（微生物学专业论文）分子标记辅助改良03s的稻瘟病和褐飞虱抗性.pdf

福建师范大学邹声浩硕士学位论文 关键词：水稻，稻瘟病，褐飞虱，标记辅助选择，背景选择 a b s t r a c t a b s t r a c t j i i f l lli iil l lll p i f l l l l f f l l l l i y 18 0 6 8 7 5 b l a s ta n db r o w np l a n t h o p p e ra r ed e s t r u c t i v et ot h eg r o w t ho fr i c e ，r e s u l t i n gi ng r e a t l o s so fc r o pe v e r yy e a r b r e e d i n ga n dp l a n t i n gt h ed e ec u l t i v a r sw i t hr e s i s t a n c e st ob l a s t a n db r o w np l a n t h o p p e ri ss i g n i f i c a t i v e ，n o to n l yt ot h er i c ep r o d u c t i o nb u ta l s ot ot h e p r o t e c t i o no fe n v i o r o m e n t b u tt h ec o n v e n t i o n a lb r e e d i n gf o rd e v e l o p i n gr i c ec u l t i v a r s w i t hr e s i s t a n c e st ob l a s ta n db r o w np l a n t h o p p e ri sv e r yd i f f i c u l tb e c a u s eo ft i m e c o n s u m i n ga n dc o s t m a r k e ra s s i s t e ds e l e c t i o n ( m a s ) g i v e s an e ww a yt od e v e l o pt h e r i c er e s i s t a n tt od i s e a s e sa n dp e s t s ，o w i n gt oi t se f f e c t i v e n e s st oi d e n t i f yt h ed i s e a s e sa n d p e s t i nt h i st h e s i s ，w er e p o r t e dt h a tt h er e s i s t a n c e so f 0 3st ob l a s ta n db r o w np l a n t h o p p e r w a si m p r o v e db ym a s t h er e c u r r e n tp a r e n t0 3 sw a sc r o s s e dw i t ht h e b l a s tr e s i s t a n c ed o n o rp a r e n t s c a r r y i n gp i d 2a n dr f 4 8c a r r y i n gp i 9a n db a c k c r o s s e dt o c o n s t r u c tt h eb a c k c r o s s i n t r o g r e s s i o nl i n e sf o rs e l e c t i n gn e w l i n e sw i t hb o t hr e s i s t a n c e st ob l a s ta n dt h eg e n e t i c a l b a c k g r o u n ds i m i l a rt ot h e0 3 s t h em o l e c u l a rm a r k e rr m 3w a su s e dt os e l e c tt h eb l a s t r e s i s t a n c eg e n ep i d 2i nt h eb a c k c r o s sb c 2 f1p o p u l a t i o nd e r i v e df r o m0 3sw i t hf u y i b ，t h e b e s ta c c u r a t er a t ei s9 5 2 4 f o rs e l e c t i o n t h em a r k e r so fa p 5 6 5 9 - 5a n da p 5 9 3 0w e r e u s e dt os e l e c tt h eb l a s tr e s i s