（发育生物学专业论文）人类锌指蛋白新基因znf328的克隆与功能研究.pdf

摘要 转录因子在多种细胞功能中担任了重要角色， 包括细胞生长、增 殖、 凋亡和细胞内的信号转导。 人们已经鉴定了 几个大的转录因子家 族。 在哺乳动物中， 含k r a b 结构域的 锌指蛋白 ( k r a b - z f p ) 家族是 人类基因中最大的一类转录因子，研究表明许多k r a b - z f p基因与 心脏发育以及心血管疾病都有关系。 我们从人类胚胎心脏c d n a文库 中克隆鉴定了一个锌指基因，经国际基因命名委员会批准命名为 z n f 3 2 8 。 该基因 全长4 5 1 1 b y ， 其开 放阅 读框( o r f ) 长2 3 7 6 b y ， 编码 了7 9 2 个氨基酸，在 n端含有一个k r a b框，c端含有 1 5 个c 2 h 2 型锌指。 z n f 3 2 8 由8 个外显子组成， 在基因组上跨越大约2 8 k b ， 其 中外显子6 . 7 分别编码了k r a b框的a和b框; z n f 3 2 8 位于染色 体带1 9 g 1 3 .4 上。 n o r t e rn b l o t 分析该蛋白 在大部分的 成体和胚胎组织 中都有表达。 亚细胞定位分析表明z n f 3 2 8 蛋白 定位在细胞核中。 用 g a l - 4 d n a结合系统对z n f 3 2 8 进行转录分析， 说明该基因是个转录 抑制因子，结构域分段分析表明 k r a b框起主要的抑制作用。在 c o s - 7 细胞中过表达z n f 3 2 8 抑制了s r e 和a p - 1 的转录活性， 而这 两种因子是m a p k信号途径介导的重要因子，说明z n f 3 2 8蛋白可 能在 m a p k信号途径中作为抑制因子介导细胞功能。为了观察新基 因 过 表 达 后 细 胞蛋白 质 表 达的 改 变， 构 建了p c m v t a g 2 b - z n f 3 2 8 真 核表达载体，应用脂质体转染技术， 将z n f 3 2 8 基因导入h e l a 细胞 系中，通过g 4 1 8 筛选，并经p t p c r鉴定，鉴定了 稳定表达的细胞 系。 提取稳定转染细胞的总蛋白， 采用双向凝胶电泳分离细胞蛋白质， 软件分析统计z n f 3 2 8 稳定转染细胞二维图谱的蛋白 质点， 并与转染 空载体的细胞蛋白 质点比 较， 结果表明该基因的稳定表达可导致h e l a 细胞的蛋白 质表达谱的改变。综合该基因的结构和表达特征，我 们初步得出结论认为:z n f 3 2 8 基因是参与多种人类胚胎器官发 生的锌指转录调控因子。 我们还研究了另外一个人类锌指蛋白家族新成员 z n f 3 8 2 的功能， 将其开 放阅读框克隆至p r s e t c及p e g f p - n 1 表达载 体中。诱导表达并用纯化的融合蛋白免疫家兔得到抗 z n f 3 8 2 的抗体。 w e s t e r n b l o t 结果显示这种抗体能特异地识别在原核表 达系统内表达的抗原，并对人类胚胎组织中的 z n f 3 8 2具有较 高的特异性。 关健词:转录抑制因子，m a p k信号途径，s r e , a p - 1 ，器官 发育，w e s t e r n b l o t ab s t r a c t t h e z i n c f i n g e r p r o t e i n s c o n t a i n i n g t h e k r u p p e l - a s s o c i a t e d b o x d o m a i n ( k r a b - z f p s ) a r e t h e l a r g e s t c l a s s o f t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s i n h u ma n ma n y o f t h e k r a b - z f p s h a v e b e e n f o u n d t o b e i n v o l v e d i n c a r d i a c d e v e l o p m e n t o r c a r d i o v a s c u l a r d i s e a s e s . i n t h i s s t u d y , w e h a v e i d e n t i f i e d a n o v e l h u m a n k r a b z i n c f i n g e r g e n e , n a m e d z n f 3 2 8 , fr o m a h u m a n f e t a l h e a rt c d n a l i b r a r y . t h es e q u e n c e o f z n f 3 2 8 c d n a c o n t a i n s a 2 3 7 6 - b p o p e n re a d i n g fr a m e ( o r f ) a n d e n c o d e s a 7 9 2 a m i n o a c i