（植物营养学专业论文）韭菜提取物对铜绿微囊藻化感抑制的研究.pdf

刘文桃韭菜提取物对铜绿微囊藻化感抑制的研究 韭菜提取物对铜绿微囊藻化感抑制的研究 摘要 铜绿微囊藻随着水体富营养化的发展，正在全世界蔓延泛滥。这种单细胞蓝 藻产生的七肽化合物( 微囊藻毒素) ，能引起人类的肝癌，也会影响水生植物和动 物的正常生长，造成严重的生态系统失衡。近年来各国都十分关注这种“生态癌” 的治理。虽然己花费巨额投资，进行了大量的研究，但至今尚无突破性进展。 近年来随着藻类化感作用研究的开展，有些学者认为利用植物的化感作用可 能是解决有毒藻类水华的有效途径。当前研究多以水生植物对藻类的影响为研究 对象，而对陆生植物的研究较少。本研究的目的旨在探索一种通过陆生植物对藻 类的化感作用防治微囊藻的新途径。 本试验通过筛选，确定了高温处理的韭菜水溶性浸提液对铜绿微囊藻 ( f a c h b 一9 0 5 ) 具有明显的化感抑制作用，研究了不同环境条件下( p h 、光照强 度、是否曝气、藻初始浓度) 韭菜水溶性浸提液对铜绿微囊藻生长的影响及其抑 制机理，对韭菜化感物质进行了初步分离。同时对韭菜中化感物质与其所处环境 之间的关系作了定性说明，且对如何利用韭菜的化感现象应用于富营养化湖泊的 治理与生态修复提出了建议。 具体结论如下： ( 1 ) 预备实验( 不同溶剂对化感物质抑藻效果的影响) ，结果表明：单一化感 物质对铜绿微囊藻抑制效果不明显，并且在化感物质发生作用时，溶剂种类和用 量起着极其重要的作用。 ( 2 ) 韭菜浸提液对铜绿微囊藻( f a c h b 一9 0 5 ) 生长影响的实验表明，高温处 理的鲜韭菜水溶性对铜绿微囊藻存在明显的抑制作用。培养7 d 后，高温处理的鲜 韭菜水溶性浸提液对铜绿微囊藻的抑制率与浸提液浓度的对数线性相关，对铜绿 微囊藻的半效应浓度e c s o 为o 8 0 8g l 。表明韭菜对铜绿微囊藻的化感抑制作用在 一定范围内可获得良好的重现。 ( 3 ) 韭菜产生化感物质的活性及浓度受d h 、光照强度、是否曝气、藻的起 始浓度的波动影响。在培养体系中化感物质对铜绿微囊藻的抑制作用是上述几种 因素综合作用的结果。本试验中，化感物质作用最佳的条件为p h 9 5 、低光照 ( 1 0 0 0 l x ) 、培养过程中的曝气、起始浓度为1 0 6 、1 0 7i n d l 条件下抑制效果最好。 ( 4 ) 抑制机理实验研究表明，经高温处理的韭菜水溶性浸提液不但对铜绿微 囊藻的超微结构产生了破坏，还对其生理生化各方面产生了影响。具体表现为铜 绿微囊藻细胞生长量显著降低，藻体叶绿素a 含量下降，膜透性增大，超氧化物 歧化酶( s o d ) 活性、可溶性蛋白含量均呈现先升高后降低的趋势，膜脂过氧化产物 丙二醛( m d a ) 积累量与超微结构所显示的细胞膜的损伤程度相一致。 ( 5 ) 对韭菜化感物质做了初步分离，发现正己烷相的抑藻效果最好，培养周 2 扬州大学硕士学位论文 期内抑制率可达9 0 以上，水相的抑藻率也达到8 0 以上。正己烷相和水相的e c 5 0 为0 2 6 m g l 和o 8 1 m g l 。正己烷相组分的抑藻效果明显好于已报道的化感物质， 有着良好的应用前景。 关键词：韭菜；铜绿微囊藻；化感作用；生物量；超微结构； 刘文桃韭菜提取物对铜绿微囊藻化感抑制的研究 3 s t u d i e s0 1 1t h e a l l e l o p a t h yo f t h ee x t r a c to fl e e ko n m i c r o c y s t i sa e r u g i n o s a a b s t r a c t m i c r o c y s t i sa e r u g i n o s aw a so v e r s p r e a d i n g a 1 1o v e rt h e w o r l d ，e s p e c i a l l y i n s e v e r e l ye u t r o p h i c a t e dw a t e rb o d i e s t h eh e p t a p e p t i d ec o m p o u n dp r o d u c e db ys i n g l e c e l lc y a n o b a c t c r i an o to n l yc a u s e dh u m a nl i v e rc a n c e r , b u ta l s oa f f e c t e dr e g u l a rg r o w t h o fa q u a t i cp l a n ta n da n i m a l a tl e a s t1 e a d e dt ot h es e r i o i l se c o s y s t e mu n b a l a l i c e t h e r e f o r e c o n t r o lo ft h e “e c o l o g yc a n c e r w a st a k e ns e r i o u s l yb ym a n yc o u n t r i e