（病原生物学专业论文）结核病拟诊病例细菌学诊断研究及pcr技术的建立.pdf

a s t u d yo nb a c t e r i o l o g i c a ld i a g n o s i sm e t h o do f s u s p e c t e dp a t i e n to ft b a n de s t a b l i s ht h ep c r s y s t e mf o rd e t e c t i o no f m y c o b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i s m a s t e rc a n d i d a t e ：z h a n gy u a n y u a n a d v i s o r ：p r o f w a nk a n g l i n s t a t ek e y l a b o r a t o r yf o ri n f e c t i o u sd i s e a s ep r e v e n t i o na n dc o n t r o l ； n a t i o n a li n s t i t u t ef o rc o m m u n i c a b l ed i s e a s ec o n t r o la n d p r e v e n t i o n ， c h i n e s ec e n t e rf o rd i s e a s ec o n t r o la n dp r e v e n t i o n 舢4m 6 胛08jim 8 川川脚y 目录 中文摘要l a b 啦蛾3 第一部分：结核病拟诊病例细菌学诊断研究 1 l j l b 舌6 材料和方法8 结果1 7 讨论2 8 小结3 4 第二部分：p c r 技术的建立 ，j i e j u 舌3 5 材料和方法3 8 结果4 5 讨论5 3 小结5 8 附录5 9 参考文献6 1 综j 苤6 4 致谢7 4 已发表论文 7 5 m t b n w m m t b c b c g p n b t c h i n h s m r f p e m 呛 s e s p p c r r p m d n a d n l l p m i l l s e e m l m m u m a b b r e v i a t i o n m y c o b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i s 结核分支杆菌 n o n m b e r c u l o u s i sm y c o b a c t e r i a 非结核分支杆菌 m y c o b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i sc o m p l e x 结核分支杆菌复合体 b a c i l l u sc a l m e t t e g u e r i n p - n i t r ob e n z o i ca c i d 卡介苗 对硝基苯甲酸 2 - t h i o p h e n e c a r b o x y l i ca c i dh y d r a z i d e 噻吩2 羧酸肼 i s o n i a z i d s t r e p t o m y c i n r i f a r m p i c i n s e n s i t i v i t y s p e c i f i c i t y r e v o l u t i o np e rm i n u t e d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d d e o x y n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e m i n u t e s e c o n d m i l l i l i t e r m i l l i m o l a r m i c r o m o l e 异烟肼 链霉素 利福平 乙胺丁醇 敏感度 特异度 聚合酶链式反应 转分钟 脱氧核糖核酸 脱氧核苷三磷酸 分钟 秒 毫升 毫摩尔 微摩尔 巾国疾病预防控制中心硕 ：学位论文 论文摘要 结核病拟诊病例细菌学诊断研究及p c r 技术的建立 硕士研究牛：张媛嫒 导师：万康林研究员 单位：传染病预防控制国家重点实验室 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 结核病是一种世界范围内最为重要的传染性疾病。随着h i v a i d s 感染的流行 和不规则化疗引起的耐药菌的传播，使结核病再次成为严重的全球性公共卫生问题。 我国是结核病高负担国家之一，患病人群数量巨大，面临着严峻的结核病流行形势。 但由于种种原因，我国结核病的基础性研究工作明显滞后，缺乏有效的早期、快速、 特异的诊断手段。