（微生物学专业论文）鲍鱼菇小分子抗氧化物质的分离纯化及其生物活性研究.pdf

摘要摘要鲍鱼菇属于担子菌纲，侧耳科，侧耳属，其味道鲜美，营养价值丰富，含有多种生物活性成分，但目前关于其活性成分的研究报导极少。本课题以鲍鱼菇子实体为研究对象，围绕其抗氧化小分子活性物质的分离纯化、构效关系及作用机制进行研究。研究采用分离小分子化合物的特有方法，利用6 0 乙醇溶液回流提取，收集提取物p 上样于a d s 一7 大孔树脂柱进行除杂和有效成分富集，分级洗脱得到e 。和e 2 ；e 。经t l c ( g f ：斜) 和h p l c 分离得到两个核苷类化合物，结构鉴定其分别为腺苷( s 铲。) 和甲硫腺苷( s ) ；e ：经s e p h a d e xl h - 2 0 凝胶层析及h p l c 分离得到皂苷类化合物，结合颜色反应以及红外光谱等方法，推测其为五环三萜皂苷( f 函) 。s 。小s 和艮。得率分别为0 0 8 1 2 ，0 0 9 5 6 $ 10 1 2 8 ，以上三个化合物均是首次在鲍鱼菇中发现。抗氧化活性实验表明，s 纠抑制红细胞溶血的活性为7 5 6 ，f 删抑制脑、肾脂质过氧化的活性达到了7 6 3 和7 1 3 。通过研究鲍鱼菇中小分子和大分子抗氧化成分间的相互作用发现，核苷类和糖蛋白类物质交叉配伍，有明显的抗氧化协同增效作用。在博来霉素造成d n a 损伤实验中，浓度高达5 0 0 9 9 m l 时，从鲍鱼菇中分离得到的各组分几乎没有促氧化副作用，而v c 做为一种广为人知的抗氧化剂，虽然具有强抗氧化活性，但其浓度在1 2 5 “g m l 时就有极强的促氧化作用。研究显示，鲍鱼菇中核苷类、皂苷类和糖蛋白类抗氧化活性物质均具有明显的降低正常小鼠餐后血糖的作用，给药剂量为2 0 m g k g 时可分别使餐后血糖值降低2 6 9 、1 3 2 、2 1 8 。因此，高效低毒的天然抗氧化药物的开发同时也为降糖药物的研制提供了新的思路。构效分析推测，核苷类物质的抗氧化活性与其立体结构和电性因素相关，裸露的n 原予表现碱性，螯合金属离子抑制自由基的产生，还可以充分接近活性氧，从而清除氧自由基；五环三萜化合物的抗氧化活性则是由于其异戊二烯骨架含有丰富的烯键，化学性质活泼，具有较强的还原性，能有效地与强氧化剂起反应，防止细胞膜和线粒体膜中的不饱和脂肪酸被氧化，从而维持了膜的完整性和功能；这一抗氧化机制的推测，为鲍鱼菇作为天然抗氧化类医药和保健t摘要品提供了理论上的支撑。关键词：鲍鱼菇，抗氧化，核苷，皂苷a b s t r a c tab s t r a c tp l e u r o t u sa b a l o n u si sp o p u l a ri na s i af o ri t sd e l i c i o u st a s t e ，h o w e v e r , i t sa n t i o x i d a n ta c t i v i t yh a ss e l d o mb e e nr e p o r t e d i nt h i sr e s e a r c h ，i s o l a t i o n ，p u r i f i c a t i o n ，r e l a t i o no ns t r u c t u r e ，a c t i v i t ya n da n t i o x i d a n tm e c h a n i s mo fc o m p o u n d sf r o mp a b a l o n e sw e r es t u d i e d t h ef r u i t i n gb o d yo fpa b a l o n u s ( d r i e d ) w a se x t r a c t e dt w i c ew i t i l6 0 ( v v )e t h a n o la q u e o u ss o l u t i o nu s i n gt h eh o tr e f l u xm e t h o d t h ec o m b i n e de x t r a c tw a sc o n c e n t r a t e da n dn a m e dpt h e npw a ss u b m i t t e dt ot h ep r e p a r a t i v ea d s 一7r e s i n b a s e dc o l u m nc h r o m a t o g r a p h ya n ds t e p w i s ee l u t i o nw a sc a r r i e do u t pw a sf i r s t l ye l u t e dw i t h3 0 ( v v ) e t h a n o ls o l u t i o nt h e n7 0 ( v v ) a n dc o l l e c t i o n sn a m e de la n de 2 e lw a st r a n s f e r e dt op r e p a r e ds i l i c ag e lt l cp l a t e ( g f 2 5 4 ) a n dt h ea c t i v ep o r t i o nw