si n r e c e n ty e a r s h o w e v e r , b r e a k t h r o u g hd e v e l o p m e n ti nt h i sa s p e c th 瓠n o tb e e nm a d ea s y e t ，i ns p i t eo fs u b s t a n t i v ei n v e s t m e n t sa n d a b u n d a n tr e s e a r c hw o r k w i t hs t u d i e so na l g a ea l l e l o p a t h yd e v e l o p e d ，s o m er e s e a r c h e r ss u g g e s t e dt h i sm a y b et h ee r i e c t i v ea p p r o a c ht os o l v eh a r m f u la l g a eb l o o m sl a t e l y c u r r e n tr e s e a r c hw o r k f o c u s e dm o r eo nt h ei m p a c to fa q u a t i cp l a n t so na l g a e ，b u tt h es t u d yo ft e r r e s t r i a lp l a n t s w a sl e s se m p h a s i z e d t h ep u r p o s eo ft h i ss t u d yw a sa i m e dt oe x p l o r ean o v e la p p r o a c h i nb i o l o g i c a lc o n t r o lo fm i c r o c y s t i sb yt e r r e s t r i a lp l a n t o u rp r e l i m i n a r ye x p e r i m e n ts h o w e dt h a tt h ew a t e r s o l u b l ee x t r a c to fi e e kc a n i n h i b i tt h eg r o w t ho fm i c r o c y s t i sa e r u g i n o s a ( f a c h b 一9 0 5 ) e f f e c t u a l l y , e s p e c i a l l yw h e n t h ee x t r a c tw a st r e a t e db vl l i g ht e m p e r a t u r e t 1 1 i ss t u d yw a sc o n d u c t e dt oi n v e s t i g a t et h e e f f e c t sa n dm e c h a n i s m so ft h ew a t e r s o l u b l ee x t r a c to fl e e ko nm i c r o c y s t i sa e r u g i n o s a u n d e rd i f f e r e n td e s i g n e dc o n d i t i o n si n c l u d i n gp h ，l i g h ti n t e n s i t y ，a e r a t i o n ，i n i t i a l c o n c e n t r a t i o no fa l g a e ，a n dt h ea l l e l o c h e m i c a l so fl e e kw a sp r e l i m i n a r yi s o l a t e d i n a d d i t o n t h eq u a l i t a t i v er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h ea l l e l o c h e m i c a l se x t r a c t e df r o ml e e ka n d t h ew o r k i n gc o n d i t i o n sw a sa n a l y z e d t h ee f f e c t i v eu s e so ft h ea l l e l o p a t h i c a le f f e c t so f 1 e e ke x t r a c tt oi m p r o v et h ew a t e re n v i r o n m e n tq u a l i t yw e r ea l s o s u g g e s t e da n d d i s c u s s e di nt h ep a p e r n er e s u l t so b t m n e dw e r es u m m a r i z e da sf o l l o w s ： ( 1 ) n