（外科学专业论文）人胚胎嗅鞘细胞的体外培养.pdf

缩略语表 内蒙古医学院学位论文原创性声明 郑重声明：本人所呈交的学位论文是在导师指导下，独立进行研究所取得的研究成 果。除文中特别加以标注引用的内容外，本论文内容不包含其他个人或集体已经公开发 表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确 方式标明。本人学位论文与资料若有不实，愿意承担一切相关的法律责任。 论文作者签名刍趾銎 劢g 年硝日 学位论文版权使用授权书 本人完全了解学院有关保留、使用学位论文的规定，同意学院保留并向国家有关部 门或机构送交论文的复印件和电子版。学院享有发表、复制、查阅、借阅及申请专利等权 利。可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论文。同时本人保证：毕业 后发表、使用学位论文以及结合学位论文研究课题再撰写的文章，作者署名单位一律为 内蒙古医学院。 论文作者签名匀验：蓼指导教师箪名 谚8 辱ac 口b 年月日 中文摘要 目的建立体外培养纯化人胚胎嗅鞘细胞( 文c a c 卿e n s h e a t i l l g 洮，呱) 的模 型，观察c i e i c s 的生长特性，获得较为理想的可供基础和临床研究的0 e c s o 方法选取 1 5 例3 6 个月自然流产或水囊引产的胚胎，采用原代培养的方法自人胚胎的嗅球培养 出嗽，利用嗽和成纤维细胞贴壁速度不同的原理，进一步纯化o e c s ，用神经生长 因子受体p 7 5 ( n e r v eg 刚曲f a c t o rr e c i p i e n t ，n g i 琅p 7 5 ) 抗体进行免疫细胞化学染色并统 计所得o e c s 的纯度。结果此培养方法简便宜行，可以获得7 0 以上的0 e c s ，完全可 以为基础和临床研究提供供体。结论成功的培养了人胚胎嗅鞘细胞，为进一步的临床 移植应用研究提供了实验材料。 关键词人胚胎嗅球嗅鞘细胞培养方法 t h ec u l t u r eo fo l f a c t o r ye n s h e a t h i n gc e i l si n v i t r of r o mh u m a ne m b r y o a b s t r a c t o b j t i v e 1 、os e tu pt h ec u l t u r es y s t e m0 f 硪a c t o r y 朗s h e a t l i 】呜c e u s ( ( m c s ) i nv i t r 0 f 似nh u m a n 曲r y o 【e t h o d sw ec h 0 0 6 ea b o r t u so ft h - e et os 没m o n t h so l da b c 埴t ll s 船r e 跚脚c ho i b j e c t i nt h er e 爱：锄c h ，w e0 0 u e c t e d1 5s p e c i r l l e nt h a ta uc a m ef r o mi n d u c t i o no fl a b d r w i t h 髓t e rb a g w es u c c e s s “l yc u l t u r e0 e c sf r c mh l 蚴a n 。即曲r y oo l f a c t o 巧b u l bb yu s i l l g p r 岫c u l t u r e ，a n dd e v e k ) pp u r i f i c a t i o no f ( 甩c sw i t hd i f f e r e n t i a la d h e s i ( mm e t h o d e u r i n g t h ec u l t u i 汜p e r 埘st h ec e u sw e r ee 、d u a t e db yi l 捌m u r l c y t o c 坷m i s t r ys t a i n i n ga n dp i d s i t i 、圯r a t e 髑c a l c u l a t e da sw e u t h es u i t a b l ep e r 埘0 ft 曲ew h e nt h ec e u sw i t ht h em 0 s tq u a n t i t ya n d t h eb e s tp r o p o r t i o no fp o s i t i v ew a sf 6 u n df o rt h ef o l k ) w i n g 锄p l o y m e n t r 姻i i l t st h e0 e c s w e r ec u d t u 代d 吼l c c e s u l l yw i t hg s k ) df e 勰m i h t ya n dr e p e a t a _ b i l i t y i nt h ep e r i o d ，t h ep r o p o r t i o no fp 0 s i t i v e0 fo e c si sh i g h e s ta n dc a na r r i v e7 0 c ( 哪i c i 吣i 伽c u l t 耐n gc i e c sf r c m e m b r y oi sf e a s i b l ea n di tb eu s et or e s t o r es p i n a l 。