（药理学专业论文）酶促牛黄与天然牛黄中枢神经药理作用的比较研究.pdf

酶促牛黄与天然牛黄中枢神经药理作用的比较 研究生：许贵斌 专业：药理学 导师：高允生教授 中文摘要 目的 观察酶促牛黄和天然牛黄对小鼠的镇静催眠、抗惊厥、抗炎、镇痛和缺氧保 护作用，初步评价酶促牛黄的药用价值，为寻找天然牛黄的替代品提供依据。 方法 1 镇静催眠实验采用光电计数法观察酶促牛黄和天然牛黄对小鼠自主活动 的影响，利用戊巴比妥钠阈剂量诱导睡眠实验观察酶促牛黄和天然牛黄对小鼠的 催眠作用。 2 抗惊厥实验采用尼可刹米和最大电休克法制备小鼠惊厥模型，观察酶促 牛黄的抗惊厥作用。 3 抗炎实验采用二甲苯致小鼠耳廓肿胀、角叉菜胶致小鼠足肿胀的炎症模 型，观察酶促牛黄和天然牛黄的抗炎作用。 4 镇痛实验应用醋酸致小鼠扭体实验和光辐射致小鼠甩尾实验，观察酶促 牛黄和天然牛黄的镇痛作用。 5 抗缺氧实验采用常压缺氧和异丙。肾上腺素致心肌缺氧小鼠模型，观察酶 促牛黄和天然牛黄对小鼠耐缺氧能力和耗氧量的影响。 结果 1 镇静催眠实验结果表明，酶促牛黄、天然牛黄和地西泮均明显减少小鼠自 主活动( p 0 0 1 ) ，增加阈剂量戊巴比妥钠诱导的小鼠睡h 民例数，延长入睡小鼠的 睡眠维持时间。表明酶促牛黄和天然牛黄具有不同程度的镇静作用和催目民协同作 用，以天然牛黄作用较强。 2 抗惊厥实验结果表明，酶促牛黄和戊巴比妥钠能延长尼可刹米对小鼠的惊 厥潜伏期，提高最大电休克小鼠的惊厥闽值，减少最大电惊厥发作的小鼠例数( p o 0 5 ，p 0 0 1 ) 表明酶促牛黄具有抗惊厥作用。 3 抗炎实验结果表明，酶促牛黄、天然牛黄、阿司匹林对二甲苯致小鼠耳廓 肿胀和角又菜胶致小鼠足趾肿胀均有抑制作用( p o 0 5 ，p 0 0 1 ) ，酶促牛黄对 二甲苯致小鼠耳廓肿胀的抑制作用具有剂量依赖性。表明酶促牛黄和天然牛黄具 有抗炎作用。 4 镇痛实验表明，酶促牛黄、天然牛黄和阿司匹林均能减少醋酸致小鼠扭体 反应次数，提高光辐射致小鼠甩尾反应的痛阈值( p 0 0 5 ，p 0 0 1 ) ，表明酶促 牛黄和天然牛黄具有镇痛作用。 5 抗缺氧实验结果表明，酶促牛黄、普萘洛尔能延长常压缺氧和心肌缺氧小 鼠的存活时间( p 0 0 1 ，p o 0 5 ) ，提示酶促牛黄能增强小鼠的耐缺氧能力。 结论 1 酶促牛黄和天然牛黄对小鼠具有镇静、催眠和抗惊厥等中枢神经抑制作 用。能抑n d , 鼠自主活动，与阈剂量戊巴比妥钠具有协同催眠作用，抑制尼可刹 米和最大电休克引起的惊厥。 2 酶促牛黄和天然牛黄对小鼠具有抗炎镇痛作用。能抑制二甲苯致小鼠耳廓 肿胀和角叉菜胶致小鼠足趾肿胀等炎症反应，对醋酸致小鼠扭体反应和光辐射致 小鼠甩尾反应模型具有镇痛作用。 3 酶促牛黄能增强常压缺氧和心肌缺氧小鼠耐缺氧能力，延长小鼠在缺氧环 境中的存活时间。 4 上述结果表明，酶促牛黄具有与天然牛黄相似的中枢神经药理作用，可部 分替代天然牛黄。 关键字酶促牛黄，天然牛黄，镇静，催眠，抗惊厥，抗炎，镇痛，抗缺氧能力 c o 【p a r a t i v es t u d yo fp h a r m a c o l o g i c a le f f e c t0 n c e n t r a ln e r v es y s t e mb e t w e e nn a t u r a l c a l c u l u sb o v i sa n dc a l c u l u sb o v i sc u 【j i v a t e db y g l u c u r o n i d a s e p o s t g r a d u a t e ： g u i b i nx u s p e c i a l i t y ：p h a r m a c o l o g y t u t o u r ： y u n s h e n gg a op r o f e s s o r a b s t r a c t o b j e c t i v e t oo b s e r v et h ee f f e c t so fn a t u r a lc a l c u l u sb o v i sa n dc a l c u l u sb o v i sc u l t i v a t e db y g t u c u r o n i d a s eo na n t i i n f l a m m a t o r y , a n t i c o n v u l s i o n ，a n a l g e s i a , s e d a t i v e ，h y p n o s i sa n d t h e i rp r o t e c t i v ee f f e c to na n t i h y p o x i ai nm i c e t oe s t i m a t et h ep h a r m a c e u t i c a lv a l u eo f c a l c u l u sb o v i sc u l t i v a t e d b yg l u c u r o n i d a s ea n dp r