a sc o l l e c t e da n dt r e a t e dw i t hp r e p a r a t i v eh p l c a f t e rt h a t f i n a lc o m p l e xs 3 ia n ds 4 1w e r eo b t a i n e d m e a n t i m e ，e 2w e n tt os e p h a d e xl h - 2 0g e lc h r o m a t o g r a p h i cs e p a r a t i o na n dt h e np r e p a r a t i v eh p l c f r o mt h i sp r o c e d u r e ，c o m p l e xf 6 3w a sf i n a l l yc o l l e c t e d t h ep u r i t i e sw e r ea s s e s s e dw i ms t a n d a r db ya n a l y t i c a lh p l ca n dt h ec o n f i r m a t i o no fc h e m i c a ls t r u c t u r e sw a sp e r f o r m e db yl c m sa n di rs p e c t r o s c o p y t h r e ec o m p o n e n t s ，9 一p - d r i b o f u r a n o s i d o a d e n i n e ( s 3 1 ) ，5 - d e o x y - 5 - ( m e t h y l i t o )a d e n o s i n e ( s 4 1 ) a n dat r i t e r p e n o i dc o m p l e x ( f 6 3 ) w e r ep r o v e d i nt h ea n t i o x i d a n ta c t i v i t yt e s t ，s 4 ii n d i c a t e dh e m o l y s i si n h i b i t i o na c t i v i t yo f7 5 6 a n df 6 3s h o w e dl p oi n h i b i t i o na c t i v i t yi nr a tb r a i na n dk i d n e yh o m o g e n a t e sa s7 6 3 a n d71 3 t h es y n e r g i s t i ce f f e c to ft h eh i g ha n dl o wm o l e c u l a rw e i g h tc o m p o n e n t sw e r ea l s os t u d i e d w h i c hs h o w e dt h a tn u c l e o t i d ec o m p l e xa n dp o l y s a c c h a r i d e p e p t i d ec o m p l e xm i x t u r e sf r o mp a b a l o n e sh a ds i g n i f i c a n ts y n e r g i s t i ce f f e c to nh y d r o x y lr a d i c a ls c a v e n g i n ga n dl p oi n h i b i t i o na b i l i t i e s ，a n dt h ec o m b i n a t i o nr a t i oo fm i x e da n t i o x i d a n t sw a sa ni m p o r t a n tf a c t o r a l t h o u g hl - a s c o r b i ca c i di sf a m i l i a ra ss t r o n ga n t i o x i d a n t ，ah i g hi n t a k eo fi tm a yl e a dt oap r o - o x i d a n ta c t i v i t yi nt h eb o d y , w h i l ec o m p l e xf r o mpa b a l o n u ss h o w e dl i t t l es t i m u l a t i n ge f f e c to nd n ad a m a g e 。