（分析化学专业论文）表面等离子体激元共振检测中的激光热效应研究.pdf

硕士学位论文 摘要 摘要 表面等离子体激元共振( s u r f a c ep l a s m o nr e s o n a n c e ，s p r ) 是一 种新兴的表面分析方法，具有快速、灵敏、免标记等优点，可实时在 线地跟踪固液界面反应。但是，在s p r 检测中，激光长时间定点照 射所引起的热效应( 简称激光热效应) 会使s p r 共振角发生偏移， 导致s p r 检测产生误差。在某些情况下，这种热效应甚至会成为s p r 测量误差的主要来源。本论文工作采用流动注射s p r ( f i s p r ) 长时 间持续检测了2 酒精溶液流经裸金及表面自组装单分子层金膜的 s p r 共振角变化，发现诸多因素会影响s p r 信号响应，如溶液流速 的大小，自组装分子层的紧密程度以及激光强度等。研究证实：激光 热效应引起的s p r 共振角偏移大小不仅与激光光强有关，同时也与 金属溶液界面处的热量传递和扩散有关。因此，在实验允许的范围 内，可以通过调低激光强度或加快热量扩散的的方式来减小激光热效 应对s p r 检测带来的影响，从而提高s p r 检测数据的精确性与准确 度。对f c c l l s h 的电化学s p r 研究进一步证实：如果不考虑或减小 这种热效应的影响，那么用s p r 去检测f c c l l s h 分子从还原到氧化 态的构型变化，其数据的准确性是值得商榷的，甚至可能导致错误的 结论。 关键词激光热效应，s p r 共振角，准确性，f i s p r ，1 1 二茂铁基十 一烷基1 硫醇( f c c “s h ) 硕士学位论文 a b s t r a c t s u r f a c ep l a s m o nr e s o n a n c e ( s p r ) i sa l lo p t i c a lt e c h n i q u et h a tc a l l m o n i t o ri n t e r f a c i a lr e a c t i o n sa ts o l i d l i q u i di n t e r f a c e s e s p ri sa t t r a c t i v e o w i n gt os e v e r a li n h e r e n ta d v a n t a g e s ，s u c ha sl a b e l f r e ea n a l y s i s ，r a p i d a n dh i g hs e n s i t i v i t y t h e r m a le f f e c ti n h e r e n ti nl o n g t e r mi r r a d i a t i o no fa f o c u s e dl a s e rb e a mc a ng e n e r a t ea p p r e c i a b l ec h a n g e si nt h es u r f a c e p l a s m o nr e s o n a n c e ( s p r ) r e s o n a n c ea n g l e s u c ha ne f f e c ti ns o m ec a s e s m a yb e c o m eam a j o rs o u r c eo fe r r o ri ns p rm e a s u r e m e n t s ，e s p e c i a l l y w h e ni n f i n i t e s i m a l s i g n a l s ( e g ，r e o r g a n i z a t i o n o fm o n o l a y e r so r c o n f o r m a t i o n a lc h a n g e so fi m m o b i l i z e dp r o t e i n s ) a r em e a s u r e d i nt h i s w o r k , t h el a s e r - i n d u c e dt h e r m a le f f e c tw a se x a m i n e db yc o n t i n u o u s l y m o n i t o r i n gc h a n g e sb r o u g h ta b o u tb yi n j e c t i n g2 e t h a n o ls o l u t i o ni n t oa f l o wc e l lh o u s i n gb a r ea n dc h e m i c a l l ym o d i f i e dg o l df i l m st h a th a db e e n i r r a d i a t e db yal a s e rb e a mf o rv a r i o u st i m e s f a c t o r sa f f e c t i n gt h es p r r e s p o n s e ，v i z ，s o l u t i o nf