o v i d ee v i d e n c ef o rf i n d i n g t h e s u b s t i t u t ef o rn a t u r a lc a l c u l u sb o v i s m e t h o d s 1 s e d a t i v ea n dh y p n o s i se x p e r i m e n t t oo b s e r v et h ei n f l u e n c eo fn a t u r a lc a l c u l u sb o v i s ( n c b 、a n dc a l c u l u sb o v i s c u l t i v a t e d b yg l u c u r o n i d a s e ( c b c g ) o na c t i v em o t i o n i nm i c eb ym e t h o do f p h o t o e l e c t r i c i t yc a l c u l a t i o n a d o p t i n gp e n t o b a r b i t a ls o d i u m ( t h r e s h o l dd o s e ) 一i n d u c e d h y p n o s i se x p e r i m e n tt oo b s e r v et h ee f f e c to fn c b a n dc b c go nh y p n o s i si nm i c e 2 a n t i c o n v u l s i o ne x p e r i m e n t a p p l y i n gn i k e t h a m i d e ( n t m ) - i n d u c e d c o n v u l s i o nm o d e la n dm a x i m a l e l e c t r o s h o c kc o n v u l s i o n ( m e s ) m o d e lt oo b s e r v et h ee f f e c to fn c ba n dc b c go n a n t i c o n v u l s i o ni nm i c e t h ee x p e r i m e n ts h o w st h a tb o t hn c ba n dc b c gc a ni n h i b i t c o n v u ls i o ni nm i c e 3 a n t i i n f l a m m a t i o ne x p e r i m e n t t oa d o p tc g n - i n d u c e df o o ti n f l a m m a t i o nm o d e li nm i c ea n dd i m e t h y l - b e n z e n e ( d m b ) 一i n d u c d e i n f l a m m m i o nm o d e l i nm i c et oo b s e r v et h ee f f e c to fn a t u r a lc al c u l u s b o v i sa n dc a l c u l u sb o v i sc u l t i v a t e db yg l u c u r o n i d a s eo ni n f l a m m a a t i o n 4 a n a l g e s i ae x p e r i m e n t a d o p t i n ga c e t i ca c i d - i n d u c e dw r i t h i n ge x p e r i m e n ti nm i c et oo b s e r v et h ee f f e c to f n a t u r a lc a l c u l u sb o v i sa n dc a l c u l u sb o v i sc u l t i v a t e db yg l u c u r o n i d a s eo nw r i t h i n gt i m e s o fm i c e t oa d o p tr e c o r d i n gi n s t r u m e n to fm i c ea c t i v em o t i o nt om e a s u r et h ea m o u n to f a c t i v i t yo fm i c ea f t e ra d m i n i s t r a t i n gm e d i c i n e t oo b s e r v et h ee f f e c to fn a t u r a lc a l c u l u s b o v i sa n dc a l c u l u sb o v i sc u l t i v a t e db yg l u c u r o n i d a s eo na c