t a n c eg e n ep f 9i nm eb a c k c r o s sb c 2 f ip o p u l a t i o nd e r i v e d f r o m0 3 sw i t hr f 4 8 t h er e s u l t ss h o wt h es e l e c t i n ga c c u r a t er a t ei s 10 0 a n dm u c h b e t t e rt h a nu s i n gt h em a r k e rp b 8 a m o n g2 2 0s s rm a r k e r sc o v e r i n g1 2c h r o m s o m e s ，5 5 s s rm a r k e r sw e r ed e t e c t e dh a v i n gp o l y m o r p h i s mb e t w e e n0 3 sa n df u y i b ，t h e nt h e5 5 m a r k e r sw e r eu s e dt oa n a l y s et h eb a c k g r o u n dr e c o v e r yr a t e so ft h er e s i s t a n tl i n e sd e r i v e d f r o mt h eb c 3 f lp o p u l a t i o n a m o n gt h es e l e c t e dl i n e s ，t h em a x i m u mo ft h eb a c k g r o u n d r e c o v e r yr a t e si s9 6 4 0 t oi m p r o v et h er e s i s t a n c eo f0 3 st ob r o w np l a n t h o p p e r , s s rm a r k e r sr m 5 7 0a n d m s 5l i n k i n g c l o s e l yt ob r o w np l a n t h o p p e rr e s i s t a n c eg e n e so fb p h l 4a n db p h l 5 r e s p e c t i v e l yw e r eu s e dt os e l e c tt h er e s i s t a n tg e n e si nt h eb a c k c r o s sp o p u l a t i o n sd e r i v e d f r o mb 5 ( c a r r y i n gt h eb r o w np l a n t h o p p e rr e s i s t a n c eg e n eb p h l 4a n db p h l 5 ) a n d0 3 s ( t h e r e c u r r e n tp a r e n t ) 4 8o u to f2 2 0s s rm a r k e r sc o v e r i n g12c h r o m s o m e sw e r ed e t e c t e d h a v i n gp o l y m o r p h i s mb e t w e e n0 3 sa n df u y i b ，t h em a r k e r sw e r eu s e dt oa n a l y s et h e b a c k g r o u n dr e c o v e r yr a t e so ft h er e s i s t a n tl i n e sd e r i v e df r o mt h eb c s f ip o p u l a t i o n i i i | l r 福建师范大学邹声浩硕士学位论文 a m o n g t h es e l e c t e dl i n e s ，t h em a x i m u mo ft h e b a c k g r o u n dr e c o v e r yr a t e si s9 6 4 0 t h e e x p e r i m e n tr e s u l t ss h o w i n gt h a tt h eb a c k g r o u n dr e c o v e r yr a t e so ft h e4 2r e s i s t a n t i n d i v i d u a l sd e r i v e df r o mb c 3 f is u b p o p u l a t i o n sv a r yf r o m81 2 0 t o10 0 ，w i t ht h e a v e r a g eo f9 3 16 m u c hh i g h e rt h a nt