0 r di n j u l y k e y 、】 吼也 h l n l a a n 印小巧oo l f a d 巧e n s h e a t k n gc e u s c e uc u l t u r e 人胚胎嗅鞘细胞的体外培养 神经再生的问题一直是困扰着神经科技工作者的难题，近年来，随着神经细胞生物 学、分子生物学、神经生理学、神经移植的飞速发展，使得中枢神经系统( c n s ) 损伤与再 生的研究有了突破性的进展o 0 d c s 是存在于嗅觉系统的一种特殊类型的大胶质细胞，分布于嗅神经、嗅球的第 一、二层和嗅上皮。0 e c s 能伴随嗅束进人中枢神经系统。o 胁兼有星形胶质细胞和雪 旺细胞的特点，并迁徙于周围神经系统和中枢神经系统。在受损的脊髓组织移植o 阢 后，0 e $ 不仅能引导、支持损伤神经轴突再生、延伸和髓鞘化作用，还能促进神经轴突穿 越脊髓损伤所形成的胶质瘢痕区。嗽移植被认为是治疗脊髓损伤最有潜力、最有希 望的方法o 0 e c s 改变脊髓损伤局部的抑制性内环境 脊髓损伤后神经轴突再生障碍与其所处的抑制性胶质环境有关，如少突胶质细胞分 泌的髓鞘相关糖蛋白( m y e l i 矗一a s s o c i a t e dg l y 0 0 p r o t e i n ，m a g ) 等。创伤性胶质细胞反应形 成的胶质瘢痕除了形成机械性屏障外，还分泌一些抑制轴突生长的分子。抑制性因素在 与促进性因素的力量对比中占据着优势地位。在体外培养和体内研究0 e c s 中发现，它 能分泌大量不同种类的神经营养因子，如神经生长因子( n ( 亚) 、脑源性神经营养因子 ( b d n f ) 、神经营养素一3 ( n t 一3 ) 和神经营养素一4 ( n t 一4 ) ，以及血小板衍化生长因子 ( p d g f ) 、神经肽y ，s 1 0 0 等，这些都是神经元生长、发育、分化、成熟的必需因子。酪 氨酸蛋白激酶基因( t r l a 、b 、c ) 是n g f 、踟和n t 一4 的高亲和力受体，主要集中在 嗅神经轴突到达嗅小球层的末端，而它们的配体n g f 和踟也高度集中于嗅球【2 】。 o e c s 胞膜上有与细胞黏附和轴突生长有关的分子，如l 1 样细胞黏附分子( c a m l 1 ) 、 层黏连素( 1 a r n i n i n ) 、含唾液酸的分子( p s a n q 蝴) 和神经细胞黏附分子( n 一 洲) 【3 】o 在成年鼠、新生鼠和胎鼠的体内，呱均表达神经生长因子受体( l n g f r ) 、l 1 样细胞黏附分子基因、层黏连素、n c 枷、波形纤维蛋白( 、，i m e n t i n ) 、角质纤 维酸性蛋白( g l i a lf i b 珊奶僦i d i cp r o t e i n ，c 巩心) 等。这些分子为神经轴突的再生建立了 良好的内在环境，有助于损伤轴突的延伸、再生，促进神经功能恢复。呱产生的神经 连接素( n e ) 【i n ) 和s 1 0 0 ，是轴突再生的促进因子。这些轴突促生长因子可以部分地解释 呱的促轴突生长的特性。培养的o e c s 在与后根神经节的神经元共同培养时，它们 还能够把轴突髓鞘化。因此，利用c i e | c s 能够分泌大量的各种神经营养因子和促轴突再 内蒙古医学院硕士研究生学位论文( 2 0 0 8 年) 生因子的生物学特性，移植的呱能够改变脊髓损伤后局部的抑制性内环境，给损伤 的神经轴突再生创造有利条件o 0 e c s 促进受损神经轴突再生、髓鞘形成和穿越胶质瘢痕的阻挡 体外培养发现，呱既表现出雪旺细胞使轴突髓鞘化的特性，又表现出星形胶质细 胞保护、支持神经细胞和促进神经轴突再生的特性。呱提供了神经轴突再生的一些 必要条件。1 9 9 7 年l i 等 4 】在s c i e n c e 上第一次报告了应用0 e c s 移植来治疗脊髓损 伤。他们把大鼠的一侧颈部皮质脊髓束切断，造成急性脊髓损伤模型，然后将培养的 呱悬液注入到损伤部位。3 1 0 周后，陆续发现切断的皮质脊髓束延伸生长，穿过损 伤区，最后到达下位脊髓的前角神经元处，形成功能性连接。i m a i z u r n i 等 1 应用x 线照 射加局部注射溴乙锭法制成脊髓后索损伤动物模型。在损伤6 d 后移植c i e i c s ，2 1 2 5 d 对脊髓的传导性进行电生理检测，动作电位传到了损伤处的远端，表明由脱髓鞘造成的 传导阻滞得到明显改善。这一结果提示移植呱能够使脱髓鞘的脊髓后索功能恢复 正常op e r e z b o l 助等 6 通过实验证实，呱具有很强的控制轴突再生方向的能力， 呱形成的“神经胶质桥”可穿过瘢痕等的阻碍，沿着轴突纵轴方向延伸生长。1 9 9 9 年 l i 等【7 再次报告了他们的研究成果，这次的动物模型不仅仅是切断皮质脊髓束损伤范 围，还包括周围的各种胶质细胞和血管等组织，伤后立即移植呱。