t i v em o t i o no fm i c e a p p l y i n gl i g h tr a d i a t i o n i n d u c e dt a i lf l i c ki nm i c ee x p e r i m e n tt os u r v e yt h ee f f e c to f n a t u r a lc a l c u l u sb o v i sa n dc a l c u l u sb o v i sc u l t i v a t e db yg l u c u r o n i d a s eo nt h r e s h o l dv a l u e o f p a i no f m i c e 5 a n t i h y p o x i ae x p e r i m e n t a d o p t i n gn o r m a la n d i s o i n d u c e dh y p o x i ai nm i c ee x p e r i m e n tt oo b s e r v et h e e f f e c to fn a t u r a lc a l c u l u sb o v i sa n dc a l c u l u sb o v i sc u l t i v a t e db yg lu c u r o n i d a s eo n a n t i h y p o x i ai nm i c e r e s u l t s 1 t h eh y p n o t i z i n ge x p e r i m e n ti n d i c a t e st h a tb o t hn a t u r a lc a l c u l u sb o v i sa n d c a l c u l u sb o v i sc u l t i v a t e d b yg l u c u r o n i d a s e c a n p ro l o n g t h e s l e e p t i m eo f m i c e m e a n w h i l e ，t h et w oc a ns t r e n t h e nt h eh y p n o s i se f f e c to fc o n t i n a li nm i c e 2 t h eo u t c o m eo fa n t i c o n v u l s a n te x p e r i m e n ts h o w st h a tc a l c u l u sb o r i sc u l t i v a t e d b yg l u c u r o n i d a s ec a nr e l i e v ec o n v u l s i o n 3 t h er e s u l t so fa n t i i n f l i m m a t o r ye x p e r i m e n t ss h o wt h a tb o t hn a t u r r a lc a l c u l u s b o v i sa n dc a l c u l u sb o v i sc u l t i v a t e db yg l u c u r o n i d a s ec a ni n h i b i td m b i n d u c e de a r i n f l i m m a t i o na n dc g n i n d u c e df o o ti n f l i m m a t i o ni nm i c e b u tt h et w oh a v ed i f f e r e n t i n h i b i t i n gr a t eo fi n f l i m m a t i o n 4 t h er e s u l to fa n a l g e s i ae x p e r i m e n ts h o w st h a tb o t hn a t u r a lc a l c u l u sb o v i sa n d c a l c u l u sb o v i sc u l t i v a t e db yg l u c u r o n i d a s ec a nr e d u c ew r i t h i n gf r e q u e n c yi nm i c e b o t h c a nr a i s ep a i nt h r e s h o l dv a l u eo fm i c e 5 t h ee x p e r i m e n ts h o w st h a tc a l c u l u sb o v i sc u l t i v a t e db yg l u c u r o n i d a s ec a n s t r e n t h e nt h ea b i l i t yo fa n t i h y p o x i ao fm i c e c o n c l u s i o n s i b o t hn