l o wr a t e ，c o m p a c t n e s so ft h ea d s o r b a t el a y e r ，a n d p o w e ro ft h el a s e rb e a m ，w e r ee x a m i n e d t h es p rd i ps h i f tc h a n g e sw e r e s h o w nt ob ed e p e n d e n tn o to n l yo nt h em a g n i t u d eo ft h el a s e rp o w e rb u t a l s oo nt h et h e r m a ld i s s i p a t i o na tt h em e t a l s o l u t i o ni n t e r f a c e w i t ha b e t t e ru n d e r s t a n d i n go ft h ep a r a m e t e r sa f f e c t i n gt h et h e r m a le n e r g y d i s s i p a t i o na n dt h et e m p e r a t u r ed e p e n d e n c eo ft h es p rs i g n a l s ，m e a s u r e s c a nb et a k e nt oi m p r o v et h ea c c u r a c yo fs p rd a t a w es h o wa sa n e x a m p l et h a t ，i ft h el a s e r - i n d u c e dt h e r m a le f f e c ti s n o tc o n s i d e r e do r r e d u c e d ，a c c u r a c yi nt h ed e t e r m i n a t i o no fr e d o x t r i g g e r e dr e o r g a n i z a t i o n o fa p r e i m m o b i l i z e d 11 - f e r r o c e n y l u n d e c a n e t h i o ls e l f - a s s e m b l e d m o n o l a y e r ( s a m ) m a yb es e r i o u s l ya f f e c t e d ，l e a d i n gt oa ne r r o n e o u s c o n c l u s i o n k e yw o r d s f l o w i n je c t i o n ( f c c l l s h ) l a s e r - i n d u c e dt h e r m a le f f e c t ，s p rd i ps h i f t ，a c c u r a c y , s u r f a c ep l a m o nr e s o n a n c e ，11 - f e r r o c e n y l u n d e c a n e t h i o l 硕士学位论文 第一章绪论 第一章绪论 表面等离子体激元共振( s u r f a c ep l a s m o nr e s o n a n c e ，s p r ) 是一种新兴的 表面分析方法，它由沿着金属与介质表面的等离子体( s u r f a c ep l a s m o n ，s p ) 激 励产生，拥有快速、灵敏、免标记等优点，可实时在线地跟踪固液界面反应。表 面等离子体激元共振具有高灵敏度和高选择性，由其构筑的传感器结构简单、功 率低，尤其在固液界面处对微小的折射率变化非常敏感，现已广泛应用于化学、 生物、食品、环境等方面。近几年，新的技术理论和方法学又推动了s p r 生物 传感器向小分子的相互作用研究、药物筛选、临床诊断、细胞膜模拟、蛋白质组 学等新兴的应用领域扩展。再者，与s p r 相关联用技术的发展应用，如流动注 射s p r 【1 1 、近红外s p r 成像技术【2 1 、s p r 荧光光谱法【3 1 、s p r 石英晶体微天平【4 】、 电化学( e l e c t r o c h e m i s t r y ，e c ) s p r 5 1 、s p r - 质谱【6 】等，使得s p r 成为分析金 属溶液化学反应、构型变化、分子重组等微观领域不可或缺的一种有利手段。 1 1s p r 的发展概况 1 9 0 2 年，r w w o o d 首次发现了入射光在衍射光栅上由表面等离子体引起的 反常衍射现象。1 9 4 1 年，f a n o 根据金属和空气界面上表面电磁波的激发解释了这 一现象。随后，有人提出了体积等离子体的概念，认为这是金属中体积电子密度 的一种纵向波动。r i t c h i e 注意到，当高能电子通过金属薄片时，不仅在体积等离 子体频率处有能量损失峰，在更低频率处也有能量损失峰，认为这与金属薄膜的 界面有关。