d p r o t e i n w i t h a n krab d o ma i n a n d c l a s s i c a l z i n c f i n g e r c 2 h z m o t i f s i n t h e c - t e r m i n u s . t h e g e n e c o n s i s t s o f 8 e x o n s , i n w h i c h e x o n s 6 a n d 7 e n c o d e t h e k r a b d o ma i n a a n d b , r e s p e c t i v e l y . z n f 3 2 8 i s l o c a t e d i n1 9 g 1 3 . 4 , g e n o m i c d n a o f a p p r o x i m a t e l y 2 8 k b . z n f 3 2 8 i s e d i n mo s t o f t h e h u m a n t i s s u e s a n a l y z e d i n d i ff e r e n t d e v e l o p m e n t a l s t a g e s , s u g g e s t i n g a p o t e n t i a l r o l e o f t h i s g e n e i n h u m a n e m b r y o n i c d e v e l o p m e n t a n d r e l a t e d d i s e a s e s . i n t h e c os - 7p r o t e i n i si n n u c l e u s . i s a t r a n s c r i p ti o nr w h e n f u s e d t o g a l - 4 d n a - b i n d i n g d o m a i n a n d c o t r a n s f e c t e d w i t h v p - 1 6 , k r a b m o t i f i s a p o t e n t r e p r e s s i o n d o m a i n . o v e r e x p r e s s i o n i n c os - 7 c e ll s i n h i b i t s t h e t r a n s c r i p t i o n a l a c t i v i t i e s o f s r e a n d a p - 1 , s u g g e s t i n g t h a t t h e p r o t e i n m a y a c t a s a t r a n s c r i p t i o n a l r e p r e s s o r i n m i t o g e n - a c t i v a t e d p r o t e i n k i n a s e ( m a p k ) s i g n a l i n g t o me d i a t e c e l l u l a r f u n c t i o n s . i n o r d e r v t o s t u d y t h e e ff e c t z n f 3 2 8 g e n e i n h e l a c e l l l i n e , t h e r e c o m b i n a n t e x p r e s s i o n p l a s m i d o f p c m v t a g 2 b - z n f 3 2 8 w a s c o n s t r u c t e d a n d i n t r o d u c e d i n t o h e l a c e l l l i n e b y l i p o f e c t i n t r a n s f e c t i o n . z n f 3 2 8 s t a b l e o v e r e x p r e s s i o n h e l a ce ll l i n e w a s e s t a b l i s h e d a n d c o n f i r m e d b y r t p c r . t o t a l p r o t e i n s w e r e e x t r a c t e d f r o m t h e s t a b l e ce l l l i n e a n d w e r e s e p a r a t e d . t h e 2 d g e l s m a p s o f cell l in e w e r e s c a n n e d a n d a n a l y z e d c o m p a r a e d w i t h t h e i r c o n t r o l r e s p e c t i v e l y . s o m e u p - r e g u l a t e d a n d d o w n r e g u l a t e d p r