c ba n d b c g p o s s e s st h e e f f e c t o fc e n t r a ln e r v es y s t e ms u c h la s f i n t c o n v u l s i b n ，s e d a t i v e ，h y p n o s i s ，e t c t h e yc a nr e f r a i nc o n v u l s i o nf r o mh a l j p e n i n gi h m i c e 2 n c ba n dc b c gp o s s e s st h ee f f e c to fa n t i i n f l a m m a t i o n ，a n a l g e s i a t h e yc a n r e p r e s sd m b i n d u c e di n f l a m m a t i o mi nm i c ea n dr e l i e ft h eg r i e fi n d u c e db yc a a n d l i g h t r a d i a t i o ni nm i c e 3 c b c gc a ne n h a n c et h ea b i l i t yo fa n t i h y p o x i ai nm i c ea n dp r o l o n gt h es u r v i v a l t i m eo fm i c e 4 4 t h ea b o v er e s u l t ss h o wt h a tc b c gp o s s e s s e st h ee f f e c to fn a t u r a ln e r v es y s t e m a sg o o da sn c b c b gm a yr e p l a c en c bo nt h ep h a m a a c e u t i c a le f f e c ti nn a t u r a ln e r v e s y s t e mp a r t l y k e y w o r d sc a l c u l u sb o v i s c u l t i v a t e d b yg l u c u r o n i d a s e n a t u r a lc a l c u l u sb o v i s a n t i i n f l a m m a t i o n a n a l g e s i a a n t i c o n v u l s i o ns e d a t i v e h y p n o s i s a b i l i t yo fa n t i h y p o x i a 英文缩写英文全称 c g n c a r r a g e e n a n n t mn i k e t h a m i d e i s o p r o p a s p d m b n s n c b c b c g p b s d z p 符号说明付丐吼明 i s o p r e n a l i n eh y d r o c h l o r i d e p r o p r a n o l o l a s p i r i n d i m e t h y l b e n z e n e n o r m a ls a l i n e n a t u r a lc u l c u l u sb o v i s c u l c u l u sb o v i sc u l t i v a t e db yg l u c u r o n i d a s e p e n t o b a r b i t a ls o d i u m d i a z e p a m 6 中文全称 角叉菜胶 尼可刹米 盐酸异丙肾上腺素 普萘洛尔 阿司匹林 二甲苯 生理盐水 天然牛黄 酶促牛黄 戊巴比妥钠 地西泮 前言 牛黄( c a l c u l u sb o v i s ；b e z o a rb o v i s ) 为脊椎动物哺乳纲偶蹄目洞角科( 牛科) 动物 牛的胆结石。千金方外台秘要中称其为土精，本草纲目记载为丑宝，现代 全国中草药汇编也叫天然牛黄。主要为黄牛( b o s t a u r u sd o m e s t i c u s g m e l i n ) ( b u b a b u sb u b a l i m a a e u s ) l 狗胆囊结石，少数为胆管中或肝管中的结石。 天然牛黄及人工培植牛黄中均含有胆色素、胆汁酸、脂类、肽类、氨基酸【6 j 和无机元烈刀。，牛黄中含胆色素7 2 7 6 ，其中胆红素含量为2 5 7 0 ，包 括：胆红素钙、游离胆红素、胆红素酯等：其他还有胆汁酸、胆绿素类，其中有胆 酸7 1 0 ，脱氧胆酸0 4 5 ，鹅脱氧胆酸、石胆酸，并有结合胆汁酸：牛黄胆汁 酸盐、甘氨胆汁酸盐等。脂类，含胆固醇2 5 4 8 ，脂肪酸1 0 2 1 ，卵磷 脂0 1 7 - - 0 2 。