在第1 周即可观察 到这些被切断的皮质脊髓束纤维沿着轴心向尾端伸展，形成一个个单一的、纤细的、有小 分叉的芽蕾，末端有微小的膨大；到第3 周，伸展的轴突已经越过损害区重新加入尾端的 皮质脊髓束中，再生轴突可长入植入区远端1 0 m m ，并形成髓鞘。轴突再生通过损伤区 时，其髓鞘由雪旺细胞型呱形成束，向损伤区两端生长迅速；晚期，星形胶质细胞型 c i e | c s 形成管道作为外鞘。与移植雪旺细胞比较，移植c e i c s 长入脊髓远端的能力更强o r a m o n c u e t o 等 8 1 联合雪旺细胞充填的导管与呱移植，以观察0 e c s 的促轴突再生 能力。结果发现，呱不仅诱导损伤轴突大量长入导管，令人惊喜的是，还能促进再生 轴突跨过移植物一脊髓界面，促进下行的皮质脊髓束和上行的脊髓固有轴突长距离再生 人断髓。s h e n 等 9 切断大鼠第1 0 胸髓，0 e c s 移植1 0 周后，抗髓鞘碱性蛋白和抗神经 生长因子受体免疫组化染色，发现大量的神经元轴突再生。 嗽促进受损脊髓的功能恢复 0 e c s 移植能有效地促进大鼠脊髓损伤动物模型的运动、感觉、反射等功能的恢复o r a m o n c u e t o 等【l o 】将大鼠制成脊髓横断模型，在两端分别注入呱，术后3 7 个月观 察到，动物的运动功能和感觉反射都有所恢复。动物后肢有自主性运动，能支撑身体重 内蒙古医学院硕士研究生学位论文( 2 0 0 8 年) 量，后肢轻触觉和本体感觉有恢复。2 0 0 2 年，“等【l l 】切断大鼠的单侧上位颈髓，立即移 植c i e | c s 悬液于损伤脊髓处o2 周后将移植c i b c s 的大鼠放在倾斜1 5 。的铁丝网上，观察 其爬行功能，连续观察7 周，发现大鼠前后肢的爬行功能有明显恢复。移植c 呸、i 墨2 个月 后，在气管插管麻醉下，暴露大鼠的一侧膈神经，用电生理方法检测膈神经的动作电位变 化，发现电位节律是中枢源的。他们得出的结论是，呱移植到受损脊髓后，可以同时 恢复前后肢的爬行功能和呼吸功能ov e 砌u 掣1 2 】在大鼠的第8 胸髓水平行椎板切除，下 位脊髓用玫瑰红浸泡，并用卤素灯照射，造成脊髓损伤模型，然后移植呱。通过对照 实验、脊髓运动功能评分( 狙评分) 等，发现呱移植组大鼠的运动功能、躯体感觉比 对照组要强。抗c 乳妲的免疫组化染色观察发现，c e c s 移植组大鼠受保护的脊髓体积 明显大于对照组ok e y v a j l f o l l 】a d i 等 1 3 】切断大鼠的单侧第一颈髓，延迟8 周后植入 呱，移植后1 3 周内，移植物连接到损伤部位并逐渐恢复了前爪的取物功能。再生 的皮质脊髓束向尾端延伸1 0 m m ，在灰质中形成树枝状末端o 0 e c s 促进脊髓损伤再生修复的作用机制 o e c s 促进神经轴突再生的特性普遍被人们认识和接受后，探讨其作用机制的研究 日趋深入ot i s a y 等 1 4 认为，0 e c s 的作用机制可能包括层黏素、硫酸软骨素、硫酸乙酰 肝素蛋白多糖和其他多种生物因子共同提供了一个促进神经轴突生长的底物ol a k a 髋 等 1 5 】对比观察了植人体内的c 凰c s 和雪旺细胞。结果发现，0 e c s 比雪旺细胞具有更强 的迁徙性以及与神经轴突、其他神经胶质细胞交织在一起的整合性ov e r d u 等u 们应用光 电损伤大鼠脊髓的动物模型，移植o e c s 治疗后发现，呱明显降低局部星形胶质细胞 的反应性增生和脊髓实质内的空泡形成，为受损脊髓的修复再生提供了有利的条件o w o o d h a l l 等 1 7 在体外培养c 魍c s 时发现o e c s 能够表达n i 疆、b 聊岍、胶质细胞源性神 经营养因子( 呱) 和它们的受体，特别是踟的表达量最多，大约是n g f 的7 倍，以 自分泌和旁分泌两种形式来完成。胶质瘢痕的阻挡是神经轴突再生难以逾越的主要障 碍。胶质瘢痕除了机械性阻挡轴突再生以外，还可以产生许多抑制轴突再生的物质，以 化学屏障的形式抑制轴突的再生。因此，嗽移植并不能减少胶质瘢痕的形成oz u 0 等【l 踟推测，嗽可能产生一种含有硫酸软骨素的酶，降解胶质瘢痕产生的化学抑制因 子oc l e i c s 消除胶质瘢痕阻挡作用的机制有待进一步研究。 目前在中枢神经损伤修复实验研究中，呱被认为是最有前途的种子细胞之一。 我们从人胚胎的嗅球取材，结合嗅球组织的细胞生长和细胞学等特性得出了一种简单、 快捷的培养方法，为进一步研究和进入临床实验奠定了基础。 直蓥直匡堂瞳塑主重壁壅生堂垡迨銮! 型璺堡2 1 材料与方法 1 1 研究对象3 6 个月自然流产或水囊引产的胚胎( 由内蒙古医学院附属医院及 内蒙古妇幼保健医院妇产科提供) 1 5 例 1 2 主要试剂： 小鼠抗人n ( 聊5 单克隆抗体n 公司 玎强一蝠免疫组化试剂盒r n d 公司 特级胎牛血清q b c 0 公司 胰蛋白酶q b 。