b e s i d e s ，n u c l e o t i d ec o m p l e x ，t r i t e r p e n o i dc o m p l e xa n dp o l y s a c c h a r i d e - p e p t i d ei i ia b s t r a c tc o m p l e xf r o mp a b a l o n e sh a da l s oe x h i b i t e dt h ep o t e n ta c t i v i t i e si ni n c r e a s i n gt h eg l u c o s et o l e r a n c eo fm i c e a tad o s eo f2 0 m g k g ，t h e yp r e s e n t e dad e c r e a s eo fb l o o dg l u c o s ea t2 6 9 ，1 3 2 ，2 1 8 b a s e do nt h es t u d yo fs t r u c t u r ea n da c t i v i t y ，i tw a ss u p p o s e dt h a tb e c a u s eo ft h es t e r e o - c h e m i c a ls t r u c t u r ea n de l e c t r i cp r o p e r t y ，e x p o s e dna t o mi nn u c l e o t i d ec o m p l e xa p p e a ra l k a l e s c e n c e ，t h u si tc a nc h e l a t et h em e t a li o na n di n h i b i tt h ep r o d u c eo ff r e er a d i c a l ；f u r t h e r m o r e ，i tw a sa l s of a v o u r a b l ef o ri tt oa p p r o a c hr e a c t i v eo x y g e na n dc l e a rr e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s m e a n t i m e ，b e c a u s eo fa b u n d a n te t h y l e n i cl i n k a g ei nt h ei s o p r e n es t r u c t u r e ，p e n t a c y c l i ct r i t e p e n o i dh a ss t r o n gr e d u c t i b i l i t ya n dc a nr e a c tw i t ho x i d a n tt op r e v e n tt h eu n s a t u r a t e df a t t ya c i df r o mo x i d a t i o na n dt h u sm a i n t a i ni t si n t e g r a l i t ya n df u n c t i o n a l lt h e s er e s e a r c h e se s t a b l i s haf o u n d a t i o nf o rf u r t h e rd e v e l o p m e n to fpa b a l o n u sa san a t u r a la n t i o x i d a n ta n df u t u r ea p p l i c a t i o ni nm e d i c i n e k e yw o r d ：p l e u r o t u sa b a l o n u s ，a n t i o x i d a n t ，n u c l e o t i d e ，s a p o n i ni v缩略词一览表缩略词一览表缩略词英文全称中文全称r o sb h tb h am d at b at c aa a p hh l vb s ap b sl p oc ”cb l mr ft l cr e a c t i v eo x y g e ns p e c i e sb u t y l a t e dh y d r o x y t o l u e n eb u t y l a t e dh y d r o x y a n i s o l em e t h y l e n e d i o x y a m p h e t a m i n eo b a r b i t u r i ca c i dt r i c h l o r o a c e t i ca c i d2 , 2 - a z o b i s 一( 2 一a m i d i n o p r o p a n e )d i h y d r o c h l o r i d eh u m a ni m m u n o d e f i c i e n c yv i r u sb o v i n es e r u ma l b u m i np h o s p h a t e - b u f f e r e ds a l i n el i p i dp e r o x i d a t i o nc y t o c h r o m ecb l e o m y c i ns u l f a t er f v a l u et h i nl a y e rc h r o m a t o g r a p h y活性氧自由基丁化羟基甲苯丁化羟基苯甲醚丙二醛硫代巴比妥酸三氯乙酸2 , 2 一偶氮一双一( 2 _ 脒基丙烷) 