蛋白、肽、氨基酸类，含粘蛋白：总氨基酸6 1 5 9 9 m g 1 0 0 9 ，其中 牛磺酸占总游离氨基酸的1 5 8 6 ，甘氨酸占3 4 6 1 ，谷氨酸占7 9 8 ，苏氨酸、 缘氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、异亮氨酸占总量的2 0 2 5 。此 外，还有精氨酸、组氨酸、酪氨酸、蛋氨酸、丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸等。无机 元素中含有k 、n a 、c a 、m g 、f e 、c u 、m n 、z n 、p b 等元素。 牛黄属珍贵、稀有中药材资源，其价格是黄金的两倍，素有“黄金易得、牛黄 难求”之说。由于牛黄在牛体内的自然发生率仅为0 9 2 1 【，而我国目前6 8 0 多种 中成药主要以牛黄为原料( 其中9 8 以上为天然牛黄代用品) ，故牛黄代用品的开 发研究非常重要。牛黄作为药物用于临床，在我国具有两千多年的历史。早在神 农本草经中就有记载主惊痫，寒热，热盛狂。”国内外学者对牛黄及其代用品培植 牛黄、体外培育牛黄和人工牛黄进行了大量药效学研究，并取得了丰硕成果。研 究证实牛黄具有解热【3 ，4 l 、镇痛【列、抗炎嘲、抗惊厥【6 1 、解痉【7 1 、平喘、抗病原微生 物【8 1 、利胆【引、促进免疫功能1 0 j 和保护心脑等广泛的药理作用。牛黄的药效学研 究尚处在定性或半定量研究阶段，至于何种成分起作用，是一种成分还是数种成 分共同起作用，以及各成分之间比例与药理作用是否有关都需进一步探讨。另据 报导，游离胆红素具有抗氧化、灭活胃肠道消化酶作用【佗l ，是牛黄发挥许多重要 药理作用不可缺少的成分。胃肠道细菌的易位及其代谢产物的渗透在许多危重病 症如创伤、休克、烧伤、败血症、阻塞性黄疸、胰腺炎和多器官功能衰竭中起关 键性作用1 1 3 】，而消化酶通过破坏胃肠道屏障加速这一过程【1 4 】。游离胆红素能够灭 活胰蛋白酶、糜蛋白酶等胰酶，存在于天然牛黄、培植牛黄和体外培育牛黄中的 胆红素多为游离型l l 川，因此，能够对胃肠道起保护作用。只有胆红素含量3 5 以 上的牛黄才可用于危重患者，含量1 8 3 4 的牛黄用于一般患者，含量低于1 8 的牛黄不能作为药物使用。游离胆红素含量的高低已经成为评价牛黄质量的重 要参数i 怕j 。 天然牛黄虽然具有很高的药用价值，但是，其来源非常有限，不能满足市场 和临床需要，因此，天然牛黄替代品的丌发研究至关重要。 天然牛黄替代品可以分为三类：培植牛黄，体外培育牛黄和人工牛黄。人工 牛黄由胆酸、猪脱氧胆酸、胆红素、贝斯素、胆固醇、无机盐等配制而成【2 1 1 ，其 、药理作用有限，只能用于一般患者，不能用于急症患者，许多中成药组方不能够 以人工牛黄为原料。体内培植牛黄系在牛的胆囊内植入异物，刺激胆囊形成结石。 此种牛黄药理作用强，疗效确切，但是其生产工艺复杂，受多种因素影响，不能 大批量生产。体外培育牛黄系根据天然牛黄形成原理，在牛体外创建类似胆囊内 环境，利用现代科学技术培育而成的天然牛黄替代品，其种类较多，生产工艺各 异，药理学作用有待进一步确认。由泰山医学院药学院与生物化学等相关学科组 成的课题组自行研制生产的酶促牛黄【1 7 j 系一种体外培育牛黄，其药效学研究尚处 在实验室研究阶段，初步研究显示，酶促牛黄在许多方面接近天然牛黄 本实验旨在观察酶促牛黄和天然牛黄的抗炎、抗惊厥、镇静催眠、镇痛和缺 氧保护作用，初步评价酶促牛黄的药用价值，为寻找天然牛黄的替代品提供依据。 制，批号0 5 0 3 1 5 。 尼可刹米( n i k e m t h a m i d e ，n t m ) ：上海禾丰制药有限公司，批号0 8 0 61 0 ， 规格0 3 7 5 9 2 m l 。 地西泮片( d i a z e p a m ，d z p ) ：北京益民药业有限公司，批号0 7 0 3 0 2 0 ，规格 2 5 m g 片。 戊巴比妥钠( p e n t o b a r b i t a ls o d i u m ，p b s ) ：中国医药上海( 集团) 化学试剂公 司，批号f 2 0 0 2 0 4 0 5 。 盐酸异丙肾上腺素注射液( i s o p r e n a l i n eh y d r o c h l o r i d e ，i s o ) ：上海禾丰制 药有限公司，批号0 8 0 11 2 ，规格l m g 2 m l 。 阿司匹林片( a s p i r i n ，a s p ) ：西安博华制药责任公司，批号0 1 0 8 0 9 7 ，规格 o 5 9 片。 普萘洛尔片( p r o p r a n o l o l ，p r o ) ：上海禾丰制药有限公司，批号0 7 1 2 0 2 ，规 格l o m g 片。 氯化钠注射液( n o r m a ls a l i n e ，n s ) ：山东科伦药业有限公司，批号0 9 0 8 1 0 。 角又菜胶( c a r r a g e e n a n ，c g n ) ：海南省长波涤青琼脂厂。 二甲苯( d i m e t h y l b e n z e n e ，d m b ) ：天津市巴斯夫化工有限公司。 