1 9 5 9 年，p o w e l 和s w a n 通过实验证实了r i t c h i e 的理论。1 9 6 0 年，s t e m 和f a r r e l 研究了此种模式产生谐振的条件并首次提出了表面等离子的概念。2 0 世 纪6 0 年代末，k r e t s c h m a n n 和o t t o 使用衰减全反射( a t t e n u a t e dt o t a lr e f l e c t i o n ， a t r ) 的方法演示了光激发表面等离子体共振的现象。7 0 年代，p o c k r a n d 和s w a l e n 用s p r ! 来检测金属薄膜特性，而g r o d o n , 贝1 利用s p r 来实时监测金属表面的反应。 在1 9 8 2 年，n y l a n d e r 和l i e d b e 培将s p r 原理用于气体检测和生物传感器领域中l 7 1 。 8 0 年代初瑞典科学家l i c d b c g 等首次将s p r 技术运用于i g o 抗体与其抗原相 互反应的测定【s 】。随后，该技术被引入生物传感器领域并迅速渗透到基础生命科 学研究中。基于s p r 技术的光学生物传感器具有其它相互作用技术所无法比拟的 优点，如不需对分子进行标记、能实时检测生物分子结合反应的全过程等，其发 展非常迅速，己经成为一种成熟的检测生分子间相互作用的方法。特别是在1 9 9 0 硕士学位论文 第一章绪论 年，瑞典的b i a c o r e a b 公司开发出世上第一台商业化的s p r 生物传感器b i a e o r e t m 之后，s p r 生物传感器的研究全面开展并不断深入，其应用范围不断扩大。近几 年，s p r 技术广泛应用于从蛋白、寡糖、脂类n d , 分子、噬菌体、病毒颗粒、细 胞等各种生物体系，商业化的s p r 生物传感器己经从根本上改变了生物分子识别 科学，成为生命科学和制药研究上的标准工具。 表1 - 1 主要产品及s p r 信息 t a b 1 1m a i np r o d u c t sa n ds p ri n f o r m a t i o n 1 2s p r 的基本原理 s p r 的基本原理是基于金属与介质界面之间的等离子体激元波激励的结果。 具体可从以下几方面加以概括： ( 1 ) s p r 现象的产生 s p r 现象是一种物理光学现象，它可以利用金属薄膜的光学耦合产生【7 】。 如图1 1 所示的棱镜起光学波导器件的作用，它由非吸收性的光学材料构成。在 棱镜底部加载一层厚度在5 0n l t l 左右的高反射率的金属薄膜( 一般为金或银) 做 为传感器的传感面。 由光源发出的p - 偏振光以一定角度入射到棱镜中，在棱镜和金属的界面处将 发生反射和折射。当入射角0 0 大于临界角o 。时，光线将发生全反射，从棱镜另 一侧面反射出去。在全反射同时，电场在金属和棱镜的界面处并不立即消失，而 是以消失波的形式向金属中呈指数衰减。消失波可与金属薄膜中的自由电子相互 作用，产生表面等离子体( s u r f a c ep l a s m o n ，s p ) ，它是一种在金属表面振荡的 电磁波。 2 硕士学位论文第一章绪论 棱镜 金属 介质 l 2 图1 - 1 全反射衰减原理激发表面等离子体的示意图 f i g 1 1s k e t c hm a po fs u r f a c ep l a s m ae x i c i t e dt h r o u g ht o t a lr e f l e c t i o na t t e n u a t i o np r i n c i p l e 消失波沿x 轴方向( 与平面平行的方向) 传播的波矢量分量k x 为： k ，：石旦s j ne o 式中o 为棱镜的介电常数，为光波的角频率，0o 为入射角，c 为光速。表面 等离子体的实质是一种在金属表面传播( 振荡) 的电磁波。由消失波激发的s p s ， 频率与消失波相同，同样沿x 轴方向传播，其波矢量k 印为： b = 鼠蔫一( 矧们 式中l 、e 2 分别为金属和介质的介电常数，n 2 为介质的折射率。 由电磁波理论可知，当两个电磁波具有相同的频率和波数时，二者可以发生 共振，即只要满足下列条件，消失波与表面等离子体就可发生共振： k 育= 七， 厢卸= 鼠矗) m 发生共振时，在棱镜与金属界面处的全内反射条件被破坏，反射率出现一个 极小值。共振的产生与入射光的角度，金属薄膜的介电常数及介质的折射率有关， 当介质不同时，共振角改变，典型的s p r 光谱见图1 2 ： 硕士学位论文 第一章绪论 鸵5 弱铀睨 i n t e r n a la 叼k 5 6 7 8 v v 剐e k m o t hin m 图1 - 2 左图为s p r 角度扫描曲线，右图为s p r 波长扫描曲线 f i g 1 - 2t h el e f ti sc u r v eo fs p ra n g l er e s p o n d e dt or e f l e c t i v i t y , t h er i g h ti sc u r v eo fs p r w a v e l e n g t hr e s p o n d e dt or e f l e c t i v i t y ( 2 ) s p r s 的光学耦合方式 目前，应用于s p r 传感器产生表面等离子体的光学耦合装置非常多，主要 包括：棱镜型，光学波导型，光栅型和光纤型四种【7 】。