l ei n h i b i t o r ye f f e c to fs i n g l ea l l e l o c h e m i c a l sw i t h o u tp r e t r e a t m e n t o n m i c r o c y s t i sa e r u g i n o s ag r o w t hw a sn o to b v i o u s a n d 也et y p ea n da m o u n to fs o l v e n t p l a y e dav e r yi m p o r t a n tr o l ew h e nt h ea l m o c h e m i c a l st o o ke f f e c t ( 2 ) t h ew a t e r s o l u b l ee x t r a c to ff r e s hl e e kt r e a t e db yh i g ht e m p e r a t u r e i n h i b i t e d m i c r o c y s t i sa e r u g i n o s a ( f a c h b 一9 0 5 ) g r o w t he f f e c t u a l l y a f t e r7d a y si n c u b a t i o n ，t h e l o g l i n e a rc o r r e l a t i o ne x i s t e db e t w e e nt h ei n h i b i t i o nr a t ea n dt h ec o n c e n t r a t i o no ft h e e x t r a c t ，a n dt h ee c s 0w a so 8 0 8g l ( 3 ) t h ei n h i b i t o r ye f f e c to fl e a ke x t r a c tt r e a t e d 淅m 址曲t e m p e r a t u r ew a sa f f e c t e d b yp h ，l i g h ti n t e n s i t y ，a e r a t i o na n di n i t i a lc o n c e n t r a t i o no fa l g a e ，w h i c hi n d i c a t e dt h a t t h ea p p a r e n ti n h i b i t o r ye f f e c to fl e a ke x t r a c td u r i n gi n c u b a t i o np e r i o dw a si n t e g r a t e d 4 扬州大学硕士学位论文 w i t ht h ei n t e r a c t i o nb e t w e e ns u c hf a c t o r s i nt h i se x p e r i m e n t ，t h eo p t i m u mc o n d i t i o n s f o rt h ea l l e l o p a t h yw e r ea sf o l l o w s ：p h 9 5 ，l o wl i g h ti n t e n s i t y ( 10 0 0 l x ) ，a e r a t i o n ，i n i t i a l c o n c e n t r a t i o no f a l g a e1 0 。1 0 i n d l ， ( 4 ) t h ew a t e r s o l u b l e e x t r a c to fl e e l 2 n 、- ， 籁 鲤 疑 5 o o 2 3 时间d 图1 - 2 不同浓度邻苯二甲酸二丁酯的无水乙醇溶液对铜绿微囊藻生长量的影响 f i g 1 - 2e f f e c to fd b p i na l c o h o lo nt h eb i o m a s so fm i c r o c y s t i sa e r u g i n o s a ( n = 3 ) 表1 2 不同浓度邻苯二甲酸二丁酯的无水乙醇溶液对铜绿微囊藻的生长抑制率 t a b l e1 - 2t h ei n h i b i t o r yr a t eo fd b pi na l c o h o lt h eg r o w t ho fm i c r o c y s t i sa e r u g i n o s a 3 2扬州大学硕士学位论文 2 2 不同溶剂对没食子酸抑制铜绿微囊藻生长的影响 图1 3 显示，单独加入以水为溶剂的没食子酸均对藻类的生长表现一定的抑制 作用。但没食子酸浓度对铜绿微囊藻生长的影响呈现不规则的变化。这种不规则 表现在两个方面：一是随着培养时间的推移，同一浓度没食子酸处理的藻密度会 在此过程中有不规律的起伏现象；二是没食子酸浓度的增加并不与藻密度下降相 对应。例如培养6 d 后，浓度为o 0 2m g l 的处理对藻生长的抑制率低于o 0 1m g ：l 处理对藻的抑制率。 