白) 家兔背部皮下4 - - - 6点免疫。6 ) 家兔耳缘静脉取lm l 血，离心分离血清检测效价用。8青岛大学硕士学位论文7 ) 第四次免疫( 第4 9 天) 取1m l 抗原( 约lm g 蛋白) 家兔背部皮下4 - - - 6 点免疫。8 ) 取全血大约1 0 0m l ( 第5 9 天) ，家兔颈动脉放血至死亡，全血置4 。c 冰箱过夜。离心分血清约4 0m l ( 第6 0 天) 。1 6 3 抗体的w e s t e r n b l o t t i n g 鉴定1 ) 将各种蛋白酶进行s d s - p a g e 电泳。2 ) 电泳完成后，用双蒸水和电转缓冲液漂洗凝胶两次，5 - - - l o m i n 次，以去除残余游离甘氨酸。3 ) 剪下尺寸相当的p v d f 膜，用甲醇或乙醇处理一下后，泡在电转缓冲液内待用。4 ) 剪下相应大小的滤纸，每l 块胶一膜夹心体中需2 张厚滤纸或6 张较薄滤纸。将海绵和滤纸放入电转缓冲液中完全浸湿。5 ) 安装电转装置，设置电压6 0 v ，电转2 h 。6 ) 电转后，将p v d f 膜放入l t b s t 中清洗3 次，每次5 m i n 。7 ) 用含1 0 的奶粉的封闭液4 过夜封闭。8 ) 一抗用封闭液稀释至适当浓度，将p v d f 膜放入其中，3 7 。c 孵育1 5 小时后，用t b s t在室温下脱色摇床上洗三次，每次1 0m i n 。9 ) 二抗同样用封闭液稀释至适当浓度，3 7 。c 孵育l d , 时后，用t b s t 在室温下脱色摇床上洗三次，每次l o m i n 。l o ) 用d a b 显色剂对p v d f 膜进行显色。1 7el i s a 方法的建立及其应用1 7 1 间接e l i s a 方法的建立1 7 1 1 间接e l i s a 程序步骤参照常规的间接e l i s a 操作程序乜4 嗡1 进行，纯化后的d 2 蛋白酶按一定浓度比例用p h9 60 0 5m o l l 碳酸盐缓冲液稀释后每孔1 0 0i l1 加入到微孔反应板中，4 包被过夜，洗涤4 次，每次3m i n ，倾去包被液扣干，加封闭液3 7 作用2 h ，洗涤4 次，每次3 m i n ，扣干，加入阳性血清和阴性血清3 7 作用1 h ，洗涤，扣干酶标板，加入酶标抗体3 7 作用1 h ，洗涤，扣干酶标板，加入t m b 显色液，3 7 作用l o m i n ，加入2 mh ：s 0 4 终止反应。在酶标仪上测定凡值。并按下列公式计算p n值：p n 值= 阳性对照孔凡均值阴性对照孔凡舳均值。1 7 1 2 抗d 2 蛋白酶抗体工作浓度及酶联抗体稀释度的确定选择连续稀释的抗d 2 蛋白酶抗体( 1 ：3 20 0 0 ；l ：6 40 0 0 ；l ：1 28 0 0 ：l ：2 56 0 0 ：1 ：3 20 0 0 ；1 ：5 12 0 0 ) 及h r p 一酶联抗体( 1 ：2 00 0 0 ；1 ：4 00 0 0 ；1 ：8 00 0 0 ；1 ：1 6 00 0 0 ；9箍二重挝型量友鎏l ：2 4 00 0 0 ) 进行棋盘滴定，确定抗d 2 蛋白酶抗体及h r p - 酶联抗体的工作浓度。以阳性血清a 4 值接近1 ，且p n 值最大时的最高稀释倍数为酶结合物的最适工作浓度2 6 1 。1 7 1 3 抗原最佳稀释度及饱和包被浓度的确定将d 2 蛋白酶作l ：2 5 、1 ：5 0 、1 ：1 0 0 、1 ：2 0 0 、1 ：4 0 0 系列倍比稀释，进行e l i s a 澳4定。以p n 值最大，阳性血清a 值接近1 的被检样品最大稀释倍数为样品最佳稀释度。选择不同浓度的d 2 蛋白酶( 4 6 4 、2 3 2 、1 1 6 、0 5 8 、0 2 9n g u1 ) 包被酶标板，每：f , 1 0 0u1 ，在上述棋盘滴定法确定的工作浓度下确定d 2 蛋白酶的饱和包被浓度。