h et h e o r e t i c a lv a l u e8 7 5 b a c k g r o u n ds e l e c t i o n c a l la c c e l e r a t e st h er e c o v e r yo ft h eb a c k g r o u n d so ft h el i n e ss e l e c t e df o rr e s i s t a n c e ，s a v e t i m ea n de n h a n c et h ee f f i c i e n c yf o rb r e e d i n g k e y w o r d s ：r i c e ( o r y z as a g v al ) ，b l a s t ， b r o w np l a n t h o p p e r ,m a r k e r - a s s i s t e d s e l e c t o n ，b a c k g r o u n ds e l e c t i o n i v 1j， 中文文摘 中文文摘 稻瘟病菌是一种病原真菌，可在水稻的不同生长阶段进行侵染，由此而引起的 稻瘟病严重阻碍了水稻正常生长，在发病严重的年份可造成水稻大幅减产甚至失收。 褐飞虱是水稻最主要的虫害，它通过刺吸水稻叶鞘韧皮部，产卵以及刺吸伤口致使 水稻感染病菌而严重危害水稻生长。通过化学方法适时防治虽然可有一定效果，但 是不但增加成本和劳力，而且化学药剂易产生大量残留，严重污染环境，影响人们 的健康，同时，由于长期使用化学药剂，不仅会引起病虫害的耐药性，而且对生态 平衡( 天敌) 也造成破坏，导致病虫害的再度爆发。利用水稻中的抗病虫害有利基 因，培育和种植抗病虫害品种是预防病虫害最有效、经济的方法。而通过分子标记 辅助技术，聚合抗病虫害有利基因可能是解决以上问题的最好途径。 水稻两系不育系0 3 s ，是广占6 3 s 的选系，也是两优0 3 6 的不育系，而广占6 3 s 及其选系配制的两系杂交稻扬两优6 号、丰两优l 号等组合是目前正在大面积推广 的几个杂交稻组合，但其抗稻瘟病和褐飞虱的能力都较弱，限制这些组合更大范围 的应用。本研究利用回交导入法，将抗稻瘟病基因p i 9 ，p i d 2 ，抗褐飞虱基因b p h l 4 ， b p h l 5 导入到不育系0 3 s 中，通过分子标记辅助选择技术，对抗性基因进行前景选 择和基因组的遗传背景选择，选择与0 3 s 表现型相似的单株，改良0 3 s 的抗稻瘟病 和抗褐飞虱能力。 在抗稻瘟病改良中，本研究利用分子标记r m 3 对水稻品种福伊b ( 含抗稻瘟病 基因p i d 2 ) 与两系不育系0 3 s 的回交群体b c 2 f l 进行标记辅助选择，结果表明分子 标记辅助选择的准确率达9 5 2 4 。同时，我们还采用分子标记a p 5 6 5 9 5 、a p 5 9 3 0 和p b 8 对r f 4 8 ( 携带有抗稻瘟病基因p i 9 ) 与0 3 s 的回交群体b c 2 f l 进行标记辅助 选择，结果表明a p 5 6 5 9 5 、a p 5 9 3 0 这两个标记比此前普遍应用于选择抗稻瘟病基 因p i 9 的标记p b 8 具有更高的精确度，抗性验证的结果和标记选择的结果相同，选 择准确度几近1 0 0 。对于遗传背景的选择，采用了2 2 0 个较均匀分布于全基因组 1 2 条染色体的s s r 标记分析了亲本0 3 s 和福伊b 间的多态性，共有5 5 个s s r 标 记表现出多态性，多态性的比例为2 5 ，并利用这5 5 个s s r 标记，分析了回交后 代相对于轮回亲本0 3 s 的背景恢复率，结果表明在b c 3 f l 中，单株的背景恢复率最 v r l r 福建师范大学邹声浩硕士学位论文 高可达9 6 4 0 。 在褐飞虱抗性改良中，分别采用了与抗褐飞虱基因b p h l 4 ，s p h l 5 紧密连锁的 s s r 标记r m 5 7 0 、m s 5 对0 3 s 与b 5 三个世代的回交群体b c l f l 、b c 2 f l 、b c 3 f l 的抗褐飞虱基因b p h l 4 ，b p h l 5 进行标记辅助前景选择。采用了2 2 0 个较均匀分布 于全基因组的s s r 标记分析了亲本0 3 s 和b 5 间的多态性，共发现4 8 个s s r 标记 表现出多态性，多态性比例达2 1 8 ，并利用这4 8 个s s r 标记，分析了回交后代 相对于轮回亲本0 3 s 的背景恢复率，结果表明在1 4 个b c 3 f l 群体的4 2 个单株中， 背景恢复率变化范围为8 1 2 0 1 0 0 ，平均值为9 3 1 6 ，也明显高于理论值8 7 5 ， 通过背景恢复率的选择可加速抗性单株的恢复，与轮回亲本更相似，提高育种效率。 