（分析化学专业论文）新型bodipy类荧光染料的设计、合成及表征.pdf

独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。掘我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得( 注：如没有其他需要特别声 明的，本栏可空) 或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对 本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学雠文储躲彤之 导师粹 学位论文版权使用授权书 名扒以 t ， 本学位论文作者完全了解堂撞有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阕。本人授权堂 盟可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名? 7 毒痞1 l 导师签字： 6 签字同期： z 。叼年6 月灿 1 7 时，荧光素的寿命基本保持不变，约为4 6 51 1 s 。 有其它物质添加到荧光素溶液中时，只会轻微地减小荧光寿命。 荧光素可以用在生物疾病检测中。将荧光素标记到患流行性感冒的雪貂呼吸 道上皮细胞中的抗体上，被传染的细胞具有非常强的荧光。经过荧光素标记研究， 流感a 病毒三个种类之间存在交叉反应，水溶性的抗原是这种传染病罪魁祸首 1 4 3 。荧光素可以用来标记d n a 。k u m k e 等报道了荧光素标记的d n a ，然后用荧 光各向异性谱检测1 。首先将标记的d n a 单链与被检测的d n a 单链形成一个 d n a 双链，被杂交的d n a 双链与e c o r i 抑制酶复合，使荧光强度增强，有利于提 高检测d n a 的灵敏度。 荧光素的n n 二羧甲基氨甲基的衍生物可用来检测生物样品中的碱土金属、 山东师范大学硕士学位论文 铝离子、钴离子、铜离子、镍离子和锌离子【4 5 】。荧光素也可对阴离子进行检测。 龚波林等报道了荧光素荧光淬灭法测定微量的碘酸根f 4 6 l 。在0 0 5m o l lh 2 s 0 4 介 质中，碘离子和碘酸根离子反应生成了碘，碘与荧光素反应，使荧光素荧光淬灭。 该体系的激发波长和发射波长分别为4 9 3n l n 和5 1 4n l n 。碘酸根含量在2 8 0g g l 范围内有良好的线性关系，检出限为2 0p g ，l 。贾秀莲等报道了了用无色荧光素 钠一荧光法测定水中的痕量氰化物1 4 7 1 ，在p h 值为9 0 的硼酸盐缓冲溶液中，有铜离 子存在下，利用无色荧光素钠测定了水中的痕量氰化物。该方法简单、快速、灵 敏度高。荧光素也用于对大气中污染物的检测。李学强等报道了荧光素荧光法测 定大气中s 0 2 1 4 8 】，该方法是一种间接测定大气中s 0 2 的方法。在p h = 5 5 7 5 中性缓 冲介质中，1 2 与荧光素反应，使荧光素的荧光淬灭。s 0 2 用氢氧化钠溶液吸收生成 y s 0 3 。当加人s 0 3 2 。时，s 0 3 2 与1 2 反应使体系荧光增强。同样，采用间接荧光 方法测定环境样品中微量a s 3 + 1 4 9 ，在p h = 5 5 7 5 中性缓冲介质中，1 2 与二氯荧光 素反应，使二氯荧光素的荧光淬灭。当加人a s 3 + 与1 2 反应，使体系荧光增强。