因此，加强结核病的实验室诊断技术研究，对及时发现确诊疾病、 有效治疗控制传染源、从而控制结核病的流行具有极为重要的意义。 我们采用抽样调查方法，选择陕西省西安市为调查点，根据全国结核病防治 工作手册中结核病拟诊病例标准，调查收集2 0 0 5 年5 8 月西安市十三个区县结 防所门诊所有拟诊病例痰标本。采用改进的痰涂片显微镜检查和痰培养方法，对5 7 4 例拟诊病例的1 6 0 2 份痰标本，进行了传统的结核病细菌学检查。痰标本涂片染色阳 性者共1 9 0 份，1 1 8 6 ；阴性1 4 1 2 份，8 8 1 4 ；同一病例的三份痰标本涂片检验 阴性4 6 1 份，8 0 3 1 ；一份检出阳性者5 8 份，1 0 1 0 ；两份阳性者3 3 份，5 7 5 ； 三份均阳性者2 2 份，3 8 4 。培养阳性共2 8 5 份，1 7 7 9 ；阴性1 2 8 8 份，8 0 4 0 ； 同一病例的三份痰标本培养阴性4 2 3 例，7 3 6 9 ：一份检出阳性者6 1 例，1 0 6 3 ； 两份阳性者4 7 例，8 1 9 ：三份均阳性者4 3 例，7 4 9 。就拟诊病例而言，涂片阳 性者1 1 3 例，1 9 6 9 ，培养阳性者1 5 l 例，2 6 3 1 ，其中涂阳培阳1 0 9 例，涂阳培 阴4 例，涂阴培阳4 1 例，涂阴培阴4 2 0 例。根据结核病细菌学检验规程规定，痰涂 片或痰培养阳性的病例即为细菌学检测阳性的病例共1 5 4 例，阳性率为2 6 8 3 。 中围疾病预防控制j ，心硕： ：学位论文 从1 3 7 例病例痰标本中分离到2 5l 株分支杆菌菌株，采用鉴别培养基培养法进 行了菌种鉴定，6 7 8 8 为结核分支杆菌感染所致，5 8 4 为牛分支杆菌所致，1 1 6 8 为非结核分支杆菌所致，1 4 6 0 为混合感染，其中1 1 6 8 为结核分支杆菌加牛分支 杆菌，2 9 2 为结核分支杆菌加非结核分支杆菌。菌种鉴定结果表明1 4 6 的病例由 非结核分支杆菌感染，n t m 感染情况不容忽视。 筛选分支杆菌菌株1 3 7 株进行药物敏感性实验，对四种抗结核一线药物( s m ， r f p ，i n h ，e ) 全部敏感的菌株为9 4 株，6 8 6 1 ；耐药菌株4 3 株，3 1 3 9 ， 其中，单耐药菌株1 0 株，7 3 0 ；多耐药菌株3 3 株，2 4 0 9 。本研究采用的是抽 样调查方式，病例包含了未经治疗的初治病人，因此结果反映的是当地分支杆菌耐 药的真实情况。 针对结核分支杆菌复合体i s 6 11 0 插入序列设计引物i n s l 和i n s 2 ，对西安市5 7 4 例拟诊病例的1 6 0 2 份痰标本和分支杆菌标准株进行p c r 检测，对r v 、9 3 0 0 6 、b c g 标准株的最小检出量分别达到1 0 2 ，1 0 3 ，1 0 3 个细菌毫升，能够特异地检出结核分 支杆菌复合体。以同一病例的三份痰标本中一份以上p c r 检测结果为阳性，即判定 该病例p c r 检测结果阳性为判断标准，在p c r 检测的5 7 4 例拟诊病例中，p c r 检 测阳性病例2 4 1 例，4 2 ；检测阴性病例3 3 3 例，5 8 ，经f 检验，p c r 检测阳性 率高于细菌学检验方法，二者差异具有显著统计学意义。评价p c r 检测方法的敏感 度和特异度分别为6 7 5 3 和7 4 7 6 。结果表明，p c r 检测方法具有较好的敏感性和 特异性，具有较好的应用前景。在p c r 检测过程中使用外部阴性对照和阳性对照， 很好地控制了由于实验条件和环境而产牛的假阳性和假阴性问题。 本研究结果直接反映出西安市分支杆菌感染的真实情况，具有重要的流行病学 意义。在研究中，对传统的结核病细菌学检测方法进行了改进，并在实际应用中取 得了很好的效果。评价p c r 检测分支杆菌方法的敏感度和特异度，探讨了p c r 在 结核病实验室诊断中的应用前景，为建立p c r 标准操作程序和质量控制体系提供了 基础。 关键词：分支杆菌；拟诊病例：细菌学检测：聚合酶链式反应 2 1 ，幽疾病预防控n q , 心硕二t 学位论文 a b s t r a c t as t u d yo nb a c t e r i o l o g i c a ld i a g n o s i sm e t h o do f s u s p e c t e d p a t i e n to f t ba n de s t a b l i s ht h ep c r s y s t e mf o rd e t e c t i o no f m y c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i s m a s t e rc a n d i d a t e ：z h a n gy u a n y u a n a d v i s o r ：p r o f w a nk a n g l i n s t a t ek e y l a b o r a t o r yf o ri n f e c t i o u