同时，研究还发现前景选择对背景选择有一定的影响，在背景选择中，前景选择所 筛选目标基因的附近区域是比较难以恢复的区域，前景选择对背景选择是有影响的。 v i 1一 目录 目录 摘要。i j l 】e i ；t r a c t i i i 中文文摘v 目j 5 ：v i i 绪论1 1 1 分子标记及其应用1 1 1 1 分子标记简介1 1 1 2 分子标记的应用。4 1 2 分子标记辅助选择在水稻育种中的作用5 1 2 1 单个基因的分子标记辅助选择。6 1 2 2 多基因聚合6 1 2 3 背景选择7 1 3 水稻抗稻瘟病基因及标记辅助选择在水稻抗稻瘟病育种中的应用。7 1 3 1 稻瘟病及水稻抗稻瘟病基因。7 1 3 2 分子标记辅助选择在水稻抗稻瘟病育种中的应用1 3 1 4 水稻抗褐飞虱基因及标记辅助选择在水稻抗褐飞虱育种中的应用1 5 1 4 1 褐飞虱及水稻抗褐飞虱基因1 5 1 4 2 分子标记辅助选择在水稻抗褐飞虱育种中的应用2 l 第1 章利用分子标记辅助选择改良两系不育系0 3 s 的稻瘟病抗性2 5 第一节供试水稻材料以及稻瘟病菌株2 5 第二节实验方法。2 5 2 1 抗性群体材料的构建。2 5 2 2 提取水稻叶片d n a 2 8 2 3 辅助育种的分子标记选择2 9 2 4p c r 扩增以及制胶电泳，染色观察2 9 第三节 结果与分析3 1 v i i 福建师范大学邹声浩硕士学位论文 3 1 回交群体的抗性表现3 1 3 2 筛选抗性基因辅助选择的分子标记。3 2 3 3 分子标记辅助0 3 s 抗稻瘟病育种的背景选择结果3 6 3 4 分析讨论4 1 第2 章分子标记辅助选择改良两系不育系0 3 s 对褐飞虱的抗性4 3 第一节供试水稻材料。4 3 第二节抗性群体的构建4 3 第三节结果分析4 4 3 1 目的基因的前景选择4 4 3 2 亲本多态性分析4 6 3 3 b c l f t 、b c 2 f l 、b c 3 f l 中各选定单株的背景恢复率5 0 3 4 部分b c 3 f 2 群体的田间抗性表现和农艺性状。5 3 3 5 分析讨论。5 4 第3 章结论5 5 附录：5 7 参考文献。6 1 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果6 9 j $ c 谢7 1 个人简历7 3 v i i i 1 k i f l 绪论 1 1 分子标记及其应用 1 1 1 分子标记简介 绪论 所有生物体具有其种属特异性的特征都可开发为标记，d n a 分子标记是d n a 分子中能够反映生物种属特异性的序列特征，这种特征可以利用多种方法揭示。 分子标记的概念有广义和狭义之分，广义的分子标记是指能够在生物体中遗传 并被检测到的d n a 序列或蛋白质；狭义分子标记是生物体基因组中特异性的d n a 片 段，本文所阐述的分子标记主要是指狭义方面的内容，也即d n a 分子标记。d n a 分子标记与经典遗传学中标记具有很大的不同，多数是共显性的，因此能够区分纯 合杂合，利于对隐性形状选择，受环境影响较小，也不受个体发育阶段和组织差异 的制约，有些分子标记数量多，分布广。分子标记在绘制遗传图，比较种属亲缘关 系，定位、克隆目的基因等研究中发挥了关键性的作用【l ，2 】。 分子标记大致可以分为四类，它们是以s o u t h e r n 杂交为基础的分子标记( i 江l p ， 原位杂交) ，以p c r 为基础的分子标记( r a p d ，s t s ，a f l p ，i n d d ，s s r ，s c a r ) ， 以m r n a 为基础的分子标记( e s t ，r t - p c r ) ，以单核苷酸多态性为基础的分子标 记( s n p ) ，其中较为常用的是s s r 标记 2 】。现对其中一些较常见的标记予以介绍： 1 1 1 1限制性片段长度多态性标记( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t h p o l y m o r p h i s m ，简称r f l p 标记) 限制性片段长度多态性( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，缩写r f l p ) 技术的原理是检测d n a 在限制性内切酶酶切后形成的特殊d n a 片段的长度，因而 凡是能产生酶切位点变异的突变，例如点突变和一段d n a 序列的插入或缺失造成 酶切位点间的长度发生变化等都可造成r f l p 的产生【3 】。 r f l p 标记有如下特点：在整个基因组均有分布，而且数量几乎是无限的；不 受表型的影响，无组织、器官的特异性；为共显性标记，可区分纯合子和杂合子； 结果比较稳定、重复性好；但r f l p 也有一些缺陷，其分析对d n a 样品的纯度要 求较高，样品需求量大，且r f l p 多态信息不高，多态性程度主要依赖于限制性内 福建师范大学邹声浩硕士学位论文 切酶的种类，另外r f l p 分析技术的步骤比较繁琐，造成工作量大、成本较高，因 而其应用受到了一定的制约【3 - 5 】。 