0 公司 多聚赖氨酸p l l武汉博士德生物工程有限公司 磷酸缓冲液( p b s )内蒙古医学院第一附属医院中心实验室 d h a j l k s 液内蒙古医学院第一附属医院中心实验室 珧伍m f 1 2 细胞培养液武汉博士德生物工程有限公司 e i 兀a 武汉博士德生物工程有限公司 1 3 主要仪器： o q 培养箱瑚罔0上海力申科学仪器有限公司 生物净化工作台阳f 韶f e 一9 0 0上海力申科学仪器有限公司 1 1 ) s a w s 台式低速离心机长沙湘仪离心机仪器有限公司 倒置相差显微镜c 岈【n p u s 公司 o i 脚u sc x 4 1 图象采集显微 日本o l 舯p l i s 公司 镜 解剖显微镜0 1 肿p 惜公司 眼科显微器械s 弛m 公司 培养瓶c c i m 啦公司 2 4 孔及9 6 孔培养板c c i m i n g 公司 培养皿i n g 公司 1 4 具体实验方法 1 4 1 消毒 将胚胎断头后全部浸入盛有0 1 新洁尔灭溶液的大烧杯中，浸泡2 0 分钟，再用大 量d h a n k s 平衡盐溶液冲洗。 。 内鏊查匡堂瞳塑塑生堂垡迨銮l 塑墨堡2 5 在b 矗f e r 中漂洗，擦掉多余的蛐 6 滴加1 3 滴生物素封闭液1 5 分钟 7 。在中漂洗，擦干 8 加一抗，过夜 9 在b u f f e r 中漂洗，洗三次，每次1 5 分钟，擦掉多余的b u f f e r 1 0 滴加1 3 滴生物素化二抗3 0 分钟 1 1 在b u f f e r 中漂洗，洗三次，每次1 5 分钟，擦干 1 2 滴加1 3 滴h s s 一躲p 3 0 分钟 1 3 在b u f f e r 中漂洗，洗三次，每次2 分钟，擦掉多余的b u f f e r 1 4 在1 滴蝠中加入1 r i db 幽c e r ，将肼姬显色剂与d a b 显色剂的b 以r 混合在一 空瓶中 1 5 滴加1 5 滴新配的d a b 溶液覆盖样本，作用3 1 0 分钟，在镜下观察控制反应 时间 1 6 在蒸馏水中漂洗一下，再换水洗5 分钟 1 7 苏木精复染1 5 分钟，p b s 冲洗反蓝 1 8 梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片 1 9 用明视野和相差显微镜观察，随机选取视野计数阳性细胞数并计算阳性百分率o 2 结果 2 1 嗅鞘细胞的形态学观察 人胚呱接种后，贴壁时间随胎龄不同而有所差异。总体来说，胎龄越小，贴壁所 需时间越短，差速贴壁的时间也越难控制o0 e c s 原代培养在接种2 4 小时内大部分已经 贴壁，呈球形；培养2 天后( 图1 一a ) ，大部分呈现圆球形，有少量的双极细胞，其突起短 小o4 天后( 图1 一b ) ，大部分细胞胞体发亮，呈现三角形、梭形、细胞发出纤细的突起，另 外还有一些胞体发暗，折光性较差的扁平细胞，胞体有几个伪足，这种细胞可能是早期的 成纤维细胞。培养第6 天后( 图1 一c ) ，双极细胞和三极细胞连成网络状，细胞形态转变 成条梭形。纯化后第3 天( 图1 一d ) ，主要是双极，三极细胞，胞体立体感强，折光性好； 纯化第5 天( 图1 一e ) ，大部分细胞呈三角形，梭形，突起迅速延伸变长，立体感强，折光 性好，一个甚至多个细长的突起，偶见成纤维细胞出现；第1 0 天( 图1 一f ) ，呱与5 天 形态一致，无明显变化；第1 5 天，嗽生长情况逐渐变差，开始出现成纤维细胞；第2 0 天，较多的呱自行脱落且逐渐死亡，成纤维细胞数目明显增多，所占比例增高。 内蒙古医学院硕士研究生学位论文( 2 0 0 8 年) 图1 a ：原代培养第2 天( 1 0 0 倍) 图1 c ：原代培养第6 天( 1 0 0 倍) 图1 b ：原代培养第4 天( 1 0 0 倍) 图1 d ：纯化后培养第3 天( 1 0 ( ) 倍) 图1 e ：纯化后培养第5 天( 1 0 0 倍)图1 f ：纯化后培养第1 5 天( 1 0 0 倍) 2 2 免疫细胞化学染色 免疫细胞化学反应显示：带细长突起的单极、双极或多极的梭形细胞抗n g f r p 7 5 为 阳性，可以确定这些细胞为嗅鞘细胞。见图2 a e 爹i 蒸，尹 誊篝“ij 豢i，逢 、 一 。2， ：| 。_ |撼 ，蝴、 一j 爹。? 溪 蔫磊羹 1 。- l 爨 。霹 图2 a ：纯化后培养第3 天，p 7 5 免 疫细胞化学染色( h r p 1 0 ( ) ) 图2 c ：纯化后培养第1 0 天，p 7 5 免 疫细胞化学染色( h r p 1 0 0 ) 内蒙古医学院硕士研究生学位论文( 2 0 0 墨盟 图2 b ：纯化后培养第5 天，p 7 5 免疫 细胞化学染色( h r p yl ( ) 0 ) 。蠢寥 筑熬 零 | | 鞠0 藩鍪茹 麓霉攀， 图2 e ：纯化后培养第2 0 天，p 7 5 免 疫细胞化学染色( h r p 1 0 0 ) 2 3o e c s 纯度测定 将染色的细胞爬片利用o i 脚u sc x 4 1 图象采集显微镜和s m a r t s c a p e 2 0 0 2 生物 显微图象分析系统进行采集和分析图象，随机选取5 个视野，计数2 0 0 个细胞中的阳性 细胞数，计算出阳性细胞所占的百分比并取1 5 例胚胎的平均值，从而得到o e c s 的百分 内蒙古医学院硕士研究生学位论文( 2 0 0 8 年) 比，这种百分比即为呱的纯度。