sd i s e a s ep r e v e n t i o na n dc o n t r o l ； n a t i o n a li n s t i t u t ef o rc o m m u n i c a b l ed i s e a s ec o n t r o la n dp r e v e n t i o n , c h i n e s ec e n t e rf o rd i s e a s ec o n t r o la n dp r e v e n t i o n d u e l a r g e l yt ot h ee p i d e m i co fh i v a i d sa n dt h ee m e r g e n c eo fm u l t i d r u g r e s i s t a n t 膨t u b e r c u l o s i s ( m d r - m t b ) t u b e r c u l o s i sf i b ) h a sb e c o m eo n eo ft h em o s ti m p o r t a n t i n f e c t i o u sd i s e a s ea n db e c o m e st h ep u b l i ch e a l t hp r o b l e ma l lo v e rt h ew o r l da g a i n c h i n a i so n eo ft h eh i g h - b u r d e nt bc o u n t r i e sw i t ha l a r g en u m b e ro ft bp a t i e n t s ，a n ds t i l lf a c e d t oa ns e v e r ep r e v a l e n c es i t u a t i o no f1 3 3 b u tt h eb a s i cs t u d yo ft bi s o b v i o u s l y b e h i n d h a n di nc h i n a e s p e c i a l l y , i ti sl a c ko f e a r l y , r a p i d ，s p e c i a ld i a g n o s i sm e t h o d s o s t r e n g t h e n i n gs t u d yo nt h er a p i dl a b o r a t o r yd i a g n o s i sm e t h o d so ft bi sv e r yi m p o r t a n tf o r c a s e - f i n d i n ga n dt bc o n t r 0 1 x i a nc i t yw a sc h o o s e da st h ei n v e s t i g a t o r yc i t yf o rt h i ss t u d ya n dt h es a m p l e i n v e s t i g a t i o nw a sc a r r i e do u t a l lt h es p u t u ms p e c i m e n sw e r ec o l l e c t e df r o mt h e s u s p e c t e dp a t i e n t sw h os u f f e r e df r o mt ba c c o r d i n gt ot h ec h i n e s en a t i o n a lh a n d b o o ko f t bp r e v e n t i o na n dc u r e ( 1 9 9 9 ，m o h ) 1 6 0 2s p u t u ms p e c i m e n sc o l l e c t e df r o m5 7 4t h e s u s p e c t e dp a t i e n t sw e r ed e t e c t e db yi m p r o v e db a c t e r i o l o g i c a ld i a g n o s i sm e t h o d s 19 0 ( 11 8 6 ) o fs p e c i m e n st e s t e df o rs m e a rs l i d em i c r o s c o p yw e r es m e a rp o s i t i v e ，1 41 2 ( 8 8 1 4 ) w e r en e g a t i v e ，a n d2 8 5 ( 17 7 9 ) o fs p e c i m e n st e s t e df o rc u l t u r ew e r ec u l t u r e p o s i t i v e ，12 8 8 ( 8 0 4 0 ) w e r en e g a t i v e o ft h es u