o t e i n s p o t s w e r e d e t e c t e d i n s t a b l e t r a n s e c t e d ce l l l i n e . a n d i n o r d e r t o s t u d y t h e f u n c t i o n o f z n f 3 8 2， a n o v e l m e m b e r o f z i n c p r o t e i n f a m i l y , t h e o r f w a s s u b c l o n e d i n t o t w o f u s i o n e x p r e s s v e c t o r s , p r s e t c a n d p e g f p - n l . a f t e r e x p r e s s i n g , t h e f u s i o n p r o t e i n s w e r e p u r i fi e d a n d u s e d t o r a b b i t s . t h e r e s u l t s h o ws t h e a n t i b o d y a g a i n s t z n f 3 8 2 h a s a g o o d s p e c i f i c i t y t o z n f 3 8 2 i n h u m a n e m b r y o b y w e s t e r n b l o t a n a l y s i s . k e y w o r d s : z n f 3 2 8 , t r a n s c r i p t i o n a l s u p p r e s s o r , m a p k s i g n a l i n g p a t h w a y , s r e , a p - 1 , o r g a n d e v e l o p m e n t , w e s t e r n b l o t bs a eb吩fcs珊哪pcr hugo 英 文 缩 写 词 简 表 牛血清白蛋白 基因数据库 d u l b e c c o s m o d i fi e d e a g l e s s o d i u m d u l b e c c o改 良培养基 二乙 基焦碳酸盐 ( d i e t h y l p y r o c a r b o n a t e ) 二甲 基亚 讽( d i m e t h y l s u l f o x i d e ) 增 强 型 绿色 荧光 蛋白 ( e n h a n c e d gr e e n fl u o r e s c e n t p r o t e i n ) 乙二胺四乙酸二钠 ( e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i c a c i d ) 澳 化乙 锭 ( e th i d i u m b r o m i d e ) 表达 序列标记 ( e x p r e s s e d s e q u e n c e t a g g e d ) 胎牛血清 ( f e t a l c a l f s e r u m , ) 人类基因组计划( h u m a n g e n o m e p r o j e c t ) 开 放阅 读 框( o p e n r e a d i n g f r a m e ) 聚 合 酶 链 式 反 应 ( p o l y m e r a s e c h a i n r e a c ti o n ) 十二烷基硫酸钠一聚丙烯酞胺凝胶电泳 ( s d s - p o l y a c ry l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s ) 国际人类基因组委员会 ( h u m a n g e n o m e o r g a n i z a t i o n ) k r iip p l e 型 环指结 构 域( k r u p p l e r i n g a s s o i c a t e d b o x ) 多 组n o r t h e r n膜 ( m u l t i p l e t i s s u e s n o r t h e r n me mb r a n e ) 美国生物技术信息中心 ( n a ti o n a l c e n t e r f o r b i o t e c h n o l o g y i n f o r m a t i o n ) 磷 酸缓 冲盐溶液 ( p h o s p h a t e - b u f f e r e d s a l i n e ) 专 一 序列 位点 ( s e q u e n c e - t a g g e d s i t e ) c d n a末端快速扩增 ( r a p i d a m p l i fi c a t i o n o f c d n ae n d s ) 简单 模 块搜索工 具 ( s i ml e m o d u l a r a r c h it e c t u r e r