图1 3 示意了上述形式 的耦合方式，箭头表示入射光路和反射或散射光路。现分别介绍以上四种光学耦 合装置形式： a 、基于a t r 原理的棱镜耦合方式 棱镜耦合方式主要包括o t t o 模式【9 】和k r e t s c h m a n n 【1 明模式。目前应用最广的 是基于a t r 原理的k r e t s c h m a n n 模式。k r e t s c h m a n n 模式是将几十纳米厚的金属 薄膜直接覆盖在棱镜的底部，待测定的介质在金属薄膜下面，消失波在金属薄膜 中透过并发生表面等离子体子共振。金属薄膜的厚度将对测定结果产生重要影 响，一般控制在5 0n l n 左右。各种主要的检测方法( 角度位移，波长位移和成像) 均可应用在此耦合方式中。此外，k r e t s c h m a n n 模式不仅可以灵活地选择被分析 物和各种高分辨的方法，而且为发展多通道s p r 传感器提供了可能。 b 、光学波导结构 光学波导结构s p r 传感器如图1 3 ( b ) 所示。这种结构的工作原理与棱镜 耦合方式的k r e t s c h m a n n 结构十分相近。波导中传播的光波经过表面覆盖有金属 层的区域时，在金属层界面发生全反射。如果表面等离子波( s p w ) 的相位与光 波导模式的相位相符，就会激发s p s 。此时在波导的输出端可以检测到s p r 峰值 曲线。它的突出优点是光路可控，易于小型化和具有良好的稳定性。 4 9 7 5 3 - o o o o o 备譬捉薹配 o 5 o 1 o o 2芍岱暑此 硕士学位论文第一章绪论 ( b ) w a v e g u i d e c o u p l e r 图1 3s p r s 光学耦合方式 ( a ) ：棱镜型，( b ) ：光学波导型，( c ) ：光栅型 其中棱镜型应用最为广泛，本实验即采用棱镜型 f i g 1 - 3o p t i c a lc o u p l i n gm o d e ( a ) ：p r i s mm o d e ，( b ) ：o p t i c a lw a v e g u i d em o d e , ( c ) ：o p t i c a lg r a t i n gm o d e c 、光栅耦合方式 光栅耦合方式的s p r 传感器如图1 3 ( c ) 所示。在这种模式中，金属层与 介质层构成周期性变化的光栅曲面，当入射光照射到光栅表面时，就会发生衍射， 不同的衍射角对应不同的衍射阶。当某一阶衍射光的波矢在界面方向的分量与 s p 的波矢相等时，二者将发生共振。此时对应的衍射阶光强就会大幅降低，甚 至消失。所以光栅耦合模式的s p r 传感器可以通过检测衍射光强分部的方法来 获得与棱镜耦合方式类似的s p r 峰值曲线。 光栅耦合s p r 传感器的优点在于可以利用现代的微加工工艺( 特别是半导体 工艺【l l 】) ，实现传感器微型化和批量生产；另外，这种模式对金属薄膜的厚度 没有严格的限制，便于制作。光栅耦合s p r 传感器的不足之处在于灵敏度较棱 镜耦合方式要低，数学模型与理论计算比棱镜耦合模式要复杂得岁1 2 】，要求被 测样品必须透明。这些不足使得这种模式的应用受到了限制。 d 、光纤耦合方式 光纤耦合结构的s p r 传感系统是以光纤作为光的传输媒介，将普通光纤部 5 硕士学位论文 第一章绪论 分保护层剥离，以代替金属薄膜。检测时，将该部分与样品接触，由于光纤的特 殊性，使得这种模式具有一些突出的优点：它可以非常方便地检测一些人类难于 进入或有害的区域；通过光纤的远距离传输，实现远程检测和分布式检测。此外 这种模式也可达到较高的灵敏度【1 3 】。 ( 3 ) s p r 的特点 s p r 作为一种表面分析方法，目前主要应用的领域包括有机薄膜性质的表 征，测定分子的浓度和质量，蛋白质吸附，层层自组装，以及生物分子识别及其 相互作用的研究，其主要特点如下： a 、免标记：s p r 传感系统是通过对敏感膜折射率变化的检测，从而获得生 物分子相互作用信息的。与通常采用的荧光分析或酶联免疫吸附测定( e l l s a ) 检测方法不同，无需对样品进行纯化或标记。这样就可省去样品的前期准备工作， 缩短了检测周期；此外还可避免标记物对检测可能造成的干扰。 b 、实时检测：s p r 生物传感系统采用的是光学检测手段，信息转换非常快 捷，因此可以对生物分子相互作用的整个过程进行实时检测。这样不但可以大幅 提高检测分析的速度，而且可以通过检测结果的分析，得到作用过程的动力学参 数。 c 、无污染检测：s p r 传感系统所采用的光学检测手段避免了与待测样品的 直接接触，因而不会对样品造成污染，保证了待测样品的长效性。 d 、高灵敏度检测：由于金属膜具有良好的导电性，所以分布于金属膜与敏 感膜界面处的表面等离子波( s p w ) 产生的电磁场主要分布于敏感膜一侧。这就 使得共振条件( 共振角或共振波长) 对敏感膜折射率的变化非常灵敏。