醋酸：天津市东丽区元大化学制剂厂 钠石灰：天津市东丽区元大化学制剂厂 3 主要仪器 t f 光热测痛仪：中国医学科学院药物研究所。 9 y l s 一1 a 多功能小鼠自主活动记录仪：山东省医学科学院设备站。 y l s 一7 b 足趾容积测量仪：山东省医学科学院设备站。 小动物耐缺氧与耗氧量动态变化同步测定装置：泰山医学院研制i j 。 电子天平：上海恒平科学仪器有限公司。 电子分析天平：o h a u sc o r p p i n e b r o o k ，n t u s a ；i t e mn o a r l1 4 0 c 。 4 药品与试剂配制 、 4 11 淀粉浆 烧杯中加入蒸馏水1 0 0 m l ，称取淀粉1 0g 加入蒸馏水中，搅拌混匀，加热致 沸，冷却后置试剂瓶中备用。 4 2 酶促牛黄混悬液的配制 酶促牛黄放入研钵中研细，称取4 0 0 0 0 9 放入烧杯中，加入2 0 m l 淀粉液，搅 拌混匀，即得2 0g k g 一酶促牛黄混悬液，移至试剂瓶中，冷减备用；将2 0g - k g j 酶促牛黄混悬液稀释l 倍、2 倍分别得到1 0 9g k g 1 、0 5g k g 一酶促牛黄混悬液。 4 3 戊巴比妥钠溶液的配制 称取2 5 0 m g 戊巴比妥钠，放入烧杯中，用少量蒸馏水溶解，移至1 0 m l 容量 瓶中，用蒸馏水稀释至刻度线，摇匀后放入冰箱中冷藏( 用前需摇晃均匀) 。 4 4 天然牛黄混悬液的配制 取天然牛黄放入研钵中研细，称取天然牛黄2 0 0 0 0 m g , 量取1 淀粉液2 0 0 m l ， 倒入烧杯中，将天然牛黄缓缓倒入淀粉液中，并用玻璃棒搅拌均匀。将配好的溶 液移至试剂瓶中，放入冰箱冷藏备用( 用前需摇晃均匀) 。 4 5 醋酸溶液的配制 用吸量管量取o 3 m l 醋酸，置于5 0 m l 容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀后转 移至棕色试剂瓶中备用。 4 6 阿司匹林溶液的配制 取阿司匹林( o 5 片) 1 0 片置于研钵中，研为粉末，量简量取1 2 5 m l 蒸馏水， 逐次加入研钵中研匀，移至试剂瓶，放入冰箱中备用( 用前摇匀) 。 4 7 地西泮溶液的配制 取地西泮片( 2 5 m 片) 2 4 片，研为粉末，量筒量取2 4 0 m l 蒸馏水，逐次加 入研钵中研匀，移至试剂瓶，放入冰箱中备用。 4 8 普萘洛尔溶液的配制 l o 取普萘洛尔片( 1 0 m g 片) 4 片置于提日，j 清洗干燥好的研钵中，研为粉末，量 取2 0 r a l 淀粉浆，逐次加入研钵中研匀，移至试剂瓶，放入冰箱中备用。 4 9 角又菜胶溶液的配制 称取2 0 0 m g 角叉菜胶，放入烧杯中，用2 0 r a l 蒸馏水溶解，将该溶液倒入试剂 瓶中，贴上标签，放入冰箱中备用。 实验方法 1 小鼠自主活动实验 1 1 分组与给药昆明种小鼠6 0 只，早6 各半，体重1 8 2 2 9 ，按性别和体重 随机分为6 组，每组1 0 只。分别为生理盐水组、地西泮组( 2 5 n a g k g 一) 、天然牛 黄组( 1 0g k g 一) 、酶促牛黄低、中、高剂量组( o 5 、1 0 和2 0g k g - ) 。酶促牛黄和 天然牛黄组每日灌胃给药1 次，连续给药3 天；地西泮组第l 、2 天灌胃等容量生 理盐水，第3 天给予地西泮；生理盐水组连续3 天同法灌胃等容量生理盐水。 1 2 观察方法给药前和末次给药后o 5 h ，分别将小鼠放入多功能小鼠自主活 动记录仪中，适应5 m i n 后，记录小鼠5 m i n 内自主活动次数。计算各组小鼠给药 前后的自主活动减少率。 自主活动减少率( ) = ( 药前自主活动次数药后自主活动次数) 药前自主 活动次数 2 与阈剂量戊巴比妥钠的协同催眠实验1 2 i 2 1 分组与给药昆明种小鼠6 0 只，雌雄各半，体重1 8 - 2 2 9 ，按性别和体重 随机分为6 组，每组1 0 只。分别为生理盐水组、地西泮组( 2 5m g k g ) 、天然牛 黄组( 1 0g k g 。) 、酶促牛黄低、中、高剂量组( o 5 、1 0 和2 0g - k g 1 ) 。酶促牛黄和 天然牛黄组每日灌胃给药1 次，连续给药3 天；地西泮组第l 、2 天灌胃等容量生 理盐水，第3 天给予地西泮：生理盐水组连续3 天同法灌胃等容量生理盐水。第3 次给药后1 h ，各组小鼠均腹腔注射戊巴比妥钠2 5m g k g 。 2 2 观察方法以小鼠翻正反射消失时间lm i n 为睡眠指标，记录注射戊巴 比妥钠3 0m i n 内翻正反射消失小鼠数。记录小鼠翻正反射消失至翻正反射恢复时 间，作为睡h 民维持时间。 3 抗小鼠抗惊厥实验 。 3 1 尼可刹米致小鼠惊厥实验 3 1 1 分组与给药 昆明种小鼠5 0 只，早6 各半，体重2 0 - - 2 4 9 ，按性别和体重随机分为5 组， 每组1 0 只。分别为生理赫水组、戊巴比妥钠组( 2 5 m g k g 一) 、酶促牛黄低、中、 高剂量组( o 5 、1 0 和2 0g k g _ ) 。