s p e c t e dp a t i e n t st h e r ew e r e113 ( 19 6 9 ) 3 r i t 圜疾病预防控制中心硕士学位论文 w e r es m e 国f fp o s i t i v e ，i n c l u d i n g5 8 ( 10 10 ) w i t ho n ep o s i t i v ep u t u ms p e c i m e n ，3 3 ( 5 7 5 ) w i t ht w os p u t u ms p e c i m e n sa n d2 2 ( 3 8 4 ) w i t ht h r e es p u t u t ms p e c i m e n s ，a n d 151 ( 2 6 31 ) w e r ec u l t u r ep o s i t i v e ，i n c l u d i n g61 ( i0 6 3 ) w i t ho n e p o s i t i v es p u t u m s p e c i m e n ，4 7 ( 8 19 ) w i t ht w os p u t u ms p e c i m e n sa n d4 3 ( 7 4 9 ) w i t ht h r e es p u t u t m s p e c i m e n s i nt h ep a t i e n t st h e r ew e r e10 9w i t hs m e a rp o s i t i v e ( s + ) a n dc u l t u r ep o s i t i v e ( p + ) ，4w i t hs + a n dc u l t u r en e g a t i v e ( p 一) ，4 1w i t hs a n dp + ，a n d4 2 0w i t hs a n dp 1 5 4 p a t i e n t sw e r ed i a g n o s e dw i t ht u b e r c u l o s i sb ys m e a ro rc u l t u r ep o s i t i v er e s u l t ，o nt h e c r i t e r i ao f b a c t e r i o l o g i c a lm e t h o d so ft h ed i a g n o s i so ft bi nc h i n a t h ep o s i t i v er a t ew a s 2 6 8 3 。 2 51 m y c o b a c t e r i u ms t r a i n sw e r ei s o l a t e df r o m13 7c a s e sa n di d e n t i f i e db yc u l t u r e m e d i u mw i t hd r u g o fa l lc a s e s6 7 8 8 w e r ei n f e c t e d b ym t b ，5 8 4 b ym b o v i s ， 11 6 8 b yn t m ( n o n - t u b e r c u l o s i sm y c o b a c t e r i u m ) 14 6 0 w e r em i x i n f e c t e db ym t b ， n t ma n dm b o v i s ，i nw h i c h1 1 6 8 w e r ei n f e c t e dw i t hm t ba n dm b o v i s 。a n d2 9 2 w e r ei n f e c t e dw i t hm t ba n dn t m t h er e s u l ts h o w e dt h a t1 4 6 o fa l it h ev i c t i m s a s s o c i a t e dw i t ht h ei n f e c t i o no fn t ma n dt h es i t u a t i o no fn t m e p i d e m i cs h o u l db ep a ym o r e a t t e n t i o n 13 7m t bs t r a i n si s o l a t e df r o mt h ep a t i e n t sw e r et e s t e df o rt h es e n s i t i v et of o u rd r u g s ， s t r e p t o m y c i n ( s m ) ，r i f a r m p i c i n ( r f p ) ，i s o n i a z i d ( 州h ) a n de t h a m b u t o l ( e m s ) ，t h e d r u gr e s i s t a n c er a t ew a s31 3 9 ( 4 3 13 7 ) ，i n c l u