正因为如 此，s p r 传感系统具有很高的检测灵敏度，而且可以在很低的生物分子浓度水 平下进行检测。 由于s p r 生物传感系统具有实时、免标记、无污染和高灵敏度检测的突出优 点，所以s p r 传感系统在生物分子及其相互作用的检测等方面具有广阔的应用前 景。 1 3s p r 技术的应用研究 自l i e x l b e r g 等于1 9 8 3 年首次运用s p r 技术进行抗原抗体相互作用分析以 来，s p r 生物传感器已广泛应用于基础生命科学、制药、食品及环境科学等领域。 近几年，新的技术理论和方法学的发展又推动了s p r 生物传感器向小分子的相 互作用研究、药物筛选、临床诊断、细胞膜模拟、蛋白质组学等新兴的应用领域 扩展【8 】 6 硕士学位论文 第一章绪论 1 3 1 生物分子的相互作用 监控小分子代o 5 k d ) 的相互作用是s p r 生物传感器的最重要的新兴应用之 一。b i a c o r e 系列仪器一直用于高亲和力( 1m m o l l ) 的小 分子配体的相互作用研究。d a y 等人比较了s p r 与其它基于溶液的方法如热量 测定、荧光法在研究小分子与酶的相互作用时分别得到的平衡常数、热力学及速 率常数，证明s p r 生物传感器是收集小分子与固定的大分子相互作用信息的一 种非常可靠的技术【1 4 】。s p r 也可用于大颗粒包括病毒、噬菌体和细胞的相互作 用研究。h o f f m a n 将阿尔茨海默淀粉样前体蛋白的重组分泌n 端结构( s a p p r e c ) 固定于金属表面，并在其上流动b 1 0 4 细胞悬液【1 5 】。他们发现如果预先保温可溶 s a p p r e c 与b 1 0 4 细胞则能够完全抑制细胞结合到该表面上，表明s a p p r e c 与细 胞相互作用具有特异性。 1 3 2 蛋白质问相互作用 s p r 生物传感器在复杂分析物的研究中也不管用武之地。h a n s s o n 等将全血 浆、促凝血酶原激酶、钙以及抗凝血剂直接混合在传感器芯片表面，用s p r 监 控血液凝固的时间和抗凝剂对凝固率的影响，该试验结果与那些用监控血液凝固 的标准方法得出的结果非常吻合。基因组测序、生物信息学及分析仪器的迅猛发 展开创了蛋白组学这一领域。目前为止主要采用二维电泳来分离复杂的蛋白质并 采用质谱法鉴定蛋白质。这些研究获得了丰富的数据，同时也给进一步研究蛋白 质结构与功能的关系提出了许多问题。要解决这些问题需要有能研究生物分子识 别及相互作用的高特异性方法。在过去的五年中，s p r b i a ( s u f a e ep l a s m o n r e s o n a n c eb i o m o l e e u l a rl n t c r a c 龙i o na n a l y s i s ) 技术和m a l d i - t o s m s ( m a t r i x a s s i s t e dl a s e rd e s o r p t i o n i o n i z a t i o nt i m 争o f - f l i g h tm a s ss p e c t r o m e t r y u l a g e s ) 技术已成 为公认的分析蛋白质结构与功能的主要手段。s o u l a g e s 等【1 6 1 对细胞的分泌、生长 和分化过程进行了详细的研究，通过分析大量的s p r 光谱数据，得到类脂层和 蛋白质通过两步键合，形成了类脂蛋白质的大分子化合物的反应机理。s p r 技 术也因其高效灵敏无需额外标记等优势，能在保持蛋白质天然状态的情况下实时 提供靶蛋白的细胞器分布、结合动力学及浓度变化等功能信息，为蛋白质组学研 究开辟了全新的模式【1 7 1 。s t o o p 1 8 】利用s p r 技术筛选和选定蛋白质结合功能决定 簇的氨基酸位点，通过深入研究血纤维蛋白溶酶原活性抑制剂p a i i 的突变体结 构功能区域，发现p a l i e 的3 个表面抗原决定簇是其不同生物活性的分子基础。 在造血细胞因子白细胞介素li ( l 1 1 ) 和其受体的分子识别模式研究中，k a r i n 成 功地应用b i a 技术证明了l 11 r 的胞外区d 3 为介导配体结合活性的主要功能区 7 硕士学位论文 第一章绪论 域，而胞外区d z 则在激活配体信号传导方面起重要作用，为正确理解 l 1 1 l 11 r g p l 3 0 分子作用机制提供了必需的数据。 1 3 3d n a 分子问的相互作用 实时追踪d n a 反应的全过程，包括基因装配、d n a 合成延伸、内切酶对双 链d n a 的特异切割等。j o r d a n 等人【1 9 】用s p r 表征了金膜表面d n a 的杂交吸附 及d n a 表面的链亲和素的固定，用s p r 监测了在金膜表面单链d n a 和生物素 标记的寡核苷酸互补序列的杂交反应，表面固定d n a 的绝对覆盖量为 3 x 1 0 1 2 c t l l 2 。o k a h a t a 等人【2 0 】成功地研究了固定在s p r 传感器表面的1 0 3 0 个碱 基的寡核苷酸与互补d n a 杂交反应的动力学，得到的结果与石英晶微天平的结 果一致。