氯化二氢人类免疫缺陷病毒牛血清白蛋白磷酸盐缓冲液脂质过氧化物细胞色素c硫酸博来霉素比移值薄层层析h p l ch i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y高效液相色谱l c - m sl i q u i dc h r o m a t o g r a p h m a s ss p e c t r o m e t e r液质联用f t i rf o u r i e rt r a n s f o r mi n f r a r e ds p e c t r o m e t e r s付里叶变换红外光谱s es y n e r g i s t i ce f f e c t协同效应v i i南开大学学位论文使用授权书根据南开大学关于研究生学位论文收藏和利用管理办法，我校的博士、硕士学位获得者均须向南开大学提交本人的学位论文纸质本及相应电子版。本人完全了解南开大学有关研究生学位论文收藏和利用的管理规定。南开大学拥有在著作权法规定范围内的学位论文使用权，即：( 1 ) 学位获得者必须按规定提交学位论文( 包括纸质印刷本及电子版) ，学校可以采用影印、缩印或其他复制手段保存研究生学位论文，并编入南开大学博硕士学位论文全文数据库；( 2 ) 为教学和科研目的，学校可以将公开的学位论文作为资料在图书馆等场所提供校内师生阅读，在校园网上提供论文目录检索、文摘以及论文全文浏览、下载等免费信息服务；( 3 ) 根据教育部有关规定，南开大学向教育部指定单位提交公开的学位论文；( 4 ) 学位论文作者授权学校向中国科技信息研究所和中国学术期刊( 光盘) 电子出版社提交规定范围的学位论文及其电子版并收入相应学位论文数据库，通过其相关网站对外进行信息服务。同时本人保留在其他媒体发表论文的权利。非公开学位论文，保密期限内不向外提交和提供服务，解密后提交和服务同公开论文。论文电子版提交至校图书馆网站：h t t p ：2 0 2 1 1 3 。2 0 1 6 1 ：8 0 0 1 i n d e x h t m 。本人承诺：本人的学位论文是在南开大学学习期间创作完成的作品，并已通过论文答辩；提交的学位论文电子版与纸质本论文的内容一致，如因不同造成不良后果由本人自负。本人同意遵守上述规定。本授权书签署一式两份，由研究生院和图书馆留存。作者暨授权人签字：2 0 年月日南开大学研究生学位论文作者信息论文题目姓名学号答辩日期年月日论文类别博士口学历硕士口硕士专业学位口高校教师口同等学力硕士口院系所专业联系电话e m a i l通信地址( 邮编) ：备注：是否批准为非公开论文注：本授权书适用我校授予的所有博士、硕士的学位论文。由作者填写( 一式两份) 签字后交校图书馆，非公开学位论文须附南开大学研究生申请非公开学位论文审批表。南开大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任由本人承担。学位论文作者签名：年月日第一章前言第一章前言地球上除厌氧生物外，所有的动植物和需氧生物都离不开氧气。氧气参与新陈代谢、线粒体呼吸和氧化磷酸化，它几乎是一切生命活动的基础物质之一。但是，氧气在参与生命活动的同时，也产生氧自由基。正常的生理情况下，体内自由基不断产生，同时又不断被清除，维持机体正常的生理功能，但是，在日光、紫外线、辐射、化学反应、药物等外界因子作用下，机体发生氧化应激反应，产生大量高反应活性的氧自由基，引起脂质过氧化作用的发生，从而导致对机体的氧化损伤，引起机体衰老和疾病的发生。因此，寻找能有效的清除自由基的抗氧化活性物质，用来延缓衰老及治疗与衰老有关的疾病已成为现代生物研究领域的热点之一。很多合成的抗氧化剂在一定的条件下有毒性和诱变性，而天然抗氧化剂往往具有高效低毒的特点，故寻找高效低毒的天然抗氧化剂已成为国内外研究发展的趋势，也是当前自由基生物学的前沿课题。第一节抗氧化的概述1 1 1氧气与自由基氧气是一切需氧生物不可缺少的生命基础之一，氧气参与新陈代谢、线粒体呼吸和氧化磷酸化，为生命体的活动提供能量。但是，氧气在参与生命活动的同时也产生氧自由基，引起细胞损伤，导致疾病发生。氧气是一切氧自由基的来源和引起氧自由基损伤的物质基础。对自由基的研究，已有较长的历史。不同时期，自由基的概念和定义也有所不同。对于自由基比较普遍的定义是“任何包含一个未成对电子的原子或原子团，均称之为自由基( f r e er a d i c a l ) ” 2 1 。未成对电子，就是指那些在原子或分子轨道中未与其它电子配对而独占一个轨道的电子。如a 、b 两个原子，各提供一个电子，通过共价键形成一个分子a ：b ，这两个电子是配对的。在化学反应中发生了均裂，a 和b 各带一个电子，它们就是未成对电子。自由基的基本特征是具有一个未成对电子，因此就决定了自由基的三个明显特点：反应性强；具有顺磁性；寿命短【引。第一章前言因为具有不配对电子，自由基具有极强的反应活性，容易反应生成稳定分子。如羟基自由基可以进攻细胞成分如膜脂、蛋白质、酶和核酸等。普通的氧分子经一电子还原生成超氧阴离子自由基，二电子还原生成过氧化氢，三电子还原生成羟基自由基，四电子还原生成水。其中，过氧化氢是一种氧化性较强的活性氧，可以参与和生成氧自由基的很多反应；羟基自由基则是已知氧化性最强的氧自由基【4 j 。