e s e a r c h t o o l ) c v - 1 o r ig e n , s v 4 0 细胞系 有丝 分 裂活化蛋白 激酶( m i t o g e n - a c t iv a t e d p r o t e i n k i n a s e ) 呻ncbipbsstsrace g 蛋白藕联的受体 c - f o s 血清应答元件 ( g - p r o te i n c o u p l e d r e c e p t o r s ) ( c - f o s s e r u m r e s p o n s e e l e m e n t ) ap - 1 血 清 应 答因 子( s e r u m r e s p o n s e f a c t o r ) 激 活 因 子 1 ( a c tiv a t i o n p r o t e in 1 ) 第一章引言和文献综述 1 、心脏的形成 心脏是脊椎动物在胚胎发育过程中第一个形成的器官，心脏的 血液循环功能对哺乳动物的生存起关键性作用，心脏发育异常是许 多先天性心脏病的发病原因，因此心脏的发育机制在经典的胚胎发 生学和分子胚胎发生学都引起了 关注。目 前对与心脏发育中调控机 制的了解主要来自 模式动物的研究，而且脊椎动物和无脊椎动物的 心脏发育在原初心管形成之前具很大程度上的相似性。对模型动物 鼠、鸡、爪蟾、斑马鱼和果蝇的研究，为心脏发育机制提供了很好 的线索。脊椎动物心脏的形成，需要一系列重要的形态发生事件， 包括细胞决定、细胞迁移和细胞分化。其中脊椎动物的心脏由多细 胞系的特化，到管状结构的形成，最后精确组装成成熟的4个心腔 结构 膜) 经历了一个复杂的发育过程il l 人类心脏发生于生心区。 生心区是指胚盘前缘脊索前板 ( 口咽 前面的中胚层，此区前方的中 胚层为原始横隔。 心脏的发生可 分成三个过程:( 一)人胚第 1 8 - 1 9天，生心区的中胚层内出现围 心 腔( p e r ic a r d i a c c o e l o m ) ， 在围 心 腔 腹 侧的 中 胚 层 形 成 一 对长 索， 称生 心 板( c a r d io g e n ic p l a t e ) ， 并 逐 渐 形 成一 对 心 管( c a d i a c t u b e ) , 接着心管融合陷入心包腔。 ( 二) 心脏外形的建立， 心管由 头端向 尾 端出现三个膨大依次称心球 ( b u l b u s c o r d i s ) 、心室和心房。以后在 心房的尾端又出现一个膨大，称静脉窦 ( s i n u s v e n o s u s ) 。不久，心 房位置逐渐移至心室头端背侧， 并稍偏左， 相继静脉窦也游离出 来， 位于心房的背面尾侧，以窦房孔与心房通连。 此时的心脏外形呈“ s 形弯曲，心房扩大，房室沟加深，房室之间遂形成狭窄的房室管 ( a t r i o v e n t r i c u l a r c a n a l ) 。 心球则可分为三段: 远侧段细长， 为动脉 干;中段较膨大，为心动脉球 ( b u l b u s a r t e r i o s u s c o r d i s ) ;近侧段被 心室吸收，成为原始右心室。原来的心室成为原始左心室，左、右 心室之间的表面出现室间沟。至此，心脏已初具成体心脏的外形， 但内部仍未完全分隔。 ( 三) 心脏内部的分隔， 胚胎发育到第5 周初， 心脏外形的建立虽已基本完成，但内部的左右分隔仍不完全，并继 续进行，约在第5 周末才告完成。 心脏各部的 分隔是同时进行的包 括5 个部分:房室管的分隔、原始心房的分隔、 静脉窦的演变和永 久性左、右心房的形成、 原始心室的分隔、动脉干与心动脉球的分 隔。至此，心脏基本形成。 2 、心脏发育与转录因子 特异荃因在时间上和空间上的表达调控机制是生物学的一个 中心问题，转录因子在这个过程发挥关键作用，这些蛋白质通过与 结构基因的顺式作用元件结合来调节转录过程，是结构基因转录过 程中的“ 调节器” 。 根据其与d n a结合的结构域的结构特征分为几种 类型。目 前，己 鉴定出了 几大 家 族的 转录因 子 2 ,3 ,4 ,3 ， 它们在哺乳动 物发育中的心脏有表达，结合一个或多个心脏特异性转录元件，调 节 心 脏的 发育， 这些 转 录因 子 有: g a t a 锌 指 蛋白 5 - , m e f 2 和s r f 子2 1 1 , carp 间 隙 蛋 白 ( c o n n e x in ) 2 2 1 , t -b o x 转 录 因 子 2 3 1 , p it x 2 2 4 1转 录 因 子 2 5 1 以 及 m s x 2 6 1 等蛋白 质也对心脏的 发育发挥不同 程度的作 用。图 1 - 1综合了 这些转录因子在脊椎动物心脏发育不同阶段的可 能作用，并与相同阶段果蝇心脏发育的分子途径进行了比较。 3 、锌指家族的简介以及与心脏发育的关系 3 . 1锌指的。 n a 结合功能域 在细胞和生物体生长、分泌、细胞系定向等过程中，基因表达 的转录水平调控是非常重要的一个环节。转录因子有一个共同的 特 性，即由不同的功能结构域组成可调变的蛋白质结构，结构域是蛋 白 结构和功能的基本单位。 