d i n gl0 ( 7 3 0 ) s t r a i n sw i t hr e s i s t a n c et o o n l yo n ed r u ga n d3 3 ( 2 4 0 9 ) s t r a i n sw i t hr e s i s t a n c et om o r et h a no n ed r u ga ts a m et i m e t h er e a s o no ft h el o w e rd r u g r e s i s t a n tr a t ec o m p a r e dw i t ht h ep r e v e n i e n tr e p o r t sw a s p a r t l yt h ec o l l e c t i o ne a s e si n c l u d i n gt h eu n t r e a t m e n tp a t i e n t s b u tt h er e s u l t ss h o w e dt h a t i tr e a l l ym i r r o r e dt h es i t u a t i o no f t h ed r u g - r e s i s t a n tm y c o b a c t e r i u me p i d e m i c w ed e v e l o p e da l li n - h o u s ep c rt od e t e c tm t bi nc l i n i c a ls p e c i m e n ，d e s i g n e da p a i r o fp r i m e r s ( i n s 1 & i n s 2 ) a c c o r d i n gt ot h ei s 6 1l0i n s e r t i o ns e q u e n c e t h ep c rw a s u s e dt od e t e c tt h es p u t u ms p e c i m e no ft h es u s p e c t e dp a t i e n t sf r o mx i a nc i t ya n dt h e s t a n d a r ds t r a i n s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h em i n i m u md e t e c t i o nq u a n t i t yt oh 3 7 r v 、 9 3 0 0 6 、b c gi s l 0 2 ，1 0 5 ，1 0 3b a c t e r i a m lr e s p e c t i v e l y , a n dt h em t bc o m p l e xc o u l db e d e t e c t e ds p e c i f i c a l l y a m o n g5 7 4t e s t e dc a s e s ，2 41 ( 4 2 ) t e s t e dw e r ep o s i t i v e ，3 3 3 ( 5 8 ) t e s t e dw e r en e g a t i v e t h ep o s i t i v ep a t i e n t sw e r ed e t e r m i n e di fa tl e a s to n es p e c i m e n 4 一一一 尘笪鉴堕堡堕丝型! ：坚堡：兰兰垡笙奎 t e s t e dw i t hp c r p o s i t i v e t h ep o s i t i v er a t eo fp c rw a sd i f f e r e n tf r o mb a c t e r i o l o g i c a l d i a g n o s i sm e t h o d sb yc h i s q u a r es t a t i s t i c s e s t i m a t et h es e n s i t i v i t ya n ds p e c i f i c i t yo fp c r t h es e n s i t i v i t ya n ds p e c i f i c i t yo fp c rw a s6 7 5 3 a n d7 4 7 6 r e s p e c t i v e l y t h er e s u l t s s h o w e dt h a tp c rw a sar a p i d ，e f f e c t i v ea n dr e l i a b l em e t h o dw i t hp e r f e c ts e n s i t i v i t ya n d s p e c i f i c i t y w ea d o p t e dt h ee x t e r n a lp o s i t i v ec o n t r o la n dn e g