酶促牛黄组每同灌胃给药1 次，连续给药3 天： 戊巴比妥钠组第1 、2 天灌胃等容量生理盐水，第3 天腹腔注射戊巴比妥钠：生理 盐水组连续3 天同法灌胃等容量生理盐水。戊巴比妥钠组第3 次给药后0 5 h 、其 余各组灌胃给药后1 h ，均腹腔注射尼可刹米1 5 0 r n g k g 。 3 1 2 观察方法 观察腹腔注射尼可刹米后各组小鼠的行为变化，记录各组出现惊厥和死亡的 动物数。记录注射尼可刹米致小鼠出现第一次阵挛性惊厥的时间，作为惊厥潜伏 期。 3 2 最大电休克致小鼠惊厥实验【2 3 1 3 2 1 调整仪器接通y l s i a 型多功能小鼠自主活动记录仪电源导线，打开 电源开关，电刺激设置为：电压6 5v ，电流2 0 m a ，波宽1 0 m a ，周期2 0 m a ，工作时间 1 5 s ，占空时间1 0 0 s ，连续输出( 开机默认，该指示灯亮) ，按下刺激输出键，刺激输 出键指示灯亮，机器处于待机状态。 3 2 2 测定小鼠基础惊厥阈值取小鼠一只，称重，将功能小鼠自主活动记录 仪输出在线的两个鳄鱼夹尖端用生理盐水浸湿，夹在小鼠的两个耳尖，将小鼠悬 空。按一下手控开关，脉冲指示灯亮，观察小鼠是否出现惊厥( 以后肢伸直为指 标) ，有惊厥反应的为初选合格。再按下输出开关，手动输出指示灯灭，为下一次 刺激做准备。对不出现惊厥的小鼠，把电压由6 5 v 提高到7 5v ，其他刺激参数不变， 如果仍不出现惊厥则弃之。按此法选出5 0 只小鼠。分别用苦味酸标记，并记下刺 激电压。 3 2 3 分组与给药筛选合格昆明种小鼠5 0 只，早6 各半，体重2 0 - - 2 2 9 ，按 性别和体重随机分为5 组，每组l o 只。分别为生理盐水( n s ) 组、p b s 组 ( 0 0 2 5 9 k g 。1 ) 、酶促牛黄低、中、高剂量组( o 5 9 k g 、l g k g 、2 9 k g 。1 ) 。酶促牛 黄组每日灌胃给药1 次，连续给药3 天：生理盐水组连续3 天同法灌胃等容量生 理盐水：p b s 组第l 、2 天灌胃等容量生理盐水，第3 天给予p b s 。第3 次给药后 l h ，各组小鼠均用药前同样的刺激参数对小鼠逐一进行电刺激。 3 2 4 观察方法观察电刺激后各组小鼠的行为变化，记录各组出现惊厥动物 数。记录小鼠出现阵挛性惊厥时的电压值，作为小鼠惊厥阈值。 4 镇痛实验 4 1 醋酸( c a ) 致小鼠疼痛扭体实验【1 9 l 4 1 1 分组与给药昆明种小鼠6 0 只，早6 各半，体重2 0 - 2 2 9 ，按性别随机 分为6 组，每组1 0 只。分别为生理盐水( n s ) 组、阿司匹林组( o 0 4 9 k g 。) 、天 然牛黄组( 1 9 k g 1 ) 、酶促牛黄低、中、高剂量组( ( 0 5 9 k g 、l g k g 、2 9 k g 。1 ) 。 阿司匹林组、天然牛黄组和酶促牛黄组每同灌胃给药1 次，连续3 天：生理盐水 组连续3 天同法灌胃等容量生理盐水。第3 次给药后0 5 h ，各组小鼠均腹腔注射 6 m g 。m l 一醋酸0 2 m l 只。 4 1 2 观察方法观察注射醋酸后各组小鼠的行为变化，记录1 5 分钟内出现扭 体反应的小鼠数量和每只小鼠的扭体次数，并且计算各用药组的镇痛率。 4 2 光辐射致小鼠疼痛甩尾实验f 1 9 1 4 2 1 分组与给药取禁食1 2 h 小鼠，以甩尾反应为指标，用光热测痛仪测定 痛阈值，取三次重复测定的平均值作为基础痛阈值。选择基础阈值为5 1 0 s 的小 鼠6 0 只，早6 各半，体重2 0 2 4 9 ，按性别和体重随机分为6 组，每组1 0 只。分 别为生理盐水( n s ) 组、阿司匹林组( 0 0 4 9 k g 一) 、天然牛黄组( 1 9 k g 一) 、酶促 牛黄低、中、高剂量组( ( o 5 9 k g 一、l g k g 、2 9 k g 。) 。阿司匹林组、天然牛黄组 和酶促牛黄组每日灌胃给药1 次，连续3 天：生理盐水组连续3 天同法灌胃等容 量生理盐水。第3 次给药后o 5 h 、1 h 光辐射小鼠尾端。 4 2 2 观察方法观察光辐射后各组小鼠行为变化，以小鼠出现甩尾反应的时 程作为痛闽值，记录各组小鼠的痛阈值。当小鼠痛阈升高到3 0 s 不出现甩尾反应 时，以3 0 s 计算痛阈值。 5 抗炎实验i 6 l 5 1 二甲苯( d m b ) 致小鼠耳廓炎性肿胀实验 5 1 1 分组与给药取昆明种小鼠6 0 只，早6 各半，体重2 0 - - 一2 2 9 ，按性别随 机分为6 组，每组1 0 只。分别为生理盐水( n s ) 组、阿司匹林组( 0 0 4 9 k g 一) 、 天然牛黄组( 1 9 k g 。) 、酶促牛黄低、中、高剂量组( ( q 5 9 k 分1 、1 9 k g 、2 9 k g 。1 _ ) 。 阿司匹林组、天然牛黄组和酶促牛黄组每日灌胃给药1 次，连续3 天：生理盐水 组连续3 天同法灌胃等容量生理盐水。第3 次给药后o 5 h ，各组小鼠均右耳涂上 2 0 u l 二甲苯致炎( 正、反两面各1 0 u 1 ) 。 