o1 2 3456 时间d 图1 3 不同浓度没食子酸水溶液对铜绿微囊藻生长量的影响 f i g 1 3e f f e c to fg a l l i ca c i di nw a t e ro nt h eb i o m a s so fm i c r o c y s t i sa e r u g i n o s a ( n = 3 ) 表1 3 不同没食子酸水溶液处理对铜绿微囊藻的生长抑制率 t a b l e l 3t h ei n h i b i t o r yr a t eo f g a l l i ca c i di nw a t e rt h eg r o w t ho f m i c r o c y s t i sa e r u g i n o s a 图1 - 4 表明，不同浓度没食子酸甲醇溶液对铜绿微囊藻的生长均没有显著的抑 制作用。在培养1 d 后，浓度为0 0 0 5 m g l 、o 0 1m g l 、0 0 2m g l 的没食子酸甲醇 处理甚至表现出对铜绿微囊藻的生长具有微弱的促进作用。与对照相比，培养3 d 后，只有浓度为0 0 4 m g l 的处理表现出一定的抑制作用，而培养5 d 后，只有浓度 为o o l m g l 和o 0 2 m g l 的没食子酸甲醇处理表现出较少的抑制作用。 l l l lg m g g g 5 m m m o l 2 4 o o o o k c o o o 0 如 加 加 o 1十。【nv籁霉弱 刘文桃韭菜提取物对铜绿微囊藻化感抑制的研究 3 3 ，、 j 目 2 i t d n 籁 鲤 聂 4 0 3 0 2 0 1 0 o12345 时间d 图1 4 不同浓度没食子酸甲醇溶液对铜绿微囊藻生长量的影响 f i g 1 4e f f e c to fg a l l i ca c i di nm e t h a n o lo nt h eb i o m a s so fm i c r o c y s t i sa e r u g i n o s a ( n = 3 ) 表1 4 不同浓度没食子酸甲醇溶液处理对铜绿微藻的生长抑制率 t a b l e1 4t h ei n h i b i t o r yr a t eo fg a l l i ca c i di nm e t h a n o lo nt h eg r o w t ho fm i c r o c y s t i sa e m g i n o s a 3 讨论 一些研究表明，抑藻化感物质一般只特定性地抑制某些藻类的生长u ，4 ，5j 。如 果事实确实如此，则人们在利用生物化感物质来防止特定藻类的爆发时就要有针 对性地采用相应的化感物质进行水的处理。就本试验的结果看，所采用的两种化 感物质，一种是被认为对穗状狐尾藻具有化感作用的没食子酸( 五倍子酸) ，一种是 对黑藻具有化感作用的邻苯二甲酸二丁酯，它们对铜绿微囊藻生长的影响是不一 样的，不仅与化感物质本身的种类有关，也与所使用的浓度有关。例如低浓度的 邻苯二甲酸二丁酯水溶液对铜绿微囊藻的生长具有微弱的促进作用，高浓度时才 表现明显的抑制( 表1 1 ) 。而不同浓度没食子酸水溶液对铜绿微囊藻生长均表现 一定程度的抑制作用( 表1 3 ) 。但总体而言，即使在较高的浓度下，它们对铜绿 微囊藻生长的抑制作用也是有限的( 图1 1 、图1 3 ) 。 本试验表明，溶剂不同，化感物质所表现出的对铜绿微囊藻生长的抑制效果 也不同。对邻苯二甲酸二丁酯来说，用无水乙醇溶解的邻苯二甲酸二丁酯其抑制 效果要好于用水溶解的邻苯二甲酸二丁酯。当加入浓度同为l m l l 时，以水作为 溶剂的邻苯二甲酸二丁酯，在培养结束时并未表现出对铜绿微囊藻的生长具有抑 制作用( 图1 1 ) ，而用乙醇作为溶剂的邻苯二甲酸二丁酯，培养结束时对铜绿微 囊藻生长的抑制率达到3 7 6 0 ，这和有关报道基本一致( 汪星，2 0 0 6 ) j 。这说明溶剂 乙醇掩蔽了邻苯二甲酸二丁酯对铜绿微囊藻化感作用的真实效果。从水和甲醇两 l l l lg m g g g 5 m m m o 1 2 4 0 o o o 矿n c o o o 0 3 4 扬州大学硕士学位论文 种不同溶剂的没食子酸对铜绿微囊藻生长的影响来看，甲醇作为溶剂反而降低了 没食子酸对铜绿微囊藻生长的抑制。如同为o 0 4m g l 的没食子酸，当所用的溶剂 为水时，它对铜绿微囊藻生长的抑制率在培养结束时是3 9 0 9 ( 表1 3 ) ，而以甲 醇为溶剂时，抑制率仅为3 8 8 ( 表1 4 ) 。这同样说明，溶剂甲醇也对没食子酸 对铜绿微囊藻的化感作用具有掩蔽作用。 4 结论 ( 1 ) 黑藻的主要化感物质邻苯二甲酸二丁酯在对铜绿微囊藻的抑制表现为：低浓 度对铜绿微囊藻的生长具有一定促进左右作用，高浓度时抑制铜绿微囊藻类的生 长。穗状狐尾藻穗状狐尾藻的主要化感物质没食子酸对铜绿微囊藻的生长具有一 定的抑制作用，但浓度的影响规律性并不明显。 ( 2 ) 不同溶剂对化感物质的化感作用发挥是有影响的，有的表现为增强，有的表 现为减弱。对邻苯二甲酸二丁酯来说，乙醇溶剂可以增强其对铜绿微囊藻生长的 抑制，而对没食子酸来说，甲醇溶剂可以减弱其对铜绿微囊藻生长的抑制。 