a t i v ec o n t r o lt oc o n t r o lt h e f a l s e - p o s i t i v eo rf a l s e - - n e g a t i v er e s u l tc a u s e db yt h ec o n d i t i o n so ft h ep c r p r o c e d u r ea n d e n v i r o n m e n t t h er e s u l t sw h i c hr e a l l ym i r r o r e dt h es i t u a i o no ft h em y c o b a c t e r i u me p i d e m i ci n x i a nc i t ys h o w e dt h a ti tw a sv e r yi m p o r t a n te p i d e m i o l o g ym e a n i n g i nt h i ss t u d y , w e i m p r o v e dt h eb a c t e r i o l o g i c a ld i a g n o s i sm e t h o d sa n da c q u i r e dp r e f e r a b l ee f f e c t e s t i m a t e d t h es e n s i t i v i t ya n ds p e c i f i c i t yo fp c rf o rd e t e c t i o nt h em t b ，a n dd i s c u s s e dt h ea p p l i e d v a l u ei nt h ec l i n i c a ll a b o r a t o r y , p r o v i d e dt h eb a s eo ft h eq u a n t i t yc o n t r o la n ds t a n d a r d o p e r a t ep r o c e d u r e k e yw o r d s ：m y c o b a c t e r i u m ；s u s p e c t e dp a t i e n t ；b a c t e r i o l o g i c a ld e t e c t i o n ； p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 5 中国疾病预防控制l 1 心硕士学位论文 第一部分结核病拟诊病例细菌学诊断研究 前言 结核病是人类的灾难，是伴随人类历史最长的疾病之一，也是全世界由单一致 病菌导致死亡最多的疾病。二十世纪4 0 年代后，多种抗结核药物的相继出现，结核 病成为可治之症，但是由于耐药结核分支杆菌耐药结核病的出现、h i v a i d s 的流 行等种种原因，使结核病再次成为严重的全球性公共卫生问题。1 9 9 3 年4 月世界卫 生组织提出“全球结核病紧急状态宣言 。 我国同样面临着严峻的结核病流行形势。据2 0 0 0 年全国结核病流行病学抽样调 查数据显示：全人口结核感染率为4 4 5 ，主要集中在2 5 岁及以上人群：活动性和 涂阳肺结核的患病率分别为3 6 7 1 0 万和1 2 2 1 0 万，估算全国有活动性肺结核病人 5 0 0 万，其中涂阳肺结核病人1 5 0 万；每年约有1 3 万人死于结核病，死亡平均年龄 为5 5 2 岁。 目前结核病的实验室诊断是发现传染源( 痰涂片或痰培养阳性病人) 的主要途径 和手段，是确定结核病诊断和化疗方案的直接依据，也是考核疗效、评价治疗效果 的可靠标准。以显微镜查痰发现涂阳病人为丰的方法发现病人是世界卫生组织最近 推行的现代结核病控制策略( d o t s ) 中的五大要素之一。痰涂片镜检和培养是全 球公认的结核病诊断的基本的和标准的方法。随着分子牛物学技术和免疫学技术的 不断发展，越来越多的新方法和新技术应用于结核病的诊断和研究，这对于结核病 人的发现起到了积极的作用。t h 是我们要了解结核病的分布与流行状况，掌握结核 病人耐药形势，仍然离不开痰标本分支杆菌的分离培养，以及后续工作。 结核分支杆菌耐药性的发牛，是当一野牛群体暴露于足以使敏感细菌的生长受到 抑制的药量时，耐药突变株选择性地牛长的结果。大量实验数据表明，在我国多种 抗结核药物耐药菌株的发生和传播越来越广泛，使结核病再度成为难治或可能是不 治之症。近年来，结核病发病率上升以及结核分支杆菌对常用抗结核药物的耐药性 的增多对国家结核病规划实施效果的影响正在日益增加。基于这种状况， 6 q i 囤疾病预防控制巾心硕上学位论文 w h o i u t l d 建议结核分支杆菌耐药性检测的结果应作为评价和改进国家结核病控 制措施的重要参考因素之一。 非结核分支杆菌( n o n t u b e r c u l o si sm y c o b a c t e r i a ，n t m ) 病系由结核分支杆菌、 牛分支杆菌和麻风分支杆菌以外的分支杆菌引起的疾病。