大提质粒步骤完整版.doc

大提质粒步骤试剂配制：1. 1M NaOH (400ml )：分子量为40，秤取16g NaOH，溶于400ml DDW中。2. 2M Tris-HCl (500ml)：分子量为121.14，秤取121.14g Tris，溶于400 ml DDW中，用HCl调节pH值为8.0，定容至500ml。3. Buffer P1 (1000ml)：用50ml离心管量取20ml 0.5M的EDTA，然后量取25ml 2M 的Tris-HCl，加入700ml DDW，用HCl调节pH值为8.0，定容至1000ml。 4. Buffer P2（1000ml）：称取10g SDS，放入1000ml的玻璃瓶中，然后加入750ml DDW，最后加入200 ml 1M的NaOH，混匀，室温放置过夜，使其自溶。(注：不需要定容，严格按步骤操作。)5. Buffer P3 (1000ml)：秤取294.42g乙酸钾，溶于800ml DDW中，用冰醋酸调节pH值为5.5，定容至1000ml。6. Buffer QBT（1000ml）：分别称取NaCl 43.83g，MoPS 10.46g，加入600ml DDW，用NaOH调节pH值为7.0，然后加入150ml 异丙醇，定容至1000ml。7. Buffer QC（1000ml）：分别称取NaCl 58.44g，MoPS 10.46g，加入600ml DDW，用NaOH调节pH值为7.0，然后加入150ml异丙醇，定容至1000ml。8. Buffer QF（1000ml）：称取NaCl 73.05g，量取2M Tris-HCl 25ml，加入800ml DDW，用NaOH调节pH值为8.5，然后加入150ml 异丙醇，定容至1000ml。9. 10TE Buffer：量取1MTris-HCl(pH8.0) 100ml，500mM EDTA(pH8.0) 20ml，加入800mlDDW，均匀混合后定容至1L。10. 配制RNase：(1) 将RNase粉末溶于10mM的乙酸钾（即Buffer P3），配制成浓度为10mg/ml的溶液。(2) 将配好的RNase溶液100加热10min, 随后冷却至室温。(3) 用1M 的Tris-HCl调节pH值至7.4，大约需要0.1体积的Tris-HCl。(4) 分装RNase溶液于1.5ml EP管中，-20保存。 使用前注意事项： 在提low-copy（低拷贝）质粒时，增加lysis buffer（裂解液）体积可以提高碱性裂解的效率以及DNA的产量。 Buffer P1在使用前加RNase A solution（RNA酶溶液），一瓶Buffer P1加入一小瓶RNase A（用前瞬时离心），终浓度为100ug/ml。 检测Buffer P2是否有因低温储存而引起的SDS沉淀。如有必要，将SDS在37溶解。 Buffer P3在4下预冷。1、 在选择平板上挑选一个单克隆，在相应抗性的LB25ml中进行初培养：37摇床300rpm下初培养约8h。 （使用的管子或烧瓶至少是培养体积的4倍。）2、将初培养菌液用选择性LB培养基稀释到1/500到1/1000。High-copy plasmid（高拷贝质粒）：用100-200ul初培养液接种100ml介质。Low-copy plasmid（低拷贝质粒）：用250-500ul初培养液接种500ml。37摇床300rpm下初培养约12-16h。OD600=4-5，此时培养细胞浓度可达到约3-4109个/ml。 (使用的烧瓶或容器至少是培养体积的4倍。）3、4离心机6000g离心15min收集细菌细胞。（如果想在此步骤停止以后再做，把细胞-20冻存。）4、 10mlBuffer P1重悬细菌细胞。（确保Buffer P1里已经加入RNase A。为使细菌完全重悬，用振荡器充分溶解菌液沉淀。）5、 加入10mlBuffer P2，轻轻上下颠倒封盖的管子4-6次彻底混合溶液，室温（15-25）下放置5min。 （不要斡旋，因为斡旋能导致基因组DNA被剪断。裂解液会有粘性。溶解反应不要超过5min。装有Buffer P2的瓶子用后要立即盖紧，以免被空气中的CO2酸化。）6、 加10ml预冷的Buffer P3，立即轻轻上下颠倒4-6次混匀，冰上放置20min。 （预冷的Buffer P3和冰上放置能促进沉淀。加入Buffer P3后有乳白色的物质形成且裂解液粘性减少。沉淀物中含有基因组DNA、蛋白质、细胞残渣。） 7、 20 min后，6000 g 4离心25min。同时，向柱子中加入10ml Buffer QBT，使其全部流过柱子，平衡柱子。8、 剪一小块纱布，折叠4层，放于柱子上部。将离心后的液体缓慢倒入纱布中，最后挤压纱布使其中的液体全部直接过滤到柱子中，使其充分流过柱子。（如果此步不只1个质粒时，挤压不同质粒的纱布时，一定要换手套，避免污染质粒）9、 用230mlBuffer QC (wash buffer)洗柱子。 （Buffer QC通过重力流通过柱子。第一次清洗就足够去除大部分质粒DNA沉淀中的污染物。但是，当培养体积较大或者菌种会产生大量的糖类时第二次清洗是必要的。）10、洗脱质粒：向柱子中加15ml Buffer QF，靠重力作用使其全部通过柱子，收集洗脱液。(注：要收集到一个新的管中。)11、沉淀质粒：向收集的液体中，加入0.7倍体积（即10.5 ml）异丙醇，轻轻混匀，6000 g 4离心25 min。（异丙醇可以充分沉淀质粒，但同时会沉淀很多盐分）12、清洗质粒：离心后，注意质粒贴壁的方向，应从其侧面倒掉废液。用5ml70%室温保存的乙醇洗涤DNA颗粒，将含有DNA的乙醇转移到1.5ml的EP管中， 6000 g 4离心10min，轻轻吸弃废液。（质粒中的乙醇会影响后续反应中的酶活性）13、 将EP管倒扣于吸水纸上，空气干燥5-10min，用适当体积的TE溶解DNA。14、 柱子回收： (1)先用自来水冲洗柱子内外；再用蒸馏水和DDW冲洗柱子内外。 (2)20ml 1M HCl流过柱子一遍，流完后再加10ml的1 M HCl，使其部分