这 种方法灵敏度高，选择性好，操作简便，体系荧光稳定，测定线性范围宽，成功 地用于工业废水和河水中微量a s ”的测定。 荧光素聪苯氧羧酸杀虫荆进行衍生化，衍生化的产物用电动色谱进行分离， 然后激光诱导荧光进行检测1 5 们。这种方法经过改进，不仅可检测苯氧羧酸，还 可检测荧光素衍生化的其他物质。 异硫氰酸荧光素也可以用于对抗生物素蛋白和生物素的检测。m o h a m m a d 等 采用异硫氰酸荧光素来标记生物素，然后利用抗生物素蛋白和生物素之间进行免 疫反应，最后用荧光分光光度法进行检测【5 ”。同样，异硫氰酸荧光素被用作镇 静安眠剂的荧光标记物。不同表面活性剂如十二烷氯化铵、十二烷基三甲基氯化 铵、十六烷基三甲基氯化铵、十四烷基三甲基溴化铵等形成的胶束对异硫氰酸荧 光素标记的镇静安眠剂的荧光强度、最大发射波长和寿命都有影响 5 2 】。 一种高灵敏的荧光传感器是基于异硫氰酸荧光素标记氨基酸然后用毛细管 电泳分离发展起来的【5 3 1 。这种传感器是由激光、聚焦透镜、样品池、光聚焦系 统、单色器和光电倍增管组成。设计这种传感器是基于两个原则：一是简单，可 以降低成本，提高可靠性。二是能够尽可能检测到荧光产生的光子，同时减少背 景光强度。这种传感器对异硫氰酸荧光素标记的半胱氨酸的检出限为1 3 1 0 。2 山东师范大学硕士学位论文 m o l l 。在此基础上，对1 7 种异硫氰酸荧光索的氨基酸进行检测，只需要1 3 5m i n 。 检出限可达6 0 0 分子睁。 异硫氰酸荧光素还被用于对蛋白质的标记。r e i f 等报道了异硫氰酸荧光素标 记的蛋白质g 作为亲和剂用于亲和免疫毛细管电泳荧光检测【盯i 。通过异硫氰酸 荧光素标记的蛋白质g 和抗体之间的亲和反应，把荧光探针标记到人血清中的抗 体上。这种复合物用毛细管区域电泳分离检测仅需1 分钟。这种快速测定可以防 止在检测过程中复合物分解。 荧光素十八烷基酯可以作用光纤荧光传感器检测醇类的荧光探针【5 “，将亲 脂性的荧光素十八烷基酯荧光试剂固定在p v c 膜上，形成一种光极膜。这种传感 器检测醇类的响应机理是，荧光素十八烷基酯和醇类分子之间形成了氢键，增加 了相对荧光强度。荧光素烷基酯同样可用于对羧酸的检测【5 7 1 。可作为荧光探针 的荧光素烷基酯有荧光素十八烷基酯、荧光素十六烷基酯、荧光素十二烷基酯、 荧光素癸基酯等。光极膜好坏直接影响检测效果。将3m g 的荧光素烷基酯，5 0m g 的p v c 和1 0 0m g 的邻苯二甲酸- - 2 - - 乙基已基酯的混和物溶于2m l 的新蒸的吼， 氢呋喃中。取0 1m l 的混和液滴g u l 2m n l 石英片上旋涂。得到4 “m 厚的光极膜。 这种光极膜通过螺丝拧到光纤头上。即可制成荧光化学光纤传感器。这种传感器 可以对甲酸、乙酸、丙酸、异丁酸、己酸进行检测。 二氧荧光素结合氯化十六烷基吡啶f 5 s l ，在实验中对溶液酸度、表面活性剂、 荧光试剂的用量等进行优化，并用此方法对模拟样品进行了分析。 5 溴甲基荧光素同样也被用作荧光探针。m u k h e r j e e 等报道了5 溴甲基荧光素 对生物样品中的胆甾醇丁酸进行衍生化，衍生化的产物用高效液相色谱分离，然 后用激光诱导荧光检测【5 ”。 总之，荧光素及其衍生物在生物领域中的研究占有极其重要的位置，一直是 化学及生物分析领域中研究的热点。 