1 1 1 2染色体原位杂交 染色体原位杂交技术是以d n a 探针同染色体所包含的d n a 链杂交，并在染色 体上直接检测的分子标记技术。当前应用最多的是荧光原位杂交技术( f l u o r e s c e n c e i ns i t uh y b r i d i z a t i o n ，简称f i s h 技术) ，该技术是利用与荧光素分子偶联的单克隆抗 体与相应抗原标记的探针分子特异性的结合来检测某d n a 序列在染色体d n a 上的 位置。由于研究目的不同，染色体原位杂交的探针来源不同，例如含目的基因的b a c 和y a c 可用于转基因植物鉴定，低拷贝或单拷贝序列可用来构建染色体的物理图 谱。 1 1 1 3 随机扩增多态性d n a 标记( r a n d o ma m p l i f i c a t i o np o l y - m o r p h i s md n a ，简称r a p d 标记) 随机扩增多态性d n a ( r a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a ) 技术是建立在p c r 基础上，应用一组1 0 个左右碱基的单链随机引物，对基因组的d n a 进行p c r 扩 增，再检测产物的多态性。整个基因组中存在大量反向重复序列，每一单链随机引 物与这些反向重复序列结合，扩增反向重复序列之间的区域，引物结合位点上d n a 序列变更、引物结合位点之间脱氧核糖核苷酸的缺失、插入或置换均可致使扩增产 物数目和长度的差异，经聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离以及染色后就可以观察 d n a 片段的多态性【6 】。 r a p d 标记多态性的检测不需要制备d n a 探针，整个技术比较简便，不需应 用分子杂交和放射性自显影等技术；引物设计时不须要知道基因组序列的信息； r a p d 标记为显性遗传，极少数具有共显性，因此不能鉴别出杂合子和纯合子；检 测时d n a 样品用量少，引物价格也比较便宜，所以成本也较低；但实验重复性不 理想，常用有假阳性或假阴性结果出现，同时引物的长度和数目、扩增反应的条件 等实验技术方面还未标准化，制约了同类结果的比较；而且也不能利用该标记得到 准确的遗传距离【7 ，8 1 。s c a r 标记则是在r a p d 标记的基础上发展来的。 2 绪论 1 1 1 4 简单序列重复标记( s i m p l es e q u e n c er e p e a t ，简称s s r 标 记) 或简单序列长度多态性( s i m p l es e q u e n c el e n g t h p o l y m o r p h i s m ，简称s s l p 标记) s s r 即微卫星d n a 序列，是一类由几个( 一般为2 5 个) 单核苷酸组成的基 序( m o t i f ) 串联重复而成的d n a 序列，长度一般为2 0 0 3 0 0 b p 左右，在基因组中 广泛分布。真核生物中常见的是( g a ) n 或( a t c ) n 类型的重复，由于重复次数 的不同，因此会在不同个体基因组的相应位置上产生多态性。由于各种串联重复序 列的两端都有单拷贝的特异性序列，因此可以来设计引物，进行扩增，利用电泳分 析技术就可检测出产物的多态性。由于水稻基因组的测序完成，我们已经知道欲设 计的分子标记在水稻基因组上的位置了【1 ，9 1 ，同时水稻基因组测序的完成也促进s s r 标记的迅速发展和广泛应用。 s s r 标记的数量十分丰富，在整个基因组中广泛分布，等位性序列的变异较多， 为共显性标记，可辨别出杂合子和纯合子，同时，实验的重复性好，结果准确。但 在引物开发时，必须知道重复基序两端的专一序列，有一定困难，标记开发的成本 也较甜1 0 】。 1 1 1 5 插入缺失长度多态性( i n s e r t i o nd e l e t i o nl e n g t hp o l y m e r - p h i s m ，i n d e l ) 水稻基因组之间存在着大量的插入或是缺失多态性，在这些多态性序列两侧设 计引物，扩增产物的长度就必然产生差异，i n d e l 标记就是按照这个原理开发出来 的【1 1 1 2 】。对日本晴和9 3 1 1 的全基因组序列进行b l a s t 比较，发现每l k b 基因组 序列内存在1 7 0 个i n d e l 标记【1 3 】。i n d e l 标记长度变化比较大( 1 b p 6 4 0b p ) 其中差 异在1 2b p 的i n d e l 占5 6 ，差异小于2 0b p 的i n d e l 占9 2 ，设计i n d e l 时，应 该优先考虑多态性差异在5 2 0b p 的i n d e l ，这样设计的i n d e l 便于检测【l 3 ，1 4 】。 