n t m 主要引起肺部病变， 尚可引起全身其他部位病变，对严重的细胞免疫抑制者还可引起血源性播散。在美国 和欧洲一些国家，由于a i d s h i v 感染者合并感染n t m 有上升趋势，尤其是a i d s 晚 期最易感染鸟结核分支杆菌，所以对n t m 的研究备受流行病专家和临床医生的关注。 某些n t m 是人体寄生菌，而非致病菌，当上呼吸道存在这些n t m 寄生菌的时候，往 往导致痰菌分离培养阳性，未经菌种鉴定的结果又常使临床医生作出错误判断，对 病人行抗结核治疗方案，造成病人的痛苦和医疗资源的浪费。 我们采用抽样调查方法，选择陕西省西安市为调查点，根据全国结核病防治 工作手册中结核病拟诊病例标准，调查收集陕西省西安市1 3 个区县结防机构结核 病门诊所有拟诊病例痰标本，采用痰涂片和痰培养方法进行细菌学检测，并采用绝 对浓度法对临床分离菌株进行了药物敏感性检测，真实地反映了西安市结核病流行 和结核分支杆菌耐药状况。采用鉴别培养基培养法对所有分支杆菌分离株进行菌种 鉴定，了解了非结核分支杆菌的感染状况，为结核病的预防控制工作提供了一份可 靠的基础科学数据。 7 r i i 困疾病预防控制巾心硕二卜学仿论文 材料与方法 1 、实验材料 1 1 标本来源：本次研究的所有痰标本均来自于陕西省西安市1 3 个区县结核病 防治机构结核病门诊的拟诊结核病患者，每位患者收集三份深咳痰( 清晨痰，夜间 痰和即时痰) 。 1 2h 3 7 r v 标准菌株由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所结核病研究室 提供。 1 3 主要试剂： 1 3 1 金胺o ，碱性复红，亚甲蓝，n 乙酰基l 半胱氨酸，p n b ，t c h 购自 s i g m a 公司。 1 3 2 m c f a r l a n d 标准比浊管由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所提供。 1 3 3 抗结核药物异烟肼，链霉素，利福平，乙胺丁醇购自s i g m a 公司。 1 3 4 石炭酸，乙醇，高锰酸钾，甘油，均为分析纯，购自北京化工厂。 1 3 5 天门冬素，磷酸二氢钾，七水合硫酸镁，柠檬酸镁，丙三醇，马铃薯淀 粉，孔雀绿购自s i g m a 公司。 1 4 试剂配制 1 4 1 9 5 乙醇：9 5 m l 乙醇与5 m l 蒸馏水混合。 1 4 25 石炭酸水溶液：5 m l 苯酚与9 5 m l 蒸馏水混合，6 0 水浴l 小时，以 保证充分混匀。该操作应在通风橱内进行。 1 4 3 金胺o 染色液：0 1 9 金胺o 先溶于1 0 m l9 5 7 , 醇中，充分溶解后，加入 5 石炭酸水溶液至1 0 0 m l ，充分混匀。 1 4 45 盐酸乙醇脱色液：5 m l 浓盐酸和9 5 m l 无水乙醇混合均匀。荧光染色前 以无水乙醇十倍稀释使用。 1 4 50 5 高锰酸钾复染液：o 5 9 高锰酸钾充分溶解于1 0 0 m l 蒸馏水中。 1 4 6 碱性复红乙醇染色液储存液：8 9 碱性复红充分溶解于1 0 0 m l9 5 7 醇中， 常温避光保存备用。 1 4 7 0 3 亚甲蓝复染储存液：0 3 9 亚甲蓝溶于5 0 m l9 5 7 醇中，加水定容至 | l 囡疾病预防控制 l 心硕 = 学位论文 1 0 0 m l 。常温避光保存备用。 1 4 8 碱性复红染色液使用液：1 0 m l 碱性复红储备液与9 0 m l5 0 o 石炭酸水溶液 充分混合。 1 4 9 痰标本消化液：2 氢氧化钠一0 i m 柠檬酸三钠水溶液，1 2 1 c ，3 0 分钟 高压灭菌。使用前，加入n a l c ( n 乙酰基l 半胱氨酸) 使终浓度为o 5 。含有 n a l c 的消化液不稳定，应现用现配，可在4 保存一夜。 1 4 1 0 菌种保存液：生理盐水1 0 0 m l ，分析纯甘油1 0 0 m i 混匀，1 2 1 1 5 分钟 灭菌。 1 4 1 l 其它常用试剂：无菌生理盐水。 1 5 主要仪器设备 1 5 1 荧光显微镜o l y m p u s 1 5 2 普通显微镜o l y m p u s 1 5 3 立式低速离心机北京医用离心机厂 1 5 4 涡流振荡器通达科技 1 5 5 生化培养箱上海一恒科技有限公司 1 5 6 生物安全柜苏净集团苏州安泰空气技术有限公司 1 5 7 架盘天平北京医用天平厂 1 5 8 干燥培养箱上海一恒科技有限公司 2 实验方法+ 2 1 痰标本的收集与筛选 2 1 1拟诊病例的选择标准：咳嗽、咳痰 1 3 周或有咯血或血痰者，即具有肺 结核可疑症状者。 2 1 2 标本的收集：每位病人收集三份深呼吸后咳出的深咳痰，标明夜间痰、 晨间痰和即时痰，分别以a 、b 、c 表示。 2 1 3 标本的保存与运送：所有留取的标本一经取得立即送入- 2 0 ( 2 冰箱冻存， 两周内泠链运输，送达目的地后，一周内完成痰涂片与痰培养检测。 