这些功能结构域从蛋白 总体分离出 来后， 无论是单独作用还是同其它来源的蛋白连接仍能保持原有的功能 ( 如d n a结合活性和转录激活活性) 。 转录激活区通常富含酸性氨 基酸，也可富含脯氨酸和域谷氨酞胺.结构域的排列方式 ( 数目 和 次序)是保守的，不同的d n a结合功能域如碱性拉链 ( b z i p ) 、 锌 指、螺旋环螺旋 ( h l h ) 和螺旋转角螺旋 ( h t h ) 也各有特点。蛋 白 质的功能往往体现在与其他蛋白 质及/ 或核酸的相互作用之中， 细 胞各种重要的生理过程，如信号的转导、细胞外界环境及内 环境变 化的反应等，都是以 蛋白 质间相互作用为纽带，并形成网络。 人 类 基因 组 估 计 有6 0 0 - 1 0 0 0 个 锌 指蛋白( z f p s ) 2 1 ， 它 们 都 含 有锌指结构域，锌指结构是由半肤氨酸和组氨酸鳌合锌离子构成 2 8 1锌 指( z in c fi n g e r ) 结 构 家 族蛋白 大 体 可分 为 锌 指、 锌纽( tw is t ) d n a , c 一 末端的 2 个锌指互相结合形成同 源二聚体， 5 - 6 锌指的存在能 加强 n 一 末端 锌指结合 g g g a a 序列的 强 度3 5 许多c 2 h 2型锌指转录因子除含有c 2 h 2锌指元件外还含有一 些 其 它的 序 列， 如b t b / p o z 域 3 6 , k r a b 框 和s c a n域 3 7 ， 这 些 序列调节着亚细胞的定位、 d n a的结合和基因的表达。 有三分之一 的c 2 h 2 型锌指蛋白同时具有一个k r a b框， 此结构域位于锌指蛋 白的 氮末端非锌指区域，约含7 5 个氨基酸，由a框和b框组成， 分别由两个外显子编码，折叠成两个a - 螺旋参与蛋白 质和蛋白 质之 间的抑制作用， 5 未翻译区和起始密码子由1 至2 个外显子编码， 锌指以 及3 未翻译区另外单独由一个锌指编码3 8 见图1 - 4 ) . k r a b 框的 抑制作用大部分是通过与转录中 介因 子- t i f 1 l3 ( 也叫k a p - 1 或 k r i p - 1 ) 相 互 作 用 实 现的 (3 9 ， 其中a 框 起 关 键 作 用， b 框自 身 没 有 强 转录抑制活性， 但它能增强k r a b 框中a框的 抑制作用。 因为当 k r a b框的a框突变时， k a p - 1 的r b c c结构不再与之发生作用， 而k a p - 1 作为共抑制因子，可直接结合d n a自 身抑制转录， 过表 达则可加强k r a b 的 抑 制 作 用。 5 u t r k r 拙a e n b s p a c e r + z lg s + 3 u t r 图1 - 4 k r a b 型锌指蛋白基因的一般结构图。 3 . 3锌指蛋白和心脏发育的关系 人类胚胎发育是一个非常复杂的过程， 每一个器官的生成in n 要 精确的表达调控，任何调控的缺陷都会导致发育的缺陷，造成很多 疾病，如先天性心脏病和癌症。随着人类生活水平的提高，生活节 奏的加快及环境的影响，心血管疾病己经是当今世界上威胁人类最 严重的疾病之一， 其发病率和死亡率已 超过肿瘤性疾病而跃居第一。 在整个心脏的发育过程中，转录调控是整个器官发育的控制中 心。 而很多转录因子都属于锌指蛋白 家族成员，它们是重要的细胞 调控因子。 这些锌指蛋白 基因家族成员在心脏发育过程中 起重要作 用， 包括g a t a - 4 ， 一 ， 一 、 n k x 2 .5 . f o g和p a n n i e r 等， 它 们一 般通 过与d n a序列的结合来调节基因 表达。 3 . 3 . 1 g a t 家族基因 锌指蛋白 转录因子g a t a 家族在心脏发育过程中 起重要的 作用， 该家族有6个成员， 均在特定的组织中表达并对组织分化中起重要 作用。 g a t a i . g a t a 2 和g a t a 3 对造血组织发育起作用， 而g a t a 4 , 5 , 6 对于大 量心脏基因 表 达的 直接调节以 及胚 胎发育、 心 血管 疾病 都很重要。g a t a 4 , g a t a 5 和g a t a 6 只在心脏、肝、肺等器官的 中 胚层和内 胚层细胞中 表达， 敲除g a t a 4 ， 早期胚胎的内 胚层发生 缺陷进而导致心脏缺陷。近来还发现 8 p 2 3 .1染色体上一段含有 g a t a 4 基因的 染 色体 缺失 与 先天性 心脏 缺陷 密切相关， 这 进一步 论 证了g a t a 4 在 心 脏 形 态 建 成中 的 重 要 作 用 4 0 1 敲除g a t a 6 的 胚 胎 内脏内胚层缺陷，小鼠 在胚胎期5 .5 到7 .5 d 期间就会死亡。 抑制心 肌细胞中的g a t a 4 和g a t a 6 ， 许多心脏基因表达量下降， 包括n n p , b m p , c t n i 、 a m h c 和b m h c 等4 1 1 。 在斑马 鱼中， g a t a 5 错义突 变引起心脏二分叉， 而g a t a 5 过表达可诱导n k x 2 .5 异位表达【4 2 1 这表明 作用。 