同时观察并统计不同时期o e c s 的纯度，结果见图 3 ，纯化后5 1 0 天的细胞纯度可达7 0 以上，但第1 5 天后细胞纯度随培养时间的延长 而明显下降，到第2 0 天时，0 e c s 的百分率只有4 0 。 丑 求 妞 窖 翟 器 o o 图3o e c s 经过纯化后随培养时间延长纯度的变化 3 5l0152 0 不同培养时间( d ) 匡羽 3 讨论 鼠o e c s 的体外培养在国内已有报道，人细胞的体外培养和低等动物细胞的体外培 养是有区别的，人细胞对体外培养的营养条件要求高，生长缓慢。而且人细胞的原代培 养还存在取材的问题。目前临床上对于妊娠3 6 个月的流产主要采取药物引产和水囊 引产两种方法，两种方法的原理不同，药物引产为通过注射药物使胎儿在宫内死亡，自母 体宫壁脱落，从而中止妊娠；水囊引产是通过物理作用使胎儿自母体宫壁脱落，引发母体 缩宫，产出胎儿，中止妊娠。我们的试验是取得胎儿组织后培养细胞，这就要求我们尽量 缩短自胎儿死亡到取材的时间，由于引产法的胎儿在宫内已经死亡，无疑增加了细胞培 养的难度，所以我们选取水囊引产的流产儿为研究对象。细胞培养要求取材过程迅速、 准确。而临床上的流产儿受各方面的条件制约，使得试验中在有些情况下不能及时作培 养。我们在反复的实验中摸索出先取材，然后置于培养液中4 保存，待各方面条件完 善后再做培养的方法。标本在4 下最长保存6 小时，然后再做培养，培养结果与立即做 原代培养无明显差异。我们培养的成功率为8 0 ，1 5 例中成功1 2 例，2 例污染，1 例未 成活，污染原因分析为当时准备不充分，取材过程中失误所致；l 例未成活分析原因为胚 胎离体时间较长。 o e c s 是一种处于中枢与外周神经系统过渡区的鞘细胞，其功能极为活跃，它除了分 泌大量神经生长因子( n g f ) 、脑源性神经生长因子( b d n f ) 、神经营养素3 ( n t 3 ) 、神经 盥鐾直匡堂堕塑堑壅垒堂焦迨塞! 塑墨堡2 营养素4 ( n ，r 4 ) 等【1 9 _ 矧营养因子以外，同时还能分泌纤维连接蛋白( f n ) ，细胞黏附基因 ( l 1 ) ，层粘连蛋白( b r n i 池) ，神经细胞黏附分子( n q 蝴) 等 加冽细胞外基质和粘附 分子，这一细胞学特性使得其成为c n s 系统损伤与再生研究中倍受亲睐的候选细胞。 原代培养的细胞不可避免存在杂细胞，c ) e i c s 中杂细胞主要是成纤维细胞，作为c i e | c s 培 养体系中最棘手的污染细胞，它的分裂增殖速度极快，一般约为2 3 天，远远超出呱 的分裂增殖速度，并且侵蚀面积大。 目前纯化0 e c s 的方法主要有： 化学药物法：通过加入阿糖胞苷来达到去除成纤维细胞的目的。我们认为加入阿 糖胞苷虽然可在短期内有效抑制成纤维细胞生长，但同时也抑制了0 e c s 的生长，且在 撤除阿糖胞苷很长时间后，嗽仍不能明显增殖。同时有可能残存的成纤维细胞失去 了0 e c s 高密度抑制作用而迅速增生，使呱纯度迅速下降。 梯度离心法及免疫亲和吸附法：纯化效果最好，其纯度可达9 9 ，但步骤较为繁 琐，费用高，同时细胞经过反复清洗，活性下降，给下一步培养带来了一定的困难o 差速贴壁法：利用成纤维细胞贴壁能力较呱强的生物学特性，经过两次贴壁， 可基本将其除去。本实验采用此方法，简便、经济、实用性强，并且可以为下一步进入临 床试验提供指导o n g f r p 7 5 是神经营养因子低亲和力受体，在嗅鞘细胞膜表面由跨膜、细胞外和胞质 等3 部分组成，其抗体能和细胞外部分发生特异性结合。其它污染细胞由于缺乏n g h 矽5 ，因此可用它鉴定呱的纯度。呱在原代纯化培养的第3 天纯度最高达 7 5 ，但细胞未完全伸展，不适宜进行手术移植；原代培养纯化的第5 1 0 天也可达 7 0 以上，细胞形态最好，因此是移植手术的最佳时间o 0 e c s 培养的最终目的是应用于临床修复脊髓损伤，而且文献报道，纯度为5 0 的 呱与纯度为9 8 的0 e c s 植人脊髓损伤处，动物模型各项恢复指标无统计学差异。 我们认为，在原代培养过程中认真取材，得到的呱可以满足实际需要，具有实际应用 价值。 4 结论 我们在认真取材的前提下，利用差速贴壁法成功地培养出人胚胎嗅神经鞘细胞，培 养操作方法简单、可重复性好，适于实际应用。经过对细胞生物学特性的初步研究发现， 原代培养后第1 5 天( 纯化培养后第5 1 0 天) 是移植手术的最佳时机。目前脊髓损伤修 复的研究不断深入，取得了很大的进展，相信不久的将来，各种研究成果将会应用于临 内蒙古医学院硕士研究生学位论文( 2 0 0 8 年) ( 2 ) ：3 3 7 2 3 5 0 2 8 i r n a i z 妇1 ii k l ，w a 砌a ns g t 聃n s p l a i l t e do l f a c t o r y s h 钮t k i 】go e l lr 即唧l i n a t ea n d - h a n c ea ) 跚a l0 0 n d u c t i o ni nt h ed 锄y e i i i 蚍e dd o 剃d 啪璐o ft h er a ts p i i l a l 柑 j jn e u i 伊 s c i 髓c e ，1 9 9 8 ，( 1 8 ) ：1 7 6 1 8 5 2 9 吴卫江，惠国桢，陆华，吕然博人胚嗅鞘细胞不同取材及培养方法对纯度的影响 j 中华实 验外科杂志，2 0 0 4 ，7 ( 2 1 ) ：8 4 1 3 0 黄红云，王洪美，修波等嗅鞘细胞移植治疗脊髓损伤临床试验的初步报告 j 海军总医院 学报，2 0 0 2 ，1 5 ( 1 ) ：1 8 2 1 囱鏊直匿堂瞳塑主堑塞生堂焦迨塞垫墨堡2 o e c s 是神经胶质细胞的一种，起源于胚胎的嗅基板( 伽a u c t 0 巧p k d e ) j ，来自于嗅 上皮的祖细胞( p r q g e n i t o rc e u ) ，在营养信号引导下向嗅球迁移。