1 7 1 4 封闭剂的选择用1 0 0 倍稀释的d ：蛋白酶包被酶标板，分别加入1 0 羊血清、1 小牛白蛋白、1 0 胎牛血清进行封闭，每孑l l o oul ，3 7 l h 后，加入l ：6 40 0 0 的阳性血清( 同时以p b s为对照) ，再加入1 ：8 00 0 0 稀释的酶标抗体，最后加入底物显色，测定其a 4 鲫值，选择a 值最大的为最佳封闭剂。1 7 1 5e l i s a 的判定标准用建立的e l i s a 检澳t 3 0 份d 2 蛋白酶阴性样品，计算a 伽平均值( x ) 和标准差( s ) ，以x + 2 s 作为阳性和阴性的临界值。1 7 1 6e l i s a 方法的特异性用建立的e l i s a 分别检测d 2 蛋白酶阳性样品各1 5 份和其他蛋白酶阳性样品及阴性样品各1 0 份，评价e l i s a 的特异性。1 7 1 7d 2 蛋白酶含量标准曲线的绘制采用间接e l i s a 法，以上述棋盘滴定法确定的d 2 蛋白酶的饱和包被浓度为基础，将d 2 蛋白酶用包被剂稀释成不同浓度包板，每孔1 0 0i il ，以上述棋盘滴定法确定的抗d 2 蛋白酶抗体工作浓度和酶联抗体稀释度绘制d 2 蛋白酶标准曲线。1 7 1 8 蛋白酶样品检测取1 3 1 份不同时间不同稀释度的d 2 蛋白酶样品，用以上所建立的e l i s a 进行检测，同时用琼脂扩散试验作为对照，评价e l i s a 的相对特异性和敏感性及e l i s a 与琼脂扩散试验检测结果的符合率。1 7 1 9 重复性实验按间接e l i s a 操作程序重复检测同浓度梯度d 2 蛋白酶，用工作曲线计算d 2 蛋白酶蛋白值，比较验检结果的重复性。1 7 2 双抗体夹心e l i s a 的建立1 7 2 1 双抗体夹心e l i s a 检测d 2 蛋白酶用碳酸盐缓冲液( p h9 6 ) 将兔抗d 2 蛋白酶抗体稀释至l ：50 0 0 ，1 0 01 tl 孔包被1 0青岛大学硕士学位论文e l i s a 板，4 。c 过夜包被，用洗涤液( 0 5m l lt w e e n 2 0 ，p h7 4p b s t ) 洗涤3 次，每孔加入1 0m l lb s a 溶液2 0 0pl ，3 7 封闭2 h ，用p b s t 洗涤3 次，加入待检样品，1 0 0pl 孔，同时用碱性蛋白酶作为阴性对照，3 7 。c 反应2 h 后，加入1 0 0pl 鼠抗( 1 ：40 0 0 ) ，3 7 反应2 h ，用p b s t 洗涤3 次，加入l ：50 0 0 稀释的h r p 标记的兔抗鼠i g g ，3 7 反应l h ，p b s t 洗涤3 次，最后加入1 0 0ul 显色剂，室温反应2 0 m i n ，用2m o l l 的h ：s 0 4 溶液终止反应，检测a 伽值。1 7 2 2e l i s a 反应条件的优化利用方阵实验确定捕获抗体和检测抗体的使用浓度。具体步骤：用包被液对捕获抗体从1 ：l0 0 0 进行连续2 倍稀释，用封闭液将检测抗体作1 ：25 0 0 连续2 倍稀释，对d 2 蛋白酶进行检测，其他步骤均按照1 2 1 中e l i s a 操作程序，以阳性孔儿值在1 o左右，空白孔的凡小于0 1 的条件作为最佳抗体工作浓度。1 7 2 3 标准曲线的制作参考文献嘲，根据以上确定的最佳条件，以最佳工作浓度的兔抗为捕获抗体包被e l i s a 板，抗原标准参考品系列稀释液为样品，浓度从1 5 8ug l 起做2 倍连续稀释至32 2 6ug l ，每个稀释度做两个复孔平行加入e l i s a 板中，最佳稀释浓度的鼠抗为检测抗体，h r p 标记兔抗鼠为酶标抗体，按上述e l i s a 实验步骤操作，测定气值，建立标准曲线。