5 1 2 观察方法致炎后o 5 h 处死小鼠，参照小鼠耳廓致炎部位，于两耳同一 部位用8 m m 打孔器冲下耳片，精密称重。以两耳片质量之差为其肿胀度，并计算 炎症抑制率。 肿胀度= 小鼠右耳片质量一小鼠左耳片质量 1 4 抑制率= 模型对照组平均肿胀度一受试药组平均肿胀度模型对照组平均肿 胀度1 0 0 5 2 角叉菜胶( c g n ) 致小鼠足趾炎性肿胀实验 5 2 1 分组与给药取昆明种小鼠6 0 只，早6 各半，体重2 0 2 2 9 ，按性别和 体重随机分为6 组每组1 0 足分别为生理盐水( n s ) 缌阿司匹林组( 0 0 4 9 k g 一) 、 天然牛黄组( 1 9 k g 1 ) 、酶促牛黄低、中、高剂量组( ( 0 5 9 k g 、1 9 k g 、2 9 k g ) 。 阿司匹林组、天然牛黄组和酶促牛黄组每同灌胃给药1 次，连续3 天；生理盐水 组连续3 天同法灌胃等容量生理盐水。第3 次给药后o 5 h ，于每只小鼠左后肢足 跖皮下注射1 角叉菜胶o 0 2 m l 只致炎。 5 2 2 观察方法于致炎后1 h 、2 h 、3 h 、4 h 、5 h 用y l s 一7 b 足趾容积测量仪分 别测定各组小鼠两后肢足趾体积，以左右足趾体积之差作为肿胀度，并计算炎症 抑制率。肿胀度= 小鼠左后肢足趾体积一小鼠右后肢足趾体积 炎症抑制率= 模型对照组平均肿胀度一用药组平均肿胀度模型对照组平均肿 胀度1 0 0 。 6 小鼠抗缺氧能力实验 6 1 正常小鼠抗缺氧能力实验 6 1 1 分组与给药取昆明种小鼠5 0 只，早6 各半，体重2 0 - - 2 4 9 ，按性别和 体重随机分为5 组，每组l o 只。分别为生理盐水( n s ) 组、普萘洛尔( p r o ) 组 ( o 0 2 9 k g 。1 ) 、酶促牛黄低、中、高剂量组( ( o 5 9 k 9 1 、1 9 k g 、2 9 k g 。1 ) 。普萘洛 尔组、酶促牛黄组每日灌胃给药1 次，连续3 天：生理盐水组连续3 天同法灌胃 等容量生理盐水。 6 1 2 观察方法第3 次给药后o 5 h ，用一测定小鼠耗氧量的特定装置啪测量 小鼠5 m i n , 1 0 m i n , 1 5 m i n , 2 0 m i n , 2 5 m i m3 0 m i n 内的累积耗氧旦、0 - 5 m i n , 5 1 0 m i n , 1 0 1 5 m i n 、1 5 2 0 m i n 、2 0 3 0 m i n 各时间段耗氧量及小鼠存活时间，记录实验所得 资料。 6 2 异丙基肾上腺素( i s o ) 致心肌缺氧小鼠抗缺氧能力实验 6 2 1 分组与给药取昆明种小鼠6 0 只，早6 各半，体重2 0 - - , 2 4 9 ，按性别和 体重随机分为6 组，每组1 0 只。分别n s 组、模型对照组、普萘洛尔( o 0 2 9 k g j ) 组、酶促牛黄低剂量组( 0 5 9 k g 。) 、酶促牛黄中剂量组( 1g k g 1 ) 、酶促牛黄高剂量组 ( 2 9 k g - i ) 。酶促牛黄组和普萘洛尔组每日给药1 次，连续3 天；n s 组和模型对照 组连续3 天同法灌胃等体积的生理盐水。末次给药后0 5 h ，除n s 组腹腔注射等体 积( o 1 m l 1 0 9 ) 的生理盐水外，其余各组小鼠均腹腔注射异丙基肾上腺素 ( i s o ) o 0 2 9 。k g 。 6 2 2 观察方法腹腔注射i s 0 2 0 m i n 后，用- - n 定小鼠耗氧量的特定装置垃叭 测量各组小鼠5 m i n 、1 0 m i n 、1 5 m i n 、2 0 m i n 、2 5 m i n 、3 0 m i n 内的累积耗氧量、存 活时间、死亡时的耗氧量，并计算剩余氧量，记录实验所得资料。 7 统计学方法 实验资料采用s p s s l 0 0 统计软件进行分析。量反应资料用均数4 - 标准差 ( x + s ) 表示，多组问均数比较采用单因素方差分析；质反应资料采用x 2 检验。 检验水平以p 0 0 5 为有统计学意义。 1 6 结果 1 酶促牛黄和天然牛黄对小鼠自主活动的抑制作用 药前各组小鼠自主活动情况表明，小鼠个体间存在一定差异。给药后3 0 m i n ， 生理盐水及各给药组小鼠的自主活动均有所减少，提示各组小鼠经历药i ，j 测定操 作后，对环境的探究行为减弱。与生理盐水组比较，酶促牛黄、天然牛黄和地西 泮均明显减少小鼠自主活动( p o 0 1 ) ，表明3 种药物均具有镇静作用。其中，地 西泮和天然牛黄的作用较强，酶促牛黄作用较弱。结果见表l 、图l 和图2 。 表l 酶促牛黄和天然牛黄对小鼠自主活动的抑制作用( x = k s ，n = 1 0 ) 组别 自主活动计数( 次5 m i n j )自主活动减少率 药前药后3 0 m i n ( ) d z p2 5m gk g 1 18 0 士4 43 9 - a ：3 7 7 8 3 n c b1 0g k g 。1 4 6 + 4 14 3 士5 3 7 0 5 c b c g0 5g k g 11 8 5 + 4 7 8 4 + 3 1 5 4 6