在成年哺乳动物，c i e i c s 在鼻腔嗅上皮的深层包绕嗅觉神经元细胞发出的轴突，与结缔组织共同构成嗅神经，经 过筛板后，穿过周围一中枢科，经系统的过渡区( p e r i p h e r a l c e n t r a lt 删1 s i t i o r l a l 嘲i o n ) 以 及蛛网膜下腔，进入嗅球。呱分布在嗅上皮( o 锄了印i t h e h 啪) 、嗅神经( 0 t o 】黟 n e e ) 、嗅中枢和嗅球表面的第一、二层【6 】or a m o o n c u e t 0 l 列报道体外培养的嗅鞘细胞 按其形态可分为：双极或梭形( f u s i f o r m ) 、多突起形( p 黜一b e a r i l l gm u l t i p o l a r ) 、扁圆形 ( r o 矗d n a t ) 或油煎蛋形( f n e de g g l i k e ) 。但是在非培养条件下，它们的形态与其相接 触的神经轴突有关。王珂等 8 研究了体外培养的嗅球成鞘细胞和鼻腔嗅黏膜的成鞘细 胞形态，证实在嗅球浅2 层的细胞培养瓶内观察到了这3 种成鞘细胞，其中以梭形细胞 最多。在鼻腔嗅黏膜的细胞培养瓶内更是以梭形细胞多见，且突起更细长，这可能是位 于周围的成鞘细胞与位于中枢的成鞘细胞所处环境不同而出现的相应变化。不同时期 阶段的在体呱均呈现典型的形态学特征，在体外培养的o e c s 由于受到多种因素的 影响而表现出来的形态特征相差很大。因此，根据在体内与体外的呱的形态学特 性，它不能归属于任何胶质细胞家族。 无论是嗅球成鞘细胞还是嗅黏膜成鞘细胞，在细胞培养条件下都有聚居现象出现， 很少发现单个的独居细胞，且成鞘细胞的生长有很强的方向性，纵行排列。杨浩等【9 3 报 道了呱在培养3 4d 时呈巨噬细胞、条梭或形态不规则状，5 d 以后大致与雪旺细胞 形态接近，呈条梭状，这可能是o e c s 再现外周雪旺细胞形态学特性的表现。 根据供体动物年龄和培养条件的不同。呱在体外可表现出不同的形态学特征o n c e n t 【l o 】认为呱在含有或不含血清的培养基培养时形态的改变是可逆的，通过调 节眦所介导的肌动蛋白细胞支架重组，可以达到改变细胞形态，并做出进一步推断： 呱来源于单一的祖细胞，随着发育及环境的变化而表现出不同形态。尽管呱的 形态学变化较多，但其超微结构与供体的年龄、取材部位和培养条件却无较大关系 1 1 】o 它们都有一个不规则的核，有时表现出较深的皱褶，凹陷。染色质在核浆内分布均匀，但 在核膜周围有点不均匀。细胞核常位于细胞中央，偶尔偏到细胞边缘。胞浆内包含有丰 富的游离核糖体、多聚核糖体和中间丝。它们绝大多数散布在胞浆中，少数成束状分布， 偶见小的纤维束和细胞轴突相连。培养的呱有一个非常典型的超微结构就是其胞 膜存在皱褶，此外相当一部分的胞膜存在和基板沉淀物相似的沉淀物质。 在生物体的一生中，嗅觉神经元有不断更新的特性，在成熟期这种神经发生也持续 堕鐾直匿堂睦塑婴塞生堂焦迨銮( 塑璺堡2 存在，并且受到高度调控，呱在这个过程中起着辅助的作用，但其具体机制目前还不 十分明确。新生的神经元发出的轴突由嗅鞘细胞包围着，穿行在外周和中枢神经系统 中，直至与嗅球的嗅小球层中的神经元发生突触联系【l2 | 。嗅鞘细胞这种能生存于中枢 神经系统，又能辅助轴突再生的特性昭示着它在脊髓损伤修复方面的巨大潜能o 1 2 嗅鞘细胞的细胞免疫特性 0 e c s 与星形胶质细胞、雪旺细胞具有相似的表型特征，与星形胶质细胞一样都能表 达胶质原纤维酸性蛋白( 鲫) ；与星形胶质细胞不同，0 e c s 能被低亲和力的神经生长 因子( l n g f ) 受体p 7 5 、层粘连蛋白、细胞粘附分子l l 、神经丝波形蛋白染色。在不同 的发展阶段和不同的培养条件下，o e c s 无论在体内或体外都表现出不同的抗原特性。 利用免疫组化技术揭示了嗽在动物出生以后能够促进神经生长，表现出对血小板源 生长因子、神经肽y 和蛋白s 1 0 0 的免疫反应性 1 3 - 1 4 io 呱膜上有与细胞粘附和轴突 生长有关的分子，如u ( 1 0 0 ) 、层粘连蛋白( 1 一锄i n i n ) 、含唾液酸的细胞粘附分子( p s a n c a m ) 和神经细胞粘附分子( n q 蝴) o 在体内o e c s 均表达l n g i 喂、l 1 、1 一 a 耐n i n 、n q 蝴、v i m e n t i n 、c 巩吁和0 4 ；神经肽y 、s 1 0 0 在新生鼠和成年鼠o e c s 中表 达阳性【1 5 1 。