2 1 4 痰标本的筛选：患者留取的痰标本，首先经过检测人员的目视检查，标 9 t t 园疾病预防控制中心硕：l ：学位论文 本量一般在2 - 巧m l ，标本性状属于干酪痰、粘液痰、褐色血痰、或含少量新鲜血液 的血痰为合格的标本。不合格标本经1 2 1 ，3 0 分钟消毒灭菌之后，予以丢弃。 2 1 5 病人背景资料的收集：病人的基本情况，临床症状和体征，以及临床初 步诊断结果等背景资料的收集，由当地结防工作人员采取调查表形式，经询问或查 阅病人登记表予以填写。调查表见附录。 2 2 痰涂片显微镜检查 。 2 2 1玻片的准备：取经9 5 乙醇擦拭脱脂过的干燥、清洁、无油污、无划痕 的新玻璃片，于玻片背面的左端1 3 磨砂玻璃处用铅笔标明标本序号。一张玻片只 能够涂抹一份痰标本，每张玻片只使用一次。 2 2 2直接涂片法：用竹签挑取痰标本的脓样、血性或干酪样部分约 o 0 5 0 1m l ，于玻片正面的右侧2 3 中央处均匀涂抹成2 x 2 5c m 椭圆形痰膜，厚薄 适中。于紫外灯下照射3 0 分钟，然后于室温下自然干燥。经荧光染色确定为抗酸杆 菌( + ) 或( ) 的痰涂片，进行萋尼氏染色，并以萋尼氏染色结果为最终结果。 2 2 3 痰涂片荧光染色：将痰膜片短时间加热固定，滴加金胺o 染色剂，染色 1 0 - 1 5 分钟，水洗。加o 5 盐酸乙醇脱色剂，l - 2 分钟，脱至无黄色，水洗。加高锰 酸钾复染剂，染色l 。2 分钟，水洗，经6 0 烤箱烤干。 2 2 4 荧光显微镜检查：用荧光显微镜1 0 倍目镜、2 0 倍物镜观察痰涂片，在 黑色背景下，抗酸杆菌呈现黄绿色荧光，2 0 倍物镜观察到的黄绿色荧光必需用4 0 倍物镜再次观察确定形态，呈现杆状或短棒状，方可确认为抗酸杆菌。荧光染色结 果判定标准见表l 。 l o 中困疾病预防控制中心硕士学位论文 表i 荧光染色结果判定标准 报告方式 镜检结果 抗酸杆菌( 阴性) 抗酸杆菌( ) 抗酸杆菌( 1 + ) 抗酸杆菌( 2 + ) 抗酸杆菌( 3 + ) 抗酸杆菌( 4 + ) 连续观察5 0 个视野，未发现抗酸杆菌 1 - - 9 条抗酸杆菌5 0 视野 10 - - 9 9 条抗酸杆菌5 0 视野 l 9 条抗酸杆菌视野 10 - 0 9 条抗酸杆菌视野 1 0 0 条抗酸杆菌视野 2 2 5 痰涂片萋尼氏染色：痰膜滴加复红染色剂，加热至出现蒸气，染色3 5 分钟，水洗。加5 盐酸乙醇脱色剂，脱至无红色为止，但不可以超过十分钟，水 洗。加亚甲兰复染剂，染色0 5 分钟，水洗，待干。 2 2 6 普通光学显微镜检查：用普通双目光学显微镜油镜，1 0 倍目镜、1 0 0 倍 物镜观察。在淡蓝色背景下，抗酸杆菌呈红色，其他细菌和细胞呈蓝色。萋尼氏染 色结果判定标准见表2 。 表2 萋尼氏染色结果判定标准 报告方式 镜检结果 抗酸杆菌( 阴性) 抗酸杆菌( ) 抗酸杆菌( 1 + ) 抗酸杆菌( 2 + ) 抗酸杆菌( 3 + ) 抗酸杆菌( 4 + ) 连续观察3 0 0 个视野，未发现抗酸杆菌 1 8 条抗酸杆菌3 0 0 视野 3 - 9 条抗酸杆菌1 0 0 视野 1 9 条抗酸杆菌1 0 视野 l - - 9 条抗酸杆菌每视野 10 条抗酸杆菌每视野 2 - 3 微酸性l i j 培养基制备 2 3 1 微酸性l j 培养基配方见表3 r i i 凼疾病预防控制中心硕j 二学位论文 表3微酸性卜j 培养基成分表 成分 剂量 基础液 天门冬素 磷酸- 氢钾 七水合硫酸镁 柠檬酸镁 丙三醇 蒸馏水 马铃薯淀粉 新鲜鸡蛋液 2 孔雀绿水溶液 2 3 2 制备方法： 2 3 2 1 基础液制备：量取蒸馏水6 0 0 m l ，加入各种无机盐成分、马铃薯淀粉、 天冬酰胺和丙三醇，1 0 0 ( 2 水浴加热3 0 分钟，期间不停摇动，以防止淀粉凝结成块， 冷却至6 0 以下。 2 3 2 2 新鲜鸡蛋液制备：洗净新鲜鸡蛋液表面，浸泡在7 0 乙醇中2 0 3 0 分 钟。取出，擦干，开口，收集鸡卵液，搅拌均匀。通过消毒的纱布过滤成鸡蛋液。 2 3 2 - 3 将6 0 0m l 基础液和1 0 0 0m l 新鲜鸡卵液混匀。加入2 孔雀绿水溶液 2 0m l ，混匀，静置2 0 分钟后，分装至灭菌1 8 1 8 0 m m 试管中，每管7 m l 。 2 3 2 4 放入热凝固器内，摆成斜面，占试管下部2 3 3 4 长度，加热至8 5 9 0 1 5 h 灭菌。冷却后取出，3 7 1 2 无菌测定2 4 h 后，4 c 避光保存，1 个月内用完。 2 4 痰标本的细菌培养 2 4 1将痰标本3 5 毫升小心移入5 0 毫升螺帽离心管中，加入2 3 倍体积的消 化液。于涡流振荡器上震荡l o 1 5 秒，使痰液完全液化，静置1 5 分钟。 2 4 2 加入无菌生理盐水至3 5 m l ，用架盘天平平衡。4 , 2 0 0 r p m 离心2 0 分钟， 小心弃去上清。吸取l - 2 m i 无菌生理盐水重悬沉淀。 2 4 3 分别将0 4 m l 痰标本处理物接种于两支微酸性l j 培养基，痰标本处