以抗原浓度的自然对数l n ( x ) 为横坐标，以a 4 值为纵坐标，绘制曲线图，根据曲线图，选择最佳线性范围，绘制标准曲线。1 7 2 4 双抗体夹心e l i s a 方法的考核( 1 ) 检测限：参考文献啪瑚1 方法计算2 0 个阴性孔的平均值( x ) 和标准差( s ) ，以x + 2 s 从滴定曲线中找到该相应值的最低浓度，即为方法的检测限，根据标准曲线的线性范围确定定量限。( 2 ) 精密度：在线性范围内取8 9 6l lg l 、2 2 4pg l 、5 6ug l3 个浓度点，采用与标准曲线同时测定的方法，在一次实验中每个浓度点测1 0 孔，计算批内变异系数。连续测1 0 批次，计算批间变异系数。( 3 ) 特异性：用建立的e l i s a 分别检测d 2 蛋白酶阳性样品各1 0 份和其他蛋白酶阳性样品及阴性样品各1 0 份，评价e l i s a 的特异性。( 4 ) 回收率：在空白检测基质中加入高( 8 9 6ug l ) 、中( 2 2 4ug l ) 、低( 5 6ug l ) 不同剂量的d 2 蛋白，按检测程序测定，计算实测值与理论值比值，求出平均回收率。( 5 ) 与b r a d f o r d 法检测结果的比较：用本实验建立的e l i s a 法与b r a d f o r d 法分别检n 1 0 批d 2 蛋白酶，以e l i s a 法测定值为x 轴，b r a d f o r d 法测定值为y 轴，绘制相关曲线，建立回归方程，并计算相关系数。1 7 2 5 双抗体夹心e l i s a 方法的应用1 11 2青岛大学硕士论文第二章结果弟一早三石禾2 - 1d 2 蛋白酶纯化及酶学性质的研究2 1 1d 2 蛋白酶的纯化发酵液上清经三步纯化过程得到了电泳纯的蛋白酶，从表2 1 - i 以看出其活性回收率3 9 1 ，纯化倍数3 0 倍。冻干浓缩后的d 2 蛋白酶经s e p h a d e xg - 7 5 层析精制，结果见图2 1 ，活性峰为峰2 。经s d s p a g e 鉴定，纯化后蛋白酶条带单一，见图2 2 。表2 1d 2 蛋白酶纯化表t a b l e 2 1p u r i f i c a t i o no fd 2a l k a l i n ep r o t e a s et o t a lp r o t e i nt o m la c t i v i t ys p e c i f i ca c t i v i t yp u r i f i c a t i o ny i e l d( r a g )( u 。1 0 )m g ) ( f o l d )( )3 63 1 71 01 0 0 03 43 7 81 29 4 4s e p h a d e xg 7 51 4 61 49 5 93 03 9 1图2 1s e p h a d e xg - 7 5 柱层析f i g 2 1p u r i f i c a t i o no f d 2p r o t e a s ew i t hs e p h a d e xg 一7 59 7 26 6 44 4 32 9 o2 0 11 4 3图2 2 纯化d 2 蛋白酶的s d s - p a g ef ig 2 2s d s - p a g eo fp u r i f i e dd 2p r o t e a s e1 ：纯化后的d 2 蛋白酶2 ：4 8 h 发酵卜清3 ：空白发酵培养基m ：1 4 4 9 7 4 k d 低分子量蛋白m a r k e r( 1 ：p u r i f i e dd 2p r o t e a s e ；2 ：f e r m c n t a ls u p c r n a t a n t ；3 ：b l a n kf e r m c n t a lm e d i u m ；m ：m a r k