体外o e c s 的免疫标记特性依赖于供体动物的年龄、培养条件和培养时间。 体外培养1 7 d 时，细胞已经显出不同的细胞表型。在第7 d ，可鉴定出胶质细胞原纤维 酸性蛋白( 黜) 阳性的胶质细胞 1 引。在含血清的培养基中，s c h w a n n 细胞样o e c s 表 达s 1 0 0 、l n g f i 之；而星形细胞样嗽不表达。r a m b n c u e t o 认为取材于嗅球的培 养细胞中咄和m b p ( 鞘基础蛋白) 均为阳性的就是呱 1 引。异源性的嗅鞘细胞免 疫原性不是很强，应用免疫抑制剂后能够诱导受体轴突再生和再髓鞘化恢复神经的传导 功能【1 7 _ 1 9 io 嗅粘膜源性的嗅鞘细胞除了具有脑源性嗅鞘细胞的特性以外，嗅粘膜源性 嗅鞘细胞还能表达一些重要的蛋白质一c i m 4 、b i n t e g r i n 、p 2 0 0 、n o t c h3 、n i g 2 、唧 和脚及c r e b 结合蛋白( c b p p 3 0 0 ) 等啪】o 1 3 嗅鞘细胞的功能特征 0 e c s 可产生血小板源性生长因子 2 、神经肽v 2 2 1 、s 1 0 0 2 3 3 以及胶质源性的微管连 接蛋白( n e x i n ) 汹】等等，其中的一些因子都是已知的能够促进神经生长和存活的因子o c 旧c s 还能表达低亲和性神经营养因子受体p 7 5 ( l n 之，k w a m m t yn ，ec 衲叭h f a c t i d rf k 印t o r ；或称u 州r ，k ) w a f f i n i t yn e u r o t r o p h i nr e c e p t o r ) ，该分子是有力的发 育调整因子，胚胎期和新生期的嗅神经组织都呈现强阳性反应。体外培养发现0 e 还 表达一系列能够促进神经生长的因子，如神经生长因子( n r g f ) 、脑源性神经因子( b d 囱鍪直匡堂瞳堡墼竺堂焦迨塞l 型璺堡2 3 7 、5 o q 孵育箱培养o 2 1 2 直接挤压法将嗅粘膜在镜下彻底剥除血管，置于d 一胁n k s 液中，用显微剪 镊直接将嗅粘膜剪切撕烂、挤压，剩余的片状组织块转移至另一试管内，d h a n k s 液洗 2 次，胰酶3 7 消化2 0 m i n ，连同机械分散的组织匀浆移至全培养液中，轻轻吹打组织块 使之形成细胞悬液，以下步骤同1 1 0 2 1 3 机械过滤法将完整嗅粘膜用双刃刀片切割形成1 r n l l l 3 组织块，进一步捣碎， 加入全培养液轻轻吹打，经过一无菌尼龙滤网过滤( 7 5 岫孔径) 获取单细胞悬液，以下步 骤同1 1 0 2 1 4 直接接种法将嗅粘膜除血管膜后，切成l n n 3 组织块直接接种在5 0 r n l 经 p l l 包被的培养瓶中，加少量全培养基o 2 2 嗅粘膜呱的培养和纯化 2 2 1n a s h 差速贴壁纯化法【3 l 】在细胞培养2 4 h 后，轻轻晃动培养瓶，将悬浮细胞液 吸出，吸取5 0 u l 细胞悬液细胞计数，调整细胞密度为1 0 6 “，重新接种于经p l l 包被的 塑料培养瓶中，移人3 7 、5 c q 孵育培养箱，第3 天向培养瓶中加入新鲜培养基1 r 1 1 l ， 第5 天完全更换培养液，观察细胞生长情况。第l o 天免疫细胞化学染色测定p 7 5 阳性 细胞比例。 2 2 2 化学试剂法将同样收获的细胞调整密度为1 0 6 r n l ，加入经p l l 包被的培养 瓶中孵育，3 6 h 后向内滴加a m c ，作用时间4 8 h ，d h a l l k s 液洗涤细胞2 次，继续全培 养液培养2 4 h ，再向培养液中加入同样剂量的a m c ，1 2 h 后除培养基，d h a n k s 洗2 遍，观察细胞形态，胰酶消化，离心后重新加入全培养基，取5 0 u l 细胞悬液细胞计数，第 1 0 天观察细胞并计算p 7 5 阳性细胞比例o 2 2 3 免疫吸附法向以上取材所得的细胞悬液内加入鼠抗人t h y l 单克隆抗体， 3 7 下作用3 0 r n j n ，该抗体将与间充质来源的成纤维细胞进行特异性结合【3 2 】。细胞悬液 离心除培养基，新鲜培养基洗2 次除抗体，全培养基重新悬浮细胞，移入山羊抗鼠i g g 包 被过的培养皿中，3 7 下孵育lh ( 培养皿使用h d d 山羊抗鼠i 如4 下孵育过夜，使用 前撤除抗体，无菌d h a n k s 液洗3 次) ，将细胞悬液再次吸出离心，培养基洗1 次，加人 全培养基后移人p l l 包被的培养皿中，调整接种密度为1 0 6 r n l ，第3 天加新鲜培养基 1 r n l ，第5 天观察细胞生长情况，胰酶消化后重新接种在p l l 包被过的培养皿中，取5 0 u l 细胞悬液进行细胞计数，第1 0 天观察细胞生长情况获取p 7 5 阳性细胞比例。 内蒙古医学院硕士研究生学位论文( 2 0 0 8 年) 3 嗅鞘细胞移植在治疗脊髓损伤中的基础实验研究 自o e 能在中枢神经系统辅助轴突再生的特性被发现以来，在最近十几年，嗅鞘 细胞已经被用于许多脊髓损伤修复的模型中，其中包括完全脊髓横断模型、脊髓半横断 模型、脊髓传导束损伤模型、脱髓鞘损伤模型、脊神经后根切断伤模型、外周神经横断和 视神经损伤模型。