在正常的生理情况下，体内自由基不断产生，但也不断地被清除，使之维持在一个正常的生理水平上。对正常的生理状态，自由基的浓度很低，不仅不会损伤机体，而且还可显示出独特的生理作用。体内某些重要物质，例如前列腺素的合成就是通过自由基反应实现的。另一方面，人体还可利用自由基的杀伤作用清除异物，例如吞噬细胞的杀菌过程就涉及到自由基对微生物的杀伤作用【5 】o1 1 2 自由基与疾病自由基参与的很多反应对机体是有益的，但在日光、紫外线、电离辐射、化学反应、药物等外界理化因子的作用下，或在某些病理情况下，机体发生氧化应激反应，将产生大量高反应活性的氧自由基，这些过量的氧自由基具有广泛的病理学效应。自由基的医学理论指出，当人体细胞长期遭受到有害的自由基攻击时，细胞的正常运作会受到影响，若自体抗氧化能力不佳，机体的免疫功能就会下降，细胞损坏积少成多到无法修复的程度，便会出现明显的老化或引发慢性疾病如糖尿病、心血管病和癌症的产生【6 。7 1 。1 1 2 1自由基与癌症最新的理论研究证明，自由基参与了人体的癌变过程。自由基能引起致癌物质在人体内的扩展和连锁反应，攻击d n a 造成多种形式的损伤，诱发肿瘤形成。自由基使一个正常细胞变成肿瘤，通常要经过三个阶段：起始、促进及扩散蔓延。大量研究证实：启动阶段自由基作用于脂质而形成的丙二醛等过氧化物，可以使d n a 发生交联或者断裂，并使检验致突变指标的姐妹染色单体互换值( s c e ) 大幅度提高，而凡能提高s c e 值的物质，都被认为具有很强的致突变和致癌作用【8 j 。自由基可攻击d n a 形成多种类型的氧化损伤，在众多的d n a 氧2第一章前言化损伤巾，8 羟基鸟嘌呤( 8 o x o g u a n i n e ) 形成频率最高、致突变性最强，可导致g ：c - - * t ：a 颠换，该突变与肿瘤的发生发展有着密切的关系。在癌症的促进阶段，各种催化剂可以使细胞产生多种活性氧，进而攻击d n a 使之受到损伤。1 1 2 2自由基与糖尿病许多研究表明，氧化应激是糖尿病慢性并发症的主要发病机制之一，活性氧自由基与糖尿病的发生和发展有密切的关系。活性氧在糖尿病慢性并发症发病机制中的作用主要是其对组织和细胞的毒性损伤以及作为重要的细胞内信使，活化许多信号转导通路，间接导致组织和细胞的损伤。人们已经发现，在糖尿病人体内许多组织，如血浆、肝、肾以及胰腺内的自由基含量明显增加，各种抗氧化酶活性下降，细胞内主要的抗氧化物质谷胱甘肽( g s h ) 含量下降，脂质过氧化终产物( m d a ) 含量增加。这些都是与高血糖毒性的作用机制密切相关的【9 j 。在糖尿病病理状态下，高血糖可以激活葡萄糖自氧化、蛋白激酶c 活化、蛋白糖基化等多个生化反应途径，这些途径有一个共同点即都会产生大量活性氧，能够对机体各组织包括胰腺组织的结构和功能产生毒性作用，导致各种并发症o o l 。而且，氧化应激可以影响胰岛素在体内的作用，增加胰岛素抵抗。过量活性氧可减弱外周组织细胞( 如脂肪细胞) 葡萄糖转运蛋白4 ( g l u t - 4 ) 的表达和转运，减少胰岛素刺激的脂肪细胞中g l u t - 4 从胞浆向细胞膜转移葡萄糖，使胰岛素刺激下的葡萄糖摄取和利用减少【l l - 1 2 】。1 1 2 3自由基与艾滋病氧自由基在单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞杀伤微生物中起着重要作用。一方面有研究表明艾滋病细胞产生氧自由基减少，可使免疫杀伤能力减弱，从而易感染各种疾病。另一方面氧自由基也可刺激艾滋病毒复制，导致病情加重。近来，越来越多的证据表明人类免疫缺陷病毒( h u m a ni m m u n o d e f i c i e n c yv i r u s ，h i v 0 1 ) 感染者处于一种慢性氧化应激状态【1 3 以们。h i v - 1 感染者谷胱甘肽耗竭，其他抗氧化物如抗坏血酸，0 t 生育酚、p 胡罗卜素及s e 等水平显著低于健康人。抗氧化酶活性也发生改变，血浆中氧化应激的标志物如m d a 、h 2 0 2 及耗氧率明显增加。活性氧通过提高病毒复制、增加炎性免疫应答、降低免疫增生应答、促进细胞凋亡及加速免疫功能丧失等进而导致h i v - 1 疾病的病理发展。1 1 2 4自由基与衰老3第一章前言h a r m a n 在1 9 5 6 年首先提出了自由基在启动一系列和衰老有关的功能障碍中扮演着重要角色的“衰老的自由基假说 【1 7 】，氧自由基引起脂质过氧化，形成脂质过氧化物( l i k ) ) ，该物质很不稳定，容易分解，产生丙二醛，丙二醛可进一步与磷脂、蛋白质等发生反应，形成一种老年色素即脂褐质，脂褐质在大脑、脑干、脊髓及神经节等部位的细胞内大量堆积，从而给神经细胞带来一定损害，同时自由基还可引起机体各种组织细胞脏器的损伤，促进各种疾病的发生与发展，从而导致生物体的衰老与死亡。1 1 2 5 其它氧化应激可引起多种疾病，除上面介绍的外，还有多种疾病的产生、发展均与氧自由基有关，如心血管系统的高血压、k e s h a n 病，神经系统巾的脑创伤、脑卒中病变、帕金森病、阿茨海默病、肌萎缩、侧索硬化等慢性病变，移植中的急性排斥和慢性排斥等。1 1 3 抗氧化剂保护的原则抗氧化剂的一个较严格和普遍被接受的定义是：任何物质当以低于氧化底物浓度存在时，可以明显推迟或抑制底物的氧化，该物质就称为抗氧化剂 4 1 。