c o i n 等人【2 l 】也详细报道了用s p r 技术研究d n a 杂交反应及测定d n a 序列的结果。 1 3 4d n a 与蛋白质相互作用 d n a 与蛋白质之间的相互作用，特别是反应动力学的研究一直没有简便快 捷的方法。以前需要用同位素标记，并且无法测定动力学常数。若采用s p r 技 术，将含目的基因的d n a 片段偶联于传感片表面上，使不同浓度的抑制蛋白流 经传感片表面，从s p r 谱就可以精确地计算出反应的动力学常数和结合亲和力 【2 2 1 。b a b i c 等【2 3 】利用b i a c o r e 仪器研究大肠杆菌的d n a 修复机理。在大肠杆菌 中，大约有1 0 种不同的蛋白质参与了修复过程。他们的研究表明，m u s t 蛋白在 结合错配区以启动修复时，与单链d n a 结合松散，与同源双链d n a 结合与解 离迅速。通过比较m u t s 与8 种可能的碱基错配序列的相互作用，证明m u t s 与 d n a 的结合是碱基特异性的，对g g 错配的亲和力最大。e t s l 癌基因蛋白能 和一些基因的d n a 调控区结合，从而调节这些基因的表达【2 4 1 。以前的研究已确 定能和e t s l 结合的d n a 序列。利用b i a c o r e 仪器，f i s h e r 博士等【2 5 】揭示了e t s l 蛋白和偶联在传感片上结合e t s i 的d n a 的结合，并用合成的含3 7 个氨基酸的 多肽k 3 7 n ( 从蛋白质序列3 6 3 - 一4 0 0 ) ，证明了e t s i 蛋白的结合区域。 1 3 5 抗体一抗原分子相互作用 通过用s p r 技术进行免疫分析，可以识别抗原的种类，测定抗原的浓度， 获得抗原一抗体结合的动力学常数( 结合一解离速率和亲和力常数) 。利用抗原 一抗体亲和力和结合过程中的动态参数，不仅可以研究结构与功能的关系，而且 对选择不同抗体用于治疗、检测、诊断等都具有非常实用的价值【2 2 1 。k a r l s s o n 2 6 】 硕士学位论文 第一章绪论 等以s p r 技术研究h i v 2 1 核心蛋白p 2 4 与其单克隆抗体m a b 的结合动力学。 a l a e d i n i 等【2 7 】应用s p r 技术成功地检测了自身免疫神经系统疾病患者体内特异 性抗体( a n t i g m lg a n g l i o s i d ea n t i b o d i e s ) 滴度，并证明以s p r 技术检测特异性抗 体相比于传统e l i s a 技术在灵敏度、精确性及检测速度方面皆有优势。a r i g a 2 s 】 以脂质体捕获联用s p r 技术鉴定1 3 淀粉样蛋白( a m y l o i db e t a - p r o t e i n ) 与神经节 苷脂的结合特异性，并获得到不同1 3 淀粉样蛋白与g m l 神经节苷脂的结合常数。 蛋白质s 是血液凝固的生理性抑制剂，p s 的失活交导致血栓的发生。g u e r m a z i 2 9 】 等以b i a 技术筛选能使p s 活性下降的生物活性分子用来证明在系统性经斑狼疮 s l e 患者体内存在抗p s 的自身免疫抗体，从而阐明了s l e 性血栓病的分子免疫 学病理机制。 1 3 6 药物筛选及鉴定 药物筛选是s p r 技术的另一个应用热点瞄】。生物传感器的高速、自动化及 高数据分辨率的特点使它们成为药物筛选领域的理想仪器。当前发展中的药物筛 选生物传感器测试包括两方面内容，一是从文库中筛选出与靶蛋白结合的化合 物，二是进行一般的a d m e ( f l p 吸附、分散、代谢、分泌) 试验。a d m e 检验的是 一种化合物穿透膜组分并结合血清中载体蛋白的能力。检查一种药物穿过膜屏障 ( 例如小肠壁) 的能力是决定其功效的第一步。一旦药物穿过小肠壁进入到血液， 某些血清蛋白会与之结合，并能协助药物毒性和分泌的调控。人血清白蛋白是药 物在体内的主要转运蛋白，硒c h 等运用b i a 技术以w a r f a r i n 为模式药物深入研 究药物一人血清白蛋白互作的动态过程，并获得两者的结合常数；f r o s t e l l k a r l s s o n 等将人血清白蛋白( h s a ) 固定在传感器表面，证明包含2 1 种化合物 的一组分析物具有h s a 亲和力，能够被快速、准确地筛选出来【3 0 1 。美国的 s c h e r i n g - p l o u g h 制药公司【3 l 】用s p r 技术发展出简便、快速、准确地筛选细胞因 子拮抗物的方法。文献【3 2 】研究了静脉内药物的传输和分布，也有许多文献研究 了细菌对万古霉素等产生抗药性的机理，均取得了很好结果。 1 3 7 临床诊断 作为传统的临床监控装置的一种补充仪器，s p r 光学生物传感器发挥了越来 越大的作用【8 】。利用生物传感器鉴定和评价潜在的疫苗组分，监测和定量测定病 人血清中的生物药剂和抗体滴度的可行性，跟踪检测动物模型，人类临床试验和 多种台式应用中的生物反应物【33 1 。r e g e n m o r t e l 利用生物传感器鉴定和评价潜在 的疫苗组分【3 4 1 。