刘文桃韭菜提取物对铜绿微囊藻化感抑制的研究 3 5 第二部分实验材料的筛选与方法的确定 1 铜绿微囊藻的基本特性及培养方法 铜绿微囊藻的幼植体为球形或长圆形的实心群体，后长成为网络状的中空囊 状体。随后由于不断扩展，囊状体破裂而形成大小不等网状胶群体。群体胶透明 无色，细胞呈球形或近球形，直径3 - 7 u m ，蓝绿色。一般具有伪空胞。铜绿微囊藻 多生长在湖泊池塘中，属喜高温藻类，一般进入5 月份池塘水温稳定在2 0 以上 时，已开始生长繁殖。夏季繁殖速度极快，生长旺盛。进入秋季水温下降时，其 生长速度减慢。当水温下降到1 5 以下，就不再生长繁殖。 本研究使用的铜绿微囊藻，购自中科院武汉水生生物研究所，编号 f a c h b 一9 0 5 ，利用b g 一1 1 培养基( 见表2 1 ) 在恒温培养室中对铜绿微囊藻进行扩大 培养。每1 5 d 转接1 次。在培养期间每天定时摇动2 3 次并变换空间位置，以减 少光照不均匀的影响。培养温度为2 5 士1 ，光照2 0 0 0 l x ，光暗比1 2 h ：1 2 h 。 表2 1 b g l l 培养液配方 t a b l e 2 - 1c o m p o s i t i o no f b g l1w o r k i n gs o l u t i o n ( g l ) 药品 浓度 n a n 0 3 k 2 h p 0 4 3 h 2 0 m g s 0 4 7 h 2 0 c a c l 2 2 h 2 0 c i t r i ca c i d f e r r i ca m m o n i u lc i t r a t e e d t a ( d i n a t r i u m - s a l o n a 2 c 0 3 a 5 + c os o l u t i o n - k d i s t i l i e dw a t e r9l9 d i s t i l l e dw a t e r h 3 8 0 3 i i l c l ，h 2 0 z n s o d 7 h 2 0 c u s 0 4 5 h 2 0 n a 2 m 0 0 4 2 h 2 0 c o ( n 0 3 ) 6 h 2 0 5 m筒叭汜儿 l m m m c ：m m m c o o o o o c 1 魄地弛魄挑眈 一l|薹|】|兰一一 3 6 扬州大学硕士学位论文 2 适宜抑藻植物的选择及对铜绿微囊藻的生长影响 2 1 试验植物的初步确定 本试验的主要目的是通过实验室模拟培养铜绿微囊藻并观察何种植物的提 取物对它们的生长产生影响。通过初步选择后，对表2 2 中植物提取物进行了对铜 绿微囊藻生长抑制率的测试。植物样品均购自扬州裴庄农贸市场。 表2 - 2 本试验中测试的植物品种 t a b l e 2 2t h ec r o p sb et e s t e d 品种品种 水芹( o e n a n t h es o l o n i f e r aw a l l ) 小葱( a l l i u ma s c a l o n i c u ml ) 大蒜( a l l i u ms a t i v u ml ) 韭菜( l e e k ) 芹菜( w i l d c e l e r yh e r b ) 莴苣( l a c t u c as a t i v al v a r a n g u s t a n am s h ) 茼蒿( r o u n d l e a fg a r l a n dc h r y s a n t h e m u m ) 苋菜( a m a r a n t h u sm a n g o s t a n u sl e d i b l e a m a r a n t h ) 菠菜( d e rs p i n a t ) 生菜( l a c t u c as a t i v al ) 芥菜( b r a s s i c a j u n c e ac o s s ) 花椰菜( b r a s s i c ao l e r a c e al v a r b o t r y t i sl ) 雪菜( b r a s s i c aj u n c e ac o s s v a r m u l t i c e p st s e ne t l e e ) 甘蓝( b r a s s i c ao l e r a c e al v a r c a p i t a t al ) 艾草( a r t e m i s i ac a p i l i a r i s ) 小飞蓬( h o r s e w e e dh e r bh e r b ac o n y z a e c a n a d e n s i s ) 车前子( a s i a t i cp l a n t a i ns e e d ) 薄荷( m e n t h a h a p l o c a l y x ) 青蒿( a r t e m i s i aa p i a c e a ) 马齿苋( p a r s l a n eh e r b ) 荷叶( 干) ( f o l i u mn e l u m b i n i sl o t u sl e a fh e y e ( d r y ) ) 2 2 植物水溶性浸提液制备阴 取新鲜植物叶片用自来水冲洗干净，再用纯净水清洗三遍，晾干后，取鲜样 4 0 9 ，用榨汁机粉碎，加2 0 0 m l 纯净水浸泡4 8 h ，经0 2 2 u r n 纤维滤膜减压抽滤得 到2 0 0 9 l ( 鲜重) 的浸出液a ；取溶液a1 0 0m l 在高压灭菌锅内经1 2 1 高温处 理2 0 r a i n ，制成溶液b 。 