在心脏特异基因调节和胚胎心脏图式发育中 有重要 g a t a因子还能与其他转录因子相互作用形成联合复合物从而 共同影响转录， 例如多类型的锌指蛋白 转录因子f o g . f o g 1 通过 它的锌指结构与g a t a l 相互作用共同调节造血细胞发育， f o g 2 在 发育的心脏中表达， 并与 g a t a 4 , 5 , 6相互作用4 3 1敲除小鼠的 f o g 2心脏发育异常， 心室和心房间隔缺损并伴随冠状动脉血管缺 失， 在胚 胎 期约1 3 d 左 右 死亡 4 4 .4 5 1 ， 这说明f o g 2 对于正 常的 心 脏 形态建成很重要，并为心脏三尖瓣形成所必需。 3 . 3 . 2 n k x 2 家族基因 n k x 2 家族转录因子基因是t i n m a n的同源异型基因，它的同 源 结构域 ( 6 0 个氮基酸)由3 个a - 螺旋组成一个螺旋一 翻转一 螺旋的结 构， n k x 2 同源结构域的c 一 末端包含1 7 个氨基酸的保守序列，同时 它具有一个不变的疏水氨基酸中心簇( v p v l v ) ， 这个结构在蛋白 质 与 蛋白 质的 相 互 影 响 中 起作 用 4 6 1目 前，己 从 脊 椎 动 物 鉴 定出6 个 结构和功能上与t in m a n 基因相关的基因: n k x 2 .3 , n k x 2 .5 , n k x 2 .6 , n k x 2 .7 , n k x 2 .8 , n k x 2 .9 ， 它们都是在心肌源细胞中 表达。 在鸡中， n k x 2 .5 是第一个在前心细胞中用原位杂交探查到的基 因 4 7 ,4 1 1 , n k x 2 .5 不只在前心细胞中 表达， 还在相邻的中 胚层、内 胚 层、 外胚层细胞中 表达。 在爪蟾和鸡中， 将表达n k x 2 .5 的细胞植入 组织培养基， 将会分化成心脏， 这说明表达n k x 2 .5 的细胞可以特化 发育成心脏。 在心肌层的正常发育中， n k x 2 .5 基因指导心脏早期分 化， 缺失n k x 2 .5 心肌层发育不良， 导致心脏发育停滞于心脏环化的 早期阶段。 n k x 2 .5 缺失的小鼠 心脏并未消失， 但该基因在心脏早期 形态发育和分化中起重要作用， 同时在心肌细胞终末分化中也作用， 包括建立和维持心室基因的表达。 n k x 2 .6 和n k x 2 .5 能一起作用于心房的发育，但这可能是由于 内胚层衍生结构缺陷所致的一种次级效应。在非洲爪蟾胚胎中 n k x 2 .5 和n k x 2 .3 联合作用可阻断生心的起始，抑制n k x 2 因子能 阻碍心脏诱导。脊椎动物n k x 2 蛋白的功能不能替代t i n m a n 基因在 果蝇心脏发育中的功能， 但n k x 2 家族的 转录因子比 果蝇t i n m a n 基 因在分工上具有更强的特异性。 在脊椎动物中，单个的基因突变不能够选择性地和整个地取消 心肌源命运，这可能与分化的心脏途径中一些元件的表达形式重叠 有关。 n k x 2 .5的定点 突变仅仅延迟了 心脏的成熟，可能 与n k x 2 .3 , n k x 2 . 6 , n k x 2 .7 , n k x 2 .8 , n k x 2 . 9 的重登表达有关4 9 ,5 0 3 . 3 . 3 h f 1 b 甚因 另外，锌指蛋白 转录因子h f 1 b 在心脏传导系统发生中 起决定 性作用。 h f 1 b 蛋白 可结合到m l c 2 v 启动子的h f 1 b / m e f 2 v 位点 起转录 激 活剂 作 用5 1 。 缺失h f 1 b 的小鼠 心脏 传导 系统功能 不正常， 由于窦房结、房室结和传导系统的某些缺陷，小鼠 经常会在成年期 死亡5 2 ， 这表明h f l b 在心脏房室 特异分化和心脏传导系统的 转分 化中 有重要作用。 上述几类锌指蛋白 在心脏发育过程中有重要调节作用，由于锌 指蛋白具有相当的可塑性，同一个锌指蛋白 可识别一套不同的、相 关的d n a序列， 但锌指蛋白 对特定顺式调节性d n a元件序列的改 变却具有相当的稳定性;不同的锌指又可识别同一序列，但亲和性 不同5 s . 我们心脏发育研究中 心现已 在人体基因中发现了 许多新的 锌 指 转 录因 子， 如z n f 3 8 2 , z n f 3 5 9 , z f p 2 8 等等 5 4 ,5 5 。 随 着 这 些 研究的深入，锌指蛋白 家族的成员会进一步扩大，其调控机制的认 识也进一步加深， 这将为我们深入了解生物体中 转录翻译等重要生物 功能提供了广阔的前景。 4 , m a p k 的简介及其和心血管的关系 4 . 1 m a p k 信号转导途径 上世纪8 0 年代早期，研究者发现p d g f 和e g f刺激可以诱导 一 个4 2 k d蛋白伽 基 团 磷 酸 化 (5 6 1 ， 与 此 同 时 发 现 胰岛 素 受 体 在 活 化 后 可以 激 活 一 个4 2 k d s e r /t h : 蛋白 激 酶 (5 7 ， 它 的 激 活 需 要介: 磷 酸化和t h r 的双重磷酸化。