1 4 罗丹明类荧光染料及其应用 罗丹明衍生物和荧光素属于同一类的化合物，常见的罗丹明衍生物由罗丹明 6 g 、罗丹明b 、异硫氰酸罗丹明、罗丹明g 、高氯酸罗丹明6 g 、罗丹明1 0 1 等。 罗丹明类化合物是以氧杂蒽为母体的碱性染料，与其它常用的荧光染料相比，罗 山东师范大学硕士学位论文 月明类荧光染料具有光稳定性好、对p h 不敏感、较宽的波长范围和较高的荧光 量子产率等优点，因此被广泛应用在药理学、生理学、分子生物学、细胞生物学、 分予遗传学、环境化学、单个分子检测、信息科学、荧光标记、激光染料等方面 6 0 , 6 1 6 2 , 6 3 彤, 6 5 1 ，是分析化学和生物医药科学等生物技术领域中最常用的荧光染料 之一。 罗丹明类荧光染料也是目前常用作荧光标记的化合物，其基本的结构如下： 罗丹明6 g 的荧光寿命在纳秒级惭】。其实验在甲醇溶液中进行，这是因为甲醇对 激光的发射波长是透明的，而且对荧光发射也是透明的，另外，甲醇对罗丹明6 g 具有很好的溶解性，可以得到清彻透明的溶液。校正自吸作用后，罗丹明6 0 的 荧光寿命随着浓度增加而减小，在2 x 1 0 4 m o f l 时，为3 7n s 。当罗丹明6 g 浓度大 于1 0 - 2 m o l l 时，荧光寿命迅速降低，主要因为能量转移到双分子罗丹明6 g 熄灭 中心了。熄灭中心的寿命约为1 0 土0 5p s i t 6 7 。如果流动状态下，罗丹明6 g 荧光 寿命为4 2 土0 2n s 6 8 】。 荧光量子产率是衡量荧光物质荧光量的尺度，有分析应用价值的荧光化合物 其值常处于0 1 1 0 之间。荧光量子产率指荧光物质吸光后所发射的荧光的光子数 与所吸收的激发光的光子数之比值，可通过测量待测荧光物质和已知量子产率的 参比荧光物质两者的稀溶液在同样激发条件下积分荧光强度( 即校正荧光光谱所 包括的面积) 和在该激发波长的吸光度加以计算得到。罗丹明b 和罗丹明1 0 1 可作 荧光量子产率的参考物质咿】。在所有温度下罗丹明1 0 1 的荧光量子产率几乎为 1 0 ，因为罗丹明1 0 1 具有较稳定的刚性结构。经过校正，在温度低于2 0 0 k 时， 罗月明b 的荧光量子产率几乎为1 0 ，但在室温下，罗丹明b 的荧光量子产率小于 或等于0 ，5 。虽然荧光量子产率有了大概的值，但仍需可靠的荧光量子产率数值。 在室温下，k u b i n 口o j 等研究了在0 5m o l l 的硫酸介质中罗丹明类化合物的荧光量 山东师范夫学顽l ：学位论文 子产率。具体的结果为罗丹明6 g ( 0 9 5 ) ，罗丹明b ( o 6 5 ) ，罗丹明3 b ( 0 4 5 ) ，罗丹 明1 9 ( o 9 5 ) ，罗丹明1 0 1 ( o 9 6 ) ，罗丹明1 1 0 ( o 9 2 ) ，罗丹明1 2 3 ( 0 9 0 ) 。 未知物质的荧光量子产率可用下列进行计算： 铋瓯每舞 式中吼为待测末知样品的量子产率；呶为标准物质的荧光量子产率；f u ，f s 为待测样、标准物稀溶液的积分荧光强度：a u 、a s 为待测样、标准物在激发波 长的最大吸光度值。 近几年关于罗丹明的合成以及应用的研究工作屡见报道。t e t s u o 7 1 , 7 2 , 7 3 , ) 首 先用乙酸酐酰化2 ，3 一二甲基一6 一硝基苯氨，用高锰酸钾将3 乙酰氨_ 4 一硝基二 甲苯氧化成3 一乙酰氨4 一硝基邻苯二甲酸，脱水后与间氨基苯酚类衍生物缩合 得到两种异构体，将硝基用硫化钠方法还原，合成了含二氨基取代的罗丹明这类 衍生物与n o 反应得到的荧光化合物经长波激发光照射后可以释放很强的荧光， 检测时不受细胞背景荧光的影响，在酸性环境下其荧光强度基本保持不变。 