生物体内的抗氧化剂包括酶与非酶两大类。前者主要是指超氧化物歧化酶( s o d ) 、过氧化氢酶( c a t ) 、谷胱甘肽过氧化物酶( g p x ) 等；后者则是指一些小分子的有机物质，如维生素e 、维生素c 、辅酶q 、半胱氨酸、谷胱甘肽、微量元素硒( s e ) 及尿酸( u a ) 等 4 1 。抗氧化剂按其物理性质可分为水溶性和脂溶性抗氧化剂。依其作用性质可以分为两大类，第一类为预防性抗氧化剂，可以清除脂质过氧化链起动阶段的活性氧等引发剂，如s o d ，c a t ，g p x 等抗氧化酶；第二类为脂质过氧化链式反应的阻断剂，可以捕捉脂质过氧化链式反应中产生的活性氧，减少脂质过氧化反应链的长度，因此可以阻断或减缓脂质过氧化的进行，如维生素c ，维生素e等就属于这类抗氧化n t 5 1 。抗氧化剂可以作用于脂质过氧化的以下几个水平 1 8 - 1 9 】：( 1 ) 减少局部氧气浓度；( 2 ) 清除起动脂质过氧化的引发剂；( 3 ) 结合金属离子，使其不能产生起动脂质过氧化的羟基自由基或使其不能分4第一章前言解脂质过氧化产生的脂过氧化氢；( 4 ) 将脂质过氧化物分解为非自由基产物；( 5 ) 阻断脂质过氧化的反应链，即清除脂质过氧化中间自由基，如脂自由基，脂氧自由基和脂过氧自由基。为提高人体的抗病能力和延缓衰老，通过抗氧化剂以对抗自由基的产生和清除体内过量自由基是一条有效的途径。1 1 4 外加抗氧化剂的保护与过氧化损伤相对，生物体自身的抗氧化保护作用使得生物体在氧化环境中得以生存，不至灭亡。但是对每个生物体而言，并不是都能保持氧化和抗氧化的平衡，因而才产生了各种脂质过氧化引起的损伤和疾病。当生物体本身不能保持二者平衡时，外加一些抗氧化剂就是非常必要的。抗氧化剂按来源可分为合成抗氧化剂和天然抗氧化剂两大类，传统上使用的抗氧化剂基本都是合成的。一百多年前，人们就发现氧气对人和动物有毒害作用，在食物中添加少量芳胺或苯酚可以防止这一毒害，这一发现吸引了有机化学家研究这些抗氧化剂的作用机理并合成了一些新的抗氧化剂。维生素e 、b h a 、b h t 以及丙基没食子酸是常用的食物添加剂。大部分合成抗氧化剂都是苯酚或芳胺类，与维生素e一样，是通过链阻断机理抗脂质过氧化的，它们可以为脂氧自由基或脂过氧自由基提供氢，干扰脂质过氧化链增长。但是，自7 0 年代以来，人们不断发现某些人工合成的抗氧化剂有一定的毒性，可以影响人体呼吸酶的活性，有的甚至还有致畸、致痛作用，从而引起人们对其的不安全感，因此，越来越多的国家开始限制或禁止使用某些合成抗氧化剂。1 9 7 7 年美国药品食品监督管理局( f d a ) 曾删去丁化羟基甲苯( b h t )的使用认可；日本厚生省也曾在1 9 8 2 年宣布禁用丁化羟基苯甲醚( b h a ) 2 0 1 。据9 0 年代美国市场的调查表明，2 6 的人认为化学合成添加剂有害；来自英国的报告称，5 8 的人认为这种食品添加剂是健康的一个主要威胁；在中国越来越多的人认为化学合成添加剂危害健康。因此，人们一直在寻求高效、卫生、安全的天然抗氧化剂。5第一章前言第二节天然抗氧化剂的研究进展1 2 1天然抗氧化剂的种类现在市场上已经出现了天然抗氧化剂食品添加剂，天然抗氧化的化妆品，甚至天然抗氧化剂的药物也在临床广泛应用，天然抗氧化剂的开发已经成为世界性的大趋势。天然抗氧化剂一般是指从天然产物组织中提取得到的具有抗氧化活性的物质。现己发现，多种天然产物均含有抗氧化成分，这些化学成分可归纳为六大类：黄酮类、苯酚类、皂苷类、鞣质类、生物碱类和其它类【2 l - 2 4 1 。现对各类成分介绍如下1 黄酮类：如水飞蓟果中含有水飞蓟素、3 一氧化黄酮水飞蓟素、异水飞蓟素等，以水飞蓟素的抗氧化活性最强。黄芩中含黄芩甙、黄芩黄素、汉黄芩黄素一7 糖甙、汉黄芩黄素、黄芩新素等，是具有较高抗氧化活性的黄酮成分。甘草中含有三羟基查尔酮，有抗氧化和抗腐蚀双重性质，添加4 0 0 p p m 其9 5 的乙醇提取物相当于2 0 0 p p mb h t ，添加6 0 0 p p m 相当于2 0 0 p p m 的山梨酸钾。淫羊草、蒲黄、菟丝子中的黄酮化合物也有丰富的银杏黄酮，用乙醇提取银杏叶( 黄酮含量1 ) ，可得到提取率1 5 以上的产品，其黄酮含量达2 5 以上。2 苯酚类：五味子含有多种五味了素、五味子酚，属于木质素类化合物，具有显著的抗氧化活性，且强于v e 。当归、川芎中含有阿魏酸，其苯环上的酚羟基是抗氧化活性基团。茶叶作为抗氧化剂资源，近年国内外许多人对其进行了深入的研究，明确其抗氧化成分为多酚类衍生物，其中表儿茶素没食子酸酯抗氧化活性为生育酚的1 6 5 倍，在茶叶中含量为5 一8 。茶多酚作为食品抗氧化剂已被我国卫生部批准，列入食品添加剂卫生标准。目前，国内有许多厂家进行商业化生产。3 皂苷类：人参、刺五加、升麻、黄芪中含有萜类皂苷，麦冬、洋地黄、党参中含有甾类皂苷，均可抑制自由基的形成。具有抗氧化活性的皂苷还有三七总皂苷、西洋参皂苷、竹节参总皂苷、绞股蓝皂苷、柴胡皂苷等。4 鞣质类：赤芍中的没食子酸丙酯属鞣质类，具有抑制脂质过氧化的作用，水解性鞣质酸作用强于缩合鞣质酸。诃子中含有3 0 4 0 的鞣质，乙醇提取物的抗氧化效果略低于t b h q 。