这些各种各样的模型中，嗽都显示了促进轴突再生，改善神经功能 的作用旧引o 1 9 9 4 年，r a m o n c u e t 0 等人阱】第一次做了嗅鞘细胞移植治疗脊髓损伤的动物实 验，他们将大鼠t 1 0 段侧后根进入脊髓处进行横断，把经纯化培养的o e c s 移植在两断 端和断端间，3 周后观察到了许多再生的背根轴突进入脊髓，从而认为通过嗅鞘细胞损 伤的背根轴突能再生人脊髓中，并且推测使用嗅鞘细胞移植也能促进中枢神经系统其他 部位损伤的修复。 1 9 9 7 年，l i 等【1 4 j 在s c i e n c e 上率先报道了将c i e i c s 移植技术尝试用于s c i 修复应 用的研究，并首先取得大鼠s c i 后瘫肢运动功能恢复的重大突破。这个研究小组报道， 将大鼠上颈髓一侧皮质脊髓束切断，造成急性脊髓损伤的动物模型。将培养纯化的嗅球 成鞘细胞悬液植入损伤部位。经过3 1 0 周的观察，发现皮质脊髓束再生通过损伤区域 并与远端脊髓桥接，并且通过实验证实大鼠的前肢也得到了功能性恢复ol i 还报道在精 确的立体定位下，用电损害的方法在成年大鼠的c 1 2 节段制造皮质脊髓束损害的模 型。在一个很局限的范围内精确损害脊髓中央所有的组织，包括轴突，星形胶质细胞，少 突胶质细胞，小形胶质细胞和微血管。损伤后立即将培养好的嗅鞘细胞悬液移植到脊髓 损伤部位。移植后第1 周，可以见到切断的皮质脊髓束轴突沿着原轴突的方向发芽，在 小的突芽前方并伴有小的静脉曲张；到第3 周可见再生的轴突被p o 阳性的鞘磷脂包绕 并成束排列，轴突延长通过损伤区域并重新进入尾端的皮质脊髓束。i m a i z u 面 3 5 1 报道在 神经脱髓鞘的情况下，嗅鞘细胞能帮助神经髓鞘化和加速神经电生理传导速度。r a m o n c u e t o 等( 2 0 0 0 ) 瞵1 于髑水平完全横断脊萌后，不再应用含雪旺细胞引导管，而只将 o e c s 悬液在距离两侧断端1 瑚m 处植入脊髓。他们发现o e c s 移植成功地实现了脊髓 损伤鼠的功能和结构重建。移植后3 7 个月，所有实验动物均恢复了运动功能和感觉 反射。 在嗅鞘细胞移植实验中，通过与s c 的比较发现，虽然s c 比o e q 的修复效果要 好【3 7 】，但是s c 在富含星型胶质细胞的环境中并不能与之很好整合地为一体，而是在胶 内蒙古医学院硕士研究生学位论文( 2 0 0 8 皇) 质细胞增生和抑制分子增多的伤口周围发生特异的、典型的过度生长。由于硫酸软骨素 蛋白多糖等抑制分子的存在，对植入的和内源性的细胞迁移和随后的髓鞘再生成、宿主 组织的轴突生长都会产生抑制作用。尽管s c 能促进轴突生长，但宿主损伤后产生的抑 制作用将移植物局限在移植区而使之不能进入宿主组织。只有当c e i c s 移植到s c 周围 后，横断的脊髓内植入的s c 才能借助于呱穿越移植部位。由于上述因素，s c 不可 能成为移植的理想供体。研究表明采用o e c s 移植来治疗脊髓损伤，可以部分的实现损 伤轴突的再生【鹞】，一般考虑这种作用是c ) e c s 通过分泌促进轴突再生的各种营养因子实 现的，这些因子m 】主要包括脑源性神经营养因子( 踟) ，神经营养素一3 和神经营养素 2 4 5 ( n ，r 3 ，n ，r 2 4 5 ) 以及细胞黏附因子( a 蝴) 等。因此，呱单独移植的效果与我们 的期望有些差距o 4 嗅鞘细胞移植治疗s c i 的临床状况 基于嗅鞘细胞在动物实验修复损伤脊髓中明确的促进轴突再生，恢复损伤平面以下 神经支配的作用，同时至今尚没有治愈脊髓损伤的可靠方法，有人开始将o e c s 治疗脊 髓损伤从动物实验跳到临床试验上来o2 0 0 5 年，澳大利亚f e r o n 等【柏】在一期临床实验 中，对3 例男性截瘫患者( 损伤时间为6 3 2 个月) 进行呱移植，细胞来自嗅黏膜活 检，并经体外纯化培养，植入1 年后没有出现手术并发症，也没出现脊髓的进一步损害以 及囊肿、肿瘤、瘘管的形成。进而认为自体嗅鞘细胞移植是安全可行的，并且计划对受试 者进行3 年的随访，观察神经功能和精神状态的变化，以确定移植的长期安全性o2 0 0 6 年l 幽等【4 1 进行了临床试验，他们对7 例脊髓损伤患者( 损伤时间为6 个月6 5 年) 进行自体嗅黏膜组织移植，术后显示患者的神经功能有不同程度的恢复( 除1 例患者有 感觉减退，原因可能是脊髓损伤平面确定错误) o 所以他们也认为嗅黏膜自体移植是可 行且相对安全的，有潜在的修复作用，但也涉及手术风险，目前需进一步长期检测一些滞 后的副作用和远期疗效。 嗅鞘细胞移植治疗脊髓损伤的临床工作尚少报道 4 2 】。我国海军总医院黄红云等人 报道的一组临床2 3 例治疗试验的初步结果表明，被治疗的脊髓损伤晚期患者的脊髓神 经功能均有不同程度的改善，且呈继续改善趋势。在其最新一组9 1 例大宗病例资料显 示出同样的结果。在该研究的9 1 例患者中，7 6 例患者临床表现为完全性，1 5 例为不完 全性脊髓损伤。临床治疗试