2 3 实验方法及测定项目 利用b g 1 1 培养基在恒温培养室中对铜绿微囊藻进行扩大培养。在培养期间 每天定时摇动2 3 次并变换空间位置，以减少光照不均匀的影响。培养温度为 2 5 - + 1 ，光照2 0 0 0 l x ，光暗比1 2 h ：1 2 h 。整个实验操作过程均保持无菌操作。试验 刘文桃韭菜提取物对铜绿微囊藻化感抑制的研究 3 7 时分别取不同适量阴a 、b 两种水溶性抽提液加入到1 0 0 m l 对数生长期的铜绿微囊 藻液中。实验设3 次重复。当天测定藻细胞的初始浓度，以后间隔2 4 h 取样，整 个处理试验持续8 d 。在倒置显微镜下用血球记数板观察和记数，通过测定藻细胞 数量的增减观察藻类的生长状况，通过公式计算出植物对铜绿微囊藻的生长抑制 率。 2 3 1 藻细胞密度的测定 每天取l m l 藻液，用l u g o l 碘液固定，血球计数板计数并计算细胞密度。每 个样品计数3 次取其平均值。 2 3 2 铜绿微囊藻生长抑制率的计算公式 露= n ：of - 一nx1 0 0 露= 1 f x 式中，n o 为对照组藻密度，n 为实验组藻密度 3 8 扬州大学硕士学位论文 3 不同植物提取物对铜绿微囊藻生长的抑制效果 表2 3 不同植物对铜绿微囊藻生长的抑制效果 t a b l e2 - 3i n h i b i t o r ye f f e c t so fd i f f e r e n tp l a n to nm i c r o c y s t i sa e r u g i n o s ag r o w t h 由上表( 表2 3 ) 可知，在所选取的植物中，有些植物浸提液对铜绿微囊藻有抑 制效果，但效果不明显，如：水芹、芹菜、薄荷等；还有一些植物浸提液对铜绿 微囊藻不仅没有抑制作用，相反却促进其生长，如茼蒿、莴苣、车前子等。而韭 菜、马齿苋、小飞蓬等对铜绿微囊藻的生长有较明显的抑制作用，其中韭菜水溶 性浸提液对铜绿微囊藻的抑制效果最好，处理8 d 后的抑制率达到9 1 7 。在相同 浓度下，植物鲜浸提液和高温处理的浸提液相比，高温处理的效果要好于鲜浸提 液。 刘文桃韭菜提取物对铜绿微囊藻化感抑制的研究 3 9 3 1 韭菜水溶性浸提液经不同处理后对铜绿微囊藻生长的影响 。 日 2 n 、- 一 囊丢 韶 器 7 0 0 0246 8 时间d c k 韭菜鲜液 高温处理液 图2 1 韭菜水溶性浸提液经不同处理后的对铜绿微囊藻生长量的影响 f i g 2 1i n h i b i t o r ye f f e c t so f w a t e r s o l u b l ee x t r a c to fl e e kb yd i f f e r e n tt r e a t i n go nt h eb i o m a s s o fm i c r o c y s t i sa e r u g i n o s a ( n = 3 ) 图2 1 表明，相同浓度下鲜韭菜水溶性浸提液对铜绿微囊藻生长初期表现为 抑制作用，后期作用不明显。而经高温处理的韭菜水溶性浸提液对铜绿微囊藻生 长则一直表现为抑制作用，抑制效果达到9 1 7 4 结论 通过筛选，初步确定韭菜提取物对铜绿微囊藻具有较大的抑制作用。在培养 试验期内，经高温处理的韭菜水溶性浸提液对铜绿微囊藻的抑制效果要好于鲜韭 菜水溶性浸提液。 后续试验将以主要以韭菜为研究对象，研究其提取物对铜绿微囊藻的抑制作 用及机理。 扬州大学硕士学位论文 第三部分韭菜水溶性浸提液对铜绿微囊藻生长的抑 制研究 本部分对筛选出的陆生植物韭菜提取物杀灭水华铜绿微囊藻的机理进行研 究，希望直接利用植物分泌或体内含有的天然物质为除藻剂，在快速杀死水华藻 的同时又不会对环境造成污染，可有效地保护水体环境及其生物，达到治理水华、 保护水体生态系统的理想目的，同时也为研究新型、高效、专一且能生物降解的 杀藻剂提供理论依据。 1 材料和方法 1 1 藻种及预培养 实验所用韭菜购于扬州市裴庄农贸市场，铜绿微囊藻购自中科院武汉水生生 物研究所，编号f a c h b 一9 0 5 ，实验前，把藻种培养至对数生长期备用。 1 2 韭菜浸提液的不同处理方法7 】 取新鲜韭菜用自来水冲洗干净，再用纯净水清洗三遍，晾干后，取鲜样4 0 9 ， 用榨汁机粉碎，加2 0 0 m l 纯净水浸泡4 8 h ，经0 2 2 u r n 纤维滤膜减压抽滤得到2 0 0 9 l ( 鲜重) 的浸出液a ；取溶液a 1 0 0 m l 在高压灭菌锅内经1 2 1 高温处理2 0 m i n ， 制的溶液b 。