1 1 1 6 单核苷酸多态性( s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m ，s n p ) 单核苷酸多态性是指同一基因座的不同等位基因之间个别核苷酸的差异或很小 的插入、缺失差异等，在分子水平上对这些差异进行检测，就可区分不同个体间的 遗传物质多态性。对s n p 进行检测的最佳手段是d n a 芯片技术，伴随d n a 芯 3 福建师范大学邹声浩硕士学位论文 片技术的迅速发展，单核苷酸多态性很可能成为最重要的分子标记技术。s n p 密度 高、遗传性质稳定、多态性充分、检测和分析可实现自动化，它具有作为新一代分 子标记特有的优越性【1 5 1 7 1 。 1 1 2 分子标记的应用 1 1 2 1 构建遗传图谱 遗传图谱是研究植物基因组的结构、进化以及基因排列顺序的有力工具，同时 也是进行基因定位、基因克隆和分子标记辅助选择的重要基础【1 8 】。遗传图谱对于基 因定位的作用相当重要，遗传图谱上包含的标记数目越多，标记分布越均匀，基因 定位就能够越发精细。分子遗传图谱的密度不断趋向于饱和促使一些植物的遗传学 研究取得了重大突破，也对分子标记辅助育种选择和基因图位克隆工作的开展发挥 了强大的促进作用。到目前为止，几乎所有重要农作物的遗传图谱都己构建成功， 如水稻、小麦、大豆、玉米、棉花、油菜等，而且多种分子标记的还在不断添加到 遗传图上遗传图谱正日渐趋于饱和【1 9 珑】。 1 1 2 2 种质鉴定与遗传多样性分析 分子标记分布于整个基因组区域，数目相当庞大，选取随机分布于整个基因组 的分子标记并对其进行多态性比较，利用这些多态性的信息就能评价研究对象的亲 缘关系，进化距离等性质【2 3 1 。在这个以分子标记为基础的比较基因组研究过程中主 要应用的是聚类分析的方法，目的是探究近缘物种间的遗传同源水平，在此基础上 开展系统发育与亲缘关系的分析【2 4 。2 8 1 。 1 1 2 3 基因定位 基因定位就是利用分子标记在染色体上的位置来判断目的基因在染色体上的大 概区域，因此只要建立了相关物种的较饱和的分子遗传图谱，定位基因工作可以变 得相对容易一些。目前，已经对许多农作物的抗病、抗虫、育性等基因开展了定位 工作，获得了大量的与目的基因紧密连锁的标记，为对这些基因进行标记辅助育种 工作奠定坚实的基础【2 9 - 3 3 。分子标记技术还为多基因控制的数量性状位点即q t l 4 绪论 定位提供了行之有效的方法。q t l 的定位把决定数量性状的多个基因转化成单个的 主效基因来分析，简化了研究进程，使得研究工作具有可操作性，利于对产量、抗 性、形态等性状的研究、改赳2 0 ，3 4 1 。 1 1 2 4分子标记辅助育种 在育种工作中选择是相当重要的环节，在传统育种中普遍采用直接选择的方法， 由于受环境、观测等影响，对目的基因的选择效果很差，而且工作量往往也比较大， 育种效率低，利用该方法越来越限制了育种工作的发展。随着分子标记技术的迅速 发展，越来越多的目标基因被定位，与目标性状基因紧密连锁的分子标记可用于分 子标记辅助选择，大大地提高了选择效率，与传统育种方法即直接选择相比，有明 显的优势。首先可排除杂合的影响和消除环境的干扰；可在幼苗期检测鉴定在成熟 期才显现的性状；可对抗性等直接表型选择比较难以鉴定的的性状进行选择；可在 同一时间对数个性状进行选择，达到聚合育种的目标，完成同时改良多个目的性状 的目标；可加快回交育种的进度，准确恢复回交亲本的背景，实现远缘优良基因的 导入。分子标记辅助选择已在水稻、玉米等作物取得重大进展，如在水稻抗稻瘟病、 褐飞虱、白叶枯病育种方面取得了良好的效果。 1 2 分子标记辅助选择在水稻育种中的作用 质量性状( 主效基因控制) 分子标记辅助选择( m a sm a r k e r - a s s i s t e ds e l e c t i o n ) 的理论已经日趋完善，在农业育种实践中得到了广泛的应用，在水稻、番茄、小麦、 玉米和大豆等许多农作物中已有许多成功的报道【2 9 , 3 5 - 3 9 。然而，就数量性状的标记 而言，分子标记辅助选择的工作还主要集中在探索方面【2 0 1 。在水稻上，主效基因的 分子标记辅助选择己有相当多的报道，尤其是对抗稻瘟病和抗白叶枯基因的辅助选 择；而对数量性状进行选择的例子还是较少，主要归结于数量性状的q t l 作用相对 较小和研究比较迟，但从原理上，对主效数量性状位点进行选择则和质量性状的选 择基本上是相同的【4 0 1 。分子标记辅助选择在水稻抗性育种中的应用主要有三个方 面。 福建师范大学邹声浩硕士学位论文 1 2 1 单个基因的分子标记辅助选择 在对单个主效基因分子标记定位的基础上，就可以利用与目的基因紧密连锁的 分子标记进行辅助选择来实现单个主效基因的导入，该方面的实践已有相当多的报 道。