研究者将其命名为m a p k( 有丝分裂原 激活的蛋白 激酶) ， 这两项研究都揭示了一个独特的激酶的存在， 它 的 激 活需 要其竹; 和s e r /t h r 基团 同 时 被 磷 酸 化 (5 8 1 。 这 个4 2 k d 蛋白 ， 就是在哺乳动物细胞中最早发现的 m a p k途径的核心成员之一一 e r k 1 ( e x t r a c e l lu l a r s ig n a l r e g u la t e d k in a s e 1 ) ( 1 . m a p k 途径 在 所 有真核生物中都是保守的。 在近 2 0年的时间内， m a p k途径的成员和相互作用相继被阐 明。它们构成了一个庞大、复杂而又精细的网络，成为目 前发现成 员最多、关系最复杂，也是研究最详尽的途径之一。它们参与细胞 生长、分裂、分化、死亡各个阶段的生理活动，调节着一系列复杂 的生物功能。 4 . 1 . 1 m a p k 途径基本特点w 1 三酶级联反应: 这是m a p k途径最显著的特点， 三个激酶构成一个最小的功能 模块被级联激活 ( 示意图1 - 5 如下) 。 胞外多种刺激因素，从神经递 质、 激素、生长因子、细胞因子到各种应激刺激如辐射伤害、渗透 压变化等等，都可以 激活这个三酶级联反应。 锹括因子 上 偏匾; 麟 雄 图1 - 5三醉级联反应 是一个s e r f i h r 蛋白 激酶， 它直接的激活因素也有多种: m e k k k 、小g蛋白 家族成员r a s , r h o 、寡聚化、 胞内 位置的变化 等等。m e k k 一 激活后可使下游激酶me k的s e r / t h r 磷酸化。 m e k的s e r / t h r 被 磷 酸 化 后 激 活， 作 为 一 个 极 具 特 色的t y r . t h r 双功能 激酶发 挥作 用。 它识 别 下 游m a p k 分 子中 “ t h r - x - 勺r 模序， 将两种不同的 氨基酸分别磷酸化后激活m a p k . ma p k是一个双磷酸化被激活的s e r / t b ; 蛋白 激酶，是m a p k 途径的核心。m a p k底物包括一些胞质蛋白 激酶、磷脂酶、骨架蛋 白，但绝大部分是核内 转录因子。 一 些 特异 性 磷 酸酶 对 “ t h r - x - t y r 模 序去 磷 酸 化 后 将 导 致m a p k 的失活。 t h r - x - t y r 存在于m a p k分子的激活环状结构之中， m e k 对这种特定的空间结构具有很高的特异性， 这就使得上游信号对 m a p k的调节受到限 制。 因此， 上游m k k k的 存在成为必然， 它可 以 被多种因素激活， 允许尽量多的上游信号输入。 所以m e k k的种 类最多，目 前在哺乳动物细胞中己 发现1 4 种， m a p k 1 2 种，m e k 种类最少，只有7 种。 ma p k的双磷酸化激活: 这也是m a p k 途径的 标识 性 特点。 m a p k mr - x - t y r 模 序的 双 磷酸化可使其活性提高数千倍，两个氨基酸残基磷酸化后使它们所 在的激活环状结构重新折叠，再与分子表面的 精氨酸结合位点相互 作 用， 形 成 激 活 状 态 分 子 构 象6 1 1 。 这 条古 老的 途 径 对 于 细 胞 增 殖的 调节是相对安全的。 4 . 1 . 2 1ia p k 的四种主要途径 途径 ( e r k途径) 这是脊椎动物中克隆的第一个m a p k途径， 也是阐述最完全的 经典途径。e r k途径的激活多由 细胞表面受体 ( 包括生长因子 酪氨 酸激酶受体、细胞因子受体、t c r、c d 2 8 , b c r , g蛋白 偶联受 体等等)激活引发，其中最主要的激活信号来自 酪氨酸激酶受体。 细胞因子受体通过r a s - g t p 这个重要分子激活e r k途径6 2 其三酶模体构成如下:m k k k : r a f l , a - r a f , b - r a f , m o s , me k k 1 , me k k 2 , me k k 3 , t p l - 2 ; m e k : me k 1 , m e k 2 ; m a p k : e r k1 , e rk 2 0 e r k激活之后转位入核， e r k 1 / 2 的底物也分别定位于胞质中、 核中。在培养细胞中，e r k途径与细胞增殖有关，对增殖的促进或 抑制作用因细胞以 及不同细胞环境中 激活的基因而异;在一些特定 的细胞中， e r k途径还可以 介导分化信号; 参与细胞周期调节: e r k 途径的激活可以抗凋亡。 途径 ( s a p k / j n k途径): 于1 9 9 1 年在人和大鼠中同时被发现， 分别被命名为j n k ( c - j u n n 端 激酶) 和s a p k( 应激 激活蛋白 激酶) (63 .6 4 ) 。 该 途 径的 特点 之一 就是可被多种应激因素激活: 热击、y 射线导致的d n a损伤、 过氧 化物体的产生、高渗等等。 