5 生物碱类：有些中草药中含有生物碱，如马钱子中的马钱子碱、附子中的6第一章前言去甲乌药碱、黄连中的四氢小檗碱、苦豆子中的苦豆碱等，在亚油酸的空气氧化中，具有类似b h a 、b h t 的抗氧化作用。6 其它类：还有许多成分如多糖类( 枸杞子多糖、茯苓多糖等) 、萜类( 苍术酮) 、不饱和脂肪酸、维生素、矿物质等均为有效的抗氧化成分。1 2 2 天然抗氧化剂的研究状况随着氧自由基和抗氧化理论研究工作地深入，天然抗氧化剂的应用越来越为人们重视，目前科学家们已经完成了对香辛料、食用植物、中草药等十余类数百种天然物质的抗氧化研究，并取得了丰硕的研究成果。食药两用中药历来被公认为既有益于健康又有特定的治疗效果，佘世望等采用硫氰酸铁法对6 0 种药食两用植物进行了抗氧化活性比较，发现有5 5 种具抗氧化活性，有2 0 种活性较强，其中昆布、丁香、香薷、白果、小茴香的乙醇粗提物的抗氧化活性与2 0 0 p p m 的茶多酚相当矧；王海宽等在实验中选用了3 0种天然食物，利用f e n t o n 反应体系，采用化学方法研究了天然食品的水提物、提取物混合物对羟自由基的清除能力大小，最后配置出四种保健饮料并通过动物试验证明它们具有良好的生物抗氧化作用【2 6 】；刘玉鹏等筛选出6 4 种抗氧化植物粉末，并且对3 0 种中药进行有机溶剂提取后，用烘箱法和o s i 法测定抗氧化活性的结果表明，厚朴、射干、甘草、芡实4 种中草药提取物具有明显的抗氧化活性【2 7 j ；李文智对我国天然抗氧化剂的进行了研究，并分述了从银杏叶、菊花、浓香乳菇菌丝体、核桃叶、芦荟汁、红萝b 、苦荞、生姜等天然物质中提取抗氧化剂的方法及各自的抗氧化作用【2 8 】；此外，科学家们对银杏的研究已久，银杏叶提取物中主要的生物活性成分为黄酮类和银杏萜内酯，具有广谱的抗氧化活性，已广泛应用于医药、保健食品等领域。到9 0 年代，日本和美国等国家已将其作为防治心脑血管疾病和抗衰老的第三代功能食品和添加剂加以开发。我国农科院茶叶研究所于1 9 8 4 年开始研究茶叶天然氧化剂，分离出了茶叶中的抗氧化成分，在猪油、大豆油、菜油、花生油等食用油脂中添加0 0 2 0 0 8 的茶叶天然抗氧化剂，证明其具有很强的抗氧化活性，过氧化值和酸价的抑制率在9 0 以上，抗氧化的效价比v e 高5 倍，与v c 和v e 并用具有协同增效作用，1 9 8 8 年7 月其被批准作为我国食品添加剂之一【2 9 】。自然界中各种来源的植物和食药用中草药种类繁多，抗氧化成分丰富，随着回归自然的潮流和中药现代化研究的深入趋势，天然抗氧化剂的研究必将受7第一章前言到越来越多的关注和重视重视。食用菌不仪是一类味道鲜美、营养丰富的食品，而且可以用作保健品和药品。研究食用菌的抗氧化作用，有助于充分利用各种食用菌的有效成分，有助于对各种食用菌进行开发利用，合理调配人们的保健膳食，从而起到抗衰防老和预防疾病的作用，因此，食用菌的抗氧化研究越来越广泛【3 0 。5 1 1 。表1 1 菇类抗氧化研究列表t a b l e1 1r e s e a r c ho nt h ea n t i o x i d a n tc o m p o n e n t sf r o mm u s h r o o m序名称活性成分文献出处号l平菇多糖沈侃等，2 0 0 22大球盖菇多糖陶明煊等，2 0 0 73白灵菇多糖李书倩等，2 0 0 74茶树菇多糖陈少英等，2 0 0 75杏鲍菇多糖p e p i 、p e p i i杨立红等，2 0 0 56 j 阿魏菇菌丝体多糖( p n m p )李永泉等，2 0 0 37双孢蘑菇担子多糖常海兰等，2 0 0 38崂山蘑菇乙酸乙酯提取物，总酚黄海兰等，2 0 0 59茶薪菇粗三萜袁广峰等，2 0 0 71 0松乳菇，红汁乳菇蛋白多糖董爱文等，2 0 0 6l l阿魏菇多糖田金强等，2 0 0 61 2赤芝乙醇萃取物r o b e r t as a l t a r e l l i e t c i t a l y 2 0 0 91 3双孢菇，多孔菌，糙皮侧耳，甲醇萃取物m a h f u ze i m a s t a s e t c 紫丁香蘑t u r k e y ，2 0 0 78第，章前言续上表1 4大白桩菇，虎掌菌，草原黑总酚、p 一胡萝卜素，番l i l l i a nb a r r o s e t c 蘑茄红素p o r t u g u e s e ，2 0 0 71 5松乳菇总酚i s a b e lc f r f e r r e i r a e t c p o r t u g u e s e ，2 0 0 71 6硫磺菌总酚、总黄酮a z i zt u r k o g l u e t c t u r k e y , 2 0 0 71 7香菇，杏鲍菇，灰树花多酚、甾醇n j o yd u b o s t e t c u s a ，2 0 0 71 8褐黄纤孔菌多酚i n k y o u n gl e e e t c t u r k e y , 2 0 0 71 9孢虫草拟肽物a k i r as a k a k u r ae t c ，2 0 0 72 0杨树菇乙酸乙酯萃取物k m l 0 e t c h o n g k o n g ，2 0 0 72 l香菇，草菇总酚l m c h e u n g e t c h o n g k o n g ，2 0 0 32 2灰树花多糖b u mc h u nl e e e t c k o r e a , 2 0 0 3本研究所用的实验材料为鲍鱼菇，鲍鱼菇( p l e u r o t u sa b a l o n u s ) 属于担子菌纲侧耳科，侧耳属，原分布于我国台湾、福建等省，别名台湾平菇、高温平菇。