黄廷友等( 2 0 0 3 ) 以含抗白叶枯基因x a 2 1 和x a 4 的抗病近等基因系i r b b 6 0 为供体亲本，不含抗白叶枯基因的恢复系蜀恢5 2 7 为轮回亲本，回交3 代自交l 代， 在分离世代中，利用与x a 2 1 和x a 4 紧密连锁的标记p t a 2 4 8 和m p l 2 分别对目标基 因x a 2 1 和x a 4 进行辅助选择，一直选择至b c 3 f 2 代，抗性分析表明，标记选择的 准确率分别在9 7 和8 3 以上【4 1 1 。金素娟等( 2 0 0 7 ) 以含有广谱抗稻瘟病基因只j 的籼稻材料b l l 2 2 为供体，感病温敏核不育系g d 8 s 为受体，四次回交和多次自 交，以分子标记r m l 4 4 ( 与r j 的遗传距离为6 8 c m ) 对分离世代进行辅助选择， 将r j 基因导入到g d 8 s 中，综合考虑分子标记辅助检测、田问农艺性状、以及 背景恢复率的结果，筛选得到了5 个株系。采用广东省具有代表性的菌株进行人工 接种，抗性鉴定的结果证明5 个改良株系的抗性频率在7 5 7 6 1 0 0 之间，而对照 组的抗性频率仅9 0 9 1 4 2 1 。 1 2 2 多基因聚合 多基因聚合就是将多个优良性状基因通过杂交、回交、复交等手段导入至同一 品系当中去，培育出同时具有多个优良品质的种质，是一种培育高产优质品系的途 径，某种程度上可以代替多基因转化。应用分子标记辅助选择技术在同一品种当中 聚合多个基因的实践已有不少报道，如陈红旗( 2 0 0 8 ) 等以金2 3 b 作为母本，分别 与含有竹一j 和a 一3 3 基因的品系c 1 0 1 l a c 和含有a 一2 基因的品系c 1 0 1 a 5 1 杂交， 将这两个f l 进行复交，构建出复交群体，对复交群体选用筛选到的多态性分子标记 ( 抗稻瘟病基因p f j 、r 一2 和r 一打的紧密连锁s s r 标记分别为r m 2 2 4 、r m 5 2 7 和r m 3 2 1 ) 进行标记辅助选择，结合稻瘟病菌人工接种抗性鉴定，以及农艺性状的 考察，挑选3 株农艺性状与金2 3 b 相似且带有3 个抗性基因的单株( 标记条带杂合) ， 再与金2 3 b 作母本回交一次，最后自交一次，对两个后代群体都逐株鉴定，最终获 得了一株带有3 个抗稻瘟病基因，而且位点是纯合的单株，其农艺性状和金2 3 b 几 乎相刚4 引。在燕麦方面，x m l i u 等人( 2 0 0 2 ) 利用与燕麦抗蚜虫基因d n 4 和d n 6 连锁之s s r 标记辅助筛选，将这两个基因导入到受体当中，极大的提高了受体对蚜 6 绪论 虫的抗性【删。 1 2 3 背景选择 水稻回交育种过程中，利用与目的基因紧密连锁的分子标记可以用来检测目的 基因是否存在，而分布于基因组的分子标记可以用来判断回交后代相对于轮回亲本 的背景恢复率，这样不但在后代中可筛选出了含有目标基因的单株( 前景选择) ，而 且也可以分析这部分单株的基因组其他部分由于发生回交与轮回亲本基因组的相似 性程度( 即背景选择) ，背景选择是在前景选择后的再次选择，是对回交群体中个体 基因组里除了目标基因之外的其它部分( 即遗传背景) 的选择【4 5 1 。背景选择可以选择 那些含有轮回亲本( 受体) 基因组比例较高的个体参加下一代的回交，从而加快恢 复受体遗传背景的速度【4 6 1 。背景选择有多种方法，包括图示基因型选择，基因组相 似性选择，标记评分选择，指数选择以及标记辅助b l u f ( m b l u p ) 选择，每种选择 方法有各自的特点和使用情况，如果背景选择最终的目的是要完全恢复受体的遗传 背景，基因组相似性选择或标记评分选择是最好的选择方法，它们可以使受体的遗 传背景，在回交3 个世代之后就达到9 8 以上的恢复率 4 5 , 4 6 】。水稻高密度饱和遗传 图谱的建立和基因组的测序完成，为背景选择提供了坚实基础，可供选择的标记越 多，标记分布越均匀，获得的背景恢复率的值越是准确。目前，应用此项选择技术 已经在许多作物的遗传改良已有不少成功的报道。 1 3 水稻抗稻瘟病基因及标记辅助选择在水稻抗稻瘟病育种中 的应用 1 3 1 稻瘟病及水稻抗稻瘟病基因 1 3 1 。1稻瘟病 稻瘟病是一种由真菌引起的水稻病害，又名稻热病，分布广泛，尤其以亚洲， 非洲和拉丁美洲等地较为严重。在我国南北稻作区均有发生，其对粳稻的危害程度 较籼稻重，在华南稻区早稻发病较晚稻重，其它稻区则相反，稻瘟病每年都不同程 度地发生和流行，近几年西南、长江中游和东北等稻区持续大流行，损失稻谷达数 亿公斤，给我国的粮食安全带来隐患 4 7 1 。从世界范围来看，每年因稻瘟病损失的水 7 福建师范大学邹声浩硕士学位论文 稻产量可以多养活6 千万人口【4 8 】。