o h l s o n 等证明了运用生物传感器监测和定量测定病人血清中的 生物药剂和抗体滴度的可行性 1 35 1 ，这项研究展示了生物传感器独特地适用于监 9 硕士学位论文 第一章绪论 控微弱的相互作用0 0 - l o o ov m o l l ) ，而且能够在无需膜表面再生的情况下连续 地工作。生物传感器提供了一种在线读取病人血清中的特异分析物水平的方法， 也可用来跟踪检测动物模型、人类临床试验和多种台式应用中的生物反应物【3 6 1 。 1 3 8 食物检测与环境监控 食品、乳品工业和环境保护工程中的质量控制、污染物检测、浓度分析是生 物传感器飞速扩大的应用领域之一【8 】。例如，生物传感器已经用于测定食物中营 养物和抗生素的水平，食品中的细菌和真菌污染量，以及空气或水传播的毒素， 杀虫剂和除草剂【3 3 1 。i n d y k 等利用生物传感器分析技术进行非内源性r 蛋白结合 测试，自动检测出牛奶、肉类、肝脏等一系列食物中的维生素b 1 2 的含量【3 7 1 。 r a s o o l y 使用b i a c o r e 3 0 0 0 生物传感器快速检测出了食物中葡萄球菌肠毒素b ( s e b ) 的浓度【3 引。生物传感器的在线分析能力和高灵敏度、微量样品需求的特 点，使得这种仪器成为食品及环境安全监控的理想工具。大气环境监测中，s 0 2 是酸雨酸雾形成的主要原因，传统的检测方法很复杂，m a r t y 等人将亚细胞类脂 类固定在醋酸纤维膜上，和氧电极制成安培型生物传感器，可对酸雨和酸雾样品 溶液进行检测【3 刿。 1 3 9 气体检测 s p r 技术以其突出的优越性，为气体的检测提供了一种崭新的检测手段，已 经受到了广泛重视。s p r 技术的高灵敏度使得大量痕量气体成分的检测变成了 可能。在化学领域，s p r 技术被广泛应用于各种物质的检测，其研究对象包括： 常见的易燃易爆和有毒气体【删、重金属离子【4 1 1 、非金属离子【4 2 】、烃类【4 3 】、醇 类洲、卤代烃【4 5 1 、醛类闱 1 4 影响表面等离子体激元共振光谱的因素 表面等离子体激元共振光谱主要受金属膜的种类及厚度、吸附层的厚度及折 射率、入射光的波长、介质溶液的折射率、温度等因素的影响。 1 4 1 金属膜种类对表面等离子体激元共振光谱的影响 不同元素的性质各不相同，因此，选择不同种类的金属材料作为表面等离子 体激元共振的基体膜将会对s p r 光谱产生很大的影响。因为s p r 是利用反射光 来研究各种体系，所以在选用金属时首先应该考虑反射率较高的金属。在可见光 l o 硕士学位论文 第一章绪论 范围内，a g ，a l ，a u 和c u 几种金属的反射率高且随着波长变化而变化的幅度 较小。其中，a g 膜的反射率最高，越膜的最高反射率区域最宽。c u 膜和a u 膜 的最高反射率区域相对较窄。对于1 0 0n m 厚的a g 和舢膜，当波长大于5 0 0n m 时，反射率达9 5 以上且基本保持为一定值。对于同样厚度的a u 膜，在波长5 5 0 衄以上时与a g 、a 1 有相同的结果。但是，灿膜的稳定性差，非常容易氧化， 影响s p r 的测定，a g 膜的稳定性也不是很理想，但是比a 1 膜要好，且由于高 反射率和较高的测定灵敏度而成为s p r 的首选。a u 膜具有较强的化学惰性，稳 定性最好，也成为s p r 传感器制作时常用的金属膜之一，尤其是在银膜不能使 用的体系中。 1 4 2 金膜厚度对表面等离子体激元共振光谱的影响 金膜厚度是影响s p r 高灵敏测量的关键常数。图1 4 中显示了一系列采用 f r e s n d 理论计算的不同a u 膜厚度的反射率强度曲线【4 7 】，使用b k - 7 玻璃棱镜 空气界面。金属膜厚度为0n m 时，是指对b k - 7 玻璃棱镜空气界面的反射率而 言。从图中我们可以看到，当入射角大于临界角4 1 3o 时都可以观察到全反射。 当金膜厚度越接近5 0n m 时，s p r 反射率曲线变得越来越窄，越来越尖，并在最 后达到一个最小的反射率。这个产生最小值的角度代表着表面等离子体激元共振 角度。印。当金膜厚度在5 0 衄以上，反射曲线还是很尖但是反射光增强( 共振 减弱) ，当金膜厚度达到1 5 0n m 或是以上时就不能使入射光与表面等离子体激 元发生共振。此时，入射角度发生变化时反射率不再有变化而只是表现为一个稳 定的常数，约为9 2 。为了在s p r 测量的过程中得到最大的灵敏度，最好能得 到一个非常尖的、最小的反射率接近o 的反射曲线。因此，金膜厚度一般选用 5 0 n m 。 硕士学位论文第一章绪论 叼l eo fi n c i d e n c e 图1 - 4 一系列f r e s n e l 计算的不同金膜厚度的s p r 反射率曲线在5 0 n m 时，s p r 角的 反射率相应的有极大的降低，因此，在很多条件下s p r 测量选择此厚度 f i g 1 - 4c h a n g e si nt h et h et h e o r e t i c a ls p rs p e c t r u mc a u s e db ya l t e r a t i o n s i nt h et h i c k n e s so fa u f i l m t h er e f l e c t i v i t yo fs p r a n g l eh a sg r e a t l yr e d u c e da c c o r d i n g l ya t5 0n m 1 4 3 吸附膜厚度对表面等离子体激元共振光谱的影响 金膜表面吸附物质会影响表面等离子体激元的产生，进而影响表面等离子体 激元共振光谱。