v i r g i n i e 7 4 壤初用罗丹明b 与肼反应合成的罗丹明b 酰肼( r b h ) 是为了测量 水中c u 2 + 含量。t h o m a s 等【7 5 1 发现r b h i 丕可用于检测一氧化氮和亚硝酸根，敏感度 极高。机理可以解释为，r b h 在酸性条件下遇亚硝酸根后开环，由无色转变为有 荧光。而y a n g t 7 6 】发现r b h 还可以有效地检测过氧化亚硝酸根。 r i b o u t 7 7 1 合成出了一种测定活细胞线粒体中氧浓度的新型探针：( 1 一芘丁 基) - 2 - 罗丹明酯。方法是将1 一芘基丁酸( p b a ) 用l i a i h 4 ，还原成1 芘基丁醇( p b ) ， 在缩合剂d c c 作用下与罗丹明1 1 0 成酯( p r e ) 。他们还通过实验研究了p r e 的荧 光性质，证明了p r e 在活细胞中的荧光寿命对氧浓度敏感，罗丹明与芘间的能量 传递与环境有关。 近年报道的新型罗丹明类荧光染料，主要是通过增加分子共平面性、结构刚 性以及分子二电子共扼体系来提高荧光效率并使荧光红移。在芳环上引入取代基 以改变荧光的光量子产率和发射波长，这些结构上的修饰弥补了罗丹明的某些功 能缺陷，使其具有了更高灵敏度、更高选择性和可靠性，更加有利于分析检测。 随着合成及应用技术的不断进步，研制高荧光量子产率、结构高度刚化、高稳定 性和超高灵敏度的复杂杂环罗丹明类荧光染料仍然是该领域的重要研究方向。开 6 山东师范丈学硕士学位论文 发多发色团的罗丹明荧光染料，通过不同性质的官能团接人，从中发现规律性， 根掘这些规律设计合成并筛选出性能优异的罗丹明衍生物将是今后罗丹明研究 工作的重点之一。 1 5 方酸菁类荧光染料及其应用 方酸菁染料是由方酸或其酯与富电子基团发生缩合反应丽得l ，3 一二取代衍 生物，取代衍生物通常是毗咯、吲哚、苯胺等基团。方酸菁上存在的方酸环残基 使其最大吸收波长和发射波长向长波方向移动，并可以增加其富电子性，稳定方 酸菁结构。对称性方酸菁的代表性结构如下【7 s ，7 9 , 8 0 j r 2 方酸菁探针分子的对称性对光谱性质有较大的影响，随分子不对称性的增 加，吸收峰半宽度变宽。在不同的试剂中，方酸菁染料的发射光谱的位移并不明 显，但不对称方酸菁染料则可显示出一定的对负向溶致变色性能，同时溶剂对 方酸菁染料的荧光量子产率影响较为明显。方酸菁染料对牛血清蛋白( b s a ) 有很 高的亲和性 豫8 0 1 。o z i n s k a s ( 8 0 肄报道了一种方酸菁衍生物和b s a 结合后，荧光寿 命为自由状态的3 1 倍、荧光强度为2 8 倍，量子产率也有较大的提高。在上图结构 中，当x = y = c ( c h 3 ) 2 ，r 2 = r 4 = h ，r l = r ：c 2 h 5 时，此荧光探针量子产率在异丙酸中 为0 0 9 ，与b s a 结合后，其值变为0 7 0 ，提高了九倍多。许多荧光探针与蛋白质结 合后，当染料蛋白质超过一定比率时，量子产率会降低，这是因为浓度高导致 荧光猝灭的缘故，其机制有待进一步探讨。 1 6 噻嗪类和嗯嗪类荧光染料及其应用 噻嗪类和嚼嗪类近红外荧光探针具有合成比