稻瘟病之所以成为一种如此严重的水稻病害主要 是由于其分布极广，一旦发病就难以控制，将造成大量减产，并且大量使用抗真菌 药剂也大大增加了水稻的生产成本，污染环境( 4 9 1 。 稻瘟病的病原菌是稻瘟病菌( m a g n a p o r t h eg r i s e a 有性世代，p y r i c u l a r i ag r i s e a c a v 无性世代) ，其孢子萌发、菌丝生长等生理过程对温度，湿度，光照都有一定 的要求，一般来说，在日照少，气候温和湿润的情况下利于其生长，此种条件下易 于发病，而且在水稻的整个生育期都可能感染，分别引起苗瘟，叶瘟，穗瘟，枝梗 瘟，谷粒瘟等。稻瘟病菌的孢子在萌发时细胞会从一端或是两端产生芽管，芽管的 末端会膨大成附着胞，附着胞紧贴于水稻组织表面，并从底部再长出侵染丝入侵宿 主组织，之后菌丝在宿主体内大量繁殖，造成组织坏死，最终使水稻减产，甚至颗 粒无收【5 0 1 。在宿主表面，病斑呈梭形或纺锤形，两端有向外延伸的褐色坏死线，病 斑中央灰白色称为崩溃部，边缘褐色称为坏死部，病斑外常有淡黄色晕圈称为中毒 部，湿度大时，病斑背面产生灰绿色霉层，“三部一线”是稻瘟病典型病斑的识别 要点。 1 3 1 2水稻抗稻瘟病基因 1 3 1 2 1 水稻抗稻瘟病基因的抗性 虽然稻瘟病菌的危害很严重，但是有些水稻品种却具有较强的抗病性，这主要 是因为它们自身携带了抗稻瘟病菌的基因，这些抗性基因可分为主效抗性基因和微 效抗性基因两类，也就是我们常说的质量性状基因座和数量性状基因座，多数品种 的抗性是质的即主效的抗性基斟5 1 】。主效抗性基因对稻瘟病菌的抗性具有小种专一 性，如果病原菌中的无毒基因发生变化即突变成新的菌株，抗性基因就会丧失对新 菌株的抗性，这主要是因为抗性的产生是抗性基因同稻瘟病菌中的无毒基因相互作 用的结果 5 2 5 3 】( 这种基因对基因的相互作用有直接和间接之分，直接是指二者的蛋 白产物直接结合，进而诱导后续反应，问接是指二者蛋白产物的结合还需要水稻体 内的其它蛋白的参与【5 4 1 ，之后再诱发后续抗性反应) 。而稻瘟病菌的变异是非常频 繁的，因而某些抗性水稻品种连续种植数年后就逐渐失去了抗性，就如同抗生素失 效一样。因此，如果能将对应于各种稻瘟病菌无毒基因的水稻抗性基因都聚合到同 一栽培品种中，就能培育出广谱持久抗性的优良水稻品种，对于水稻稳产、减少化 绪论 学药剂的使用量，降低生产成本，减少污染，保证粮食安全具有重要的意义。 抗稻瘟病基因的抗性可以分为完全抗性和部分抗性，是根据表型区分的，具有 部分抗性的水稻株也能被观察到稻瘟病菌引起的损伤但是较无部分抗性的感病株病 叶面积更少【5 2 1 ，而完全抗性则可使水稻株几乎无病斑。部分抗性常由多基因控制， 可能与q t l 有关，目前已发现有1 1 个已知的部分抗性是由单基因控制的的。抗稻 瘟病基因还可以分为广谱抗性和普遍抗性，广谱抗性是指是指对多个稻瘟病菌株都 有抗性，但抗菌谱一般不同，虽然抗菌谱可能会有交叉；普遍抗性是指抗性基因无 特异性，对所有稻瘟病菌株都有抗性，有许多部分抗性基因就属于普遍抗性，无菌 株特异性，但有些部分抗性基因则不然( 如p g p f 2 1 ，p i 3 4 ) ，而完全抗性都是特异的 不具有普遍抗性。 1 3 1 2 2 已定位的主效抗稻瘟病基因 到2 0 0 9 年3 月为止，总计已报道了6 0 个抗稻瘟病位点，包括了6 9 个主效基 因。这些主效抗性基因成簇地分布于3 号染色体以外的其他水稻染色体上，其中6 8 个为显性基因，1 个为隐性基因。已定位抗稻瘟病基因在水稻染色体组上分布状况 如下表( 引自国家水稻数据中心h t t p ：w w w r i c e d a t a c n g e n e g e n e _ p i h t m ) 表1 - 1已定位的主效抗稻瘟病基因 t a b l e1 - 1 m a p p e dc o m p l e t eb l a s t - r e s i s t a n c eg e n e s p i 口 p i b p i - f p i “p i 5 f p i 3 p t ，k p t k h p i k - m p f t p i t n b 9 0 0 0 2 b n 2 0 9 p 0 6 - 6 等 p 0 6 6 , c a 8 9 等 m 5 5 6 1 等 i n a8 6 1 3 7 等 v 8 6 0 l o i k 8 1 3 k 8 1 2 5 等 t e t e p k u s a b u e k 3 t s u y u a k e k 5 9 p a i k a n - t a o 等 9 s 0 4 g 0 3 与c 1 4 5 4 之间的1 7 0 k b 内 r 5 4 3 ( 2 0 c m ) r m 2 2 4 y 6 8 5 5 r a 之问的2 c m 区间 r m 2 5 4 ( 1 3 4 c m ) r