我们可以知道随着吸附膜厚度的增加，膜的s p r 共振角度移向 更大的值，并且反射率曲线变的更宽。 1 4 4 吸附膜折射率对表面等离子体激元共振光谱的影响 不但吸附膜的厚度会影响表面等离子体激元共振光谱的共振角度位移，吸附 膜的折射率也会影响共振角度的位移。图1 - 5 【4 8 1 是7 5n m 的膜在不同折射率的 理论计算反射率曲线，n 分别是1 3 ，1 4 ，1 5 ，1 6 和1 7 。从图中可以看到，与 膜厚度增加的情况相似，相同厚度下折射率大的膜s p r 共振角度的位移大。 1 2 盖-暑可口篁擎正。p 硕士学位论文第一章绪论 图1 - 5 不同折射率薄膜上的s p r 反射率曲线这些曲线是7 5 a m 的膜在不同折射率计 算的反射率曲线，折射率分别为n - - 1 3 ，1 4 ，1 5 ，1 6 ，1 7 f i g 1 - 5c h a n g e si nt h et h e o r e t i c a ls p rs p e c t u mo a u s o db ya l t e r a t i o n si nt h er e f r a c t i o ni n d e x o ff i l m s t h i c k n e s so ft h ef i l m si sa t7 5 n m ，r e f r a c t i v ei n d e x sa r er e s p e c t i v e l y1 3 、1 4 、 1 5 、1 6 、1 7 1 4 5 温度对s p r 信号的影响 金属膜表面介质水溶液折射率的变化会影响s p r 信号的准确测定，介质水 溶液折射率的变化受到溶液的性质，浓度和温度的变化。溶液的性质和浓度在具 体的实验中是一定的。介质溶液温度的变化是影响s p r 信号准确测定的一个重 要的因素。 t e m p e r a t u r e 1 3 l，善u喾m正书 一b r x ) f 8j、篇童星 硕士学位论文 第一章绪论 图1 - 6 溶液折射率与温度的关系图( 0 1m 0 1 l 1n a c l 溶液) f i g 1 6t e m p e r a t u r ed e p e n d e n c eo f t h er e f r a c t i v ei n d e xf o ro 1mn a c l 在图1 - 6 4 9 】中，随着溶液温度的升高，溶液折射率逐渐减小；从图1 5 可知 道折射率越大时，s p r 共振角也越大；因此，介质溶液温度升高会导致s p r 共 振角负移。 图1 - 75 0 衄a g 膜的s p r 共振波长与入射角随温度变化的关系( 水及棱镜的折射率分 别为1 3 3 3 与1 5 4 0 ) f i g 1 7s p r r e s o n a n tw a v e l e n g t ha saf u n c t i o no fa n g l eo fi n c i d e n c ea td i f f e r e n tp e m p e r a t u r c sf o r a gf i h nw i t hn a = 1 3 3 3a n dn p - 1 5 4 0 t h i c k n e s so f f i h na tr o o mt e m p e r a m r ei s 丘x e da t5 0 1 1 1 1 1 如图1 7 【删所示，从图中可看出在入射角一定时，金属膜表面温度越高，s p r 共振波长( 即s p r 共振角) 越大，因此，金属膜温度升高将导致s p r 共振角正 移。 1 5 激光热效应的研究进展 1 5 1 激光热效应的研究应用 激光是一种高能量的光，具有明显的热效应。从能量的角度来看，当激光作 用于物质时，物质分子吸收入射到其内部的光子能量，其振动和转动加剧，即激 光光子能量转化为物质分子的动能。分子振动动能即为通常意义上的热能。这部 分热能先储存在直接受照射的物质中，然后逐渐传递给周围部分，或以热辐射的 1 4 一譬墨吾墨暑参誊譬霉3_ 硕士学位论文 第一章绪论 形式辐射出去。激光作用于材料表面的热转换主要是通个三种途径进行，即电子 传导、声子热传导和辐射热传导。通过激光能量的吸收和热扩散，引起物体边界 上和内部的热流运动，使得各处的温度不同程度的上升。激光热效应在许多领域 得到了广泛的应用。 热效应是激光生物学中最重要的生物效应，激光治疗原理就基于热效应，其 中局部温度的升高是最重要的参数变化。激光热作用现已广泛用于激光手术和治 疗中。激光首先应用于眼科治疗疾病，开创了激光在医学上的应用；随后激光刀 作切割实现取得成功；激光治疗肿肿瘤通过凝结局部组织避免切除