其三酶模体构成如下:m e k k : me k k 1 , m e k k 2 , m e k k 3 , m e k k 4 , t a k 1 , mu k , t p l - 2 , s p r k , a s k 1 , ms t ; m e k : m k k 4 , mkk7 ; map k: j nk1 , j nk2 , j nk 3 a j n k目 前己 发现三种， j n k 1 和j n k 2 在体内 广泛存在， j n k 3 只 存在于脑中。 j n k对底物具有双重识别机制，但它没有胞质底物， 均为核内的转录因子， 它们是: c - j u n , a t f - 2 , e l k - 1 , p 5 3 , d p c 4 , n f - a t 4 o j n k与细胞凋亡相关: 在一些情况下， j n k途径也参与细 胞 存 活 和 生 长 调 节 6 5 1 m a p k p3 e 途 径( 户8 途 径) : p 3 8 途 径的 激 活因 素 和j n k途 径大 致 相同 ， 被 一 些应 激因 素: 辐射、渗透压变化、热击、脂多糖、蛋白合成抑制剂等激活;也可 以 被g p c r和i l - 1 , t n f - a 等细胞因子受体激活。 其三酶模体构成如下: m e k k : t a k 1 , a s k 1 , s p r k , p a k ; m e k : mk k 3 , m k k 4 , mk k 6 = ma p k : p 3 8 a , p 3 8 8 , p 3 8 d , p 3 8 g o p 3 8 激酶 的 底 物 大 部 分 是 转 录因 子， 也 有 胞 质 底 物。 p 3 8 途 径 对 造血细胞因子的产生非常重要: 也与细胞因子诱导的增殖反应相关; p 3 8 途 径 还与 凋 亡 相 关 ; p 3 8 途径 在已 分 化 细胞 中 的 功 能 还 不 清楚， 但目 前已 有证据表明它于血小板激活相关。 mk k s / m a p k e r k 途径: 关于 这条途径知之甚少， 迄今还未发现此途径的m e k k . e r k s 可被过氧化、高渗透压等应激条件激活，也可被一些非应激刺激如 血清激活。 有实验证实e r k 5 可以 被m k k 5 激活， 激活后转位入核。 4 . 1 . 3 m a p k 途径特异性的实现 m a p k途径特异性的实现主要有5 种方法:( 1 ) 酶一 底物相互 作用6 6 1 。 作为酶促级联反应的m a p k途径一大特点就是每一个下游 激酶均为上游激酶的底物，因此，这种直接的酶一底物相互作用在 信号传递的过程中发挥重要作用，并且对于相同的底物，不同的 m a p k识别机制不同;( 2 ) 分子平台和接头。 分子平台和接头分子 将相关的分子拉到一起， 大大促进了m a p k途径的的 特异性。 分子 平台是一个具有多分子结合位点的大分子，它能将某条途径相互作 用的分子拉到一起，并具有途径灵活的调节能力，具体的调节方式 是磷酸化。m a p k途径成员有些也可作为平台分子。 ( 3 ) m a p k 途径功能模块的空间组织。m a p k途径成员在胞内的精确定位、 m a p k激活之后的核转位、 最后ma p k还能通过调节下游底物的胞 内空间分布影响其信号功能来提高其激活/ 被激活的 特异性; ( 4 ) m a p k模块的时间组织， 主要是指m a p k途径激活时间长短对细胞 产生特异性反应的作用。由信号上游分子和反馈抑制/ 激活途径决 定; ( 5 ) 信号的交叉与整合。 m a p k途径与p k a途径、 p 1 3 一 激酶 途径、c a t 通路和激素信号协作共同调节基因表达。 4 . 2 ia a p k 怕号途径和心血曹发育及心血管疾病 心脏发育涉及大童心脏组织特异性基因的时空表达调控，在这 一过程中 胞外信号及 其传导和特异性转录因 子的 表达起到了 关键性 作用。在m a p k途径的作用下，e t s 蛋白、s r e和s r f 结合而成的 复 合物诱导早 基因， 如c - f o s 的 表 达。 在 此过 程中e t s 蛋白e l k 1 与 s r e的 结 合 必 须 有s r f 的 参 与 s7 ) 。 大 量的 研究 表明 参 与 激活c - f o s 的s r f 的表达具有组织特异性。 它能与n k x 2 .5 和g a t a 4 等心脏特 异 性转录因子相结合。 在成纤维细胞中， s r f 和g a t a 4 ( 勺 共同作用 可以 激活肌源性或非肌源性的s r f 依赖性的启动子; s r f 与g a t a 4 及 n k x 2 .5的相互作用可激活心脏 a - a c t in的启动子从而诱导这一蛋 白 在 成纤 维 细 胞中 的 表 达 6 8 -7 1 . s p x与g a t a 6 及n k x 3 .2 在 动 脉平 滑 肌细胞中 和 顺式元 件共同 激活 a 1 i n t e g r i n , s m 2 2 a 和 c a l d e s m o n 等平滑肌基因的表达。 此外在内皮素通过g p c r ( e t a / e t , ) 调控心 脏发育过程中， 也需要s r f 与g a t a的相互作用来激活心房利尿钠 肤的 表达 17 2 1 。 这些研究说明了s r f 和 在