另取鲜韭菜4 0g 至8 0 c 烘箱中干燥4 8 h 后粉碎，用2 0 0 m l 纯净水浸 泡4 8 h ，经0 2 2 u m 纤维滤膜减压抽滤得到浸出液c ，浸出液的浓度仍以活体重量 表示2 0 0 9 l ( 鲜重) ，取溶液c 1 0 0 m l 在高压灭菌锅内经1 2 1 高温处理2 0 r n i n ， 制的溶液d 。 1 3 实验方法 利用b g 一11 培养基在恒温培养室中对铜绿微囊藻进行扩大培养。在培养期间 每天定时摇动2 - - 3 次并变换空间位置：以减少光照不均匀的影响。培养温度为 2 5 + 1 ，光照2 0 0 0 l x ，光暗比1 2 h ：1 2 h 。整个实验操作过程均保持无菌操作。试 验当天测定藻细胞的初始浓度，以后间隔2 4 h 取样，在倒置显微镜下用血球记数 板观察和记数。通过测定藻细胞数量的增减观察藻类的生长状况。 1 4 不同处理的韭菜水溶性浸提液对铜绿微囊藻生长的影响实验 分别取a 、b 、c 、d 韭菜水溶性抽提液加入到1 0 0 r n l 对数生长期的铜绿微囊 藻液中，使其浓度系列为0 ，o 2 5 ，o 5 ，1 ，2 9 l 。实验设3 次重复。 刘文桃韭菜提取物对铜绿微囊藻化感抑制的研究 4 1 1 5 藻细胞密度的测定 每天取l m l 藻液，用l u g o l 碘液固定，血球计数板计数并计算细胞密度。每 个样品计数3 次取其平均值。 1 6 高温处理水溶性韭菜浸提液的半效应浓度e c 5 0 确定 8 】 用培养液将处于指数生长期的铜绿微囊藻藻液稀释，在一系列2 0 0m l 三角 瓶中分别加入l o o m l 藻液，将高温处理的水溶性韭菜浸提液加入其中，使浓度分别 为0 2 5 、0 5 、1 和2g l ，置于培养箱中继续培养。同时在倒置显微镜下用o 1m l 藻计数板观察和记录藻细胞数，计算出生长抑制率，绘制第7 d 高温处理的水溶性 韭菜浸提液浓度与藻生长抑制率的关系曲线，计算半抑制浓度e c 5 0 。 2 结果与分析 2 1 韭菜水溶性浸提液经不同处理后对铜绿微囊藻生长的影响 图3 1 为不同浓度的鲜韭菜水溶性浸提液对铜绿微囊藻生长的影响。结果表 明，高浓度的韭菜水溶性浸提液对铜绿微囊藻的生长有显著的抑制作用，低浓度 时表现为促进作用。浓度为0 2 5 9 l 时，韭菜水溶性浸提液对铜绿微囊藻的生长在 培养期内一直表现为促进；浓度为0 5 9 l 时，仅在培养3 d 、4 d 表现为稍稍的抑制 作用，其他培养期间也表现为促进铜绿微囊藻的生长。浓度为1 9 l 、2 9 l 时，鲜 韭菜水溶性浸提液对铜绿微囊藻的生长表现为较强的抑制作用，但在培养周期内， 铜绿微囊藻没有被完全致死。 一1 0 0 j 目 乌8 0 戈 6 0 綦4 0 禽 最 2 0 o 01234567 时间d 图3 1 不同浓度的鲜韭菜水溶性浸提液对铜绿微囊藻生长量的影响 f i g 3 - 1i n h i b i t o r ye f f e c t so fd i f f e r e n tc o n c e n 似i o n sw a t e r - s o l u b l ee x t r a c to ff r e s hl e e ko t lt h e 4 2 扬州大学硕士学位论文 b i o m a s so f m i c r o c y s f i sa e r u g i n o s a ( n 2 3 ) 图3 2 为不同浓度的高温处理鲜韭菜水溶性浸提液对铜绿微囊藻生长的影响。 结果表明，除了浓度为o 2 5 9 l 外，其他浓度的高温处理的鲜韭菜水溶性浸提液对 铜绿微囊藻的生长皆有显著的抑制作用。随着韭菜水溶性浸提液浓度的升高，对 铜绿微囊藻生长的抑制作用加强，7 d 后，浓度为l e , l 、2 e 2 l 的处理对铜绿微囊藻 的生长抑制率基本一致，培养7 d 后最大抑制率可达9 0 3 ；而浓度为o 5 9 l 的处 理，第4 d 后对铜绿微囊藻的抑制效率有所下降。 o 乌 h 器 、 籁 基 弱 o1 234567 时间d 图3 - 2 不同浓度的高温处理鲜韭菜浸提液对铜绿微囊藻生长量的影响 f i g 3 2i n h i b b o r ye f f e c t so fd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n sw a t e r s o l u b l ee x t r a c to ff r e s hl e e kt r e a t e d b ym g ht e m p e r a t u r eo nt h eb i o m a s so fm i c r o c y s t i sa e m g i n o s a ( n - 3 ) 图3 3 显示，不同浓度干韭菜水溶性浸提液对铜绿微囊藻的生长没有明显的抑 制作用。浓度为1 9 l 的处理在实验前3 d ，其对铜绿微囊藻的生长表现为抑制作用， 从第4 d 开始，抑制效应逐渐解除，细胞密度呈快速上升趋势。浓度为2 9 l 的处理， 对铜绿微囊藻抑制效果最好，其他浓度下对铜绿微囊藻生长的抑制则没有显著的 差异。 