1 9 7 4 年，h a ny h 等首次对其进行了报道，其菌柄发黑发暗，菌褶边缘呈帚状，菌盖表面通常有瑕疵，菌丝有黑色的孢子囊【5 2 巧3 1 。鲍鱼菇生长的温度范围为2 0 3 0 ，适宜温度2 5 - - - 2 8 ，是夏季栽培的菌类，因气温高，水份散失快，因而配制培养基时含水量以6 5 - - - 7 0 为宜，菌丝培养室的相对湿度以6 0 - - 7 0 为宜，出菇阶段相对湿度要求9 0 - - 9 5 ，对菇体的发育有利。子实体生长时对氧气量要求较高，同时需要散射光。其子实体肉质肥厚，蛋白质含量高，且富含维生素及矿物质。据分析，鲜菇含水分9 2 7 5 ，干菇含粗蛋白1 9 2 0 、脂肪1 3 4 8 、可溶性糖1 6 6 l 、粗纤维4 8 、氨基酸总量占2 1 8 7 【5 4 】，其中必需氨基酸8 6 ，均高于其它侧耳，是一种食、药兼用的理想食品。9第一章前言第三节菇类小分子活性物质研究概况1 3 1小分子抗氧化活性物质的研究目前国内外对抗氧化物质的研究从来源看，大多数来自植物，对菇类中抗氧化成分的研究相对较少。菇类作为一个重要的研究领域，其品种繁多，各种结构新颖的生物活性物质的报导也是层出不穷，而且其代谢产物具有各种各样的化学结构及生理特征，因此具有很大的开发潜能。此外，菇类不仅可以直接收集当研究材料使用，而且可以通过人工栽培或者菌丝体发酵培养等方法提供大量原料，因此菇类的研究具有明显的后发优势。目前对菇类抗氧化成分的研究，绝大多数都是对粗提取物活性进行测定，对其中纯化产物的抗氧化活性则涉及甚少；而对纯品的研究主要是针对多糖、蛋白等大分子抗氧化物质，而大分子抗氧化物质由于其性质和结构的特点，在加工和储藏过程中容易被分解破坏，从而影响了其抗氧化活性。在人体组织中，小分子抗氧化剂以多种形式存在，如谷胱甘肽、还原型辅酶、肌肽等都是由细胞合成；尿酸、胆红素等是细胞新陈代谢的产物；而抗坏血酸、生育酚、多酚等则是由饮食中补充得到。小分子抗氧化物质通过直接清除活性氧或者是与过渡金属离子的螯合而起到抗氧化的作用。研究表明，氧自由基和其他活性氧代谢物具有反应时间短、速度快的特征，因此要清除活性氧自由基，抗氧化剂就必须定位于活性氧产生部位，同时具有高浓度，并能持续不断的进行清除作用，才能达到保护机体的作用。小分子抗氧化剂作用对活性氧有着独特的亲附性【5 5 1 ，其分子量小，能渗透到细胞中，能够以高浓度在细胞的某一氧化损伤位点定点作用，并且能够被细胞再生，从而起到保护作用【5 6 1 。此外，小分子抗氧化物质通常具有较好的溶解性，研究表明，低分子量的壳聚糖衍生物比高分子量的衍生物具有更好的抗氧化活性1 5 7 1 。并且，相比于大分子，小分子抗氧化物质不但更好的热稳定性，还有研究表明，紫菜中的小分子抗氧化物质在超过1 0 0 。c 条件下，其抑制亚油酸自氧化能力急剧增加【5 8 1 ，这对于食品加工和储藏都是极有意义的。1 3 2 菇类中小分子活性物质的研究食药用菌作为膳食补充物或者药膳在我国已有悠久的历史，李时珍的本草纲目中就对灵芝、木耳、茯苓、鸡枞等二十余种菌类的药物性能和作用分1 0第一章前言别做了记载。现代分析技术的运用，揭示了食药用菌中多种生物活性物质，其中包括多糖类，如云芝多糖、香菇多糖、茯苓多糖等；免疫蛋白类，如月夜菌中的月夜菌素、金针菇中的扑菇素；蛋白多糖体，如从云芝中提取的p s k 和p s p ，口蘑属中提取的p s p c 等等。这些提取物都有增强人体免疫力、抗肿瘤、抗氧化等功能。除了这些大分子化合物外，食药用菌中还含有丰富的代谢产物和小分子活性物质。1 3 2 1 萜类化合物已知的存在于食药用菌中的萜类化合物有倍半萜、二萜化合物和三萜化合物。它们是以异戊二烯为结构单元组成的化合物，又称类异戊二烯。萜类化合物的生理活性包括生长调节作用、抗氧化作用、抗肿瘤活性以及抗真菌微生物活性等。近十多年来国内外学者从灵芝、茯苓以及苦红菇等担子菌中提取得到一百多种三萜类化合物，其中有一部分通过动物实验具有抗肿瘤活性和提高免疫的作用【5 9 】；如灵芝酸是灵芝巾含有的一种三萜类化合物，有四环三萜和五环三萜两类，已分离得到的灵芝酸有上百种，具有保肝、排毒、降血压、降胆固醇等作用【6 0 】；又有报道，从苦红菇中分离得到的两个三萜酸类化合物，称为苦红菇a 与b ，都是四环三萜葫芦烷骨架结构的化合物，其子实体的甲醇提取物的酸性部分有很强的抗肿瘤活一i , 生t 6 1 1 。1 3 2 2 甾醇类化合物许多食药用菌中都含有甾醇类化合物，主要包括麦角甾醇类、胆甾醇类和谷甾醇类等。甾醇类是甾体的化合物，它以游离或糖结合的形式存在，是机体激素或者激素的前体，动物合成维生素d 的原料，也是医药工业制备甾体类激素的原料。甾醇类化合物尤其是麦角甾醇具有消炎、抗癌等多种生物活性。对蛹虫草菌丝进行化学研究，发现有麦角甾醇物质以及1 3 一谷甾