约 o 刘文桃韭菜提取物对铜绿微囊藻化感抑制的研究 4 3 3 目 2 n 、- ， 籁 蟹 弱 8 0 6 0 4 0 2 0 o 01234567 时间d 图3 3 不同浓度干韭菜水溶性浸提液对铜绿微囊藻生长量的影响 f i g 3 - 3i n h i b i t o r ye f f e c t so fd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n sw a t e r 。s o l u b l ee x t r a c to fd r yl e e ko nt h e b i o m a s so fm i c r o c y s t i sa e r t l g i n o s a ( n = 3 ) 图3 4 是不同浓度高温处理干韭菜水溶性浸提液对铜绿微囊藻生长的影响。结 果显示，当浓度为0 2 5 l ，0 5 9 l 时，高温处理的于韭菜水溶性浸提液对铜绿微 囊藻几乎没有抑制作用，从培养第2 d 起，反而稍稍促进了铜绿微囊藻的生长；浓 度为l g l ，2 9 l 的处理，浸提液对铜绿微囊藻有明显的抑制作用，但与图2 相比 可知，其抑藻效果没有经高温处理的鲜韭菜水溶性浸提液好。 3 吕 2 c , q 、_ ， 籁 禽 最 8 0 6 0 4 0 2 0 o 01234 56 7 时间d 图3 4 不同浓度高温处理干韭菜水溶性浸提液对铜绿微囊藻生长量的影响 f i g 3 - 4i n h i b i t o r ye f f e c t so fd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n sw a t e r s o l u b l ee x t r a c to fd r yl e e kt r e a t e d b yh j g ht e m p e r a t u r eo nt h eb i o m a s so fm i c r o c y s t i sa e r u g i n o s a ( n ：3 ) 扬州大学硕士学位论文 2 2 经高温处理的韭菜水溶性浸提液对铜绿微囊藻半效应浓度e c 5 0 的 确定 藻类的生长符合l o g i s t i c 模型，其曲线为s 型，当藻类受到外源物质影响时， 其生长曲线会发生改变【1 3 。由图3 2 可知：高温处理的韭菜水溶性浸提液对铜绿 微囊藻的抑制效果最好。从高温处理的鲜韭菜水溶性浸提液的浓度及其对铜绿微 囊藻生长的抑制率之间浓度效应曲线( 图3 2 ) 可以看出，高温处理的韭菜水溶性 浸提液对铜绿微囊藻的抑制作用显著并具有浓度效应。在培养的前2 d 内，低浓度 的2 个处理( 加入浸提液0 2 s g l 、o 5g l ) 表现为促进作用。2 d 后，o 2 s g 几处理 继续表现为促进作用，而o 5 l 处理则表现出抑制作用，在第4 d 时抑制率为 6 0 1 。高浓度处理( 加入浸提液l g l 、2g l ) 在整个培养期均表现为抑制作用， 在培养7 d 后抑制率分别为8 5 0 ，9 0 3 ，且高温处理的鲜韭菜水溶性浸提液对铜 绿微囊藻的抑制率随浓度升高而增强。7 d 后，高温处理的鲜韭菜水溶性浸提液对 铜绿微囊藻的抑制率与浸提液浓度的对数线性相关( 图3 5 ) ，符合米氏曲线方程 y = 5 4 6 8 l n ( x ) + 6 0 1 2 9 ( r 2 = 0 9 0 7 6 ) 。根据浓度效应方程，计算出相对应7 d 的半效 应浓度e c s 0 值为0 8 0 8g l 长 l 卜 藤 器 姒 矧 y = 5 6 8 3 8 l n ( x ) + 6 2 1 2 4 ；一删鞘i lo 5 11 5 22 浓度( g l ) 5 图3 5 培养7 d 后，高温处理的鲜韭菜水溶性浸提液的浓度及其对铜绿微囊藻生长的抑制率之 间浓度效应关系 f i g 3 - 5a f t e rc u l t u r e d7d a y s ，t h el o g - l i n e a rc o r r e l a t i o ne x i s t e db e t w e e n t h ei n h i b i t o r yr a t eo f m i c r o c y s t i sa e r u g i n o s aa n d t h ec o n c e n t r a t i o no ft h ew a t e r - s o l u b l ee x t r a c to ff r e s hl e e kt r e a t e db y h i g ht e m p e r a t u r e ( n = 3 ) o加们 刘文桃韭菜提取物对铜绿微囊藻化感抑制的研究 4 5 3 讨论 利用植物体内产生的天然克生物质进行生态调控，在陆生杂草的防治及淡水 生态系统中藻类水华的控制方面国内外早有研究，并取得很好进展【9 _ 1 1 1 。但关于陆 生蔬菜和杂草对该方面的研究刚刚起步，报道极少。 本研究显示，韭菜体内含有克藻物质。在本实验浓度范围内，较低浓度的处 理( 0 2 5 9 e l 、0 5 l ) 表现为促进效应，浓度为l g l 、2g l 鲜韭菜浸提液对铜绿